CN1557324A - 蜕皮甾酮在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜕皮甾酮的医药用途，特别是蜕皮甾酮在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。根据体内实验和体外实验的研究结果表明，蜕皮甾酮治疗胰岛素抵抗有其优越性，其可以改善胰岛素抵抗所致的血糖升高，具有显著改善胰岛素抵抗的效果，也具有增加2型糖尿病患者胰岛素敏感性的作用，并且毒性低，副作用小，使用安全。

Description

蜕皮甾酮在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用

                       技术领域

本发明涉及蜕皮甾酮的用途，特别是蜕皮甾酮在制药领域中的应用。

                       技术背景

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是亚细胞、细胞、组织或机体的一种病理生理状态，经典定义是指需要超过正常量的胰岛素始能在胰岛素的效应器官产生正常的生理效应，现代的胰岛素抵抗概念则泛指胰岛素在周围组织摄取和清除葡萄糖的作用减低。胰岛素的主要靶器官是肝脏、骨骼肌及脂肪组织，主要生理效应包括其介导的葡萄糖的摄取及处理(糖的氧化及贮存)，促进蛋白质和脂肪合成，抑制糖异生，抑制脂肪分解和酮体生成等。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病因和显著特征。它也在糖耐量异常、肥胖、高血压、异常脂质血症、动脉粥样硬化等的病理生理过程中发挥着重要作用。临床工作中常见到上述造成心、脑血管疾病的多种危险因素集聚于一个个体的状态，将这种状态称为代谢综合症或胰岛素抵抗综合症。医学界已把伴有胰岛素抵抗的糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、脑卒中称为“死亡五重奏”，这可怕的五重奏可能是21世纪威胁人类健康与生命安全的头号杀手。因此，改善胰岛素抵抗或增加胰岛素敏感性的药物学研究具有重要的临床意义。近来直接针对提高胰岛素敏感性或改善胰岛素抵抗的药物的应用倍受关注，目前首推胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物。经体内、外实验研究证实，该类药能提高肌、脂肪细胞对葡萄糖的摄取及利用，抑制肝葡萄糖输出，这类药物的临床应用在2型糖尿病的治疗史上具有重要意义。但是此类药物具有不同程度的肝脏毒性(如曲格列酮有导致肝坏死的报道)和其它不良反应，如水肿、腹泻、上呼吸道感染、体重增加、头痛、头晕等。且由于上市不久，其安全性尚有待进一步临床考验。

蜕皮甾酮是一种天然产物，呈无色针状结晶(乙醇-己烷)，熔点242℃(分解)，分子式C₂₇H₄₄O₇，分子量480.62，结构如下：

蜕皮甾酮最初在昆虫体内发现，是一种具有蜕皮活性的物质，有促进细胞生长的作用。60年代以后人们发现植物界也有蜕皮甾酮的存在，其在植物界的分布不仅较动物界高，而且广，资源丰富，如牛膝、桑叶、祁州漏芦等均含有该种物质。蜕皮甾酮在昆虫体内含量极微，因此植物蜕皮甾酮是目前商业用蜕皮甾酮的主要来源。研究表明，蜕皮甾酮有多种药理学作用，如促进核糖核酸和蛋白质合成，影响糖代谢，促进脂类代谢，免疫调节，影响中枢神经系统、抗氧化、活血化瘀等，但目前尚无有关蜕皮甾酮治疗胰岛素抵抗的报道。

                        发明内容

本发明的目的是提供蜕皮甾酮在制药中的新用途，具体地说是提供蜕皮甾酮在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用，以制备能有效治疗胰岛素抵抗的药物

蜕皮甾酮可以从昆虫体内或植物体内提取，将其用于治疗胰岛素抵抗，即口服蜕皮甾酮以治疗胰岛素抵抗，其剂量为5-15mg蜕皮甾酮/日，每日分两次口服，蜕皮甾酮可以制成胶囊、片剂或颗粒剂等药剂学上所说的各种口服剂型。

药代动力学研究表明，蜕皮甾酮易被小鼠吸收，服药后血药浓度维持时间较长。服药后8小时血中蜕皮甾酮的浓度达高峰，服药后8小时衰减40％左右。蜕皮甾酮是许多常用中药的活性成分之一和有效单体，它是一种天然产物，毒性小，因此蜕皮甾酮治疗胰岛素抵抗有其优越性，其能够改善胰岛素抵抗所致的血糖升高，具有显著改善胰岛素抵抗的效果，也具有增加2型糖尿病患者胰岛素敏感性的作用。

为了更好地理解本发明的实质，以下用蜕皮甾酮的体内实验和体外实验研究结果来说明其在改善胰岛素抵抗中的功效作用。

1、蜕皮甾酮改善实验性2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗

1.1 动物及分组处理：

清洁级近交系雄性4周龄Wistar大鼠，体重180-190g，购自重庆医科大学实验动物中心，适应性喂养2周，明暗周期为12小时，室温控制在22-28℃，随机分成四组：A组(正常对照组)喂以常规饲料，B组(模型对照组)、C组(治疗组)及D组(阳性药物对照组)喂以高脂膳食。高脂膳食配方：脂肪热比为59％(其中猪油占39％)，蛋白质热比为21％(其中酪蛋白占31％)，碳水化合物热比为20％(其中玉米淀粉占30％)，此外附加必需维生素及矿物质。每只大鼠每天供给的总热量约310kJ，与正常对照组大鼠自由进食摄取的能量基本相同。高脂饮食一个月后，B、C、D三组大鼠按25mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，复制出2型糖尿病大鼠模型。于STZ注射后第三个月起，C组开始喂饲蜕皮甾酮(7.5mg/kg剂量灌胃，以蒸馏水溶解配制)，D组喂饲吡格列酮(20mg/kg剂量灌胃)，A、B组予等体积生理盐水灌胃作为对照，每日一次，连续四周。

1.2 方法

1.2.1 胰岛素抑制试验

实验时，大鼠过夜禁食。以1％戊巴比妥钠按20mg/kg剂量麻醉，在大鼠右颈动脉和左颈静脉分别置入PE50导管，40U/ml肝素盐水管内保留抗凝。手术完成麻醉清醒后2小时，在可以自由活动状态下，以微量注射仪从颈静脉中以20ul/min的体积持续灌注葡萄糖(0.22mmol/kg/min)、胰岛素(30mmol/kg/min)和生长抑素(920pmol/kg/min)共150min。灌注液以0.5％BSA生理盐水配制。在该实验条件下，持续灌注30-60min后，血中葡萄糖及胰岛素水平达到稳态平衡。以灌注90、120和150min时3点血糖及胰岛素平均值作为稳态血糖(steady-state plasma glucose，SSPG)、稳态胰岛素(steady-state plasma insulin，SSPI)值，以衡量胰岛素敏感性的程度。

1.2.2 高胰岛素正常血糖钳夹技术(简称钳夹试验)

按上述方法在大鼠右颈动脉和左颈静脉分别置入PE50导管。将准备好的大鼠颈静脉导管接上三通管的一端，三通管的另两端分别接上输注胰岛素或葡萄糖的输液管。颈动脉导管则接一装有肝素生理盐水(浓度为40U/ml)的注射器，每10min推动1次注射器冲洗导管，以保证导管通畅。静置30min后，将连接颈动脉导管的注射器取下，取血1滴，用One Touch II微型血糖仪测定基础血糖值。然后以恒定的速度(10mU/kg/min)输注胰岛素(丹麦诺和诺得公司产品，浓度为40U/ml，用生理盐水稀释，使用前新鲜配制)。以后每5min测定血糖1次。当血糖低于5mmol/L时开始输注10％葡萄糖。调整葡萄糖输注速率使血糖控制在4.5-5.5mmol/L水平。60min后，当连续三次血糖值均在上述范围时，即认为达到了稳定状态。计算血糖维持在4.5-5.5mmol/L稳态时的葡萄糖输注率(GIR)。

1.3 结果

1.3.1 蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠空腹血糖和血浆胰岛素的影响(见表1)：

蜕皮甾酮喂食后，C组无论是空腹血糖还是血浆胰岛素都要比B组明显降低；药物干预后，C组和D组血糖及血浆胰岛素比较，均无显著性差异(p＞0.05)。

1.3.2 蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠胰岛素抑制试验SSPG、SSPI的影响(见表2)：

胰岛素抑制试验结果显示，C组、D组的SSPG、SSPI均明显低于B组(P均＜0.05)；C组与D组比较无论是SSPG还是SSPI均无显著性差异(p＞0.05)。

1.3.3 蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠钳夹试验葡萄糖输注率的影响(见表3)：

钳夹试验结果显示，C组、D组的GIR均显著高于B组(p均＜0.05)；C组与D组比较GIR无显著性差别(p＞0.05)。

1.4 结论

①本研究通过高脂膳食加小剂量STZ腹腔注射可成功复制出具有胰岛素抵抗特征的2型糖尿病模型(B组的GIR显著低于A组)。

②蜕皮甾酮可减轻胰岛素抵抗模型大鼠的高胰岛素血症，提示蜕皮甾酮可改善胰岛β细胞的代偿性高分泌状态，并能增加胰岛素转运的效率，从而一方面改善胰岛素抵抗所致的血糖升高，另一方面降低血浆胰岛素水平。

③蜕皮甾酮能明显改善胰岛素抵抗和增加胰岛素敏感性。

④蜕皮甾酮与吡格列酮具有相似的增加胰岛素敏感性的效果。

2、蜕皮甾酮改善胰岛素抵抗HepG2细胞模型的胰岛素抵抗。

2.1 建立IR的HepG2细胞模型及实验细胞分组：

2.1.1 HepG2肝癌细胞的培养。HepG2肝癌细胞由重庆医科大学超声研究所提供，按常规方法培养，用DMEM培养液培养。消化液采用胰蛋白酶、EDTA消化液，胰蛋白酶终浓度为0.125％，用培养液调节细胞浓度至1×10⁶/ml。

2.1.2 胰岛素抵抗HepG2肝癌细胞模型复制：将培养的HepG2肝细胞悬液用4℃DMEM培养液(含30％小牛血清，50μg/ml青霉素，50U/ml链霉素，2mmol/l谷氨酸，12mmol/l碳酸氢钠及25mmol/l葡萄糖)洗涤一次，以灭活胶原酶，然后用不含小牛血清的DMEM(其余成分同上，且以后使用的培养液均同此)洗涤两次以除去血清蛋白。将细胞转移至培养皿中，并用培养液将细胞浓度调至1.5×10⁶/2ml为宜。经37℃，5％CO₂至少孵育5小时，再用培养液洗涤一次。然后加入1ml新配制的含有或不含有5×10^-7mol/L人胰岛素的培养液(不加胰岛素者为对照)于37℃，5％CO₂孵育16小时，再用不含胰岛素的培养液洗涤2次，共二十分钟。

2.1.3 实验细胞分组：

将培养板中的细胞随机分成下列几组：

正常对照组：细胞常规培养未加任何处理：

药物加对照组：常规培养加药物蜕皮甾酮10μg/ml；

模型对照组：IR HepG2肝癌细胞未加任何处理；

模型处理组：IR HepG2肝癌细胞加药物蜕皮甾酮10μg/ml。

2.2 方法

2.2.1 细胞的葡萄糖摄取率的检测及IR HepG2肝癌细胞模型鉴定：

2.2.1.1 IR HepG2肝癌细胞模型鉴定：采用³H-D-葡萄糖掺入实验即葡萄糖摄取率评价细胞的胰岛素敏感性，按文献进行。将经过16小时孵育的细胞加入1ml DMEM培养液(分别含0ng/ml，10ng/ml，100ng/ml人胰岛素)于37℃预孵育半小时，然后加入³H-D-葡萄糖(3μCi/ml培养液)于37℃，5％CO₂条件下孵育1小时，并通过加入冰冷的磷酸缓冲液快速洗涤细胞以终止反应。细胞用0.5ml、20％KOH融解后，转移至玻璃试管中。取出100μl细胞融解液测定蛋白质浓度。向玻璃试管中加入2倍体积冷乙醇(660μl/ml)溶液洗涤两次。离心后弃去上清液，将沉淀物(糖原)倒置沉积在直径2厘米的滤纸片上。滤纸片经4℃，660μl/ml乙醇搅拌洗涤四次，共三小时。将滤纸片烤干后，置于10ml闪烁液中用液体闪烁仪测定放射性计数。

2.2.1.2 细胞的葡萄糖摄取率的检测：根据³H-D-葡萄糖的比放射性，细胞融解液的蛋白质浓度及糖原的放射性计数，可计算出³H-D-葡萄糖掺入率，单位为nmol葡萄糖/mg蛋白质/小时。

2.2.2 残余¹²⁵I-胰岛素结合率测定：将各组细胞分别置于含10^-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下，用预冷的PH4.0的DMEM培养液及0.0lmol/L PBS分别冲洗5次。每孔中加2ml含3uCi¹²⁵I-胰岛素的DMEM培养液，4℃孵育3小时。弃培养液用0.01mol/L PBS冲洗5次，每孔中加入0.25％胰酶1ml，室温消化25分钟，用含15％小牛血清的DMEM培养液终止反应。吹打细胞并移入测试管中，用1ml PBS洗5次，洗液一并加入测试管中，2000rpm离心10min。弃上清，测沉淀放射计数。用10^-7mol/L胰岛素与¹²⁵I胰岛素竞争结合后的残余¹²⁵I-胰岛素结合量作为非特异性结合。未用胰岛素刺激的HepG2细胞残余¹²⁵I-胰岛素结合量作为对照。

2.3 结果

2.3.1 实验各组HepG2细胞残余¹²⁵I-胰岛素结合率的比较(见表4)：

高于生理浓度(10^-7mol/L)的胰岛素刺激24小时后，模型对照组HepG2细胞残余¹²⁵I-胰岛素结合率明显低于正常对照组(p＜0.01)，提示胰岛素抵抗的HepG2细胞模型复制成功。模型处理组HepG2细胞残余¹²⁵I-胰岛素结合率明显高于模型对照组(p＜0.05)。

2.3.2 实验各组HepG2细胞的³H-D-葡萄糖掺入率的比较(见表5)：

由表5可见，在培养液中加入胰岛素后，模型对照组HepG2细胞的葡萄糖掺入率在各种浓度的胰岛素刺激下，均显著低于正常对照组细胞，提示IR细胞模型复制或建立成功。在不同浓度胰岛素刺激下，模型处理组HepG2细胞的葡萄糖摄取率均明显高于模型对照组。

2.4 结论

①利用高胰岛素培养HepG2细胞可成功诱导胰岛素抵抗细胞模型。

胰岛素抵抗最主要的特征是胰岛素刺激的葡萄糖摄取和利用障碍，因此利用³H-D-葡萄糖掺入实验检测细胞的葡萄糖摄取率，可以较准确地评价细胞的胰岛素敏感性，从而判断是否存在胰岛素抵抗。胰岛素受体数目减少和受体后缺陷是导致肝细胞胰岛素抵抗的主要原因。

②蜕皮甾酮能增加胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取率，即能促进葡萄糖转运活动(转化为糖原)从而增加胰岛素敏感性，减轻细胞胰岛素抵抗。

③蜕皮甾酮能提高胰岛素抵抗HepG2细胞的¹²⁵I-胰岛素结合率，即可增加细胞表面胰岛素受体数目，提示蜕皮甾酮可改善胰岛素抵抗和增加胰岛素敏感性。

                       具体实施方式

方式一：按本领域技术人员公知的技术方法制备蜕皮甾酮颗粒剂

取蜕皮甾酮10g，以改性淀粉微晶纤维素为填充剂，以甲基纤维素作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，分装成5mg/包，包装即得。

方式二：按本领域技术人员公知的技术方法制备蜕皮甾酮胶囊剂

取蜕皮甾酮10g，以改性淀粉微晶纤维素为填充剂，以甲基纤维素作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，分装成5mg/囊，包装即得。

方式三：按本领域技术人员公知的技术方法制备蜕皮甾酮片剂

取蜕皮甾酮10g，以改性淀粉微晶纤维素为填充剂，以甲基纤维素作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，压片，5mg/片，包装即得。

表1：治疗后各组空腹血糖及血浆胰岛素水平的比较

组别    鼠数    空腹血糖      空腹血浆胰岛素

        (只)    (mmol/L)         (mIU/L)

A组      8     5.11±0.67^**   15.76±3.57^**

B组      9    15.38±3.81      53.48±10.15

C组      10   10.07±2.05^*    31.71±8.62^*

D组      9    11.47±2.36^*    32.53±9.05^*

注：与B组比较^*p＜0.05；^**p＜0.01

    表2：  治疗后各组胰岛素抑制试验SSPG及SSPI的比较

组别    鼠数      SSPG           SSPI

        (只)    (mmol/L)        (mIU/L)

A组      8    10.78±2.17^**   293.94±19.37^**

B组      9    31.24±7.35      509.87±30.29

C组      10   22.71±4.63^*    397.78±21.76^*

D组      9    21.85±5.12^*    415.69±23.37^*

注：与B组比较^*p＜0.05；^**p＜0.01

           表3：治疗后各组钳夹试验葡萄糖输注率的比较

                     A组           B组         C组           D组

  鼠数(只)            8             9          10             9

GIR(mg/kg/min)   15.07±1.82^**  3.04±1.15  10.56±3.71^*  9.87±3.52^*

注：与B组比较^*p＜0.05；^**p＜0.01

      表4：实验各组HepG2细胞¹²⁵I-胰岛素结合率的比较

                   正常对照组    药物加对照组  模型对照组  模型处理组

¹²⁵I-胰岛素结合率  902±187^**    979±203^**    431±215    707±236^*

(cpm)

注：与模型对照组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01

    表5：实验各组HepG2细胞³H-D-葡萄糖摄取率的比较

                                    胰岛素浓度

实验次数

                        0ng/ml        10ng/ml        100ng/ml

正常对照组    8      12.1±0.8^**    19.9±0.7^**    28.9±1.4^**

药物加对照组  8      12.7±0.9^**    23.3±0.6^**    29.8±1.5^**

模型对照组    8      20.3±1.0       13.5±0.8       19.2±1.0

模型处理组    8      24.7±1.1^*     17.9±0.9^*     24.7±1.1^*

注：与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

葡萄糖摄取率的单位为nmol葡萄糖/mg蛋白质/小时

Claims (1)

1、蜕皮甾酮在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。