CN1751693A - 黄芪多糖在治疗或预防胰岛素抵抗的药中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芪多糖在治疗或预防胰岛素抵抗的药物中应用。该研究表明，黄芪多糖具有减轻体重、降低血糖、改善糖耐量异常，减少腹部脂肪，增加胰岛素敏感性等作用，且不影响胰岛素分泌。能够有效的预防和治疗胰岛素抵抗，对与胰岛素抵抗相关疾病，如糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等的预防和治疗也有良好作用。

Description

黄芪多糖在治疗或预防胰岛素抵抗的药中应用

                          技术领域

本发明涉及医用医药，更具体涉及一种预防和治疗胰岛素抵抗的药中的用途，适用于糖尿病及其血管病变、糖尿病肝病、肾病以及冠状动脉病变等的治疗或预防。

                          背景技术

胰岛素抵抗是糖尿病、动脉粥样硬化和高血压等疾病的共同土壤，是严重危害人类健康的常见、多发病。胰岛素抵抗若不能尽早治疗和预防，将发展为2型糖尿病、冠状动脉粥样硬化、高血压等疾病。尤为引人注目的是2型糖尿病，约占糖尿病患者总数的90％-95％。由于老年人口增加、肥胖和缺乏锻炼等不良生活方式的普遍化，2型糖尿病正成为一种非常普遍的慢性病，还因其高发病率和死亡率已成为继癌症和心脑血管病之后人类健康的第三大“杀手”。因此，加强胰岛素抵抗的防治对预防糖尿病的发生尤为迫切。目前，尚无一种有效而无害的防治胰岛素抵抗的药物面世。

首先介绍目前国内外治疗糖尿病药物的现状及研发情况：

第一类：胰岛素增敏剂

目前国内外主要使用的是TZD类药物即噻唑烷二酮类(太罗)。代表药物有：罗格列酮(史克比)和吡格列酮(武田)，

作用：这类药物作用于过氧化酶增殖剂激活受体-γ，简称PPAR-γ，能增加周围组织(肌肉和脂肪组织)对葡萄糖的利用率及降低肝脏对葡萄糖的输出率。因此又叫胰岛素增敏剂。通过调动周围组织的“积极性”，提高周围组织对胰岛素的敏感性、发挥胰岛素的降糖效率，保护受损的胰岛细胞，使得残存胰岛功能得到恢复。

应用前景及缺点：这类药物是临床上所有2型糖尿病人的首选药物，与其他口服药物相比较为安全有效。其缺点是可引起体重增加，水肿及贫血，而体重增加是糖尿病患者的大忌。

此外还有一些同类衍生物问世，其作用机制与罗格列酮类似，均为小分子化合物：①MCC2555(isaglitazone)MCC2555是三菱制药公司开发的口服降糖药。本品为TZD类衍生物，作用于过氧化物酶增殖活化受体(peroxisome pro2liferationactivated receptor-γ，PPAR γ)，能降低IR，同时还能治疗脂肪沉滞性动脉硬化症。目前已在美国和欧洲进入二期临床试验阶段。②KRP-297KRP-297是杏林制药公司开发的治疗II型糖尿病的口服药物。它有激动PPAR γ/α受体的双重作用，可以提高胰岛素敏感性，改善脂质和脂蛋白的特性。目前已在日本和美国进入三期临床试验阶段。缺点：头痛、腹泻和疲劳乏力。③FK2614FK-614是藤泽制药公司开发的口服降糖药。现已在美国和日本进入二期临床试验阶段。相关临床数据未见报道。④BMS-298585(muraglitazar)BMS2298585是Bristol2MyersSquibb开发的治疗2型糖尿病、肥胖和其他代谢失调症的药物。本品为氨基乙酸类似物，具有PPARα/γ双重激动作用。二期临床已经完成，计划进入三期临床试验。⑤GW2409544GW2409544是GlaxoSmithKline公司开发的PPARα/γ双重激动剂，用于治疗2型糖尿病和混合血脂异常。目前已在美国和英国进入三期临床试验阶段。相关临床数据未见报道。

上述药物大多尚未上市，而且，因其为小分子化合物，其副作用也不容忽视。

目前进入临床试验阶段的胰岛素抵抗改善药还有一部分为非TZD结构。研究发现，替代TZD结构而得到的化合物仍然具有药理活性，因此非TZD类胰岛素抵抗改善药正成为新的研究方向。

第二类：双胍类

此类药物包括：苯乙双胍(降糖灵)和二甲双胍(降糖片)

作用是增加周围组织对葡萄糖的利用和抑制肠道对葡萄糖的吸收，抑制肝糖异生和肝糖输出。

应用前景及缺点：与磺脲类相比，二甲双胍降糖作用相对缓和，低血糖发生少。因此二甲双胍已成为临床应用最广泛的双胍类药物，主要用于联合用药，治疗肥胖型糖尿病患者。苯乙双胍有严重的乳酸酸中毒副作用，在许多国家已被禁止使用，国内临床也在减少用量。而二甲双胍可完全避免乳酸酸中毒。

第三类：α-葡萄糖苷酶抑制剂

代表药物有：阿卡波糖(acarbose，德国拜耳)和伏格列波糖(日本武田)。

作用是是通过抑制α-葡萄糖苷酶，减慢水解及产生葡萄糖的速度并延缓葡萄糖的吸收，从而降低餐后血糖。它还有一定的降血脂作用，能防治糖尿病的慢性并发症。

应用前景与缺点：抑制α-葡萄糖苷酶的作用是可逆的，所以向葡萄糖的转化仅仅是推迟，而不是完全阻断。其严重的胃肠道反应和昂贵的价格使之应用受限。

第四类：胰岛素分泌促进剂

分为磺脲类药物及格列萘药物，以及非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂。

前者的发展经历了三代：第一代主要是甲苯磺丁脲和氯磺丙脲；第二代有格列本脲(优降糖)、格列齐特(达美康)、格列吡嗪(美吡达)和格列喹酮(糖适平)等；第三代有格列美脲等。目前我国临床上所用的主要是第二代，第一代仍有少量使用，第三代尚未见临床应用报道。

作用是刺激胰岛素的分泌。

应用前景及缺点：早期产品因仅能够刺激胰岛素分泌付出的代价是胰岛β细胞“劳累过度”，最终将导致胰岛细胞衰竭！这种拔苗助长的治疗理念忽视了长期刺激带病工作的胰岛细胞会产生负面效应，会导致胰岛细胞功能的过早衰竭，并发症提前出现，那将造成难以挽回的生命代价。目前第三代产品格列美脲能增强胰岛素的敏感性，依然具有一定的促进胰脏β-细胞胰岛素的分泌作用。

后者即非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂此类药物和SU类药物结构虽然不同，但作用机制却有相同之处，均为促进胰岛β细胞分泌胰岛素，不同之处在于它们与β细胞结合的部位不同。已上市的药物有：：瑞格列奈(repaglinide，德国Boehringer Ingelheim)和那格列奈(nateglinide，HMR公司和日本山之内)。处于三期临床试验阶段的药物有Kissei公司的mitiglinide。

应用前景与缺点：因为作用机制与前一种有相同之处，均为促进胰岛β细胞分泌胰岛素，因此也具有前述副作用。

第五类  口服胰岛素

作用：近年来研制的口服胰岛素，可模仿生理性胰岛素分泌，有效地降低血糖。

应用前景及缺点：这类药物引起低血糖和体重增加。一般不作为2型糖尿病患者首选或常规给予主要用于1型糖尿病患者。目前研究的剂型有胶囊、胶丸、微囊，也有用凝胶、片剂及油水合成的复合包裹性乳液。

根据临床应用情况，以上治疗胰岛素抵抗/2型糖尿病的药物可以简要汇总如下：

药物种类	分子靶点	效应部位	副作用
				口服胰岛素胰岛素分泌促进剂双胍类α-葡萄糖苷酶抑制剂	胰岛素受体SU受体/K+ATP通道未知α-葡萄糖苷酶	肝脏、肌肉、脂肪胰岛β细胞肝脏(肌肉)肠	低血糖、体重增加低血糖、体重增加胃肠不适、乳酸中毒胃肠不适
胰岛素抵抗改善药物	PPARα/γ；β3受体；胰高血糖素受体	脂肪、肌肉、肝脏	体重增加、水肿、贫血

                          发明内容

本发明的目的是在于提供一种黄芪多糖在治疗或预防胰岛素抵抗中的应用，还可作为含2型糖尿病及其他胰岛素抵抗相关代谢疾病(特别是肥胖症)的药物和保健品原料。该黄芪多糖具有减轻体重、降低血糖、降低血脂、改善糖耐量异常，减少腹部脂肪，增加胰岛素敏感性，其疗效显著、标本并治、作用确凿，是安全无毒的中药制剂，可作为胰岛素增敏剂。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗四氧嘧啶诱导的1型糖尿病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗2型糖尿病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗预防胰岛素抵抗的高糖连续输注的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗糖尿病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗糖尿病引起心脏病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗糖尿病脂肪性肝病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗糖尿病引起肾病的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗肥胖症的药中的应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗或预防胰钪素抵抗引起的肝脏病理损伤的药中应用。

本发明涉及黄芪多糖作为制备治疗心血管病变的药中应用。

研究开发具有预防和治疗胰岛素抵抗包括2型糖尿病及其他胰岛素抵抗相关代谢疾病，同时具有减轻肥胖的药物是目前国内外关注的热点方向。开发的黄芪多糖通过大量实验显示出确凿而明显的降糖降脂减轻体重的多重功效，相应在胰岛素抵抗，2型糖尿病及其他胰岛素抵抗相关疾病(特别是肥胖症)的应用领域具有以上所用药物不可替代的优势，而且大量的实验结果从各个层面对其药理作用机理的解释是目前大多数中草药所望尘莫及的。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

黄芪多糖的制备：

1.提取：采用优化水煎提取工艺并略作改进提取黄芪多糖。取黄芪药材，切成约0.5cm厚的饮片，80℃烘干，粉碎。加8倍水，煮2h，过滤；残渣加6倍量水，煮沸1h，过滤；残渣再加4倍量水，煮沸0.5h，过滤，合并三次滤液，浓缩到1∶1。Sevag法去蛋白，即在滤液中加入氯仿-戊醇5∶1混和物剧烈振摇10min，反复10次。蒸馏水透析24h。加3倍量无水乙醇，搅拌，放置12h，离心，将沉淀蒸干。再加水溶解，加入3倍量乙醇，沉淀离心，蒸干，即得黄褐色粗多糖，称重，与取药材量相比，即得收率。

2.纯化：Sephadex G-150柱层析：称取15克Sephadex G-150，用200ml蒸馏水室温处理8小时，使之充分溶胀。湿法装于72×2.7cm层析柱中。将1克黄芪多糖粗品溶于0.1mol/L NaCl溶液中，加到层析柱上，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min。每管2ml，硫酸-苯酚法隔管检测，合并单一峰，冷冻干燥，得黄芪多糖精品。

3.多糖含量测定：

(1)标准溶液配制：标准葡萄糖溶液配制：取干燥至恒重的葡萄糖100mg，定容到100ml；

(2)苯酚液的配制：取苯酚100克，加铝片100mg与碳酸氢钠50mg，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分10克，加水150ml，置于棕色瓶中。

(3)标准曲线制作：精密吸取标准葡萄糖0、10、20、40、60、80、100微升，分置于具塞试管，各加蒸馏水至2ml，再各加苯酚溶液1ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5ml，摇匀放置5分钟，置沸水浴加热15分钟，取出冷却到室温，于490nm处测定吸收度，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取50mg多糖样品，定容到100ml，取50μl按标准曲线的测定方法测定吸收度。根据标准曲线求出多糖的含量。

APS的收率为2.0％，总多糖含量为38.5％。提取的APS为淡褐色可溶于水的粉末。使用前用蒸馏水新鲜配置成20g/L的溶液。

另外提纯的黄芪多糖可作为改善胰岛素抵抗的口服液、胶囊、片剂、散剂和丸剂的原料药。

一种治疗及预防胰岛素抵抗及其相关疾病包括糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等的黄芪多糖片剂重量配比为(单位克)：黄芪多糖粉末30、十二烷基硫酸钠(冲成浆状)45～50每10万片、12％羧甲基淀粉(冲成浆状)、硬酯酸镁3000每10万片

制备方法：将黄芪多糖粉末与十二烷基硫酸钠和羧甲基淀粉混合搅拌均匀制成软材，湿润剂亦可用50％的乙醇，过筛，干燥(温度90℃左右)，最后加入硬酯酸镁混匀，压片，片重约0.6克。口腹，一次1～2片，一日2～3次，小儿可酌情减量。

一种治疗及预防胰岛素抵抗及其相关疾病包括糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等的黄芪多糖散剂重量配比为(单位克)：黄芪多糖纷末1.0、木糖0.1、羧甲基淀粉0.8、阿拉伯胶0.2、蛋白Q.S.、3.5％单硬酯酸甘油酯Q.S.

制备方法：黄芪多糖粉末与木糖、羧甲基淀粉、阿拉伯胶、蛋白混合并通过二号筛制成颗粒并于60℃以下干燥后经3.5％单硬酯酸甘油酯处理后制成散剂并称定重量，从原黄芪多糖的含量计算应服的剂量，成人每天服用安全剂量在3.3～5.1克/天，一天一次，成人体重按60公斤计算，小儿可酌情减量。

一种治疗及预防胰岛素抵抗及其相关疾病包括糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等的黄芪多糖蜡丸剂重量配比为(单位克)：黄芪多糖纷末120～160、米蜡15～20

制备方法：取黄芪多糖药粉120～160克，另取米蜡15～20克加热熔化后与黄芪多糖药粉研匀，制丸，每丸3克，用蜡皮封固。口腹，一次一丸，一日1～2次，小儿可酌情减量。

一种治疗及预防胰岛素抵抗及其相关疾病包括糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等的黄芪多糖胶囊制备方法：取黄芪多糖药粉0.3～0.6克(每粒填充量)，1号软胶壳按以下配比制备：明胶∶阿拉伯胶∶甘油∶整馏水＝10∶1∶10.4∶16.7，装入黄芪多糖药粉包装成形。口腹，一次2粒片，一日2～3次，小儿可酌情减量。

本发明将APS应用于治疗五种不同的动物模型包括：四氧嘧啶(alloxan)诱导的1型糖尿病(大鼠)模型、高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素复制的胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠模型、高糖连续输注的胰岛素抵抗大鼠模型、遗传性肥胖型2型糖尿病小鼠(KKAy)模型、高脂喂养诱导的胰岛素抵抗小鼠动物模型中均显示出良好的减轻肥胖程度，降低体重，降低血糖，降低胰岛素抵抗指数，改善糖耐量异常，改善高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性的作用。可作为胰岛素增敏剂使用。

通过提取和制备的黄芪多糖在下述疾病中的应用：

1.黄芪多糖作为制备治疗四氧嘧啶(alloxan)诱导的1型糖尿病(大鼠)的药中的应用

选取SD大鼠30只，雌雄不限，体重221.4±16.98g，随机分为三组，每组10只：(1)正常对照组(control)(2)糖尿病组(DM)，alloxan 200mg/kg腹腔注射，注射后72h，预测血糖在11.1mmoll以上者为造模成功。每日腹腔注射生理盐水。(3)黄芪多糖治疗组(APS)，经alloxan造模成功后，每日腹腔注射APS注射液400mg/kg，连续五周。以上三组每日均给予高糖高脂饮食。观测大鼠的精神、毛发、活动、体重、饮食等。分别于治疗2周后、5周取尾静脉血，用one touch II血糖分析仪测定血糖。糖尿病大鼠出现毛发干枯、杂乱、脱落、倦卧活动减少，食量减少，大便稀溏等。给予APS治疗后，大鼠精神好转，毛发光整、有色泽，活动增多，食量增加。APS+DM组血糖明显低于DM组，2.黄芪多糖作为制备治疗2型糖尿病及减轻肥胖的药中(大鼠)的应用

高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素处理10周龄SD大鼠复制胰岛素抵抗和II型糖尿病模型；给予高脂饮食(high-fat diet，HFD)(41％脂肪，41％碳水化合物和18％蛋白质)。链脲佐菌素(STZ)(30mg/kg，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH4.5)或等体积的柠檬酸缓冲盐溶液。注射后动物自由进食、进水并维持高脂饮食。STZ注射72小时后，测动物空腹血糖，大于6.7mmol/L者可诊断为糖尿病。APS治疗能显著降低HFD/STZ糖尿病鼠体重(P＜0.01)，而对正常大鼠无影响。APS(400mg/kg/d po)治疗5周后，TIIDM大鼠的空腹和餐后血糖明显下降(P＜0.05)，并不影响TIIDM和正常对照鼠的血胰岛素水平。可明显提高TIIDM大鼠减弱的胰岛素敏感性。而且模型组空腹和餐后血糖以及体重都明显高于两个对照组，当用黄芪多糖治疗组血糖明显降低而且体重恢复正常，两对照组各项指标无明显差异。

3.黄芪多糖作为制备预防胰岛素抵抗的高糖连续输注(大鼠)的药中应用

采用葡萄糖输注大鼠模型动态地观察胰岛素状态向糖尿病状态的转变。在本模型中，持续的全身葡萄糖超负荷导致胰岛素抵抗(正常血糖/高胰岛素血症，normoglycemia/hyperinsulinemia)，然后导致TIIDM状态(高血糖/正常胰岛素，hyperglycemia/normoinsulinemia)。本模型模拟了营养超负荷患者的病理生化情况和随后的由于脂肪和骨骼肌组织脂质蓄积增加而导致的胰岛素抵抗。持续输注葡萄糖(GI)10天导致一过性高血糖和持续的高胰岛素血症。在第10天，GI鼠血糖浓度较对照组稍高，但没有统计学意义。GI到第15天，增加的血胰岛素浓度恢复到正常，而血糖浓度增加。因此在本模型中，大鼠在第10天前发展为胰岛素抵抗，到第15天时为II型糖尿病。

4.黄芪多糖作为制备治疗糖尿病及由其引起的心脏病、脂肪性肝病、肾病和治疗肥胖的药中的应用

雌性KKay小鼠和C57BL/6J小鼠各22只均购自中国医学科学院动物中心，鼠龄8周，饲养于武汉大学P3动物中心标准饲养房(设施环境合格证号：No.SCXK 2003-0003)，室温20℃，相对湿度50％～80％，每日光照12h，自由摄食、饮水，每周监测体重。KKAy鼠投予标准高脂颗粒饲料(由中科院提供)，C57BL/6J鼠投予普通小鼠饲料。于第12周末测定尾静脉血糖，随机血糖大于13.9mmol/L者诊断为糖尿病。给予APS灌胃(700mg/kg/day)治疗8周后，结果显示黄芪多糖可降低糖尿病小鼠血糖水平，改善其糖耐量，提高其胰岛素敏感性，降低其胰岛素抵抗指数，减少其内脏脂肪含量，减轻糖尿病小鼠肝脏脂肪变性及纤维增生，KKAy组肝脂肪变性、胶原沉积、胞浆疏松、可见部分血管病变；KKAy+APS组各种病变均较轻，而对正常对照组小鼠无影响。肾脏病理损伤改变：KKAy组肾小球纤维化，肾小球基底膜增厚系膜基质增生，肾小管中可见蛋白管型，肾小球出球和入球小动脉壁玻璃样变性，KKAy+APS组各种病变均较轻，而对正常对照组小鼠无影响。

对遗传性糖尿病小鼠(KKAy)，APS治疗能减轻心肌超微结构损伤，使线粒体结构恢复正常肌纤维排列整齐。

5.黄芪多糖作为制备治疗或预防胰岛素抵抗引起的肝脏病理损伤药中的应用

选取C57BL/6J小鼠40只，随机分为4组。证实APS的胰岛素增敏作用和降糖的效果。

上述动物经分别设正常对照组、APS正常对照组、胰岛素抵抗组(IR)和黄芪多糖(APS)治疗组，APS口服或腹腔注射治疗5～8周后采血检测血糖、血脂、血胰岛素、糖耐量以及胰岛素抵抗指数。并检测肌肉和肝脏变化。本实验成功的建立了高脂喂养诱导的胰岛素抵抗动物模型，具有肥胖，高胰岛素，低胰岛素敏感性特点的实验性胰岛素抵抗小鼠，其空腹血糖处于正常范围。在给予高脂饮食同时，给予APS治疗，12周后，显示APS具有较好的降低肥胖程度，改善高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性的作用。同时我们观察APS对肝脏及肾脏病理改变的保护作用，发现胰岛素抵抗组：肝脂肪变性、胞浆疏松；胰岛素抵抗黄芪多糖预处理组：各种病变均明显减轻。

6.黄芪多糖作为制备治疗糖尿病引起的心血管病变药中的应用

30只SD大鼠随机分成正常对照组、四氧嘧啶糖尿病组与糖尿病黄芪多糖(APS)治疗组(黄芪多糖400mg/kg/d腹腔注射)，5周后应用形态定量的方法比较各组的心肌病理检查结果。

心肌取自左心室前壁中部，福尔马林固定，常规石蜡包理，切片作HE及PASM染色，并作Luminin及胶原IV染色，备测心肌毛细血管基底膜厚度。应用计算机图像分析仪，在200倍光镜下计数毛细血管断面，计算平均毛细血管密度，毛细血管基底膜厚度，毛细血管与肌纤维数计数比率。本研究结果证实，APS能减轻alloxan导致的糖尿病大鼠内皮细胞损伤。

本发明与现有的口服降糖药相比，具有以下优点和效果：

1、采用了优化水煎提取工艺，同时略作改进从膜荚黄芪药材中提取了所需的具有药理作用的黄芪多糖有效成分。一方面提高药物纯度使药物更易吸收，另外减少杂质对药理作用发挥的干扰，增进了药物的疗效。

2、本发明提取工艺简单，成熟，成本适中、药物疗效保证、易于吸收、易于工业生产。

3、本发明取材为传统中草药，药材分布广泛，资源丰富极有开发价值。

4、本发明采用黄芪多糖治疗五种不同的胰岛素抵抗动物模型，均显示出良好的减轻肥胖程度，降低体重，降低血糖，降低胰岛素抵抗指数，改善糖耐量异常，改善高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性的作用。尤其是对胰岛素抵抗阶段的作用更为显著。其疗效显著，机理确凿、重复性好，无毒、副作用，可作为胰岛素增敏剂使用。

5、药理研究表明，本发明对胰岛素抵抗，糖尿病的慢性并发症(含糖尿病心脏病变、肝脏病变、肾脏病变以及糖尿病视网膜病变)均有良好的预防和治疗作用，标本兼治，防患于未然。

6、通过大量动物实验结果显示本发明安全、天然无毒。这一点是目前临床上各类胰岛素增敏剂所望尘莫及的，因此大有研究及市场开发前景。

                          附图说明

图1.APS对T2DM大鼠胰岛素敏感性的影响.T2DM大叔的胰岛素敏感性显著低于正常组，APS治疗可明显改善T2DM大鼠减弱的胰岛素敏感性。bP＜0.05vs control；eP＜0.05vs TIIDM group

图2A遗传性糖尿病小鼠治疗前后体型比较(左治疗后KKAY+APS，右未治疗KKAY)KKAy组小鼠毛发枯黄、杂乱、倦卧、活动减少、大便稀清、体重明显高于其它各组(p＜0.01)。与KKAy相比，KKAy+APS组小鼠精神较好，毛发光洁，爱活动，多饮、多食、多尿症状明显改善，体重及内脏脂肪及肝指数明显降低(p＜0.01)。图2B饮食诱导的胰岛素抵抗C57BL/6小鼠给药前后体形的比较(左治疗后C57BL/6J+APS，右未治疗C57BL/6J)，同样是高热量饮食，APS预处理小鼠后，给药组体形未出现肥胖，且与正常对照组相比体重无明显增加(P＞0.05)，而未治疗组与正常组和APS治疗组相比体重都有明显增加(P＜0.05)，动物出现肥胖体态。

图3APS对GLUT4转位的影响图中显示糖尿病黄芪多糖治疗组(KKAY+APS)，两个正常对照组(control)和(control+APS)在胰岛素刺激以后胞膜中GLUT4明显多于无胰岛素刺激时即基础状态下胞膜中该蛋白的表达，但是糖尿病组(KKAY)胰岛素刺激前后胞模中GLUT4表达无无明显改变。，^*P＜0.05vs Basic statement of each group

图4Western Blotting检测肝糖原合成酶活性( x±s)用磷酸化糖原合成酶pser641-GS表达量来间接反映酶活性的改变，即各组P-GS/GAPDH的表达量的差异，并以C57BL/6J组作为100％。由图5可见：p-GS(无活性形式)KK组、K+A组均较C组表达增强(p＜0.01)C+A组与C组无统计学差异(P＞0.05)，而KK组蛋白又较K+A组表达强(p＜0.01)。★：p＜0.01 vs C57BL/6J gloup；★：p＜0.01 vs KKAy gloup)

图5各组骨骼肌PTP1B活性正常对照组(Control)，黄芪多糖对照组(Control+APS)以及KKAY黄芪多糖(KKAY+APS)治疗组在给予胰岛素刺激后胞膜GLUT4的含量明显高于基础状态(P＜0.01)，而KKAY组则无明显改变。cP＜0.05 vs control；eP＜0.05 vs TIIDM group。

图6肝脏Masson染色组织切片：蓝色示胶原纤维，核染成暗蓝色，胞浆为红色(200×)

左图示KKAy组：肝脂肪变性、胶原沉积、胞浆疏松、可见部分血管病变；右图示KKAy+APS组：各种病变均较轻

图7肝脏HE染色组织切片(200×)：左图示胰岛素抵抗组：肝脂肪变性、胞浆疏松；右图示胰岛素抵抗黄芪多糖预处理组：各种病变均明显较轻。

                          具体实施方式

(-)按下述方法提取黄芪多糖粉末：

1.提取：采用优化水煎提取工艺并略作改进提取黄芪多糖。取黄芪药材，切成约0.5cm厚的饮片，80℃烘干，粉碎。加8倍水，煮2h，过滤；残渣加6倍量水，煮沸1h，过滤；残渣再加4倍量水，煮沸0.5h，过滤，合并三次滤液，浓缩到1∶1。Sevag法去蛋白，即在滤液中加入氯仿-戊醇5∶1混和物剧烈振摇10min，反复10次。蒸馏水透析24h。加3倍量无水乙醇，搅拌，放置12h，离心，将沉淀蒸干。再加水溶解，加入3倍量乙醇，沉淀离心，蒸干，即得黄褐色粗多糖，称重，与取药材量相比，即得收率。

2.纯化：Sephadex G-150柱层析：称取15克Sephadex G-150，用200ml蒸馏水室温处理8小时，使之充分溶胀。湿法装于72×2.7cm层析柱中。将1克黄芪多糖粗品溶于0.1mol/L NaCl溶液中，加到层析柱上，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min。每管2ml，硫酸-苯酚法隔管检测，合并单一峰，冷冻干燥，得黄芪多糖精品。

3.多糖含量测定：

(1)标准溶液配制：标准葡萄糖溶液配制：取干燥至恒重的葡萄糖100mg，定容到100ml；

(2)苯酚液的配制：取苯酚100克，加铝片100mg与碳酸氢钠50mg，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分10克，加水150ml，置于棕色瓶中。

(3)标准曲线制作：精密吸取标准葡萄糖0、10、20、40、60、80、100微升，分置于具塞试管，各加蒸馏水至2ml，再各加苯酚溶液1ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5ml，摇匀放置5分钟，置沸水浴加热15分钟，取出冷却到室温，于490nm处测定吸收度，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取50mg多糖样品，定容到100ml，取50μl按标准曲线的测定方法测定吸收度。根据标准曲线求出多糖的含量。

APS的收率为2.0％，总多糖含量为38.5％。提取的APS为淡褐色可溶于水的粉末。使用前用蒸馏水新鲜配置成20g/L的溶液。

(二)按下述方法制备成不同剂型：

黄芪多糖片剂的制备：按重量配比为(单位克)分别称取黄芪多糖粉末30、十二烷基硫酸钠(冲成浆状)45～50每10万片、12％羧甲基淀粉(冲成浆状)、硬酯酸镁3000每10万片

具体制备方法：将黄芪多糖粉末与十二烷基硫酸钠和羧甲基淀粉混合搅拌均匀制成软材，湿润剂亦可用50％的乙醇，过筛，干燥(温度90℃左右)，最后加入硬酯酸镁混匀，压片，片重约0.6克。

黄芪多糖散剂的制备：按重量配比(单位克)称取黄芪多糖纷末1.0、木糖0.1、羧甲基淀粉0.8、阿拉伯胶0.2、蛋白Q.S.、3.5％单硬酯酸甘油酯Q.S.

具体制备方法：黄芪多糖粉末与木糖、羧甲基淀粉、阿拉伯胶、蛋白混合并通过二号筛制成颗粒并于60℃以下干燥后经3.5％单硬酯酸甘油酯处理后制成散剂并称定重量。

黄芪多糖蜡丸剂的制备：按重量配比为(单位克)称取黄芪多糖纷末120～160、米蜡15～20

具体制备方法：取黄芪多糖药粉120～160克，另取米蜡15～20克加热熔化后与黄芪多糖药粉研匀，制丸，每丸3克，用蜡皮封固。

黄芪多糖胶囊制备方法：取黄芪多糖药粉0.3～0.6克(每粒填充量)，1号软胶壳按以下配比制备：明胶∶阿拉伯胶∶甘油∶整馏水＝10∶1∶10.4∶16.7，装入黄芪多糖药粉包装成形。

(三)黄芪多糖在五种胰岛素抵抗动物模型中治疗或预防胰岛素抵抗及其相关疾病包括糖尿病、肥胖症、糖尿病血管病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病以及冠状动脉病变等中的应用

实施例1黄芪多糖作为制备治疗APS对四氧嘧啶(alloxan)诱导的1型糖尿病大鼠药中的应用

SD大鼠30只，雌雄不限，体重221.4±16.98g，随机分为三组，每组10只：(1)正常对照组(control)(2)糖尿病组(DM)，alloxan 200mg/kg腹腔注射，注射后72h，预测血糖在11.1mmoll以上者为造模成功。每日腹腔注射生理盐水。(3)黄芪多糖治疗组(APS)，经alloxan造模成功后，每日腹腔注射APS注射液400mg/kg，连续五周。以上三组每日均给予高糖高脂饮食。

观测大鼠的精神、毛发、活动、体重、饮食等。分别于治疗2周后、5周取尾静脉血，用one touch II血糖分析仪测定血糖，

糖尿病大鼠出现毛发干枯、杂乱、脱落、倦卧活动减少，食量减少，大便稀溏等。给予APS治疗后，大鼠精神好转，毛发光整、有色泽，活动增多，食量增加。APS+DM组血糖明显低于DM组，结果见表1。

      表1 各组血糖水平的比较(mmol/L)( x±s)

Group	n	2周末	5周末
				ControlDMAPS	101010	5.14±0.8025.82±6.49*14.78±7.10#	4.86±1.0317.89±8.37*6.77±3.64#

^*P＜0.01 vs Control group；#P＜0.01 vs DM group

实施例2黄芪多糖作为制备治疗APS对高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导胰岛素抵抗和2型糖尿病药中(模型)及作为减肥的药物的应用

高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素处理10周龄SD大鼠复制胰岛素抵抗和II型糖尿病模型；给予高脂饮食(high-fat diet，HFD)(41％脂肪，41％碳水化合物和18％蛋白质)。链脲佐菌素(STZ)(30mg/kg，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH4.5)或等体积的柠檬酸缓冲盐溶液。注射后动物自由进食、进水并维持高脂饮食。STZ注射72小时后，测动物空腹血糖，大于6.7mmol/L者可诊断为糖尿病。APS治疗能显著降低HFD/STZ糖尿病鼠体重(P＜0.01)，而对正常大鼠无影响。APS(400mg/kg/d po)治疗5周后，T2DM大鼠的空腹和餐后血糖明显下降(P＜0.05)，并不影响T2DM和正常对照鼠的血胰岛素水平。可明显提高T2DM大鼠减弱的胰岛素敏感性。而且模型组空腹和餐后血糖以及体重都明显高于两个对照组，当用黄芪多糖治疗组血糖明显降低而且体重恢复正常，两对照组各项指标无明显差异。结果见表2和图1。

                            表2 实验动物血糖、血胰岛素、体重

	对照组	对照组+APS	T2DM	T2DM+APS
					空腹血糖(mmol/L)餐后血糖(mmol/L)胰岛素(pmol/L)体重(g)	4.3±0.26.6±0.5162±13200±2	4.1±0.26.2±0.3168±15202±2	10.3±0.8*15.6±1.2*178±20220±5b	6.8±0.5e9.8±0.7e171±18205±3e

^*P＜0.05 vs control group，eP＜0.05 vs TIIDM group

实施例3黄芪多糖作为制备治疗APS对高糖连续输注大鼠模型药中的应用

采用葡萄糖输注大鼠模型]动态地观察胰岛素状态向糖尿病状态的转变。在本模型中，持续的全身葡萄糖超负荷导致胰岛素抵抗(正常血糖/高胰岛素血症，normoglycemia/hyperinsulinemia)，然后导致T II DM状态(高血糖/正常胰岛素，hyperglycemia/normoinsulinemia)。本模型模拟了营养超负荷患者的病理生化情况和随后的由于脂肪和骨骼肌组织脂质蓄积增加而导致的胰岛素抵抗。

持续输注葡萄糖(GI)10天导致一过性高血糖和持续的高胰岛素血症。在第10天，GI鼠血糖浓度较对照组稍高，但没有统计学意义。GI到第15天，增加的血胰岛素浓度恢复到正常，而血糖浓度增加。因此在本模型中，大鼠在第10天前发展为胰岛素抵抗，到第15天时为II型糖尿病。结果见表3。

            表3 APS对高糖连续输注大鼠模型不同时间点血糖水平的影响

Parameter	Controls(C，saline)vs.GR(glucose)	Day 0	Day 1	Day 2	Day 5	Day 10	Day 15
								Glucose(mM)IRI	CC+APSGRGR+APSC	7.4±0.26.9±0.58.6±0.78.0±0.641±2	8.1±0.17.9±0.326.6±2.1*26.3±1.945±3	6.3±0.096.8±0.220.8±1.6*19.9±1.239±1	6.8±0.57.5±0.48.2±0.68.4±0.648±4	8.3±0.47.8±0.510.3±1.79.8±1.542±2	6.7±0.66.8±0.513.8±1.2*8.9±0.8#37±2

(μU/mL)

C+APSGRGR+APS

38±244±340±2

43±4907±45**900±44

40±2590±16**578±14

44±3229±13**234±14

39±3102±10*100±10

42±452±650±5

C，control rats；GR，rats with glucose infusion；IRI，immunoreactiye insulin.Datarepresenting results of six independent experiments are expressed asmeans±SEM.^*p＜0.05；^**p＜0.01GRvscorrespionding control rats；#p＜0.05vscorresponding un-treated groups.

实施例4黄芪多糖作为制备治疗APS对遗传性糖尿病小鼠(KKAY)模型胰岛素抵抗的改善及糖尿病肝病药中的应用

雌性KKay小鼠和C57BL/6J小鼠各22只均购自中国医学科学院动物中心，鼠龄8周，饲养于武汉大学P3动物中心标准饲养房(设施环境合格证号：No.SCXK 2003-0003)，室温20℃，相对湿度50％～80％，每日光照12h，自由摄食、饮水，每周监测体重。KKAy鼠投予标准高脂颗粒饲料(由中科院提供)，C57BL/6J鼠投予普通小鼠饲料。

于第12周末测定尾静脉血糖，随机血糖大于13.9mmol/L者诊断为糖尿病。

给予APS灌胃(700mg/kg/day)治疗8周后，结果显示黄芪多糖可降低糖尿病小鼠血糖水平，改善其糖耐量，提高其胰岛素敏感性，降低其胰岛素抵抗指数，减少其内脏脂肪含量，减轻糖尿病小鼠肝脏脂肪变性及纤维增生，而对正常对照组小鼠无影响。见表4、5、6，图2和图6。

表4：各组动物体重，肝重，内脏脂肪含量，肝指数，肝糖元含量( x±s，n＝8～

                                 10)

		KK组	K+A组	C组	C+A组
						体重(g)内脏脂肪(g)肝重(g)肝指数(％)	用药前用药后用药后用药后用药后	40.38±0.944*49.50±1.400*5.72±0.251*3.710±1.404*8.690±1.676*	39.930±0.571*41.063±0.863*4.683±0.164*#1.950±0.991*#4.990±1.937#	20.400±0.29021.150±0.1500.561±0.0740.900±0.0944.610±0.723	19.950±0.17420.950±0.1380.640±0.0950.960±0.0984.650±0.550

^*P＜0.01 vs C57BL/6J组：#P＜0.01 VS KKAy组

表5各组动物随机血糖、空腹胰岛素、HomaIR分数( x±s，n＝8-10)

		KK组	K+A组	C组	C+A组
						随机血糖(mmol/l)空腹胰岛素(uU/mi)HomaIR分数	刚药前用约后用药前用药后用药前用药后	26.53±0.85*#33.13±2.07*#33.00±1.10*28.20±1.10*11.87±0.32*15.50±0.45*#	26.08±1.44*15.94±2.14*31.00±1.20*26.10±1.30*10.76±0.7l*9.97±0.54*	7.42±0.207.21±0.255.70±0.406.10±0.501.29±0.211.38±0.36	7.31±0.426.80±0.136.00±0.505.80±0.701.36±0.251.47±0.25

^*P＜0.01 vs C57BL/6J组；#P＜0.01 vs KKAy+APS组

表6不同周龄的KKAy与C57BL/6J小鼠口服糖耐量试验的比较(单位mmol/L)

Group	Age(week)	0min	30min	60min	120min
						C57BL/6J组(n＝10)C57BL/6J+APS组(n＝10)KKAy组(n＝8)KKAy+APS组(n＝8)	1220122012201220	5.12±0.305.45±0.185.10±0.555.68±0.408.24±0.42#12.42±0.92#7.81±0.42#8.60±0.84*	12.66±0.6012.88±0.5812.03±0.4913.23±1.1922.19±1.24#40.22±1.17#22.88±1.17#31.84±1.05*	7.68±0.386.83±0.267.43±0.357.30±0.6522.84±1.20#30.34±1.09#21.80±1.69#17.23±1.96*	5.81±0.306.53±0.285.63±0.226.20±0.4510.09±0.88#16.04±1.72#12.83±0.61#9.71±1.42*

#P＜0.01 compared with group C57BL/6J and group C57BL/6J+APS at the sameage，^*P＜0.01 compared with group KKAy at the same age

实施例5黄芪多糖作为制备治疗APS胰岛素抵抗小鼠模型(C57BL/6J小鼠)药中的应用

选取C57BL/6J小鼠40只，随机分为4组。证实APS的胰岛素增敏作用和降糖的效果。

上述动物经分别设正常对照组、APS正常对照组、胰岛素抵抗组(IR)和黄芪多糖(APS)治疗组，APS口服灌胃(700mg/kg/day)治疗12周后采血检测血糖、血脂、血胰岛素、糖耐量以及胰岛素抵抗指数。并检测肌肉和肝脏变化。本实验成功的建立了高脂喂养诱导的胰岛素抵抗动物模型，具有肥胖，高胰岛素，低胰岛素敏感性特点的实验性胰岛素抵抗小鼠，其空腹血糖处于正常范围。在给予高脂饮食同时，给予APS治疗，12周后，显示APS具有较好的降低肥胖程度，改善高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性的作用。结果见表7，图7。

表7各组小鼠体重、空腹血糖和空腹胰岛素水平及KITT结果

Data are exvressed as the mean±S.E.M.，n indicates the number of animals studied.APS：astragalus polysaccharide.^*Significantly different from control group(P＜0.05)；

Signficantlydifferent from IR group (P＜0.0v5)

本发明将APS应用于五种不同的胰岛素抵抗动物模型，均显示出良好的减轻肥胖程度，降低体重，降低血糖，降低胰岛素抵抗指数，改善糖耐量异常，改善高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性的作用。可作为胰岛素增敏剂使用。

实施例6黄芪多糖作为制备治疗对糖尿病心血管病变药中的应用

30只SD大鼠随机分成正常对照组、四氧嘧啶糖尿病组与糖尿病黄芪多糖(APS)治疗组(黄芪多糖400mg/kg/d腹腔注射)，5周后应用形态定量的方法比较各组的心肌病理检查结果。

心肌取自左心室前壁中部，福尔马林固定，常规石蜡包理，切片作HE及PASM染色，并作Luminin及胶原IV染色，备测心肌毛细血管基底膜厚度。应用计算机图像分析仪，在200倍光镜下计数毛细血管断面，计算平均毛细血管密度，毛细血管基底膜厚度，毛细血管与肌纤维数计数比率。

表3 各组心肌病理改变的比较(x±s)

组别	肌纤维数	毛细血管数	毛细血管数/肌纤维数	毛细血管直径(μm)	基底膜厚度(μm)
						ControlDMAPS	8.74±0.459.11±0.509.09±0.57	8.90±1.662.10±1.20*5.10±1.66#	0.90±0.060.17±0.03*0.72±0.13#	3.17±0.533.09±0.373.27±0.56	0.45±0.161.05±0.31*0.54±0.13#

^*P＜0.01与control组比较；#P＜0.01与DM组比较。

本研究结果证实，APS能减轻alloxan导致的糖尿病大鼠内皮细胞损伤。

对遗传性糖尿病小鼠(KKAy)，APS治疗能减轻心肌超微结构损伤，使线粒体结构恢复正常肌纤维排列整齐。

(四)APS治疗作用机理的实验研究(潜在的分子靶点)

实施例7APS增加遗传性糖尿病小鼠骨骼肌细胞GLUT4蛋白表达和转位

雌性KKay小鼠和C57BL/6J小鼠各22只均购自中国医学科学院动物中心，鼠龄8周，饲养于武汉大学P3动物中心标准饲养房(设施环境合格证号：No.SCXK 2003-0003)，室温20℃，相对湿度50％～80％，每日光照12h，自由摄食、饮水，每周监测体重。KKAy鼠投予标准高脂颗粒饲料(由中科院提供)，C57BL/6J鼠投予普通小鼠饲料。于第12周末测定尾静脉血糖，随机血糖大于13.9mmol/L者诊断为糖尿病。给予APS灌胃(700mg/kg/day)治疗8周后，结果显示黄芪多糖可降低糖尿病小鼠血糖水平，改善其糖耐量，提高其胰岛素敏感性，降低其胰岛素抵抗指数，其分子机理与显著增加胰岛素刺激后GLUT 4由胞浆向质膜转位有关，结果见图3。

实施例8APS增加遗传性糖尿病小鼠肝糖原酶活性，增加肝糖原合成

雌性KKay小鼠和C57BL/6J小鼠各22只均购自中国医学科学院动物中心，鼠龄8周，饲养于武汉大学P3动物中心标准饲养房(设施环境合格证号：No.SCXK 2003-0003)，室温20℃，相对湿度50％～80％，每日光照12h，自由摄食、饮水，每周监测体重。KKAy鼠投予标准高脂颗粒饲料(由中科院提供)，C57BL/6J鼠投予普通小鼠饲料。于第12周末测定尾静脉血糖，随机血糖大于13.9mmol/L者诊断为糖尿病。给予APS灌胃(700mg/kg/day)治疗8周后，结果显示黄芪多糖可降低糖尿病小鼠血糖水平，改善其糖耐量，提高其胰岛素敏感性，降低其胰岛素抵抗指数，，增加KKAy小鼠肝糖原的合成，其机理与明显增加肝糖原酶活性有关。结果见图4。

实施例9APS抑制高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导胰岛素抵抗和2型糖尿病模型骨骼肌PTP1B活性

高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素处理10周龄SD大鼠复制胰岛素抵抗和2型糖尿病模型；给予高脂饮食(high-fat diet，HFD)(41％脂肪，41％碳水化合物和18％蛋白质)。链脲佐菌素(STZ)(30mg/kg，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH4.5)或等体积的柠檬酸缓冲盐溶液。注射后动物自由进食、进水并维持高脂饮食。STZ注射72小时后，测动物空腹血糖，大于6.7mmol/L者可诊断为糖尿病。APS治疗能显著降低HFD/STZ糖尿病鼠体重(P＜0.01)，而对正常大鼠无影响。APS(400mg/kg/d po)治疗5周后，T2DM大鼠的空腹和餐后血糖明显下降(P＜0.05)，并不影响T2DM和正常对照鼠的血胰岛素水平。可明显提高T2DM大鼠减弱的胰岛素敏感性。而且模型组空腹和餐后血糖以及体重都明显高于两个对照组，当用黄芪多糖治疗组血糖明显降低而且体重恢复正常，两对照组各项指标无明显差异。在胰岛素信号转导通路上，试验发现T2DM大叔骨骼肌PTP1B的蛋白表达水平显著高于(1.6倍，P＜0.05)正常对照组。APS治疗后，T2DM大鼠骨骼肌PTP1B的蛋白表达水平下降30％(P＜0.05)结果见图5。

Claims (11)

1、一种黄芪多糖在治疗或预防胰岛素抵抗的药中应用。

2、黄芪多糖在制备治疗1型四氧嘧啶诱导糖尿病的药中应用。

3、黄芪多糖在制备治疗2型糖尿病的药中应用。

4、黄芪多糖在制备治疗或预防胰岛素抵抗的高糖连续输注的药中应用。

5、黄芪多糖在制备治疗糖尿病的药中应用。

6、黄芪多糖在制备治疗糖尿病引起心脏病的药中应用。

7、黄芪多糖在制备治疗糖尿病脂肪性肝病的药中应用。

8、黄芪多糖在制备治疗糖尿病引起肾病的药中应用。

9、黄芪多糖在制备治疗肥胖症的药中的应用。

10、黄芪多糖在制备治疗或预防胰钪素抵抗引起的肝脏病理损伤的药中应用。

11、黄芪多糖在制备治疗心血管病变的药中应用。

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