CN1539515A - 一种防术后粘连的生物材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种防术后粘连的生物材料及其制备方法，涉及一种生物材料及其制备。本发明以壳聚糖和透明质酸钠为主要原料，分别配成一定浓度的溶液并按一定的体积比混合；然后将混合溶液脱去气泡，装入模具中冻干，制成薄膜状或管状；再用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇的混合液浸泡；用蒸馏水冲洗净，再凉干或冻干、消毒后备用。在上述制备过程中还可复合曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖等防粘连药物。该方法制备工艺简单，所有原料廉价易得；所制备的防粘连材料不仅具有较强的粘附性、机械强度以及抗菌性，而且具有良好的生物相容性、止血活性和促进组织修复的生物活性，且使用方便，在体内存留时间较长。

Description

一种防术后粘连的生物材料及其制备方法

技术领域

本发明所涉及一种生物材料及其制备方法，尤其涉及利用壳聚糖/透明质酸钠制备的防术后粘连用的生物材料材料的制备，属于生物医学技术领域。

背景技术

术后粘连是一种非常普遍的手术后并发症，它是指手术后出现的结缔组织纤维带与相邻的组织或器官结合在一起的异常结构。粘连的程度可以从一片纤细的薄膜到稠密的具血管疤痕的组织。严重者常导致肠梗阻、不育症、慢性盆腔疼痛等，增加了再次手术的困难及进一步发生并发症的潜在性。造成粘连的原因可归结为①手术创伤；②局部缺血；③异物存留；④出血和暴露伤口表面；⑤细菌感染等。目前，常用的减少粘连的方法有两种：1)直接灌注各种物质，如林格溶液(Ringer’s solution)、肝素钠、右旋糖苷70、可的松、抗生素和酶等，以减少或抑制纤维结缔组织的形成，但全身给药缺乏有效的药物载体，不能达到粘连部位，腹膜的快速吸收限制了药物的半衰期。2)使用隔离物，在创伤组织之间提供机械屏障[Pijfman BM，Dorr PJ，Brommer EJP，et al.Prevention of adhesions：review.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1994，53：155～163]，如膨化聚四氟乙烯(Gore-Tex)[Dizerega GS.Contemporary adhesionprevention.Fertil Steril，199461：219-235]和氧化再生纤维素(Interceed TC7)[Shimanuki T，Nishimura K，Montz FJ，et al.Localized prevention of postsurgieal adhesion formation andreformation with oxidized regenerated celllose.Biomed Mater Res，1987，21：173-185]。这些隔离物虽有一定的效果，却存在明显的缺陷。其中Gore-Tex膜需要缝合才能固定在组织部位上，在体内不能降解，需要二次手术去除。Interceed TC7则必须在完全止血的情况下才能使用，而且吸收快，体内存留时间短，尚未获得临床的普遍认可。理想的防粘连膜应具备良好的生物相容性、自动粘附性、可降解吸收性、足够的体内存留时间、促进伤口愈合并将纤维组织增生降至最低程度等特性。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又叫玻璃酸，是一种广泛存在于动物组织细胞间质中的一种粘多糖。30多年前，Rydell就报道了在伤口愈合期间局部给予透明质酸可有效地防止过度的纤维变性反应[Rydell NW.Decreased granulation tissue reaction after installation ofhyaluronic acid.Acta Orthop，Scand，1970，11：307-311]。但是，天然的透明质酸由于在植入部位存留时间较短，其预防粘连作用不能达到理想的效果。后来，Weiss等人将交联的不溶性透明质酸凝胶，应用于临床，并取得了一定的效果[Weiss C，Levy H，Denlinger IL，et al.The roleof Na-hylan in reducing postsurgical tendon adhesion.Part 1.Bull Hosp Jt Dis Orthop Inst，1987，46：9-15；Balazs EA，Leshchiner EA.Hyluronan，its cross-linked derivative-hylan and theirmedical applications.In：Inagaki H，Phillips GO，eds.In cellulosics utilization：research andrewards in cellulossics.New York：ElsevierAppl Science，1989.233～241]。最早以透明质酸为主要成分上市的隔离剂是Genzyme公司生产的，该制剂是以细菌发酵法制备的透明质酸和羧甲基纤维素钠(CMC)结合在一起的一种透明质酸-CMC膜，容易水合并溶解于水溶性介质中，对有些部位的粘连有明显的抑制作用[Burns JW，Colt MJ，Burgess LS，et al.Preclinicalevaluation of Seprafilm bioresorbable membrane.Eur J Surg，1997，577(Suppl)：40-48]。最近，Biomatrix公司开发了利用矫形外科的透明质酸防粘连制剂。在预防腹腔、心血管和盆腔手术后粘连中，屏障型物质是最有效的，可以机械隔离受伤部位，防止组织表面之间形成血纤蛋白网状结构。由于透明质酸类产品价格昂贵，在抗菌性能方面还存在明显的不足。进一步研究、开发不同类型的防粘连剂，降低成本，增强疗效，是目前临床研究的热点之一，也必将在医药领域取得巨大的社会和经济效益。

甲壳质(Chitin)是甲壳素和壳聚糖的统称。1811年法国Braconnot(Muzzarelli RAA.Chitin，Pergamen Press Ltd，Oxford，1977)从菌类中提出的一种类似纤维素结构的物质，因其大量存在于低等动物特别是节肢动物(如虾、蟹昆虫等)的甲壳中而得名。是一种维持和保护甲壳动物及微生物躯体的不溶于水、碱和常规溶剂的线性氨基多糖，常与蛋白质以共价键形式结合存在。每年海洋动物源产甲壳素近十亿吨，是一种取之不尽、用之不竭的再生资源。壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的一系列产物，是地球上仅次于纤维素的第二大类多糖。此碱性粘多糖具有独特的分子结构特征、化学性质及生物功能。如良好的生物相容性和生物可降解性，降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，降解过程中产生的中间产物在体内不积累，无免疫源性[姜雪松，王勃生等.生物医学工程学杂志，1996；13(4)：353.]，抗菌、消炎、止血、促进伤口愈合等。近年来，随着研究的深入和广泛，壳聚糖已经被广泛应用于生物医学领域，如透析膜、可吸收缝线、药物释放载体、固定化酶载体等。有些项目已具有生产价值和实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种防术后粘连的生物材料及其制备方法，该方法以廉价易得的壳聚糖为主要原料，且制备工艺简单；所制备的生物材料成本低，与创伤组织的粘附性较好，具有良好的机械强度和优良的抗菌性能，使用方便，便于推广和应用。

本发明的技术方案如下：一种防术后粘连的生物材料，其特征在于该材料可按如下方法制备：

(1)将壳聚糖或羧甲基壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～5％的溶液；将透明质酸钠加入弱酸或去离子水中，配成浓度为0.5～10％的透明质酸钠溶液，使二者充分混和，调节其pH值达到1～4；将上述透明质酸钠的溶液与壳聚糖溶液按体积比为1～10∶200混匀混合；

(2)将所配混合溶液脱去气泡，装入模具中冻干、烘干或凉干，制成薄膜状或管状材料，其中膜厚为0.1～3毫米，管子内径1～50毫米；

(3)用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇的混合液浸泡后冻干、烘干或凉干。也可用蒸馏水冲洗后，再凉干或冻干、消毒后备用。

本发明的技术特征还在于：在所述的步骤(1)中制备的壳聚糖/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠/胶原酸溶液或聚乙二醇、聚乙烯醇水溶液。

本发明的特征还在于：在上述方案的基础上，在步骤(2)冻干前的溶液中或步骤(3)冻干前的样品中加入干重比为0.1～1％的曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖、生物蛋白胶或可的松。

本发明中步骤(1)中的弱酸采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。

本发明提供的一种防术后粘连的生物材料的方法，该方法包括如下步骤：

(a)将壳聚糖或羧甲基壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～5％的溶液；将透明质酸钠加入弱酸或去离子水中，配成浓度为0.5～10％的透明质酸钠溶液，使二者充分混和，调节其pH值达到1～4；将上述透明质酸钠的溶液与壳聚糖溶液按体积比为1～10∶200混匀混合；

(b)将所配混合溶液脱去气泡，装入模具中凉干、烘干或冻干，制成薄膜状或管状，其中膜厚为0.1～3毫米，管子内径为1～50毫米；

(c)用氨水或氨水与乙醇、氨水与丙酮、氨水与甲醇的混合液浸泡后冻干、烘干或凉干。也可用蒸馏水冲洗后，再凉干或冻干、消毒后备用。

本发明的技术特征还在于：在所述的步骤(a)中制备的壳聚糖/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠/胶原酸溶液或聚乙二醇、聚乙烯醇水溶液。

在上述步骤(b)冻干前的溶液中或步骤(c)冻干前的样品中加入干重比为0.1～1％的曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖、生物蛋白胶、可的松或抗生素。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和突出性效果：本发明采用廉价易得的壳聚糖为基本原料，制备工艺简单，成本低；所制备的防粘连材料不仅具较强的粘附性、机械强度以及抗菌性，而且具有良好的生物相容性、止血活性和促进组织修复的生物活性，且使用方便，在体内存留时间较长。既是良好的隔离层，又是良好的给药体系，配合胶原抑止剂曲尼斯特等防粘连药物，能够从根本上解决手术后防粘连的问题。经细胞实验和动物实验表明：该防粘连材料可在体内(包括内脏、血管、骨科手术等)普遍使用，是一种止血、防粘连、促进组织修复的、在体内降解速度可调的多功能材料，在外科手术防粘连中具有广泛的应用价值。

具体实施方式

本发明以壳聚糖或羧甲基壳聚糖为主要原料，将其溶于弱酸中，配成浓度为0.5～5％的溶液；其中弱酸可采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。将透明质酸钠加入弱酸或去离子水中，配成浓度为0.5～10％的透明质酸钠溶液，使二者充分混和，调节其pH值达到1～4；将上述透明质酸钠的溶液与壳聚糖溶液按体积比为1～10∶200混匀混合。

将所配混合溶液脱去气泡(经静止或真空脱泡)后装入模具中凉干、烘干或冻干，制成薄膜状或管状，通过倒入溶液的量来控制形成的薄膜的厚度，(注管状材料的制备：将壳聚糖/透明质酸钠溶液装或注射到由同心管状聚四氟乙烯、玻璃或聚硅酮(硅树脂)制成的环形容器中，然后迅速凉冻，干燥。)，其中膜厚一般为0.1～3毫米，管子内径为1～50毫米。

所用凝固剂氨水的浓度可为1％-80％的范围内，通过氨水的浓度来控制防粘连材料的机械强度。也可用氨水与乙醇、氨水与丙酮、氨水与甲醇的混合液浸泡。

本发明的技术方案还可在制备的壳聚糖/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠/胶原酸溶液或聚乙二醇、聚乙烯醇水溶液。

为了增加所制产品的防粘连效果，在冻干前的溶液中或成型后的薄膜层中加入干重比为0.1～1％的曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液(Ringer’s solution)、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖、生物蛋白胶或可的松。

为了增加该防粘连材料在使用时的粘附性，在该产品使用前，还可用壳聚糖弱酸溶液(用碳酸氢钠调节酸溶液的pH值)、明胶/乳酸与羟基乙酸共聚物(PLGA)/EDC、壳聚糖/PLGA/EDC、羧甲基纤维素水溶液、生物蛋白胶或血清蛋白涂抹海绵层表面以增加海绵的粘附性。

实施例1：

将脱乙酰度为80％、分子量为200000道尔顿的壳聚糖快速(50℃下)溶解在2％的醋酸溶液中，制成浓度为1％壳聚糖溶液；将透明质酸钠加入去离子水中，配成浓度为1％的透明质酸钠溶液。将1M HCl逐滴加入透明质酸钠溶液，同时搅拌，直至pH值达到4；将上述透明质酸钠溶液按1∶20(v/v)比例加入壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀后分装在容器中，凉干或冻干，制成厚为1毫米的薄膜；用20％氨水浸泡5分钟后，再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

实施例2：

将脱乙酰度为90％、分子量为100000道尔顿的羧甲基壳聚糖溶解在2％的醋酸溶液中，制成浓度为1％羧甲基壳聚糖溶液；将透明质酸钠加入去离子水中，配成1％的透明质酸钠溶液。将2M HCl逐滴加入透明质酸钠溶液，同时搅拌，使二者充分混和，直至其pH值达到3；将上述透明质酸钠溶液按1∶50(v/v)比例加入羧甲基壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀后分装在容器中，冻干，制成壁厚为2毫米、内径为20毫米的管状材料(管状材料制备：将羧甲基壳聚糖/透明质酸钠溶液注射到由同心管状聚四氟乙烯制成的环形模具中，然后凉干即得)；用20％氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后然后在所制备的薄膜上加入重量比0.1％的曲尼斯特溶液，再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用时可将管状材料套在断裂的管状组织(如肠子)外围，避免伤口与其它组织接触。

实施例3：

将脱乙酰度为70％、分子量为300000道尔顿的壳聚糖与I型胶原分别溶解在1％的醋酸中，制成浓度为1.5％壳聚糖和1％的胶原的溶液，将壳聚糖和胶原溶液按20∶1(v/v)混合。将透明质酸钠与羧甲基纤维素钠加入去离子水中，配成1％的透明质酸钠与羧甲基纤维素钠的溶液。将透明质酸钠和羧甲基纤维素钠溶液按1∶1(v/v)混合。将1M HCl逐滴加入透明质酸钠/羧甲基纤维素钠溶液，同时搅拌，直至pH值达到2左右；将上述透明质酸/羧甲基纤维素钠溶液按1∶100(v/v)比例加入壳聚糖/胶原溶液，充分搅拌、混匀。再用80％氨水溶液浸泡15分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后加入1％(干重)的右旋糖苷70(右旋糖苷70可先溶于水中)再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。使用中可用少量1％的壳聚糖/氯化钙(重量比为20∶1)醋酸(用碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值到5左右)涂抹壳聚糖/透明质酸钠/羧甲基纤维素钠海绵附着面，以增强防粘连膜的粘附性。

实施例4：

将脱乙酰度为70％、分子量为100000道尔顿的壳聚糖溶解在1％的盐酸中，制成浓度为5％壳聚糖溶液。将透明质酸钠与聚乙二醇分别溶于去离子水，配成10％的透明质酸钠溶液与15％的聚乙二醇水溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙二醇溶液按1∶1(v/v)比例混合，然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右；将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀。分装在容器中，冻干，形成厚为2毫米的海绵层，用25％的氨水浸泡10分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后加入1％的林格溶液，再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用中可用1毫升生物蛋白胶涂抹壳聚糖/透明质酸钠/聚乙二醇附着面，以增强防粘连膜的粘附性。

生物蛋白胶的配制：将1g猪(血)纤维蛋白原37℃下溶于约10mL的蒸馏水中制成溶液A。将5000单位的人的凝血酶溶于由1mL 0.5M氯化钙(CaCI₂)，4mL抑肽酶(5000KIE)及7mL蒸馏水配制成的B溶液中。使用前将相同体积的A液和B液混合均匀，取一定量剂涂抹于出血处或伤口周围，然后贴上海绵。

实施例5：

将0.5％的壳聚糖(脱乙酰度为50％、分子量为300000道尔顿)甲酸溶液与0.5％的透明质酸钠水溶液(用盐酸调至pH为3)，按体积比200∶1混合均匀，分装在容器中，冻干。用氨水/甲醇(9∶1)浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后在所制备的薄膜上加入重量比0.1％的生物蛋白胶溶液，再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

实施例6：

将壳聚糖与透明质酸钠分别溶解在醋酸溶液中制成2％的壳聚糖与2％透明质酸钠溶液，并按体积比(50∶1)，制成浓度为1％的混合液，脱去气泡，分装容器中，冻干，形成5mm厚的海绵层。用氨水/甲醇(7∶3)浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后加入1％的可的松，再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用中在海绵层上涂抹壳聚糖/PLGA/EDC(10∶90∶1)，以增强薄膜的粘附性和防粘连效果。

壳聚糖/PLGA/EDC胶粘剂的配制：将等量的壳聚糖醋酸溶液和PLGA的1，4-二氧六环溶液混合，37℃下预热后加入一定量的EDC的水溶液中即可。使用时将上述液体滴于出血处涂抹开后贴上止血海绵。

实施例7：

将1％的壳聚糖(脱乙酰度为60％，分子量为490000)丙酸溶液分装在容器中，冻干，制成3mm厚的海绵。用氨水/丙酮(9∶1)浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净。然后再加入质量比为1％的透明质酸钠与0.1％的右旋糖苷冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用中壳聚糖/透明质酸钠/曲尼斯特薄膜可用1％的羧甲基纤维素水溶液涂抹创伤面，以增强薄膜的粘附性，避免缝合手术。

实施例8：

将脱乙酰度为70％，分子量为300000的壳聚糖醋酸溶液分装在容器中，制成2mm厚的海绵。将透明质酸钠与聚乙烯醇分别溶于去离子水，配成5％的透明质酸钠溶液与20％的聚乙烯醇溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙烯醇溶液按1∶1(v/v)比例混合，然后逐滴加入1M HCl使其pH降至2左右；将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀，冻干。用30％氨水浸泡2小时后，蒸馏水冲洗干净，加入1％的硫酸右旋糖。然后再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用中壳聚糖海绵可用生物蛋白胶涂抹创伤面，以增强薄膜的粘附性和防粘连效果。

实施例9：

将2％的壳聚糖马来酸(脱乙酰度为50％，分子量40000)溶液中加入1％(v/v)的浓度为2％的透明质酸钠溶液(pH为1)，冻干。用10％的氨水浸泡20分钟后，蒸馏水冲洗干净，再加入1％的硫酸右旋糖，然后再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

使用中壳聚糖海绵可用明胶/PLGA/EDC胶粘剂涂抹创伤面，以增强海绵的粘附性。

明胶/PLGA/EDC胶粘剂的配制：将等量的明胶水溶液和PLGA氯仿溶液混合，37℃下预热后滴于出血处。随即加入少量的EDC的磷酸缓冲液或水溶液，最后贴上防粘连海绵。

实施例10：

将脱乙酰度为85％的分子量为100000道尔顿的4％壳聚糖的盐酸溶液，与1％的透明质酸钠盐酸溶液按体积比为60∶1混合，冻干，制成3mm厚的薄膜。用20％氨水浸泡5分钟后，蒸馏水冲洗干净。加入0.1％的肝素钠再冻干、Co⁶⁰消毒、备用。

Claims (7)

1.一种防术后粘连的生物材料，其特征在于该材料可按如下方法制备：

(1)将壳聚糖或羧甲基壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～5％的溶液；将透明质酸钠加入弱酸或去离子水中，配成浓度为0.5～10％的透明质酸钠溶液，使二者充分混和，调节其pH值达到1～4；将上述透明质酸钠的酸溶液与壳聚糖溶液按体积比为1～10∶200混匀混合；

(2)将所配混合溶液脱去气泡，装入模具中凉干、烘干或冻干，制成薄膜状或管状，其中膜厚为0.1～3毫米，管子内径1～50毫米；

(3)用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇的混合液浸泡后冻干、烘干或凉干。也可用蒸馏水冲洗后，再凉干或冻干、消毒后备用。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述的步骤(1)中制备的壳聚糖/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠/胶原酸溶液或聚乙二醇、聚乙烯醇水溶液。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在上述步骤(2)冻干前的溶液中或步骤(3)冻干前的样品中加入干重比为0.1～1％的曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖、生物蛋白胶或可的松。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的弱酸采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。

5.一种防术后粘连的生物材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)将壳聚糖或羧甲基壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～5％的溶液；将透明质酸钠加入去离子水中，配成0.5～10％的透明质酸钠溶液，将盐酸逐滴加入透明质酸钠溶液中，同时搅拌，使二者充分混和，直至其pH值达到1～4；将上述透明质酸钠的酸溶液与壳聚糖溶液按体积比为1～10∶200混匀混合；

(b)将所配混合溶液脱去气泡，装入模具中凉干、烘干或冻干，制成薄膜状或管状，其中膜厚为0.1～3毫米，管子内径1～50毫米；

(c)用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇的混合液浸泡后冻干、烘干或凉干。也可用蒸馏水冲洗后，再凉干或冻干、消毒后备用。

6.按照权利要求5所述的方法，，其特征在于：在所述的步骤(a)中制备的壳聚糖/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠/胶原酸溶液或聚乙二醇、聚乙烯醇水溶液。

7.按照权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在上述步骤(b)冻干前的溶液中或步骤(c)冻干前的样品中加入重量比为0.1～1％的曲尼斯特、金属锌蛋白酶、林格溶液、肝素钠、右旋糖苷、硫酸右旋糖、生物蛋白胶或可的松。