CN1527876A - 用于控制生物膜的化合物、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于控制生物膜的氮杂环化合物、组合物和方法，即，分裂生物膜、阻止生物膜的形成、加强生物膜或修改生物膜。本发明还提供了本发明所使用的设备和筛选用于生物膜控制的试验化合物的方法。

Description

用于控制生物膜的化合物、组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2001年4月27日提交的USSN 60/287,138的优先权。
发明领域
本发明涉及用于控制生物膜的化合物、组合物和方法，即，分裂生物膜、阻止生物膜的形成、加强生物膜或修改生物膜。本发明还提供了本发明所使用的设备和筛选用于生物膜控制的试验化合物的方法。
发明背景
生物膜是微生物的粘性群落，所述微生物如生长在各种表面上的细菌、原始细菌、真菌、霉菌、藻类或原生动物或其混合物(参见Nature，第408卷，第284-286页，2000年11月16日)。当微生物将自己安置在宿主表面并激活参与产生包括多糖的基质的基因时，就会形成生物膜。该基质可为生物膜细菌提供保护，使其免受生物杀灭剂的侵害。
被称作密度感应信号的分子帮助引发和协调形成生物膜的部分过程。细菌不断地分泌低含量的信号，并通过其表面或内部的受体感应这些信号。当细菌足够多使得该些信号的浓度达到临界阈值时，该受体会引发行为变化。一旦该现象发生，细菌就会作出反应，采取共同行为如形成生物膜，和在细菌为病原菌时使用毒性因子如毒素。细菌除了与其同类成员通信外，还进行类间通信，因此生物膜可包含不止一种细菌。
生物膜常常是不受欢迎的。例如，生物膜可通过覆盖设备如冷却系统或水产业设备而造成损害。生物膜还有害于健康。例如，许多在医院获得的传染病与生物膜有关，其可污染植入体和导管。牙线是生物膜形成的主要候选场所。生物膜还可导致从囊肿性纤维化病人的肺部传染病到龉齿病等多种疾病。
然而，生物膜也可以是有益的。例如，生物膜可用于用作生产药品的生物反应器中，生物膜还是污水和其它水处理系统的组分。
一种阻止或分解生物膜的方法是干扰密度感应信号。已研制出一些化学物质，这些物质能干扰信号合成或同密度感应信号受体结合而不会激活该受体。还研制出了能降解信号的酶。某些密度感应信号典型具有酰化高丝氨酸内酯环系。据报道，WO 00/06177提供了用于识别自动诱导物合成反应调节物的方法，该调节物能促进或抑制高丝氨酸内酯的生成。据报道，WO00/32152提供了细菌发送信号因子4，5-二羟基-2，3-戊二酮，其中该因子帮助诱导发光基因的表达。
现需识别调节生物膜的形成和生长的试剂，以及用于检测该形成和生长的方法和设备。本发明解决了这些问题，并提供调节该过程的氮杂环分子和用于检测该调节的方法和设备。
发明概述
本发明涉及用于控制生物膜的化合物、组合物和方法。“控制”生物膜是指分裂生物膜和/或阻止生物膜的形成，加强生物膜的形成和/或生长，或修改生物膜。本发明还涉及用于确定化合物对生物膜的作用的测定和方法。本发明还提供了用于测试基质表面生物膜控制的装置。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用并不是对其为本发明的现有技术的认可。
附图概述
图1为如测定参考实施例4中所描述的塑性试管基生物膜生长和检测方法的侧横截面视图。
图2a为如测定参考实施例5所描述的生长室阵列基生物膜生长和检测方法的一个实施方案的侧横截面视图。
图2b为如测定参考实施例6所描述的生长室阵列基生物膜生长和检测方法的一个可选实施方案的侧横截面视图。
图3为如测定参考实施例5和6所描述的生长室阵列基生物膜生长和检测方法的两个盖中之一的顶视图。
图4为如测定参考实施例5和6所描述的生长室阵列基生物膜生长和检测方法的中间部件的顶视图。
发明详述
本发明提供了用于控制基质表面上生物膜的化合物和方法。本发明还提供了筛选试验化合物在控制生物膜方面的活性的方法和用于检测基质表面上生物膜控制的装置。“生物膜”是指微生物的粘性群落，这些微生物如能生长在各种基质上的细菌、原始细菌、真菌、霉菌、藻类或原生动物。生物膜可包括一种或多种微生物。“基质”是指任何生物膜可在其上形成或已经形成表面。基质包括但不限于硬的或软的表面如聚合物、塑料、管形材料、陶瓷、金属物、玻璃、羟基磷灰石、皮肤、骨或组织。
“控制生物膜”在本发明中是指分裂生物膜和/或阻止生物膜的形成，加强生物膜的形成和/或生长，或修改生物膜。本发明提供了用于控制生物膜的具有结构A或结构B的氮杂环化合物，或其组合、其盐、或其立体异构体。控制基质上的生物膜的方法包括用具有如本发明所述的结构A或结构B的化合物接触该基质，接触的时间充分长以控制基质上的生物膜。
结构A：
Figure A0280892600081
对于用于控制生物膜的具有结构A的化合物，n是1至4，R是H、烷基、酰基或烷氧羰基。此外，当n是1时，R1和R2独立地是H、C6-C20烷基或链烯基；其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H。当n是2时，R1和R2独立地是H、C4-C20烷基或链烯基；其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H。当n是3时，R1和R2独立地是H、C5-C20烷基或链烯基；其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H。当n是4时，R1和R2独立地是H、C1-C20烷基或C2-C20链烯基。
结构B：
对于用于控制生物膜的具有结构B的化合物，n和m独立地是1、2、3或4；X是C1-C20烷基或C2-C20链烯基R1和R4独立地是H、烷基、酰基或烷氧羰基，且R2和R3独立地是H或烷基；前提条件是当n和m是2时，X是C8-C20烷基或C8-C20链烯基。本发明者认识到本发明所提供的氮杂环化合物的盐、立体异构体或组合可用于控制生物膜。
本发明还提供了如下文所述的具有结构A或结构B的新化合物、或其盐或其立体异构体、或其组合物。本发明的实施方案提供了具有结构A的化合物，当n是1时，R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；且R1和R2独立地是H、C6-C20烷基或链烯基；且其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H。这些化合物如本发明的合成实施例1至3中所示合成。根据本发明的实施例，本领域技术人员能够合成具有相关取代基的化合物。如实施例2中使用适当的链烯基胺代替n-癸胺可制备R1和R2独立地是链烯基的化合物。如在实施例2中使用适当的1-烷基-2-氮杂环丁烷羧酸可制备R是烷基的化合物，Cromwell等人在J.Heterocyclic Chem.(1968)，5(2)，309-311中描述了该酸的合成。按类似于实施例9的方法让适当的2-氮杂环丁烷羧酸酰胺与酰基氯反应可制备R是酰基的化合物。
本发明的另一个实施方案提供了具有结构A的新化合物，当n是3时，R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；且R1和R2独立地是H、C5-C20烷基或链烯基；且其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H。这些化合物如本发明的合成实施例7至9中所示合成。根据本发明的实施例，本领域技术人员能够合成具有相关取代基的化合物。如实施例7中使用适当的链烯基胺代替n-辛基胺可制备R1和R2独立地是链烯基的化合物。如在实施例7中使用适当的1-烷基-2-氮杂环己烷羧酸可制备R是烷基的化合物，如Hu等人在WO9943658中所描述，该酸可通过2-氮杂环己烷羧酸的还原烷化获得。
本发明的另一个实施方案提供了具有结构A的新化合物，当n是4时，R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；且R1和R2独立地是H、C5-C20烷基或链烯基。这些化合物如本发明的合成实施例10和11中所示合成。根据本发明的实施例，本领域技术人员能够合成具有相关取代基的化合物。按类似于实施例9的方法使适当的2-氮杂环庚烷羧酸酰胺与酰基氯反应可制备R是酰基的化合物。如在实施例10中使用适当的1-烷基-2-氮杂环庚烷羧酸可制备R是烷基的化合物，该酸可通过2-氮杂环庚烷羧酸的还原烷化获得。Seebach等人已经描述了2-氮杂环庚烷羧酸的合成(Liebigs Ann.Chem.(1989)，(12)，1215-1232)。可根据实施例10中用氨替代n-辛基胺的方法或Cromwell等人在J.Heterocyclic Chem.(1971)，8(1)，19-24中所描述的方法制备R1和R2是H的化合物。
本发明的另一个实施方案提供了具有结构B的新化合物，其中n和m独立地是1、2、3或4；X是C1-C20烷基或C2-C20链烯基；R1和R4独立地是H、烷基、酰基或烷氧羰基，且R2和R3独立地是H或烷基；前提条件是当n和m是2时，X是C8-C20烷基或链烯基。这些化合物如本发明的合成实施例12和13中所示合成。根据本公开内容，本领域的技术人员还知道如何根据实施例1至13制备n和m独立地是1、2、3或4的化合物。
除非另具说明，“烷基”是指具有1至20个碳原子的完全饱和的一价烃基。所述烷基可是直链或支链的。优选那些包含4、5或6至20个碳原子的烷基，尤其优选包含4、6、8、10或12个碳原子。“酰基”是指具有羰基的基团。“烷氧羰基”是指COOR，其中R是烷基。“链烯基”指具有2至20个碳原子的不饱和一价烃基，其具有一个或多个双键。链烯基可以是直链或支链的。优选那些包含4至20个碳原子的链烯基，尤其优选包含8、10或12个碳原子。
“独立地”是指紧靠该术语前的两个或多个基团相同或不同；即，从该术语后的名单中选取一个基团不会影响其它基团的选取。
根据本公开内容，“其盐”是如本发明所提供的氮杂环化合物的盐，其有有机或无机酸如，例如，氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐，或是本领域普通技术人员已知的其它盐。
通过分析和比较有试验化合物处理下得到的生物膜的量和无试验化合物处理下得到的生物膜的量，可以测定本发明所提供的氮杂环化合物对生物膜的控制。由处理所产生的生物膜的量的变化可来自于对生物膜的胞外多糖基质的影响、或对生物膜内的微生物的影响、或对胞外多糖基体与微生物其间关系的影响。不受理论的约束，本发明者认为本发明的氮杂环分子可能在模仿、干扰或修改密度感应分子在生物膜通信中的作用。本化合物还可通过例如减少毒素生产、降低毒性、干扰信号分子、或增加生物膜在例如生物反应器中生成的酶的含量来修改生物膜。
“试验化合物”是用于筛选其在控制生物膜方面的活性的候选化合物。本发明的实施例检测了某些种类细菌中生物膜的分散和形成，这些种类的细菌与消费者和医学环境相关，且广泛代表了细菌细胞壁的类型。由于假单胞菌广泛存在于在高湿度环境中形成的生物膜中，且其是有代表性的革兰氏阴性细菌，本发明对该类细菌进行了检测，如那些在淋浴器、马桶、贮水池和下水道里边或周围的假单胞菌。由于表皮葡萄球菌通常位于人体皮肤上且其是有代表性的革兰氏阳性细菌，本发明对该细菌进行了检测。绿脓杆菌和表皮葡萄球菌都具有医学重要性，是医院获得性传染病中的条件性病原体和常见致病作用物，现认为这些生物体在生物膜状态下的生长是重要的。此外，这三种生物代表着处理生物膜的难度范围，其中绿脓杆菌是最难控制的。本发明所描述的筛选方法也适用于其它细菌和真菌，包括例如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或糠秕马拉色菌。
本发明中生物膜生长的测量使用结晶紫作为定量的全体生物膜染色剂，其染色细胞和胞外多糖，以迅速识别控制绿脓杆菌、荧光杆菌和表皮葡萄球菌生物膜的活性化合物。根据类似的方法，生物膜的量化还可使用其它染色或测定，包括但不限于多糖染色、DNA染色、化学或生化测定、酶测定或物理方法。这些方法通常对包含在生物膜内的细胞具有破坏性。
非破坏性的可选方法也可用于量化化合物在控制生物膜方面的活性程度。根据本公开内容，可通过物理、化学或生物方法如刮削、超声波降解法、在缓冲剂中搅拌(消化法)、同玻璃珠一块摇动、化学制剂、酶或本领域技术人员已知的其它方法从生物膜上释放出完整的细胞。然后运用下述方法测量所释放的细胞的数目，所述方法如使用琼脂板，使用具有或没有荧光活性细胞分类的荧光或非荧光可存活细胞或全体细胞染色、光散射技术、图像分析、酶测定或生化方法对经典的生物学可存活细胞计数。根据本公开内容可使用本领域技术人员已知的其它方法，但预计目前可利用的最容易和最高性价比的方法是本发明所描述的结晶紫法。
本发明所公开的测定法测量化合物控制生物膜的程度，不考虑控制机制，从这种意义上说该测定法是“功能性的”。因此，该测定不管化合物在控制生物膜方面的活性如何，不会区别化合物对细菌生长是杀灭的、抑制的或是非抑制的。根据本公开内容，附加测定将阐明这些活性化合物的活性机制，如最小抑制浓度测定、生长率测定、非特异细胞溶解测定、基于具体受体基因或蛋白的测定，和本领域技术人员已知的其它测定。
本文所公开的本发明所使用的功能测定法的优点是，使用该测定可发现具有任何生物膜控制机制的化合物，包括通过目前未知的机制进行作用的化合物。
本发明所公开的测定法尤其适用于对形成于硬表面的生物膜及其对例如各种清洁组合物的易感性的研究。根据本公开内容，对于本领域的技术人员而言，显而易见的是，微小的改变就能使该方法适用于其它类型的表面如软的、多孔的或不规则表面。
本发明还提供了方法，其用于增强具有生物膜分散活性的化合物对分散生物膜的量的作用。该方法包括用具有生物膜分散活性的化合物培养生物膜足够长的时间以使该化合物分散生物膜，向该生物膜施加碱，培养生物膜足够长的时间以增强该化合物的作用，和确定当前生物膜的量。同没有碱相比，有碱增强了该化合物的作用。碱可以是任何碱，例如NaOH、KOH或NH4OH。同没有加碱步骤的测定相比，在分散测定中使用碱可加强该测定的灵敏度。
在控制基质上的生物的方法的实施方案中，该化合物具有结构A，且n是1；当控制旨在增强生物膜的形成或增强现有生物膜时，R是烷氧羰基，R1是H，且R2是C10-C12烷基；和当控制旨在阻止生物膜的形成或分散现有生物膜时，R和R1是H，且R2是C6-C12烷基。
在控制基质上的生物膜的方法的另一实施方案中，该化合物具有结构A，且n是2；当控制旨在增强生物膜的形成或增强现有生物膜时，R是烷氧羰基或烷基，R1是H，且R2是C6-C12烷基；和当控制旨在阻止生物膜的形成或分散现有生物膜时，R和R1是H，且R2是C10-C12烷基。在另一实施方案中，R是H，R1是H，且R2是C10烷基。
在控制基质上的生物膜的方法的另一实施方案中，该化合物具有结构A，且n是3；可供选择地，R是H或烷氧羰基，R1是H，且R2是C8烷基；当控制旨在增强生物膜的形成时，R是烷氧羰基、烷基或H，R1是H，且R2是C8烷基。
在控制基质上的生物膜的方法的另一实施方案中，该化合物具有结构A，且n是4。
在控制基质上生物膜的方法的另一个实施方案中，该化合物具有结构B，且n和m是1、3或4；可供选择地，n和m是2，和优选地，X是C12烷基，且R1、R2、R3和R4是H。当n和m是2，且当控制旨在增强生物膜的形成或增强现有生物膜时，X优选是C12烷基，R2和R3优选是H，和R1和R4优选是烷氧羰基。当n和m是2，且当控制旨在增强生物膜的形成或增强现有生物膜时，优选地，X是C12烷基，且R1-R4是H。
生物膜控制的应用
本发明提供了控制生物膜的方法和化合物。该方法包括用上述化合物接触基质。在本发明的优选实施方案中，用该化合物处理基质，例如应用到基质上的化合物在基质上留下残余物。为了控制生物膜，组合物包括一种或多种占组合物重量的约0.001％至约99％、约0.01％至约50％，或例如约0.1％至约10％的化合物。
在本发明的一个实施方案中，为了分裂生物膜和/或阻止其形成，在高度潮湿的环境中向基质应用上述化合物和/或组合物。该基质可以是硬表面，包括浴室表面如淋浴器、马桶或洗碗池、厨房表面如洗碗池或废物处理器，或织物表面。可供选择地，该化合物和/或组合物可用于处理高湿度设备如洗碗机、冰箱等的内部。可供选择地，该基质可以是另一个厨房表面和/或其它表面如海绵、切菜板(木质或塑料的)或洗碗布。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物用于洗衣应用中，例如，应用于洗衣机槽和/或辊筒内部。该化合物和/或组合物可应用于织物。该化合物和/或组合物可减少恶臭、辅助洗涤和/或阻止霉菌在储藏于潮湿环境中的织物如衣服、窗帘或其它织物上的生长。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于通过减少清洁剂和/或减少氯在如泳池、温泉和/或热浴盆中的使用来防止表面污垢。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于户外基质如墙板、屋顶材料、甲板和/或天井以阻止户外霉菌和/或藻类的生长。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于植物和/或花瓶和/或鱼缸中，例如通过减少清洁工作量并提供更长期持久的有益效果。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于易形成生物膜的汽车空调设备或其它空调设备，以阻止或处理生物膜的形成。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于防止家用水过滤系统(例如，过滤器、壳体和/或输水管道)上生物膜的形成。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于防止地下室霉菌生物膜的形成。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用作抗感染药，例如与另一种抗菌剂如抗生素一起使用。该化合物和/或组合物可用于治疗病人与生物膜发展有关的疾病状态，如细菌感染，用于囊肿性纤维化或HIV，或免疫缺失病人。可供选择地，该化合物和/或组合物可用于处理医疗或牙医设备如导管、管道、镶补工具等以防止或处理其上生物膜的形成。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于口腔护理应用，如牙齿或假牙以控制牙斑和/或口臭。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于控制皮肤上生物膜的形成，例如，头皮屑的控制(防止马拉色菌生物膜在头皮上形成)、用于手/皮肤杀菌剂(防止自然微生物区系的生长或恢复)、用于除臭剂应用或用于脚的护理(防止真菌生长如脚藓，而不分裂自然微生物区系)。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于鞋护理应用以控制在鞋表面形成细菌和/或真菌生物膜。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于防止中毒休克综合症或恢复失衡的微生物区系(例如，封闭在如尿布中的皮肤或阴道)。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于任何具有金属、陶瓷、玻璃、复合物或聚合物部分的加工机械，尤其用于纸、食品、药和化妆品加工应用。该化合物和/或组合物可用于防止生物膜在金属、陶瓷、玻璃、复合物或聚合物上的形成，以及防止真菌或细菌生物膜在纸制品中的生长。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用作食品和/或饮料防腐剂。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于普通使用的表面涂层以阻止生物污染(例如，漆或房屋、船只、织物、地毯、鞋等的涂层)。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于普通使用的被浸渍的材料(例如，塑料、木材、复合材料)或受控的传输系统。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于建筑应用如材料保护(例如，木材、墙板、屋顶等)和设备保护。在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于海洋和淡水生物污染保护(例如，在船只、码头、防波堤、浮标、绳索和军事上的应用)。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于生物处理应用以促进在，例如废水处理系统/工厂、生物矫正系统或生物处理系统(例如全细胞生物催化作用)中最佳生物膜的形成。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于农业应用如农作物保护、农作物营养(促进所需的生物膜)和处于农歇期的污染保护(例如，沟渠、水泵等)。
在本发明的可选实施方案中，该化合物和/或组合物可用于水产业应用如预防疾病和促进最佳的表皮生物膜。
药物剂量、制剂和给药
对于药物应用，“治疗有效量”是指本发明组合物在控制生物膜方面能达到特定医疗目标的浓度或量或含量，其中控制生物膜是指如减少生物膜的形成、分散生物膜或对生物膜有毒性。具体的“治疗有效量”将根据下列因素而变化：特定治疗情况、病人的身体状况、所治疗的哺乳动物的种类、治疗的持续时间、并发治疗(如果存在)的性质、所采用的具体制剂和该化合物或其盐的结构。
本发明的药物方法可以任何适当的剂量施用。所施用的剂量将根据下列已知因素而变化：特定化合物、盐或组合的药效特征、和其用药方式和途径；施用对象的年龄、健康或重量；症状的性质和程度；药物和患者的代谢特征；并发治疗的种类；治疗的频率或想要达到的效果。有效剂量可根据动物模拟测试系统或体外测试系统的剂量反应曲线进行推断。
剂量单元可包括稀释剂、增补剂、载体、脂质体等。该单元可以是固体或凝胶形式如丸剂、片剂和胶囊等，或是适于口服、直肠、局部、静脉注射或非肠道给药的液体形式或注射到治疗处或治疗处周围。用于口服的制剂可包括无毒可药用的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露糖醇、山梨醇、环糊精、环糊精衍生物等。根据本发明的方法，药物局部应用包括油膏剂、霜膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷剂、气雾剂或油。适于鼻部给药的制剂可以液体形式给药，例如鼻喷剂、鼻液滴或通过喷雾器进行气雾剂给药，包括活性成分的含水或油溶液。适于非肠道给药的制剂包括与目标患者血液等压的含水和不含水制剂；和含水和不含水的无菌悬浮液，该悬浮液可包括为使化合物定位靶血液组分或一个或多个靶器官而设计的悬浮系统。
药物前体是指本发明所提供的化合物的形式，该化合物在其被转化是所需的生物活性形态之前具有最小的治疗活性。药物前体是具有一种或多种功能团或共价结合的载体的化合物，其功能团或载体通过体内代谢过程脱离该化合物以形成各自的生物活性化合物。药物前体包括这样的化合物，其中羟基或胺基团例如通过化学键结合到任何基团上，该基团在哺乳动物患者服用该化合物后会裂开以分别形成游离羟基或胺基团。药物前体的实施例包括但不限于醇或胺官能团的乙酸酯、甲酸酯或苯甲酸酯衍生物、磷酸酯、二甲基甘氨酸酯、氨烷基苄基酯、氨烷基酯或羧基烷基酯的官能团。
代谢物是指本发明化合物的分解产物或末端产物，或该化合物通过代谢或生物转化作用产生的盐；例如，生物转化为其共轭物或通过氧化、还原或水解而生物转化为极性更大的分子。化合物的代谢物或其盐可以是更具生物活性的形态。根据本公开内容，本领域的技术人员知道本发明化合物的代谢物活性的测定，例如，检测生物膜的分散或防止。
辅助成分
本发明还提供包括一种或多种上述化合物和一种或多种辅助成分的组合物。例如，该组合物包含约0.0001％至约50％的上述化合物和余量的辅助成分。辅助成分的实施例包括但不限于抗生素、生物杀灭剂、助剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、载体、二价阳离子、酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料传递剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、着色剂、盐填充剂、水溶助长剂、光催化剂、荧光剂、织物护理剂、包括水溶性表面活性剂的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、防皱剂、其它抗菌剂、杀菌剂、杀真菌剂、色斑、银器护理剂、防锈和/或防腐蚀剂、止泡剂、碱性来源、溶剂、加溶剂、载体、加工助剂、颜料、香料或pH控制剂。表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、两性的、两性分子的、两性离子的、阳离子的、半极性非离子的或其混合物。
本发明的组合物可包括溶剂或其混合物。根据本发明，适于掺入组合物的溶剂包括含水基或有机基溶剂。溶剂可包含水、盐、盐缓冲剂、葡萄糖、甘油、乙醇胺、醇、丙二醇衍生物如正丁氧基丙醇或正丁氧基丙氧基丙醇、2-(2-烷氧基乙氧基)乙醇、2-烷氧基乙氧基乙醇、或聚(亚烷基乙二醇)烷基醚，尤其是正丁氧基丙氧基丙醇、丁基CARBITOL，一乙醇胺(MEA)，二乙醇胺、三乙醇胺、苄基醇、甲醇、乙醇、异丙基醇、或二醇如2-乙基-1，3-己二醇和2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇或其混合物。此外，非邻位C4-C8支链或直链亚烷基乙二醇，如己二醇、(4-甲基-2，4-戊二醇)、1，6-己二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇是本发明的溶剂实施方案。本发明使用的另一种低极性的非水溶剂是一-、二-、三-或四-C2-C3亚烷基乙二醇一C2-C6烷基醚。此类化合物的具体实施例包括二亚乙基乙二醇单丁基醚、四聚乙二醇单丁基醚、二丙二醇一乙基醚和二丙二醇单丁基醚。丁氧基丙氧基丙醇(BPP)也被看作一种溶剂。可用于本发明的另一种低极性的非水有机溶剂是低分子量的聚乙二醇(PEGs)。此类原料是那些分子量是至少约150的物质。最优选分子量约200至600的PEGs。本组合物中典型地使用的溶剂的含量按组合物重量计为约0％至约30％。
本发明所述的掺入组合物中的2-烷基链烷醇和溶剂的组合具有可接受的润湿性能，且因此提供无条纹和蒸发的有益效果。“润湿”是指组合物应用到表面上，尤其是疏水表面上时会形成膜而不是单个的小滴，和/或干燥时不会在上述表面形成小滴。在干燥期间小滴的形成可导致在上述表面出现可见的残余物(“条纹”)。对比之下，膜的干燥在干燥后的结果是减少或甚至防止可见残余物(无条纹清洁有益效果)。此外，本发明所述的润湿性导致上述组合物所施用的表面上形成一层均匀的组合物膜。
在本发明的可选实施方案中，可将上述化合物加入市售的组合物例如可从宝洁公司获得的那些组合物中。
在本发明的可选实施方案中，上述化合物可用于配制化妆品或医药组合物。适于局部化妆品或医药组合物的辅助成分包括包含一种或多种选自下列成分的载体：i)润肤剂，ii)溶剂，iii)湿润剂，iv)增稠剂，v)粉末，vi)香料，vii)蜡，viii)防腐剂，ix)表面活性剂，x)碱，以及其它上述辅助成分的补充或之外的成分。可局部施用于皮肤的局部组合物可呈任何形式，包括溶液、油、霜膏、油膏剂、凝胶、洗剂、香波、免洗型或漂洗型头发护理剂、奶剂、清剂剂、润湿剂、喷剂、皮肤贴剂等。典型地，施用于受感染区域的组合物用量是每平方英寸约1至约1000毫克，优选约1至约100毫克。本领域的技术人员根据所选择的化合物和组合物的目标用途，无需过度试验即可选择合适的辅助成分和数量以配制入上述组合物。
本发明所提供的包括化合物的成套产品
本发明还涉及成套产品，其包括本发明所述的化合物和/或组合物，和本发明所述化合物和/或组合物的使用说明，以及包含该化合物和/或组合物的的包装，或与该化合物和/或组合物的销售或使用相关的其它形式的广告。该说明可以以消费者产品制造公司或供给公司典型采用的任何方式包括进该成套产品。实施例包括以附着在包装该化合物和/或组合物的包装物上的标签来提供说明；附着在包装物上或购买时与包装物相随的纸张说明；或广告、示范、和/或可能与购买或使用该化合物和/或组合物相连的其它书面或口头说明。
特别是该说明将包括该化合物和/或组合物的使用说明。该说明，例如，还可包括与应用到基质的化合物和/或组合物建议用量有关的信息。
生物膜小瓶装置
参照图1，其是一次性生物膜生长装置的横断面视图，该装置用于各种表面上的生物膜的生长和测试，其包括包含内凸螺纹5的塑性小瓶6(其材料是聚乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或其它聚合物，但优选聚丙烯)，螺帽部件7可插入其中。螺帽部件由模制的塑性顶部分1和凹螺纹部分3组成，该螺纹部分上安放着一个在螺帽部件7旋入小瓶6时能提供液体不渗透的密封O形环2(其材料是聚硅氧烷、合成或天然橡胶或其它合适材料)。螺帽部件7的中空部分植入一个圆片4，该圆片包括生物膜要在其上进行生长的表面，该表面包括但不限于聚合物、陶瓷、金属、玻璃、复合物或天然材料表面如木材。圆片4通过摩擦力或使用注入螺帽部件中空部分的合适的生物相容的粘合剂(其不会抑制生物膜生长)进行固定，以使暴露的圆片表面与螺帽部件的螺纹部分3的末端齐平。该装置的有用尺寸包括但不限于：凹螺纹部分3的内径约8毫米，塑性小瓶6的内径约11毫米，和圆片4的直径约8毫米。
参照图1所示装置，生物膜可生长在圆片4的表面上。这可通过下述操作实现：将一定体积的植入了细菌或真菌的液体生长介质放入小瓶4中，将安置了圆片4的螺帽部件7旋入小瓶6，然后将小瓶放在处于合适的受控温度环境中的组织培养旋转器上。候选用于控制生物膜的试验化合物加入液体生长介质，加入的时间可在生物膜形成之前、之后或两者。
生物膜生长室阵列
用于检测基质表面生物膜控制的装置是本发明的一个方面。该装置包括第一主体，该主体具有用于支持无凸起的可移动基质表面的平台，生物膜生长在该基质表面上；和适于同轴接受第一主体的第二主体，第二主体具有多个单体槽；其中当第一和第二主体装配起来进行使用时，这些槽与第一主体的基质表面保持液体密封流通。
参照图2a，其是可重复使用的双片生物膜生长室阵列(2P-GCA)的侧横截面视图，图2b是可重复使用的三片生物膜生长室阵列(3P-GCA)的侧横截面视图。2P-GCA和3P-GCA能实现真实条件下生物膜在各种材料上的生长和检测。本发明该些部分的图解说明请参看附图。给出图2a、2b、3和4不是出于限制的目的，且根据本公开内容，某些简单的修改对本领域的技术人员是显而易见的。
参照图2a所描述的本发明，2P-GCA包括盖部件90和容器部件110，盖部件设计成接受附着在生长表面30或是生长表面的一部分的各种材料，容器部件包含多个单体生长室(槽)，用于在表面30和该部件的单体槽80之间提供液体密封流通。通过使用螺栓40和螺母45以及插入定位钉孔20的定位钉(材料优选是不锈钢)来保持盖部件90和容器部件110之间的连接，其中通过每个槽80使用单体0形环50(其材料是聚硅氧烷、合成或天然橡胶或其它合适材料)来保持液体密封流通。当本发明处于完全装配构型时，O形环80紧紧地连接溶剂部件110和表面30。
参照图2a，盖部件90由聚合物10的单个嵌段(如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯或其它聚合物)加工制成，包括尺寸是能接受表面30的浅凹100、定位钉孔20、容纳表面固定螺钉130的孔和接受螺栓40的孔。根据本公开内容，对于本发明领域的技术人员显而易见的是，盖部件嵌段可选择由除聚合物之外的材料加工制成，如金属、复合物、或其它材料、或在铸造或模制方法中使用几乎任何理想的材料预制。
参照图3和图4，其分别是盖部件90和容器部件110的顶视图。参照图3，盖部件嵌段10包含浅凹100，通过使用两个表面固定螺钉130将表面30固定在其中。此外，还可看到包括两个定位钉孔20，用于接受两个帮助保持盖部件90和容器部件110定位的定位钉。此外，还有四个孔用于接受四个保持2P-GCA 90和110两个部分连接的螺栓40。参照图4，可看见容器部件嵌段70中加工制成的相同的孔，其中容器部件嵌段70中的孔140和150分别用于配合盖部件嵌段10中的孔120和20，以保持螺栓40与适合定位孔20的定位钉的连续性。
参照图2a，容器部件110也是由单个聚合物嵌段65(如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯或其它聚合物)加工制成，包括尺寸是能接受表面30的浅凹160、定位钉孔20、容纳表面固定螺钉130的孔和接受螺栓40的孔。根据本公开内容，对于本发明领域的技术人员显而易见的是，同盖部件嵌段一样，容器部件嵌段也可供选择地由如上所述的除聚合物之外的材料加工制成。
参照图4，本发明的容器部件110包含多个单体槽80，单体槽80在浅凹160中加工制成，而浅凹160又在容器部件嵌段中加工制成以接受从盖部件90突出的表面30，两者请参照图2a和图3。每个槽80用于模仿单体生长小瓶，如本发明提到的公开于图1的小瓶6，且每个槽都包括直径比槽大的0.5至5毫米深的额外浅凹，以为上述型号的O形环50提供容座(容器)。
参照图2a和图4，容器部件110包括由聚合物或其它材料制成的附加臂60，该臂用于附着在组织培养旋转器或类似的旋转设备上，其能平稳地旋转处于受控温度环境中的完全装配的、如本发明所述的公开于图1中的生长室。该匀速旋转能让本发明表面30上的单体环形生物膜进行可再现的生长。
当使用时，并参照图2a、图3或图4所示的本发明2P-GCA，单体生物膜阵列会生长在本发明表面30上。这可通过下述操作实现：将O形环50放入其在容器部件110内的容座中，向单体槽80加入相同或不同体积的相同或不同的液体生长介质，向每个槽单独或一起植入相同或不同的细菌或真菌，使用插入定位钉孔20/150的定位钉连接包含本发明已固定表面的盖部件90，使用螺栓40和螺母45将盖部件和容器部件固定在一起，然后将完全装配的设备用附加臂60附着在一个组织培养旋转器上，或将该设备本发明表面朝下地放在一个摇动培养器上，然后在合适的温度下通过或不通过分别以旋转或摇动进行培养。
另一个用于检测基质表面上生物膜控制的装置是本发明的一个方面。该装置包括第一和第三主体，每个主体具有用于支持无凸起的可移动基质表面的平台，该基质表面用于生物膜在其上生长；和具有第一面和第二面的第二主体，第二主体以三明治定位的方式在第一面和第二面接受第一主体和第三主体，第二主体具有多个单体槽；其中当第一和第二主体装配起来进行使用时，这些槽与第一主体的基质表面保持液体密封流通。第二主体具有多个从第一面伸展到第二面的单体孔，这些孔的两端形成槽开口，当装配好该装置进行使用时，这些孔与第一和第三主体的基质表面保持液体密封流通。
参照图2b，其是本发明在图2a中公开的容器部件的可选择实施方案。参照图2b，结合参照图3和图4，可看见经过修改的容器部件110，加工多个槽85使其贯穿整个嵌段70，增加浅凹160，O形环50及其容座，得到新的容器部件115。因此容器部件115被加工成接受两个作是两个同样盖部件90的一部分附着的同样表面30。
除了容器部件被修改成接受两个同样盖部件90之外，3P-GCA与2P-GCA在许多方面相同。稍微延长图2a所描述的四个螺栓40以适应完全装配的三片部件的更大尺寸，得到四个如图2b所描述的更长的螺栓55。这种3-片的实施方案的优点是，在生物膜生长完成前必须更换生长介质的情况下，只需要移动一个盖，因此生长在另一个盖上的生物膜完全不受干扰。此外，在不更换生长介质生物膜就能生长的情况下，可形成和/或检测两倍多的生物膜。
在2P-GCA和3P-GCA的一个实施方案中，盖部件90和容器部件110/115中的浅凹要加工制成使其尺寸能容纳一块如表面30的标准浴室瓷砖。这个设计的优点是该瓷砖既可本身作为生物膜生长表面，又可作为本发明有关不同材料层的支撑物，不同材料包括但不限于聚合物、陶瓷、金属、玻璃、复合物或天然表面如木材。所述层可用粘合剂、胶带、摩擦力或其它方法附着到瓷砖上，且因此在完全装配的本发明中可作为实际的生物膜生长表面。
在一个浴室瓷砖的实施方案中，参照图2a、图3和图4，盖部件90的加工嵌段10的有用尺寸包括但不限于嵌段尺寸是约156平方毫米，厚约25毫米，具有一个深约3毫米的约109平方毫米的浅凹100。该尺寸足够用于容纳一块约108平方毫米的标准浴室瓷砖。容器部件110的嵌段65的有用尺寸包括但不限于嵌段尺寸是约156平方毫米，厚约41毫米，具有一个深约3毫米的约109平方毫米的浅凹160，24个深约35毫米直径约8至12毫米的孔，且两孔中心距约15至18毫米。
在一个浴室瓷砖的实施方案中，参照图2b、图3和图4，有用尺寸包括上述相同尺寸，除了容器部件115厚约43毫米，在嵌段70的反面另加一个深约3毫米的约109平方毫米的浅凹160以容纳第二个盖部件90，并且槽孔85要贯穿整个嵌段。
当使用时，参照本发明图2b、图3和图4所示的3P-GCA，一个单体生物膜阵列会生长在有关的两个表面30上，其中这两个表面各自可由相同的或不同的材料制成。这可用与上述2P-GCA发明相同的方法实现，除了在加入大量的液相生长介质之前要用具有螺丝纹的螺栓65和四个螺母45将下方的盖部件90固定好。
在本发明2P-GCA和3P-GCA的实施方案中，可将控制生物膜的试验化合物加入液相生长介质中，加入的时间是在生物膜形成之前、之后或两者。通过上述方法可实现这些化合物对生物膜形成和/或分散的作用的量化。使用之后，表面30可被除去和丢弃或清洁后重复使用，通过使用试管刷和通常可获得的洗涤剂可容易地清洁槽80/85以重复使用。该方法尤其适于对在硬表面上形成的生物膜及其对例如各种清洁组合物的易感性的研究。
本发明所提供的生长室装置是可重复使用的设备，其中可使用同一设备进行生物膜生长和测定。无需如Ceri等人的美国专利6,326,190和20010049975中的破坏突出物等物理干预或干扰生物膜。该设备最适于用水不渗透的硬表面作为基质，但由于任何表面都可能作是基质，所以该设备是多用途的。由于可使用机器可移动的盖，所有加入或清除液体的步骤，包括量化的步骤可自动完成，所以该设备可容易地设置为自动操作。该设备可容易地升级为更高或更低的槽密度和/或更大或更小的槽。通过变化槽中液体的体积和旋转器或摇动器的旋转速度，可在较宽范围内调整通风。
筛选用于基质表面生物膜控制的试验化合物的方法是本发明的一个方面，该方法包括获得上述装置、在基质表面没有试验化合物可形成生物膜的条件下，在该装置的槽中用试验化合物培养生物膜形成的微生物，并比较有该试验化合物和没有该试验化合物两种情况下生物膜在基质表面的形成。当有该试验化合物情况下生物膜的形成少于没有该试验化合物的情况时，则说明该试验化合物对生物膜在该基质表面的形成有抑制活性，当有该试验化合物情况下生物膜的形成多于没有该试验化合物的情况时，则说明该试验化合物对生物膜在该基质表面的形成有促进活性。
筛选用于分散基质表面现有生物膜的试验化合物的方法是本发明的一个方面，该方法包括获得上述装置，在一定条件下在该装置的槽中培养生物膜形成的微生物以在基质表面形成生物膜，用试验化合物接触基质表面的该生物膜和比较有该试验化合物和没有试验化合物两种情况下基质表面的生物膜的量。当有该试验化合物情况下生物膜的量少于没有该试验化合物的情况时，则说明该试验化合物对该基质表面的生物膜的分散有活性。
除非另外指明，本文中所有量、份数、百分数和比例均以重量计。所有引用的美国专利均引入本文以供参考。
根据长期存在的专利法惯例，在本申请中，包括权力要求书中，术语“一”(a)和“一”(an)是指“一或更多”。
本发明所描述的化合物可通过常规的有机合成方法制备，本领域的普通技术人员可在无过度试验的情况下容易地获得这些化合物。下文描述其具体实施例。
实施例
下述实施例举例说明本发明，但并不旨在限制或定义本发明的范围。
本文使用了各种缩写。下面表1所示是可能用到的缩写和其定义。
                  表1-缩写
    缩写     定义
    BOC-ON     2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈
    CV     结晶紫
    DIEA     N，N-二异丙基乙胺
    EtOAc     乙酸乙酯
    g     克
    ISMS     离子喷射质谱
    mg     毫克
    mL     毫升
    mmol     毫摩尔
    PBS     磷酸缓冲盐
    PyBOP     苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷鏻基六氟磷酸盐
    TEA     三乙基胺
    TFA     三氟乙酸
    THF     四氢呋喃
化合物合成实施例
实施例1-N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸(1)
将(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(1.00g，9.89mmol)溶解于12mL的1∶1的二恶烷∶水中。加入三乙胺(2.1mL，14.84mmol)，紧接着加入BOC-ON(2.68g，10.9mmol)。搅拌该混合物6.75小时，然后倒入水(50mL)中并用醚萃取(7次，每次50mL)。冰浴冷却该水溶液并用冰冷的1N HCl溶液将pH调至约2.5。所得溶液用二氯甲烷萃取(3次，每次50mL)。用MgSO4干燥该组合的有机萃取物，在真空中过滤和浓缩以得到油产物。向该油产物中加入己烷(100mL)并将混合物放入冷箱中过夜。轻轻倒出己烷，然后将该产物(1)在真空中干燥以获得白色固体。ISMS：MH+202.2
实施例2-N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸正癸基酰胺(285)
将N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸(1)(90mg；0.447mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正癸胺(72mg；0.470mmol)，N，N-二异丙基乙胺(116mg；0.895mmol)和PyBOP(244mg；0.470mmol)。在室温下搅拌该反应4天，然后在减压下浓缩。该粗产物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(己烷中10％→60％的乙酸乙酯)进行提纯以获得期望的产品(285)。ISMS：MH+341.4
用类似方法，以正己胺、正辛基胺和正十二烷基胺替代正癸胺分别制备化合物283、284和286。
实施例3-(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸正癸基酰胺(289)
将N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸正癸基酰胺(285)(160mg；0.470mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(2mL)并在室温下搅拌该溶液2小时。在真空中将该溶液在40C下进行浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中然后倒入饱和碳酸氢钠溶液。用饱和碳酸钾溶液将pH调至9。摇动该混合物使各层分离。用二氯甲烷萃取水层(3次，每次5mL)。用水冲洗该组合的有机萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩以获得期望的固体产物(289)。ISMS：MH+241.2
以类似方法分别用化合物283、284和286制备287、288和290。
实施例4-N-(乙酰基)-DL-脯氨酸正癸基酰胺(7)
Figure A0280892600272
将N-(乙酰基)-DL-脯氨酸(Sigma Chemical Company，St.Louis，MI)(100mg；0.64mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正己胺(77mg；0.76mmol)、N，N-二异丙基乙胺(181mg；1.40mmol)和PyBOP(397mg；0.76mmol)。在室温下搅拌该反应18小时，然后在减压下浓缩。该残余物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(己烷中80％→100％的乙酸乙酯，紧接着己烷中50％→100％的丙酮)进行提纯以获得期望的产物(7)。ISMS：MH+241.4
用类似方法，以正辛胺和正癸胺替代正己胺分别制备化合物8和9。
实施例5-N-(叔-丁氧羰基)-L-脯氨酸正癸基酰胺(12)
将N-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(137mg；0.64mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正癸胺(120mg；0.76mmol)，N，N-二异丙基乙胺(181mg；1.40mmol)和PyBOP(397mg；0.76mmol)。在室温下搅拌42小时，然后在减压下浓缩。该残余物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(己烷中20％→70％的乙酸乙酯)进行提纯以获得期望的油产物(12)。ISMS：MH+355.2
用类似方法，以正己胺、正辛基胺、正丁胺和正十二烷基胺替代正癸胺分别制备化合物10、11、155和160。
用类似于制备化合物10、11、12、155和160的方法，以N-(叔-丁氧羰基)-D-脯氨酸替代N-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸制备化合物153、154、158、152和159。
实施例6-L-脯氨酸正癸基酰胺(32)
Figure A0280892600282
将N-(叔-丁氧羰基)-L-脯氨酸正癸基酰胺(12)(120mg；0.339mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(2mL)并在室温下搅拌该溶液2.5小时。在真空中将该溶液在40C下进行浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中并倒入饱和碳酸氢钠溶液。用饱和碳酸钾溶液将pH调至9。摇动该混合物使各层分离。用二氯甲烷萃取水层(3次，每次5mL)。用水冲洗该组合的有机萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩以获得期望的油产物(80mg)。ISMS：MH+254.8
用类似于制备化合物10、11、155和160的方法分别制备化合物30、31、165和168。
用类似于制备化合物153、154、158、152和159的方法分别制备化合物163、164、166、162和167。
实施例7-(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环己烷羧酸正辛基酰胺(22)。
Figure A0280892600291
将(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环己烷羧酸(Aldrich ChemicalCompany，Milwaukee，WI)(1.00g；4.36mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(20mL)中。依次加入正辛基胺(0.620g；4.80mmol)，N，N-二异丙基乙胺(1.24g；9.60mmol)和PyBOP(2.50g；4.80mmol)。在室温下搅拌该反应25小时，然后在减压下浓缩。该残余物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(己烷中20％→40％的乙酸乙酯)进行提纯以获得期望的油产物(22)。ISMS：MH+341.2
按类似方法用(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环己烷羧酸(AldrichChemical Company，Mi lwaukee，WI)替代(R)-(+)-1-(叔-丁氧羰基)-2-氮杂环己烷羧酸制备化合物19。
实施例8-(R)-(+)-2-氮杂环己烷羧酸正辛基酰胺(23)
Figure A0280892600301
将(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环己烷羧酸正辛基酰胺(8)(1.00g；2.94mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(40mL)中。加入三氟乙酸(20mL)并在室温下搅拌该溶液7小时。在真空中将该溶液在40 C下进行浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(200mL)中并倒入饱和碳酸氢钠溶液。用饱和碳酸钾溶液将pH调至9。摇动该混合物使各层分离。用二氯甲烷萃取水层(3次，每次50mL)。用水冲洗该组合的有机萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩以获得期望的固体产物(23)。ISMS：MH+240.8
用类似于制备化合物19的方法制备化合物20。
实施例9-1-辛酰基-(R)-(+)-2-氮杂环己烷羧酸正辛基酰胺(28)
Figure A0280892600302
将(R)-(+)-2-氮杂环己烷羧酸正辛基酰胺(23)(100mg；0.416mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(3mL)中。加入三乙基胺(63mg；0.624mmol)并冰浴冷却该溶液。用注射器滴加辛酰氯(74mg；0.458mmol)。搅拌该溶液15分钟，然后让其升温至室温。再次搅拌4.5小时后，将该溶液倒入饱和碳酸氢钠溶液并用二氯甲烷(20mL)萃取。用水冲洗该二氯甲烷萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩。该残余物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(在己烷中0％→40％的乙酸乙酯)进行提纯以获得期望的油产物(28)。ISMS：MH+367.4
用类似于制备化合物20和23的方法，以乙酰氯替代辛酰氯分别制备化合物21和24。
实施例10-(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环庚烷羧酸正辛基酰胺
将(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环庚烷羧酸(如TetrahedronLetters(1994)，35(2)，237-240中描述的方法制备)(1.00g；4.11mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(20mL)中。依次加入正辛基胺(0.584g；4.52mmol)、N，N-二异丙基乙胺(1.17g；9.04mmol)和PyBOP(2.35g；4.52mmol)。在室温下搅拌该反应24小时，然后在减压下浓缩。该残余物经过硅胶色谱法进行提纯以获得期望的产物(2)。
实施例11-(S)-(-)-2-氮杂环庚烷羧酸正辛基酰胺(3)
Figure A0280892600312
将(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮杂环庚烷羧酸正辛基酰胺(2)(1.00g；2.82mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(40mL)中。加入三氟乙酸(20mL)并在室温下搅拌该溶液7小时。在真空中将该溶液在40C下进行浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(200mL)中并倒入饱和碳酸氢钠溶液。用饱和碳酸钾溶液将pH调至9。摇动该混合物使各层分离。用二氯甲烷萃取水层(3次，每次50mL)。用水冲洗该组合的有机萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩以获得期望的产物(3)。
实施例12-N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷双酰胺
将N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(161mg；0.749mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入1，12-二氨基十二烷(75mg；0.374mmol)、N，N-二异丙基乙胺(155mg；1.20mmol)和PyBOP(409mg；0.786mmol)。在室温下搅拌该反应7小时，然后在减压下浓缩。该残余物经过硅胶色谱法使用梯度洗脱(己烷中20％→50％的乙酸乙酯)进行提纯以获得期望的产物(225)。ISMS：MH+595.6
实施例13-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷双酰胺(226)
Figure A0280892600331
将N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷双酰胺(225)(190mg；0.319mmol)在室温下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(1mL)并在室温下搅拌该溶液1.75小时。在真空中将该溶液在40 C下进行浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中并倒入饱和碳酸氢钠溶液。用饱和碳酸钾溶液将pH调至9。摇动该混合物使各层分离。用二氯甲烷萃取水层(3次，每次50mL)。用水冲洗该组合的有机萃取物，用MgSO4干燥，在真空中过滤和浓缩以获得期望的固体产物(226)。ISMS：MH+395.4
测定参考实施例
主要的高生产量小板筛选法
本发明所描述的高生产量筛选法是基于细菌附着到96槽小板并在其上形成生物膜的能力，和它们能被如结晶紫(CV)这样染色生物膜而不染色塑性材料的染料染色的能力。该小板的的材料是聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)或其它材料。紧接着对染料进行乙醇萃取，并用小板读数器进行分光光度法量化。
已经详细描述了用于数种细菌的多个版本的这种筛子(参见，例如Cowan，M.M.和Fletcher，M.，1987，J.Microbiol.Methods 7：241-249；Shea，C.，和Williamson，J.C.，1990，Biotechniques 8：610-611；O′Toole，G.A.，和Kolter，R.，1998，Mol.Microbiol.28：449-461；Loo，C.Y.等人，2000，J.Bacteriol.182：1374-1382)；几乎可使用任何细菌。通过选择理想的染料和生长介质，还可对该筛子进行修改以用真菌如酵母菌用于类似用途。
本发明涉及改进的筛子，该筛子易于使用、迅速且可促进自动操作。这些筛子可用于发现抑制或增强生物膜形成的化合物，或还可用于发现引发生物膜分散的化合物。该筛选法还可用于确定存在于生物膜中的细菌对杀菌剂或其它抗菌剂的易感性。
参考实施例1-生物膜防止筛，其用于筛选抑制生物膜形成的化合物。
用绿脓杆菌菌株PAO1(生长于R2A介质中(Handbook ofMicrobiological Media；CRC Press，1997年，第二版，R.M.Atlas编著)，经过改性以滤掉Mg2+但包括0.3-0.5％果糖(pH7.0)和3μM硫酸亚铁铵)、荧光杆菌菌株ATCC 13525(生长于R2A中，经过改性以滤掉Mg2+但包括0.3-0.5％丙酮酸钠(pH7.0))、表皮葡萄球菌菌株ATCC 35984(生长于TSB的稀释液中(Handbook of Microbiological Media；CRC出版社，1997年，第二版，R.M.Atlas编著)追加1％果糖(pH7.0)和3μM硫酸亚铁铵)制备3mL的隔夜培养物。任选地向每种生长介质中添加HEPES(pH7.3)以得到10mM的最终浓度。
向每槽包含100μl相应的上述生长介质的96槽圆底PS、PVC或PP(优选PP或PVC)小板中加入待检测的化合物(溶解于DMSO中)并进行混合，以得到250-500μM的最终浓度。这些小板还可用于在相同的相应生长介质中制备该化合物的相继稀释液，以获得包含，例如160μM和32μM最终浓度的相同配套化合物。在稀释液系列槽中包括对照槽，其仅仅包含DMSO。从这3ml隔夜培养物中，向三套稀释液板中的每个板每槽植入在适当培养物的相同液体生长介质中的5μl 1∶1稀释液。在湿度受控环境中，在300C下(对于绿脓杆菌或荧光杆菌)或370C下(对于表皮葡萄球菌)，以每分钟200转的速度摇动密封板进行培养。
用CV对有生物膜附着在小板表面的槽以下列方法进行染色：从每个槽中除去液体紧接着用每槽150μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次且最后每槽加入100μl PBS，或不冲洗就直接加入细菌培养物染色剂。向每槽100μlPBS或细菌培养物中加入25μl 1％CV溶液(在~10％乙醇中)。在室温下培养45分钟后，从板中除去染料溶液。通过注入去离子水流并翻转该板4至5次轻轻冲洗或使用自动吸移管管理器，立刻除去残余染料。将冲洗过的板在室温下晾干0.5至2小时。通过向每槽加入150μL 95％乙醇萃取紧附的染料，紧接着有力地混合10至15秒并在室温下无摇动培养45分钟。随后，将稀释(在乙醇中)的或未稀释的CV萃取物的样本转移至平底聚苯乙烯微滴定浓度板，并用小板读数器在586nm下测量吸光率。比较包含化合物的槽的读数与仅仅包含DMSO的对照槽的读数平均值。测量复制的样本，并记录复制槽数据值的平均值。
表2显示了这种生物膜防止筛的效果，其中使用本文所述化合物进行实验，采用的生物膜是参考实施例1中指明的三种细菌的生物膜。通过比较在每种化合物存在的情况下形成的生物膜和DMSO对照组，即每组4个样本，根据生物膜减少的平均百分比来表达数据。使用所述的三种化合物浓度进行测定。正数表示化合物防止生物膜形成，而负数表示化合物增强生物膜形成(变化百分比系数是≤10％)。该表清楚地表明了特定化合物对一种或多种细菌生物膜的防止效力。
【表2-1】
                         表2
【表2-2】
                        表2(续)
Figure A0280892600371
【表2-3】
                        表2(续)
Figure A0280892600381
【表2-4】
                            表2(续)
【表2-5】
                            表2(续)
Figure A0280892600401
【表2-6】
                        表2(续)
Figure A0280892600411
【表2-7】
                            表2(续)
Figure A0280892600421
【表2-8】
                        表2(续)
【表2-9】
                          表2(续)
【表2-10】
                            表2(续)
参考实施例2-生物膜分散筛，其用于筛选引发或促进已形成的生物膜分散的化合物。
如参考实施例1中，制备隔夜培养物并分配100μL的生长介质，但在如参考实施例1中指明的条件下进行细菌培养和生长之前，既不加化合物也不加DMSO。
待生物膜在槽中生长后，除去每个槽中的液体，紧接着每槽用150μL PBS冲洗一次，然后除去槽中液体。化合物的稀释液既可在单独的小板中用参考实施例1所描述的相同方法(但每槽用100-150μL PBS，而不是生长介质)制备，紧接着将其加入到包含已经长成的生物膜的经过冲洗的槽中，也可将化合物直接加入到将要加入到槽中的100-150μL PBS中。然后如参考实施例1中所描述的，小板在20-250C下、不摇动或以每分钟200转的速度摇动进行培养0.5至24小时，紧接着用CV染色。任选地，在染色和测量之前，可另外用150μL PBS冲洗一遍板，紧接着加入1-100mM氢氧化钠溶液并在20-250C下培养15至60分钟。然后如参考实施例1中所描述完成CV染色和测量。在使用难以移动脱除的细菌生物膜时，这种任选的的二次处理可松动生物膜和改进分散筛对化合物作用的敏感性。
参考实施例3-改进的生物膜分散筛，其用于筛选引发或促进已形成的生物膜分散的化合物
特此公开对参考实施例2中公开的方法进行修改后的方法，其大大改进了分散筛的敏感性和再现性。这种方法部分地基于这样的观察结果，即缺乏营养的生物膜例如那些如参考实施例2中用PBS中的化合物处理过的那些有着固有的不稳定性，因此在生物膜分散测定中往往产生更多的虚假正面结果。在本文所描述的修改后的方法中，化合物在有新鲜液相生长介质的情况下加入，以使得到的生物膜继续生长，除非试验化合物触发生物膜的分散。
按上述方法制备隔夜培养物，并将100μL适当的液相生长介质分配到两个相同的96槽小板，在这种方式下，使每种细菌配备两个相同的小板以进行测定。在细菌培养之前既不加化合物也不加DMSO，并允许两个相同板中的细菌在如参考实施例1中指明的条件下生长24小时。
在槽中待测的生物膜生长后，从两个小板中挑选一个，将其有生物膜附着的槽用CV进行染色，根据参考实施例1所描述的方法测量数量，并平均整个板各个槽的数据，得到一个生长控制值t0。每对小板中剩下的一个用DMSO中的化合物或只用DMSO进行处理作为对照槽：首先，除去槽中的槽悬浮液，然后加入新鲜的100μL适当的相同液相生长介质，紧接着直接加入并混合化合物DMSO溶液以得到390μM的最终化合物浓度。在与参考实施例1相同的条件下，将包含化合物的小板再连续培养22至26个小时。然后除去槽悬浮液，每槽加入溶于PBS中的100μL 0mM NaOH(表皮葡萄球菌)，20mM NaOH(荧光杆菌)或30mMNaOH(绿脓杆菌)溶液，并在室温下培养30分钟。因为试验测定表明碱对采用表皮葡萄球菌菌种的实验没有增强作用，因此不向表皮葡萄球菌悬浮液中加入NaOH。随后每槽用150μL PBS冲洗三次，紧接着除去最后的液体，按参考实施例1所描述用CV染色和测量数量。每个包含化合物的槽的数据构成一个化合物值R，并且平均只包含DMSO的对照槽的数据以生成第二控制值t24。对照两个控制值，每个被检测的化合物对生物膜分散的作用通过下式进行计算：
如果R＜t0，
Figure A0280892600471
和如果R＞t24，
Figure A0280892600472
表3显示了这种生物膜分散筛的效果，其中实验使用本文所述化合物进行，采用的生物膜是如参考实施例1中指明的三种细菌的生物膜。对照两个控制值，每组4个样本，根据在每种化合物存在的情况下形成的生物膜减少的平均百分比来表达数据。按上述方法进行测定，使用的化合物浓度是390μM。正数表示化合物对现有生物膜的分散(减少)，而负数表示化合物对现有生物膜的增强(促进生长)(变化百分比系数是≤15％)。该表清楚地表明了特定化合物对一种或多种细菌的现有生物膜的分散效力。
【表3-1】
                                表3
Figure A0280892600481
【表3-2】
                            表3(续)
Figure A0280892600491
【表3-3】
                            表3(续)
【表3-4】
                            表3(续)
Figure A0280892600511
【表3-5】
                              表3(续)
Figure A0280892600521
【表3-6】
                            表3(续)
Figure A0280892600531
用于生长在各种硬表面上的生物膜的鉴别模型
为了检测控制生物膜的化合物的效力，如应用如参考实施例1中公开的那些化合物，已经开发出用于在任何硬表面上生长的模型生物膜的量化方法。该方法还可用于确定存在于生物膜中的细菌对杀菌剂或其它抗菌剂的易感性，和用于确定引发生物膜分解的化合物的效力，如应用如参考实施例2中公开的那些化合物。此前已经描述了生长和检测所定义的表面上生物膜的方法(参见，例如，美国专利6,051,423；5,605,836；6,326,190；2001/0049975；WO0077162；和欧洲专利1038972)，但是，这些方法不能应用到许多不同的表面，不适用于高生产量模式，或者不易于量化操作，或有其它限制其广泛应用的方面。
本发明涉及这样的方法，其可应用于几乎任何细菌在几乎任何表面(包括聚合物、陶瓷、金属、玻璃、复合物和天然表面如木材)上的生物膜生长，是定量的、可再现的，且适于高生产量的模式。通过选择理想的染料和生长介质，还可对本发明的方法进行修改以用于类似用途，如真菌如酵母菌。此外，本发明的方法可以使用许多取自生物膜的天然微生物接种体，这些生物膜存在于现实生活设施或自然环境中，如浴室瓷砖表面、马桶表面、皮肤表面、水管、牙齿或医疗水管、土壤样本等。
参考实施例4-基于在单体塑性小瓶中生长的生物膜生长和检测方法
对带有内螺纹帽和O形环的2ml聚丙烯低温贮藏小瓶(Corning #2027)进行修改，向帽的空腔插入8毫米的圆片，该圆片可是浴室瓷砖、浴室隔间丙烯酸塑料或马桶陶瓷。或者通过让圆片的直径稍大于塑性帽，或者通过提前在帽的空腔中应用标准的聚硅氧烷粘合剂来使圆片固定在与帽的内部顶端齐平的位置。完美结果是如图1所描述的均匀表面，生物膜可在其上生长。
向修改的小瓶中注入0.5至1mL用果糖或丙酮酸盐补充物改性的R2A介质(如参考实施例1中所描述)，并用5至10μL的绿脓杆菌菌株ATCC 10145或荧光杆菌菌株ATCC 13525隔夜培养物进行培养。然后将培养的小瓶在20-250C下，在设定转速是每分钟1至3转的组织培养旋转器上放置24小时。任选地，然后用新鲜介质替换原来的1mL液体介质，且再持续培养24小时；按此顺序重复更换介质和持续生长1至3次以得到所需厚度的生物膜。
生长之后，丢弃小瓶的底部并换之以包含200μL 1％CV溶液(在~10％乙醇中)的新鲜小瓶底部。然后重新用帽盖上小瓶，重新将其放置在组织培养旋转器上，并在上述环境中培养约15至75分钟以使生物膜染色。将小瓶帽移去并轻轻地将其浸入4份分开的去离子水中以除去非紧附的CV染料，紧接着除去帽表面多余的水。然后通过将帽旋入包含0.5至1.0mL 1％脱氧胆酸钠在95％7醇中的溶液(且可供选择地4至6个直径是1至3mm的玻璃珠以辅助除去染料)的新鲜小瓶底部，并剧烈摇动1至5分钟。随后，如参考实施例1中所描述的，将未稀释的或稀释(在乙醇中)的CV萃取的样本转移至平底聚苯乙烯微滴定浓度板，并用小板读数器在586nm下测量吸光率。
表4显示了重复的小瓶测定的结果，该测定使用由浴室标准白瓷砖制作的8毫米圆片，生长和量化的条件如上述荧光杆菌所指明的，生物膜生长24小时后更换一次液体生长介质，共生长48小时。所报告的数据是在586nm下测量200μL萃取的染料溶液所得的光密度，一式六份。对照小瓶不用细菌进行培养，但跟培养的小瓶进行一样的处理，且在CV量化步骤中空白数据代表只包含缓冲剂的微滴定浓度板槽。较小的数字表示较少的生物膜生长。该表表示，相对于对照组，这种方法能产生具有良好信噪比的可再现数据。
        表4
  小瓶编号     OD586nm
    1                           0.9362                           0.8403                           0.6014                           0.8955                           0.8816                           0.794
  对照组1                       0.076对照组2                       0.085
    空白                        0.038空白                        0.037
参考实施例5-基于2-片生长室阵列的生物膜生长和检测方法
如图2a、3和4所示，加工一个聚丙烯嵌段以产生一个24个单体圆柱体槽的阵列，这24个槽基本上模仿如参考实施例4中所描述的低温贮藏小瓶底部(“嵌段底部”)。加工每个槽，以在槽的顶端是O形环或垫圈提供容座，且槽间距设计成与标准的96-槽小板的槽间距匹配，以便能用多路吸移管管理器进行液体操作。如图2a、3和4所示，加工单独的聚丙烯嵌段以提供凹槽盖(“嵌段帽”)，用于容纳108×108毫米的表面(如浴室瓷砖、陶瓷、塑料、玻璃)。嵌段底部包含用于定位嵌段帽和底部的金属钉，而嵌段帽包含为容纳来自嵌段底部的钉而钻的孔。嵌段帽还包含一套螺钉以将表面夹紧到凹陷的支持平台上。此外，嵌段底部包含一个改装臂以将其安装到组织培养旋转器的机动化部分。将该表面附着到嵌段帽，然后将嵌段帽与底部定位好，以使表面接触到O形环或垫圈，其对表面提供密封作用。在嵌段帽和底部都加工出螺纹孔以容纳螺钉，该螺钉用于将嵌段帽和底部牢固地夹在一起以在O形环上提供充分的压力来产生密封效果。这样，如参考实施例3所描述，该整个部件装配系统精确地模仿出24槽小瓶-帽部件装配系统。任选地，可容易地修改嵌段设计以适应其它较大规模的格式(如48或96槽)。
向嵌段底部的槽中注入0.5至1mL如考实施例1所描述的介质，并用5至10μL参考实施例1所描述的细菌菌株的隔夜培养物进行培养。然后将嵌段底部和包含标准尺寸白色浴室瓷砖的顶部定位并夹在一起，然后将该部件装配系统在适当温度下放在旋转速度设定在每分钟1至3转的组织培养旋转器上或放进摇动培养器中，持续24小时。任选地，然后用新鲜介质替换原来的1mL液体介质，且培养再持续24小时；按此顺序重复更换介质和持续生长1至3次以得到所需厚度的生物膜。
生长之后，移开嵌段底部并用200μL 1％CV溶液(在~10％乙醇中)更换原来的液体。然后重新装配好嵌段系统，重新将其放置在组织培养旋转器上，并在上述环境中培养约15至75分钟以使生物膜染色。拆开嵌段系统各部分，在温和的去离子水流下冲洗包含瓷砖表面的嵌段帽，直至除去所有可见的非紧附染料。任选地，可使用试管刷和常见的洗涤剂除去任何吸附在嵌段底部槽壁的多余染料；这有助于减少由于有时会发生的非具体染色而出现的任何背景。作为更快的可选择的方法，可只需用一个新的或预先清洁过的嵌段底部更换该染色的嵌段底部。然后向每个槽滴入0.5至1.0mL 1％脱氧胆酸钠在95％乙醇中的溶液(且可供选择地4至6个直径是1至3mm的玻璃珠以辅助除去染料)，以萃取瓷砖表面的紧附染料，重新装配好嵌段帽和底部，然后或者重新将其放置在组织培养旋转器上，紧接着在上述环境中培养约0.5至2小时，或任选地，剧烈摇动1至5分钟。随后，如参考实施例1所描述，将吸取的未稀释的或稀释的(在乙醇中)CV萃取物样本从解开的嵌段转移至平底聚苯乙烯微滴定浓度板，并用小板读数器测量吸光率，然后同对照组加以比较。
使用后，移去并丢弃表面，槽80/85很容易能用试管刷和常见的洗涤剂制剂清洁后供再次使用。
根据本公开内容，对于本领域的技术人员显而易见的是，描述检测防止生物膜形成的化合物的本生长和检测方法可容易地应用于筛选引发生物膜分散的化合物，其操作是：首先让生物膜在没有这些化合物的条件下生长，然后测量加入这些化合物之后的效果。
表5显示了使用所述方法收集的数据，荧光杆菌生物膜在标准浴室无光泽白瓷砖上连续生长72小时，包括两次更换液体生长介质。使用了聚丙烯嵌段帽和底部。所报告的数据是在586nm下测量200μL萃取的染料溶液所得的光密度，共16组培养槽和8组对照槽。对照槽(第5和6列)没有用细菌培养，但跟培养槽(第1至4列)进行一样的处理。较小的数字表示较少的生物膜生长。
                                  表5
    1     2     3     4     5   6
    A   0.442   0.444   0.576   0.566   0.302   0.331
    B   0.463   0.412   0.538   0.603   0.282   *
    C   0.451   0.358   0.488   0.623   0.267   0.324
    D   0.478   0.579   0.624   0.691   0.260   0.304
*无可获得数据
表6显示了类似的光密度数据，也是使用所述方法收集的，但采用的是表皮葡萄球菌生物膜在标准浴室有光泽白瓷砖上生长72小时，包括两次更换液体生长介质。使用了聚丙烯嵌段帽和底部。所报告的数据是光密度测量结果，共20组培养槽(第1至5列)和4组对照槽(第6列)。较小的数字表示较少的生物膜生长。
                                        表6
    1     2     3     4     5   6
    A   0.830   0.595   1.065   1.152   1.111   0.241
    B   0.633   0.858   0.849   0.878   0.743   *
    C   0.842   0.746   1.561   0.822   0.801   0.167
    D   0.961   1.076   1.157   1.013   1.048   *
*无可获得数据
表5和表6一起清楚地证明了上述检测方法实现了多种细菌的可再生生物膜生长，并且适于检测生物膜控制化合物的效力。
参考实施例6-基于3-片生长室阵列的生物膜生长和检测方法
除槽孔钻至完全贯穿嵌段外，如图2b、3和4所示，加工聚丙烯或TEFLON嵌段以产生24个单体圆柱体槽的阵列，如参考实施例5所示。制作两个与上述及图2b、3和4所示的盖部件(嵌段帽)相同的盖部件。
除了当更换嵌段底部槽中的液体生长介质时，只需移去一个盖部件外，3P-GCA的使用与参考实施例5所述的2P-GCA相同。这种设计的优点是，如果研究的是敏感的生物膜，在整个方法中它们完全不会受到干扰。如果研究的生物膜是对干扰不敏感的，那么3P-GCA的另一个优点是其每个盖部件90的两个表面30都可用于生长生物膜，特别是为了生物膜的生长将3P-GCA安放在组织培养旋转器上，以使液体生长介质能接触两个表面30。
根据本公开内容，对于本领域的技术人员显而易见的是，通过最优化生长介质组合物和体积、通风(旋转速率)、温度、介质更换、接种体大小、以及其它化学、物理和生物参数，2P-GCA和3P-GCA都是充分多用的，能生长和检测在任何表面上任何细菌或真菌的生物膜。
表7显示了使用上述3P-GCA方法检测的化合物，采用的是表皮葡萄球菌生物膜在标准浴室无光泽白瓷砖上生长72小时，包括两次更换液体生长介质。使用了聚丙烯嵌段组件。所报告的数据是光密度测量结果，每种检测的化合物有3组培养槽，包括3个培养的和3个未培养的槽组，相对应的是第1列(化合物32)、第2列(化合物168)、第3列(化合物226)、第4列(培养的对照槽)和第5列(未培养的对照槽)。较小的数字表示较少的生物膜生长。
                                     表7
    1     2     3     4     5
    A     0.175     1.981     0.202     2.387     0.211
    B     0.244     1.581     0.269     1.870     0.162
    C     0.207     1.517     0.147     2.201     0.206
从数据可看出，化合物32和226明显地具有强大的生物膜阻止活性，而化合物168在该种检测方法中具有更加温和的效果，同参考实施例1和2所描述的方法相比，这种方法更实际但生产量较小。
根据本公开内容，对于本领域的技术人员显而易见的是，描述检测阻止生物膜形成的化合物的本生长和检测方法可容易地应用于筛选引发生物膜分散的化合物，其操作如下：首先让生物膜在没有这些化合物的条件下生长，然后测量加入这些化合物之后的效果。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案，根据本公开内容，对本领域专业人员显而易见的是，在不背离本发明精神和范围的条件下，可以对其进行各种改变或变化。因此在附加的权利要求书中将覆盖在本发明范围内的所有这些变化或改变。

Claims (10)

1.控制基质上的生物膜方法，所述方法包括：
用具有结构A的化合物接触所述基质：
Figure A028089260002C1
其中n是1至4；和
当n是1时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H、C6-C20烷基或链烯基；
其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H；
当n是2时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H；C4-C20烷基或链烯基；
其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H；
当n是3时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H；C5-C20烷基或链烯基；
其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H；或
当n是4时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H、C1-C20烷基或C2-C20链烯基；
或其盐，或其立体异构体；
或用具有结构B的化合物接触所述生物膜：
Figure A028089260003C1
其中
n和m独立地是1、2、3或4，
X是C1-C20烷基或C2-C20链烯基；
R1和R4独立地是H、烷基、酰基或烷氧羰基，和
R2和R3独立地是H或烷基；
前提条件是当n和m是2时，X是C8-C20烷基或C8-C20链烯基；
或其盐或其立体异构体；
接触充分长的时间以控制所述基质上的所述生物膜。
2.具有结构A的化合物：
Figure A028089260003C2
其中n是1、3或4；和
当n是1时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H、C6-C20烷基或链烯基；
其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H；
当n是3时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H；C5-C20烷基或链烯基；
其中当R是H时，R1和R2其中之一不是H；或
当n是4时，
R是H、烷基、酰基或烷氧羰基；和
R1和R2独立地是H；C5-C20烷基或链烯基；
或其盐，或其立体异构体。
3.具有结构B的化合物：
其中
n和m独立地是1，2，3或4，
X是C1-C20烷基或C2-C20链烯基；
R1和R4独立地是H、烷基、酰基或烷氧羰基，和
R2和R3独立地是H或烷基；
前提条件是当n和m是2时，X是C8-C20烷基或C8-C20链烯基；
或其盐，或其立体异构体。
4.包括如权利要求2所述的化合物和包括载体的组合物。
5.包括如权利要求3所述的化合物和包括载体的组合物。
6.装置，所述装置用于检测基质表面生物膜控制，并包括：
第一主体，所述第一主体具有支持无凸起的可移动基质表面的平台，所述基质表面用于生长生物膜；和
第二主体，所述第二主体适于同轴接受所述第一主体，所述第二主体具有多个单体槽；
其中当所述第一和第二主体装配起来并使用时，这些槽与所述第一主体的基质表面保持液体密封流通。
7.装置，所述装置用于检测基质表面生物膜控制并包括：
第一和第三主体，每个主体具有支持无凸起的可移动基质表面的平台，所述基质表面用于生长生物膜；和
第二主体，其具有第一面和第二面，所述第二主体以三明治对齐的方式在所述第一面和第二面接受所述第一主体和第三主体，所述第二主体具有多个从所述第一面伸展到所述第二面的单体孔，这些孔的两端形成槽开口，当装配好所述装置进行使用时，这些孔与所述第一和第三主体的基质表面保持液体密封流通。
8.筛选用于基质表面生物膜控制的试验化合物的方法，所述方法包括：
获得如权利要求7所述的装置；
在容许没有试验化合物在基质表面形成生物膜的条件下，在所述装置的槽中用试验化合物培养生物膜形成的微生物；
比较有所述试验化合物和没有所述试验化合物两种情况下生物膜在所述基质表面的形成，
其中当有所述试验化合物情况下生物膜的形成少于没有所述试验化合物的情况时，则说明所述试验化合物对生物膜在所述基质表面的形成有抑制活性，和
其中当有所述试验化合物情况下生物膜的形成多于没有所述试验化合物的情况时，则说明所述试验化合物对生物膜在所述基质表面的形成有促进活性。
9.筛选用于分散基质表面现有生物膜的试验化合物的方法，所述方法包括：
获得如权利要求7所述的装置；
在所述装置的槽中培养生物膜形成的微生物以在所述基质表面形成生物膜；
用试验化合物接触所述基质表面的生物膜；
比较有所述试验化合物和没有试验化合物两种情况下所述基质表面的生物膜的量，
其中当有所述试验化合物情况下生物膜的量少于没有所述试验化合物的情况时，则说明所述试验化合物对所述基质表面的生物膜的分散有活性。
10.用于增强具有生物膜分散活性的化合物对分散的生物膜的量的作用的方法，所述方法包括：
用具有生物膜分散活性的化合物培养生物膜足够长的时间以使所述化合物分散生物膜；
向所述生物膜添加碱；
培养生物膜足够长的时间以增强所述化合物的作用；和
确定当前生物膜的量；
其中同没有碱相比，碱的存在增强了所述化合物的作用。
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