CN101099874B - 生物偶连材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生物偶连材料，为胶原蛋白或其水解物与碳二亚胺发生不完全偶连反应后的产物，该偶连材料具有流动性和粘附性，该偶连材料可用于手术中防渗漏和防粘连处理。本发明的偶连材料在使用时是未完全偶连的，并且在使用过程继续反应直至偶连完成，其自身能够通过偶连反应粘附于组织表面，可以更好地防止创面出现组织粘连和体液渗出(或渗漏)。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物偶连材料，尤其涉及一种利用生物大分子在碳二亚胺作用下形成的偶连材料及其制备方法，该偶连材料可用于手术中防渗漏和防粘连处理。
背景技术
在施行腹部、心血管、脊柱及腱部外科手术后，手术性粘连是普遍存在的问题。手术性粘连可导致严重的临床并发症，如肠梗阻、腹腔和盆腔疼痛、不育症等，增加再次手术的困难以及发生进一步并发症的潜在危险。
造成粘连的原因很复杂，可归述如下：(1)手术创伤；(2)局部缺血；(3)异物存留；(4)出血和暴露伤口表面；(5)细菌感染。
目前预防粘连常用的方法主要有两种途径：调节手术技术和使用辅助剂。调节手术技术有三种：(1)减少直接手术，即采取保守疗法，在开放性手术中选择腹腔镜和胸腔镜；(2)减少手术过程中的创伤，包括细心操作，避免局部干燥，勿缝合腹膜伤口以减少局部缺血；(3)避免体内导入异物。
调节手术技术的办法在一定程度上起到减少粘连的作用，但从粘连的形成原因来看，并不能很有效地预防粘连，因此手术本身不能避免，仅仅靠“调节手术技术”实现预防术后粘连也不是根本解决办法。
利用的辅助剂主要有药物(抗凝剂、抗炎剂、钙通道阻滞剂、细胞生长抑制剂以及水解剂)和隔离剂(大分子溶液和物理隔离膜)两种方式。
近年来，对于以上各种预防粘连的方法都有广泛、深入的研究，但是由于缺乏有效的药物载体，存在全身给药不能达到粘连部位、腹膜的快速吸收限制了药物的半衰期、隔离膜在体内无法生物降解、存留时间短以及缺乏安全性等方面的原因，尚未获得临床的普遍认可。尽管存在上述种种困难，目前使用物理隔离膜仍被认为是一种可实现有效地预防粘连的方法。
目前有几种物理隔离膜被美国食品药品局(FDA)批准在美国市场使用，一种是美国强生(Johnson & Johnson)生产的氧化再生纤维素(Interceed)，它主要用于防止妇科手术后的粘连。另外一种是美国Genzyme公司推出的透明质酸-羟甲基纤维素钠(HA-CMC)生物可吸收性膜(seprafilm)，它主要用于腹腔和盆腔手术中。近年来，许多的动物实验和临床应用表明，透明质酸钠在预防和减少外科术后粘连中为一安全、有效和理想的药物。已有报道透明质酸钠成功地应用于肌腱修复过程中以减少粘连的形成(Stonge R，WeissC，Denlinger JL，et，al.A preliminary assessment of Na hyaluronate injection into“No Man’s Land”for primary flexor tendon repair.Clin Orthoped Ret Res，1980，148：351-357。Weiss C，Levy H，Denlinger JL，et al.The role of Na-hylan inreducing postsurgical tendon adhesions.Part 2 Built Hospiit DisOrthop Inst.1987，47：31-39)。大连医科大学第一临床学院与中国科学院大连化学物理研究所合作，研制成功一种可用来预防创伤与术后组织粘连的新材料—多聚合纤维素(Poly-CMC)，研究证明它具有良好的防粘连效果。壳聚糖(Chitosan，几丁糖)广泛存在于无脊椎动物的外壳和许多真菌的细胞壁中。几丁糖的化学结构与纤维素相似，研究发现几丁糖具有以下三种作用：(1)促进组织生理性愈合、抑制瘢痕组织形成、体外细胞培养和生长的双重特性；(2)止血作用；(3)生物屏障作用。近年来它成为一个研究热点，已有很多相关专利，例如CN200310103212.4、CN200410023520.0、CN200410019168.3和CN200410093448.9在审查过程中。
同时也有研究显示，物理隔离膜存在的缺点是不能与伤口及其周围组织紧密地粘连，造成隔离膜移动，因此不能有效地止血、防止其他体液和纤维蛋白原渗出。临床研究发现使用Seprafilm的病人比不使用Seprafilm的对照组病人更容易发生瘘和腹膜炎；对肠联结的病人，Seprafilm更容易造成与渗漏相关的并发症(Beck，D.E.，Cohen，Z.，Freshman，J.W.et.al.Aprospective，randomized，multicenter，controlled study of the safety of Seprafilmadhesion barrier in abdominopelvic surgery of the intestine.Dis Colon Rectum，2003，46，1310-1319)。另一方面，临床上使用的透明质酸钠制剂尚存在一些不足，如分子量不够大、浓度较低、有的剂型不易进行大规模生产等。此外透明质酸钠还存在体内滞留时间短的问题，研究发现1％透明质酸钠在兔皮肤和膝部的半衰期只有12到24小时(Laurent，U.G.B.，Dahl，L.B.and Reed，R.K.，Exp.Physiol.，1991，76，695-703；Brown，T.J.，Laurent，U.G.B.，andFraser，J.R.E.，Exp.Physiol.，1991，76，125-134)，这大大地限制了它在手术中的作用。
总之，目前的物理隔膜法在临床应用还存在如下问题：隔膜不具流动性，不容易涂布；仅仅是物理过程，难以保证其与组织的结合；固态膜在覆盖创面时难以保证死角的覆盖质量。
寻找新的偶连材料，通过化学手段更有效实现手术创面的防粘连和防渗漏，在临床治疗中具有非常积极的作用。
发明内容
本发明所欲解决的技术问题是针对外科手术后防粘连手段存在的上述问题，提供一种生物偶连材料，该偶连材料的使用可同时在手术创面产生物理隔离和化学隔离功效，更有效地防止手术中创面的渗液、防止术后粘连、促进创伤快速愈合。
本发明提供的生物偶连材料为胶原蛋白或其水解物与碳二亚胺发生不完全偶连反应后的产物，且具有流动性和粘附性；用于偶连反应的原料包括：胶原蛋白0.1～10％或胶原蛋白水解物5～60％、碳二亚胺0.1～5％、生物多聚糖0～20％、偶连促进剂0～5％、余量为水，所述各原料的含量均以原料总重量为基准。
本发明的生物偶连材料是一种将原料经过了适当偶连反应的产物，实现偶连的主要原料有二种，一种是胶原蛋白或其水解物，另一种是碳二亚胺。胶原蛋白或其水解物来自动物体中最为丰富的一种蛋白质，具有优越的生物相容性。胶原蛋白由三条肽链螺旋缠绕而成，每条肽链又由上千个氨基酸通过肽键-RC(O)-NH-连结。在这上千个氨基酸中，10％以上的氨基酸带有羧基，另外超过10％的氨基酸带有氨基。碳二亚胺能在室温中性生理条件下迅速将羧基和氨基偶连，即，能够偶连胶原蛋白或明胶中的羧基和氨基，形成生物偶连材料。
胶原蛋白能够被水解成明胶，所以，所述胶原蛋白水解物包括明胶。明胶广泛地用于医学、食品等日常生活领域，不仅来源广泛，本身还具有良好的安全性。
本发明所利用的偶连反应中，碳二亚胺与羧基反应，生成O-acylisourea中间体，O-acylisourea中间体容易与氨基反应形成化学键-C(O)-NH-。但是，O-acylisourea中间体在溶液中容易被水解重新转化回羧基，为了使能与氨基反应的羧基中间体较为稳定存在，本发明的偶连原料中还可包括适当的辅助原料—偶连促进剂，例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，N-hydroxysuccinimide)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，N-hydroxysulfosuccinimide)，反应中O-acylisourea中间体可以与NHS或Sulfo-NHS反应，形成另外一种较为稳定的能与氨基反应的羧基中间体-NHS酯或Sulfo-NHS酯。因此NHS或Sulfo-NHS可以更加有效地使羧基和氨基接合进而形成偶连度更大的生物偶连材料。
用于制备本发明偶连材料的另一类辅助原料是一些生物多聚糖类物质，尤其是存在于动物各组织中的多糖类，例如透明质酸，它广泛存在于动物的各种组织中，目前应用于眼黏性手术、关节病、软组织修复和作为药物载体等。透明质酸是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡糖-(1→4)-O-D-葡糖醛酸的双糖重复单位所组成的一种线形聚阴离子电解质，分子量可高达4×106～5×106，每个双糖重复单位含有一个羧基，如同胶原蛋白或其水解物中的羧基一样，与碳二亚胺和NHS或Sulfo-NHS反应，与胶原蛋白或其水解物中的氨基结合，形成偶连度更大的生物偶连材料。
根据本发明优选的方案，适用的生物多聚糖可以为透明质酸或其盐，其在原料中的含量为0～5％；其他还可适用的生物多聚糖物质包括肝素、壳多糖、软骨素或藻酸等，其在原料中的含量为0～20％。
制备本发明的偶连材料是将反应原料在室温～95℃水溶液进行反应，溶液pH值控制在4～8，最好该水溶液中除原料外没有含羧基和氨基的物质。
明胶、胶原蛋白和透明质酸是广泛使用的生物材料，许多研究工作将这些材料通过偶连反应形成凝胶或固态膜用于生物医学领域。本发明的偶连材料的重要特征就是在提供使用时应仍具有流动性和粘附性，也就是说，原料之间的偶连反应是不完全偶连，产物在提供使用时是具有流动性和粘附性的流体，或者说此类材料是原料混合后、在形成固态胶凝之前的中间物质，该材料的存在时间可以通过控制原料浓度以及温度来控制。研究显示，本发明的材料能够粘于组织表面，其粘附能力随反应时间的不同而变化。在原料混合后，随着偶联度增大和流动性的降低，材料粘附于单位组织面积的量(粘附量)逐渐增加，达到一个极大值后逐渐减少至零。所以，本发明的偶连材料是指粘附量大于零的材料组成，该偶连材料可粘附于组织表面，其在每平方厘米组织表面的粘附量为大于0且小于或等于200毫克(0＜粘附量≤200mg)，从手术操作的实际情况考虑，本发明的偶连材料所具有的粘附量优选是10～120毫克每平方厘米。该粘附量是指将组织样品在37℃下单面浸渍3秒钟后，组织样品的单面粘附量。可以通过测定样品浸渍前后的质量差来得到。发明人的研究显示，这种流体态的偶连材料可以最为有效地防止手术渗漏和粘连。
本发明提供的偶连材料通过选择适当的原料并控制反应物浓度和反应条件(温度、时间)而得到，所以在不同参数和条件下偶连程度可以有所不同，宏观体现在流动性和粘附性有所差异，但只要偶连产物具有适当的流动性和粘附性，就符合本发明的主要特征。例如本发明的偶连材料的原料组成可以是：明胶10～30％、碳二亚胺0.2～2％、偶连促进剂0～2％，以及辅助原料(0～2％透明质酸、0～15％壳多糖或0～15％软骨素)，余量为水或生理盐水，反应温度37℃～60℃。考虑到临床应用，材料凝固时间应控制在1～15分钟。
人体组织和器官是由细胞和多种生物大分子组成，生物大分子中的蛋白质和多糖广泛地分布在组织和器官表面，它们含有大量的羧基和氨基。将本发明的材料在偶连过程中涂于组织或器官表面，材料中的活性中间体也可以同时与组织或器官表面的氨基反应，形成与组织紧密的连接。此外，本发明的材料是不完全偶连产物，其中未反应的碳二亚胺和NHS或Sulfo-NHS(如果含有的话)在继续偶连的同时也与组织或器官表面的羧基反应，产生的活性中间体一方面与材料中的氨基反应，加强组织与材料的粘连，同时也会与自身组织或器官表面的氨基反应，使组织或器官表面的生物大分子偶连，进一步防止手术渗漏，并屏蔽能形成粘连的活性位点以防止手术粘连。
所以，本发明的偶连材料与目前有记载的偶连材料最大的区别在于使用时是未完全偶连的，并且在使用过程继续反应直至偶连完成，即，偶连材料自身能够通过偶连反应粘附于组织表面(化学粘结与物理粘结相结合)，更好地防止创面出现组织粘连和体液渗出(或渗漏)。可以理解，本发明的偶连材料要求制备后(反应达到适当的偶连度)短时间内使用，或者说是制备后即刻使用。由于该材料是流体态，在使用中可以通过例如注射的方法直接施用于组织或器官表面需要防渗漏和粘连部位，很方便地进行涂布，尤其是对一些死角或边缘部位，可以借助其流动性实现良好的涂布和覆盖效果。
本发明的偶连材料的使用方法可以是将原料混合后立即或在一段时间内(偶连反应未完成)涂于创面，通过继续发生偶连反应使材料与所接触的组织同时形成化学和物理的连结。
本发明使用的偶连反应原料中，优选地，所述碳二亚胺的化学结构中含有能促进羧基和氨基形成化学键的R1-N＝C＝N-R2基团，其中的R1和R2为烷基、环烷基、芳烷基或它们的取代物。例如，R1是-CH2CH3，R2是-(CH2)3-N(CH3)2HCl，该化合物是乙基(N，N-二甲氨丙基)碳二亚胺或其盐酸盐(ethyl(N，N-dimethylaminopropyl)carbodiimide，称EDC)；非限制性，适用的碳二亚胺还有：环己基-β-(N-甲基吗啉基)乙基碳二亚胺对-甲苯磺酸酯(cyclohexyl-β-(N-methylmorpholino)ethylcarbodiimide p-toluene-sulfonate)、1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(1-(3-dimethylamino-propyl)-3-ethylcarbodiimide methiodide)、1，6-亚己基双(乙基碳二亚胺)(1，6-hexamethylenebis(ethylcarbodiimide))、对-亚苯双(乙基碳二亚胺)(p-phenylene-bis-(ethyl)-carbodiimide)等。
总之，本发明对现有技术的重要贡献就在于提供了一种生物相容的、能与组织紧密粘连的生物偶连材料，可有效防止手术渗漏和粘连，并且可以作为药物和细胞载体用于医疗中。
本发明的偶连材料也可以作为药物和细胞载体，可加入止血、防止炎症、防粘连的药物以及细胞，并在防止术后粘连、促进创伤快速愈合的同时，更有效地防止手术中创面的出血、组织断面的渗血和渗液。
本发明的偶连材料可以归纳出以下特点：
1.易操作：由于原料未完全偶联，流动性好，可以直接注射于组织或器官表面需要防渗漏和粘连部位，涂布容易；
2.覆盖完全：流动态下使用，容易覆盖固态膜难以覆盖的死角；
3.反应迅速：涂布后继续进行的偶连反应可以在数分钟内完成；
4.粘连性好：该材料涂布于创面后可以与组织表面同时形成物理和化学的紧密粘连，从而防止隔离膜移位和体液渗漏；
5.物理隔离：该流动性材料经继续反应能够转变为凝胶，作为一种物理隔膜隔离不同组织和器官；
6.化学隔离：该偶连材料同时可以与器官表面可引起粘连的分子反应，屏蔽或灭活这些活性分子；
7.该偶连材料可促进组织自身表面分子相互偶连防止体液渗漏；
8.偶连产物能同时润滑组织和器官表面；
9.可以作为药物和细胞载体；
10.生物相容性好，安全；
11.能够被生物降解；
12.原料丰富，产品成本低。
本发明的材料可用于腹部、心血管、脊柱、腱部、妇科盆腔等易发生粘连的外科手术中。
附图说明
图1为显示检测本发明实施例1中原材料(10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS)混合后不同时间的粘度变化图片。
图2的A和B显示肠壁样品单面与10％明胶/0.2％EDC/0.2％NHS、10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例1)、20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例2)、10％明胶/1％EDC/1％NHS(实施例3)和10％明胶/1％透明质酸(HA)/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例6)混合后不同时间接触前后重量的变化情况。
图3显示将本发明的材料凝固前后在狗小肠表面的粘附情况，其中，图片A显示的是10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例1)偶连成凝胶后，没有粘附性，图片B(实施例1：10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS)、图片C(实施例2：20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS)和图片D(实施例6：10％明胶/1％透明质酸钠/0.5％EDC/0.5％NHS)显示将本发明的材料偶连成凝胶之前涂于组织表面，材料偶连凝固后能够有效地与组织结合。
图4为防渗漏实验中应用的渗漏检测装置示意图。
图5显示本发明的生物偶连材料的防渗漏效果，生理盐水从针刺破的小洞喷射而出(图片A)，实施例1中材料(10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS)(图片B)和实施例2中材料(20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS)(图片C)能够有效地防渗漏。
图6显示本发明的20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例2)的防粘连效果优于1％透明质酸钠。
具体实施方式
以下所述实施例详细说明了本发明的实施和有益效果，但并非用以限定本发明。在这些实施例中，所有反应原料均来自商购品；除另有说明外，所有份数和百分比均按重量计。
材料制备实施例
实施例1
0.1克明胶在60℃溶解于0.85毫升含0.1M 4-Morpholineethanesulfonicacid(MES)的生理盐水中(pH6.0)，与0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS在37℃均匀混合，形成本发明的生物偶连材料。在不同的反应时间试验产物的流动性变化(即，粘度改变情况)。
请结合参见图1中图片A-F所示，用镊子简易检测该材料的流动性。在所述各原料混合90秒后，所形成的偶连材料仍可以用镊子拉出细丝，随着时间的增加，越来越粗的丝和越来越多的材料能够被拉出来，约三分钟(180秒)后产物的粘度明显增加，流动性减弱，大约十分钟后材料形成凝胶，基本上失去了流动性。
该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例2
0.2克明胶在60℃溶解于0.75毫升含0.1M 4-Morpholineethanesulfonicacid(MES)的生理盐水中(PH6.0)，与0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例3
0.1克明胶在60℃溶解于0.80毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，与0.10毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS均匀混合，形成流动性材料，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例4
0.4克明胶在60℃溶解于0.55毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，与0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例5
0.05克明胶在60℃溶解于0.85毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，与0.10毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例6
0.01克透明质酸在室温溶解于0.44毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，加入0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.5毫升20％明胶溶液混合，形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
同样观察产物的流动性变化，初期情况与实施例1相似，大约十分钟后材料形成凝胶，基本上失去了流动性。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例7
0.01克透明质酸在室温溶解于0.44毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，加入0.05毫升溶于相同溶液的5％EDC和5％NHS，均匀混合，再与0.5毫升20％明胶溶液混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例8
0.005克透明质酸在室温溶解于0.395毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，加入0.10毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.5毫升20％明胶溶液混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例9
0.03克透明质酸在室温溶解于0.62毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，加入0.1毫升溶于相同溶液的10％EDC，均匀混合，再与0.25毫升20％明胶溶液混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例10
0.02克透明质酸在室温溶解于0.48毫升含0.1M MES的生理盐水中(pH6.0)，加入0.1毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.4毫升0.25％酸碱中性的胶原蛋白溶液混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例11
0.2克明胶在60℃溶解于0.75毫升生理盐水中，与0.05毫升溶于相同溶液的10％环己基-β-(N-甲基吗啉基)乙基碳二亚胺对-甲苯磺酸酯均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例12
0.2克明胶在60℃溶解于0.75毫升生理盐水中，与0.05毫升溶于相同溶液的10％1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例13
0.2克明胶在60℃溶解于0.75毫升生理盐水中，与0.05毫升溶于相同溶液的10％1，6-亚己基双(乙基碳二亚胺)均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例14
0.2克明胶在60℃溶解于0.75毫升生理盐水中，与0.05毫升溶于相同溶液的10％对-亚苯双(乙基碳二亚胺)均匀混合，反应适当时间内可形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况参见实施例1的结果。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后会形成一层透明凝胶膜。
实施例15
0.1克肝素在室温溶解于0.45毫升生理盐水中，加入0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.4毫升25％明胶溶液混合，形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后形成一层透明凝胶膜。
实施例16
0.05克壳多糖在室温混于0.45毫升生理盐水中，加入0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.45毫升20％明胶溶液混合，形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后形成一层透明凝胶膜。
实施例17
0.05克软骨素在室温混于0.45毫升生理盐水中，加入0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.45毫升25％明胶溶液混合，形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后形成一层透明凝胶膜。
实施例18
0.1克藻酸在室温混于0.45毫升生理盐水中，加入0.05毫升溶于相同溶液的10％EDC和10％NHS，均匀混合，再与0.4毫升25％明胶溶液混合，形成本发明的具有流动性的生物偶连材料。
随着反应的不断进行，该流动性材料转变为凝胶，变化情况类似于实施例6。该流动性材料能够粘于组织表面，随着反应的继续最后形成一层透明凝胶膜。
粘附实验例
本实验例用以说明本发明的具有流动性和粘附性的生物偶连材料在组织表面的粘附效果。
实验方法：粘附实验以狗小肠为研究样品，从小肠壁截取多个直径为12毫米的圆形样品。形成偶连材料的原料在37℃均匀混合后，在不同偶连时间内将肠壁样品外表面与材料完全接触3秒钟(将样品平放于材料表面，用镊子轻压样品保证样品单面与材料完全接触)，之后夹起肠壁样品(让多余的材料从样品表面离开)，待材料凝固后称重，比较肠壁样品在与材料接触前后的重量，并观察材料在狗小肠表面的粘着情况。
实验结果：
肠壁样品与10％明胶/0.2％EDC/0.2％NHS混合后在不同时间内接触前后重量的变化参见图2中图片A所示。
10％明胶/0.2％EDC/0.2％NHS混合1分钟后，肠壁样品外表面与材料完全接触3秒钟，肠壁样品增加9毫克；10％明胶/0.2％EDC/0.2％NHS混合29.5分钟后，肠壁样品外表面与材料接触3秒钟，肠壁样品增加68毫克；在10％明胶/0.2％EDC/0.2％NHS混合41分钟和60分钟后同样操作，肠壁样品重量依次增加63和95毫克；之后，重量增加减少，在混合86分钟后操作，肠壁样品重量只增加51毫克；混合二个半小时后，材料失去了粘合性和形成流动性，转变为凝胶，此时样品重量几乎没有变化(粘附量接近0)，说明此时的材料与组织表面没有粘连(只能作为一种物理隔膜使用)。
请参见图2中图片B所示，增加EDC、NHS和明胶浓度可以显著缩短凝胶形成时间，当10％明胶中EDC和NHS的浓度增加至0.5％(实施例1)，流动性材料在4分钟后转变为凝胶；如再增加明胶浓度至20％(实施例2)或增加EDC和NHS的浓度至1％(实施例3)，流动性材料在2分钟转变为凝胶。从该图2图片B中也可看出，加入透明质酸也可显著改变凝胶形成时间，图中以实施例6材料形成的曲线显示，此时偶连速度略有降低，形成凝胶的时间延长，但最大粘附量没有很大改变。
请结合图3所示，发明材料各组份混合凝固后没有粘附性，图3中图片A显示的是10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例1)混合十分钟凝固后，不能粘附于狗小肠表面。图3中图片B-D显示将本发明材料各组份混合后立即涂于狗小肠表面(30-90秒之间)，流动性材料在狗小肠表面的粘着情况。其中，图3中图片B显示的是采用10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS按照实施例1操作得到的材料的粘附结果，图3中图片C是采用20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS按照实施例2操作得到的材料粘附结果，图3中图片D则是采用10％明胶/1％透明质酸钠/0.5％EDC/0.5％NHS按照实施例6操作得到的材料的粘附结果。从图中可以看出，本发明的流动性材料转变成的凝胶能够有效地紧密粘连在小肠表面(小肠壁)。
防渗漏实施例
实验方法：请结合图4的防渗漏实验装置示意图所示，将生理盐水充满狗小肠，肠中生理盐水的压力通过控制空气压力来控制，实验中的空气压力约为6.895千帕(1PSI)，用针(直径0.8毫米)刺破肠壁，生理盐水从小洞喷射而出(如图5中的图片A所示)。将本发明的新鲜制备的流动性材料涂于小洞处，观察渗漏情况。
实验结果：将新鲜(反应1分钟左右)制备的10％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例1)涂于小洞处，生理盐水停止喷射(图5中的图片B所示)，在约6.895千帕(1PSI)压力下只有微量生理盐水滴出(1滴/10秒)。采用20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例2)涂于小洞处，在约6.895千帕(1PSI)压力下没有发现生理盐水渗出，将压力升至约13.79千帕(2PSI)，仍没有发现生理盐水渗出(如图5中的图片C所示)。采用10％明胶/1％透明质酸钠/0.5％EDC/0.5％NHS(实施例6)涂于小洞处，在6.895千帕(1PSI)压力下也没有发现生理盐水渗出，将压力升至13.79千帕(2PSI)，仍没有发现生理盐水渗出。说明本发明的具有流动性(不完全偶连)的生物偶连材料具有良好的防渗漏的功能。
防粘连实验例
实验方法：以狗为动物实验模型，将狗(20公斤)右前爪第二和第五指屈指肌腱在后掌处完全切断，手术刎合，第二指刎合处涂本发明的20％明胶/0.5％碳二亚胺/0.5％NHS(具体制法参见实施例2，制备后1分钟内使用)，第五指刎合处涂1％透明质酸钠，缝合伤口。三周后观察粘连程度。
实验结果：请参见图6所示结果，可以看出，本发明的20％明胶/0.5％EDC/0.5％NHS比1％透明质酸钠能更有效地防止刎合肌腱与周围组织粘连。
Claims (9)
1.一种生物偶连材料，为胶原蛋白水解物与碳二亚胺发生不完全偶连反应后的产物，该偶连材料具有流动性和粘附性；用于偶连反应的原料包括：明胶5～60％、碳二亚胺0.1～5％、生物多聚糖0～20％、偶连促进剂0～5％、余量为水，所述各原料的含量均以原料总重量为基准。
2.根据权利要求1所述的偶连材料，其中，该偶连材料可粘附于组织表面，其在每平方厘米组织表面的粘附量为大于0且小于或等于200毫克。
3.根据权利要求1所述的偶连材料，其中，所述生物多聚糖包括透明质酸或其盐、肝素、壳多糖、软骨素或藻酸。
4.根据权利要求3所述的偶连材料，其中，所述生物多聚糖为透明质酸或其盐，其在原料中含量为0～5％。
5.根据权利要求1所述的偶连材料，其中，所述碳二亚胺的化学结构中含有能促进羧基和氨基形成化学键的R1-N＝C＝N-R2基团，其中的R1和R2独立地为烷基、环烷基、芳烷基或它们的取代物。
6.根据权利要求5所述的偶连材料，其中，所述碳二亚胺包括乙基(N，N-二甲氨丙基)碳二亚胺、环己基-β-(N-甲基吗啉基)乙基碳二亚胺对-甲苯磺酸酯、1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物、1，6-亚己基双(乙基碳二亚胺)或对-亚苯双(乙基碳二亚胺)。
7.根据权利要求1所述的偶连材料，其中，所述偶连促进剂为羟基琥珀酰亚胺或羟基磺化琥珀酰亚胺。
8.根据权利要求1所述的偶连材料，其中，所述发生不完全偶连反应后的产物为pH值在4～8的流体物质。
9.制备权利要求1～8任一项所述的生物偶连材料的方法，包括使反应原料在室温～95℃水溶液中进行反应，控制溶液pH值在4～8，得到未完全偶连的流体产物。
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