CN1535726A - 一种分子佐剂、其制备方法以及含该分子佐剂的基因疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型分子佐剂CR2BD，该分子佐剂可增强诸如基因疫苗的体液和细胞免疫功能；本发明还公开了该分子佐剂的制备方法；本发明还公开了该分子佐剂的应用；本发明还公开了以该分子佐剂融合乙肝病毒构建而成的新型乙肝基因疫苗。

Description

一种分子佐剂、其制备方法以及含该分子佐剂的基因疫苗

技术领域

本发明属免疫学领域，具体涉及一种分子佐剂CR2BD及其制备方法，以及以该分子佐剂制备的乙型肝炎疫苗。

背景技术

免疫佐剂可通过改变抗原理化性状、增强抗原提呈、改变免疫应答类型等方式增强疫苗的免疫效果，是疫苗研究和应用中不可或缺的成分。近年，分子(内)佐剂的研究得到了广泛的关注。补体成分C3d已被证实具有一定的免疫佐剂作用，但需多拷贝重复，分子量较大，实际工作中难以被用于分子(内)佐剂。

本发明中，发明人根据C3d增强免疫应答效果是通过该分子与其特异性受体CR2结合的分子机制，预测了C3d与CR2的结合域，制备了该结合域的编码基因片段，以乙肝病毒包膜蛋白为靶抗原，研究了该片段增强免疫应答的作用，证实了CR2BD的分子佐剂作用。并以该分子佐剂为基础，制备了一种新型的乙肝疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种分子佐剂CR2BD，含有SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列。该分子佐剂来源于补体C3d分子与其受体CR2分子特异性结合的活性域，保持了与CR2结合的特性，具有增强诸如基因疫苗的体液和细胞免疫的功能。作为一种方式，该分子佐剂以头尾相连方式串连的4个拷贝同源分子的方式发挥分子佐剂作用，各拷贝均以适当的连接序列进行头尾连接，其中连接序列可以是Gly-Ser序列。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种制备上述分子佐剂的方法，该方法包括：a)提供一表达载体，该表达载体含有所述的分子佐剂序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得产物。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种含有特异性分子佐剂的真核表达载体，以及转化有上述载体的宿主细胞。在本发明的一个实施方式中，选用的表达载体经过了独特的设计，由寡核苷酸ON33以一定方式插入pVAX1质粒改建而成，依次含真核增强子Kozak序列、ATG起始编码子、BglII和Bam HI两个具有相同酶切粘性末端的限制性内切酶位点、TAGTAA双终止编码子，由此构成了一个独立的转录与翻译单元以及构建质粒的克隆单元。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种以分子佐剂CR2BD制备的乙型肝炎疫苗pVAON33-S2/S-CR2BD4。它是以本发明中构建的pVAON33真核载体为载体，5’端含乙肝病毒S2/S、3’端含所述的分子佐剂构建而成的真核表达重组体。

本发明还提供了一种将所述的乙肝基因疫苗在制备预防和治疗乙肝的药物中的应用方式。作为本发明的一个方式，可将乙肝基因疫苗转化原核细胞，大规模抽提和纯化质粒DNA，溶于一定的介质中，进行免疫。采用的免疫方式包括但不限于肌肉免疫、基因枪皮内轰击等。作为一种实施方式，本发明可以采用肌肉免疫。其中所述的原核细胞可以是大肠杆菌细胞，所述的介质可以是生理盐水或其他生物相容性介质。质粒DNA的浓度范围可以是0.5-2.0μg/μl，较优的浓度为约1.0μg/μl，每只小鼠注射约100μl。

附图说明

图1显示了重组质粒的构建图；

图2显示了pVAON33-S2/S-CR2BD重组表达质粒的PCR鉴定与DNA检序，

其中A为pVAON33重组质粒的酶切鉴定，B为pVAON33-CR2BD重组表

达质粒的PCR鉴定，C为pVAON33-CR2BD重组表达质粒的DNA检序结果，D为C3d-CR2BD的DNA序列(84bp)；

图3显示了含不同拷贝CR2BD编码基因重组质粒免疫小鼠血清抗-HBsIgG的检测；

图4显示了追加免疫后小鼠血清中特异性抗HBs IgG抗体的检测；

图5显示了追加免疫前后小鼠血清中特异性抗HBs IgG抗体效价的检测；

图6显示了追加免疫前后小鼠血清中特异性抗HBs IgG抗体亲和力检测；

图7显示了免疫小鼠脾细胞的体外特异性增殖活性的检测；

图8显示了基因免疫诱导的特异性CTL活性的检测。

具体实施方式

实施例1  分子佐剂CR2BD的DNA序列的选择，不同拷贝CR2BD重组质粒的构建、

鉴定及其大量纯化

自补体C3d分子中选择第1209位氨基酸残基至第1236位氨基酸残基区域，其氨基酸序列为：KFLNTAKDRNRWEEPDQQLTNVEATSYA，(SEQ ID NO：1)，根据氨基酸序列，其DNA编码基因序列为：5′-AAG TTT CTG AAC ACA GCCAAA GAT CGG AAC CGC TGG GAG GAG CCT GAC CAG CAG CTC TAC AAC GTA GAGGCC ACA TCC TAC GCC-3′(SEQ ID NO：2)。

为研究CR2BD的分子佐剂作用，我们采用基因免疫技术，以乙肝病毒包膜蛋白HBs/presAg为靶抗原(S2/S)，以头尾相连的1～4拷贝CR2BD融合S2/S，构建真核表达重组体pVAON33-S2/S-CR2BD.1～4(图1)。具体方法如下：

1.pVAX1质粒的改建

1.1寡核苷酸ON33的设计与合成

寡核苷酸ON33上游(ON33U)：5’-AGCTTGCCACCATGAGATCTGGATCCTAGTAAG-3’(SEQ ID NO：3)和ON33D：5’-GATCTTACTAGGATCCAGATCTCAT GGTGGCA-3’(SEQ ID NO：4)，由上海申友生物公司合成。ON33U与ON33D经退火后形成的双股DNA片段依次含HindIII酶切粘性末端、Kozak真核增强子序列、ATG起始编码子、Bgl II酶切位点、BamH I酶切位点、TAGTAA双终止编码子和BamH I酶切粘性末端，其中5’和3’的Hind III和BamH I酶切位点用于在酶切载体的连接，连接后保留Hind III酶切位点，但BamH I酶切位点消失；引入Bgl II酶切位点和BamHI酶切位点是考虑两者的粘性末端相同，以便多拷贝基因片段的克隆。

1.2 ON33U与ON33D退火形成的双股DNA

将10mmol/L的ON33U与ON33D各25μl加入PCR反应管，置PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司产品、型号为PE2400型)，按下列程序使之退火形成的双股DNA：94℃变性1分钟，然后以每分钟下降1度的速度下降温度，直至4℃，置-20℃备用。

1.3 pVAX1质粒的酶切与回收

pVAX1质粒为真核表达载体，包含CMV-IA真核细胞启动子、BGH转录终止子、pMB1原核细胞复制子以及Kanr抗升素筛选基因。为本发明所采用表达载体。

1.3.1  菌种的复苏与冻存：取-70℃保存菌种DH5α，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。菌种冻存前，于37℃ 280rpm振荡培养8-12小时至最佳生长状态，加入已灭菌的纯甘油使其终浓度为15-20％，混匀分装立即于-70℃保存。

1.3.2感受态DH5α制备：取-70℃保存菌种，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。挑选新鲜单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养过夜，按1∶100比例取菌液至100ml LB培养液，于OD590为0.4时取下，将培养液分装至预冷无菌的50ml聚丙烯管，于冰上放置5-10分钟，然后于4℃ 1100rpm离心5分钟，细菌沉淀用10ml 0.1M预冷的CaCl₂溶液重悬，于4℃ 1100rpm离心5分钟，弃沉淀，再用10ml CaCl₂悬浮菌体，冰上放置30分钟，4℃ 1100rpm离心5分钟，用2ml预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬各管细菌，然后按每管200μl分装于预冷的1.5ml Eppendorf管，立即冻存于-70℃。

1.3.3质粒DNA转化宿主细菌：取5μl质粒DNA，加入200μl DH5α感受态中，混匀，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，立即置冰浴5分钟，加入800μl LB培养液，37℃ 120rpm振荡培养45分钟，3000rpm离心3分钟，弃上清，留约100μl液体悬浮菌体，均匀涂布于含卡那青霉素(60μg/ml)的LB平板上，37℃培养16-20小时。

1.3.4质粒DNA的小量抽提：自转化平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的2ml LB液体培养基中，37℃ 280rpm振荡培养14-16小时，以NaOH裂解法小量抽提质粒DNA：将1.5ml菌液到入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm离心1分钟收集菌体，以100μl Sol I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮；加入200μl新鲜配制的Sol II(0.2N NaOH，1％SDS)，充分混匀裂解菌体，冰浴10分钟；加入150μl预冷的Sol III(3M KAc，pH4.8)，轻柔而充分混匀，冰浴10分钟，使质粒DNA复性；12000rpm离心5分钟，上清移入另一1.5ml Eppendorf管，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃放置20分钟；15000rpm离心10分钟，弃上清，室温干燥后以50μl无菌三蒸水溶解，-20℃保存备用。

1.3.5酶切与回收  以HindIII和BamHI(TaKaRa公司产品)对pVAX1质粒进行双酶切，具体方法如下：在小于1μg的质粒DNA中加入2U相应内切酶、2μl相应缓冲液，加双蒸水至20μl，37℃反应1～24小时，65℃终止反应，以1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。

1.4酶切载体与ON33的连接取适量酶切pVAX1质粒和ON33加入反应管，使载体和片段摩尔数之比为1∶3，然后加1μlT4DNA连接酶(MBI公司产品)、1μl缓冲液，补双蒸水至10μl，混合后置16℃反应1小时或4℃过夜。

1.5  连接产物转化宿主细菌，方法同前。

1.6  阳性克隆的筛选

1.6.1  菌落PCR初筛阳性克隆：引物序列T7U：5’-TTAAT ACGAC TCACTATAG-3’(SEQ ID NO：5)和T7D：5’-TAGAA GGCAC AGTCG AGGCT GAT-3’(SEQ ID NO：6)，由上海申友生物公司合成；Taq DNA多聚酶、dNTP等PCR试剂购自Biostar公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。以T7U和ON33D为上下游引物进行PCR以初筛阳性转化克隆，PCR反应条件为：反应总体积50μl，依次加入10X缓冲液5μl、25mM MgCl₂3μl、10mM dNTP 1μl、10mM正反向引物各1μl、Taq酶1U、模板1μl，然后补高压三蒸水至50μl。反应程序为：94℃预变性15分钟，进入PCR循环：94℃变性45秒、58℃复性45秒、72℃延长45秒，重复30个循环，最后延长10分钟。将PCR所有试剂按比例混和，分装于Ep管，25μl/管，然后用无菌牙签挑取菌落涂于管底，500rpm离心。PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

1.6.2  酶切鉴定：抽取PCR阳性克隆的质粒DNA，方法同前。以BamHI或BglII进行单酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳观察是否引入BglII酶切位点。

1.6.3 DNA测序检测：构建质粒的最终鉴定需进行DNA序列检测，本发明所建重组质粒均委托上海申友生物公司完成，采用ABI PRISMTM377 DNASequencer测序仪，以T7U或TR421U为测序引物。

结果显示，ON33已成功插入pVAX1质粒，pVAON33质粒已含BglII酶切位点(图2 A)，DNA序列检测证实ON33的基因框架准确。

2.pVAON33--S2/S和pVAON33-S2/S-CR2BD.1~4重组质粒的构建及大量纯化

2.1  重组质粒的构建

按图1所示构建重组质粒pVAON33--S2/S和pVAON33-S2/S-CR2BD.1～4，具体方法同上。

PCR法获得CR2BD的编码基因，纯化产物经BglII和BamHI双酶切后依次由pVAON33质粒的BamHI酶切位点插入，构建pVAON33-CR2BD.1～4重组质粒。PCR法和DNA测序证实不同拷贝的CR2BD编码基因已插入pVAON33质粒，编码框架正确。

PCR获得HBV-preS2/S的编码基因，酶切后分别插入pVAON33及pVAON33-CR2BD.1～4质粒，构建pVAON33--S2/S和pVAON33-S2/S-CR2BD.1～4重组质粒，PCR法和DNA测序证实HBV-preS2/S的编码基因的插入方向和编码框架正确(图2)。

2.2  重组质粒的大量纯化

采用QIAGEN Plasmid Mega Kit质粒DNA大量纯化试剂盒(商售、基因公司产品)可获得大量纯化的、不含LPS的上述重组质粒DNA，具体步骤如下：取-70℃冻存菌种接种于2ml LB(Kan 100μg/ml)液体培养基，37℃活化8小时，将活化的菌液按1∶500扩大培养至500ml LB(Kan 100μg/ml)液体培养基中，37℃ 280rpm振荡培养15小时，6000g、4℃离心15分钟，收集菌体，在4个高速离心管中各以12.5ml预冷P1(50mM Tris-HCl，10mMEDTA/pH＝8.0，100μg/ml RNase A)充分悬浮菌体，各缓慢加入12.5ml P2(0.2N NaOH，1％SDS)，轻柔颠倒混匀4-6次，室温作用5分钟，再缓缓加入12.5ml预冷P3(3M KAc pH＝5.5)，颠倒混匀4-6次，冰上放置20分钟，20000g、4℃离心30分钟，取上清20000g、4℃离心15分钟，离心过程中将tip-2500阴离子交换柱垂直固定，以35ml QBT(750mM NaCl，150mM MOPS，pH＝7.0，15％异丙醇，0.15％Triton X-100)过柱使其pH值平衡，将离心上清过柱，待液体自然流干后，以100ml QC(1.0mM NaCl，150mMMOPS，pH＝7.0，15％异丙醇)洗柱，最后以35ml QF洗脱液(1.25M NaCl，150mM Tris-HCl，pH＝8.5，15％异丙醇)将质粒DNA从柱上洗脱，分装于2个高速离心管，各加入24.5ml异丙醇，颠倒混匀后20000g、4℃离心30分钟，弃上清，以7ml 70％乙醇洗涤DNA，再以20000g、4℃离心15分钟，仔细弃上清，以空气干燥约10分钟，最后以少量无菌生理盐水溶解DNA。以紫外分光光度计测定DNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，接近1.9时认为达到纯度，以OD₂₆₀＝0.1时DNA的含量为50μg/ml计算DNA的浓度，将质粒DNA调整为1μg/ml，冻存备用。

实施例2 CR2BD可增强HBV特异性抗体免疫应答

1.小鼠及其肌肉基因免疫

采用左后腿胫骨前肌注射法以纯化的pVAON33--S2/S和pVAON33-S2/S-CR2BD.1～4重组质粒免疫BALB/c(H-2d)雌性小鼠，每组6只小鼠，100μg DNA/100μl/只；质粒DNA初次免疫后的第12周，以纯化HBsAg蛋白加强免疫各组小鼠。

具体方法：基因免疫前1天，以0.75％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(按50μg/g体重)，调整麻醉后小鼠的腿姿以暴露胫骨前肌、注射100μl 0.25％丁哌卡因，方法如下：消毒后于肌肉的中部垂直进针，针尖插入深度由套管决定，约为2-3mm，缓慢推进，可见注射肌肉膨胀，完毕后将针头旋转90，停留5秒钟，缓缓拔出。24小时后，即第1天时，以同样的方法麻醉小鼠，于前日注射丁哌卡因的部位以同样手法注射100μg质粒DNA。定期自眼眶内静脉按期采集各组小鼠全血，4℃放置，5000rpm离心10分钟收集血清，-20℃保存。

2.免疫小鼠抗HBV-preS2/S IgG抗体检测

采用常规ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗HBV-preS2/S IgG抗体水平，具体步骤如下：纯化HBsAg蛋白(北京市肝炎研究所产品)5μg/ml(100μl/孔)包被96孔酶标反应板，置湿盒中，37℃放置1小时，4℃过夜。测血清标本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗涤三次，每次3分钟；以含5％山羊血清和5％小牛血清的PBST封闭，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；小鼠血清以0.01M PBST稀释后加入孔中，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；加入以0.01M PBST稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(美国Southern Biotech公司产品、效价1∶5000)，37℃作用1小时，0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；OPD显色，1M H₂SO₄终止反应，测OD490nm值。

结果显示，含不同拷贝CR2BD编码基因的重组质粒诱导的特异性抗体均高于对照pVAON33-S2/S，其增加幅度与CR2BD的拷贝数有一定关系，其中pVAON33-S2/S-CR2BD.4重组质粒免疫组诱导的抗体水平最高(图3)。质粒DNA初次免疫后的第12周，以纯化HBsAg蛋白加强免疫各组小鼠，结果pVAON33-S2/S-CR2BD.4重组质粒免疫组抗体水平迅速增高并维持最高水平(图4，5)，表明CR2BD能增强基因免疫诱导的初次免疫应答和回忆反应，其中4拷贝CR2BD的增强作用最为显著。

实施例3 CR2BD可增强HBV特异性抗体的亲和力

检测追加免疫前后HBV特异性抗体的亲和力，具体方法如下：纯化HBsAg蛋白(北京肝炎所产品)5μg/ml(100μl/孔)包被96孔酶标反应板，置湿盒中，37℃放置1小时，4℃过夜。测血清标本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗涤3次，每次3分钟；以含5％山羊血清和5％小牛血清的PBST封闭，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤3次，每次3分钟；小鼠血清以0.01M PBST稀释后加入孔中，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤3次，每次3分钟；加入梯度稀释的NaSCN(浓度依次为0、0.5、1、1.5、2.、2.5、3.和3.5M)，置室温1 5分钟，PBST洗涤6次每次3分钟；加入以0.01M PBST稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(美国Southern Biotech公司产品、效价1∶5000)，37℃作用1小时，0.01M PBST洗涤3次，每次3分钟；OPD显色，1M H₂SO₄终止反应，测OD_490nm值。

结果发现，pVAON33-S2/S-CR2BD.4重组质粒免疫组小鼠抗体的亲和力均强于pVAON33-S2/S重组质粒免疫组(图6)。

实施例4 CR2BD可增强HBV特异性细胞免疫应答

1.免疫小鼠特异性淋巴细胞增殖试验

用上述重组质粒免疫以同法免疫8周龄BALB/c(H-2d)小鼠，取小鼠脾细胞以特异性抗原HBsAg刺激培养72小时，进行淋巴细胞增殖试验。

具体方法如下：无菌取小鼠脾细胞，Tris-NH₄Cl破坏红细胞并洗涤，调细胞浓度至5×10⁶/ml，加入96孔平底板，100μl/孔，同时加入HBsAg(终浓度依次为6.25、12.5、25、50μg/ml)，置37℃ CO₂孵箱培养72小时。在收获细胞前16小时每孔加入0.5μCi³H-TdR，继续培养。最后以多头细胞收集仪收集各孔细胞于玻璃纤维滤纸上，40℃烘干，以液体闪烁计数器(上海原子核研究所日环仪器一厂产品、型号为SN-6904)测量CPM值。

结果发现，CR2BD能增强基因免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性(图7)。

2.免疫小鼠特异性CTL活性检测

取上述基因免疫小鼠脾细胞，以HBsAg体外刺激培养5天后作为效应细胞，以SP2/0-preS2/S细胞(稳定表达HBV-preS2/S的细胞株)为靶细胞，进行特异性CTL杀伤测定。具体方法如下：

2.1  SP2/0-preS2/S细胞的构建及其同位素标记

2.1.1脂质体法转染细胞及其筛选：在转染前24小时取3×10⁵的Sp2/0细胞加入6孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养过夜，次日待细胞密度为70-80％时进行转染。转染前小心吸去培养液，并以不完全1640培养液(GibcoBRL公司产品)轻洗3遍，加入0.8ml无血清无抗生素1640培养液。在含100μl无血清无抗生素1640培养液的无菌微量离心管中加入2μg质粒DNA，在另一无菌微量离心管中加入12μl脂质体(Invitrogen公司产品)和88μl无血清无抗生素1640培养液混匀，用微量加样器将含质粒DNA的培养液轻轻滴加入含脂质体的培养液中，轻旋混匀，室温下静置45分钟以促进脂质体-DNA复合物的形成。然后逐滴加入上述细胞孔内，轻轻旋转平板使脂质体-DNA与细胞充分接触，置37℃5％CO₂培养。5小时后加入含20％胎牛血清(Hyclone公司产品)；的1640培养液以中和脂质体的毒性，继续培养。48小时后按10∶1稀释分孔培养，并加入G418(终浓度为800μg/ml)，同时设置空白对照，10天左右可见抗性细胞呈集落生长。收获生长集落较多的细胞孔细胞，稀释后加入96孔平底细胞培养板，使每孔细胞分别达5个、1个、0.5个和0.25个，以800μg/ml终浓度的G418(购自上海华美生物公司)进行筛选，待培养1-2周后，观察每孔细胞的克隆数并记录单克隆的细胞孔，进行培养后转种24孔细胞培养板。收获细胞检测HBsAg的表达。选择目的蛋白表达最强的单克隆细胞作为靶细胞用于下列试验。

2.1.2靶细胞的同位素标记：取对数生长期的靶细胞(4×10⁶)以40μCi³H-TdR(终体积为0.8ml)置37℃水浴标记2.5小时(每30分钟混匀细胞1次)，Hank’S液洗涤3次并计数，调整浓度为2×10⁵/ml，用作CTL细胞杀伤的靶细胞。

2.2效应细胞的诱导

无菌取小鼠脾细胞，Tris-NH4Cl破坏红细胞并洗涤，调细胞浓度至5×106/ml，加入96孔平底板，100μl/孔，同时加入HBsAg(终浓度依次为25μg/ml)和IL-2(终浓度2×10⁴U/L)，置37℃ CO₂孵箱培养5天，其中于第3天换一半培养液(含2×10⁴U/L IL-2)。第5天收获细胞，以不完全1640培养液洗3遍，计数并调整细胞浓度作为效应细胞。

2.3  杀伤试验

将上述靶细胞按50μl即1×10⁴/孔加入96孔圆底板，同时将调整浓度后的为效应细胞加入96孔圆底细胞培养板中，每孔100μl使效靶细胞比例分别为80∶1、40∶1、20∶1和10∶1，并设三复孔。培养前以500rpm30秒离心96孔圆底板，置37℃、5％CO₂孵箱中5.5小时。取出后每孔加入50μl双酶溶液(Dnase I 100μg/ml，胰蛋白酶1.2％)，微量搅拌器上振荡30秒，再置CO₂孵箱中0.5小时，取出后立即以多头细胞收集仪将各孔内容物抽滤于玻璃纤维滤纸上，烘干后分别放入塑料小管，加约600μl闪烁液(PPO2.5g，POPOP 0.25g，二甲苯500ml，提前一个月配好)，以液体闪烁计数器(上海原子核研究所日环仪器一厂产品、型号为SN-6904)测量CPM值。杀伤率计算如下：杀伤率(％)＝(1-实验孔CPM均值/靶细胞自然释放CPM均值)×100％。

结果发现，CR2BD能增强基因免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性以及对靶细胞的特异性CTL杀伤活性(图8)。

以上结果证实CR2BD是一种强作用的分子佐剂，能增强基因免疫诱导的特异性抗体及细胞免疫应答，其中4拷贝的作用最强。以该分子佐剂融合表达HBV S2/S所构建的新型乙肝基因疫苗为一新的增强性基因疫苗。

                                   序列表

<110>上海欣安基因免疫与疫苗研究开发有限公司

<120>一种分子佐剂、其制备方法以及含该分子佐剂的基因疫苗

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>PRT

<213>分子佐剂的氨基酸序列

<400>1

Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Gly

                 5                   10                  15

Glu Gln Leu Thr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala

             20                  25

<210>2

<211>84

<212>DNA

<213>分子佐剂的编码基因

<400>2

aagtttctga acacagccaa agatcggaac cgctgggagg agcctgacca gcagctctac

60

aacgtagagg ccacatccta cgcc

84

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>3

agcttgccac catgagatct ggatcctagt aag

33

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>4

tagaaggcac agtcgaggct gat

23

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ttaatacgac tcactatag

19

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>6

tagaaggcac agtcgaggct gat                           23

Claims (12)

1.一种分子佐剂，其特征在于，它含有至少1拷贝的SEQ ID NO：1结构的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的分子佐剂，其特征在于，它以头尾相连方式串连的4拷贝同源分子的方式发挥分子佐剂作用，各拷贝之间以连接序列连接。

3.根据权利要求2所述的分子佐剂，其特征在于，各拷贝之间的连接序列为Gly-Ser。

4.编码权利要求1所述的分子佐剂的DNA分子，其特征在于，它包含至少1拷贝的SEQ ID NO：2结构的序列。

5.一种真核表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的基因序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的表达载体转化。

7.一种制备权利要求1、2或3所述的分子佐剂的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一种表达载体，该表达载体含有权利要求4所述的序列以及与

该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；

c)在适合的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得产物。

8.一种真核表达载体，其特征在于，它是由寡核苷酸ON33以一定方式插入pVAX1质粒改建而成。

9.一种乙肝基因疫苗，其特征在于，它是由权利要求1、2或3所述的分子佐剂融合乙肝病毒S2/S构建而成的。

10.根据权利要求9所述的乙肝基因疫苗，其特征在于，它是以权利要求8所述的真核载体为载体，5’端含乙肝病毒S2/S的真核表达重组体、3’端含权利要求1、2或3所述的分子佐剂。

11.权利要求9或10所述的乙肝基因疫苗在制备预防和治疗乙肝的药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其中包括将乙肝基因疫苗转化原核细胞，大规模抽提和纯化质粒DNA，溶于一定的介质中，进行肌肉免疫。

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