FI103056B - Menetelmä ja testipakkaus näytteenottopinnan esikäsittelemiseksi - Google Patents

Description

103056

MENETELMÄ JA TESTIPAKKAUS NÄYTTEENOTTOPINNAN ESIKÄSITTE-LEMISEKSI

5 Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelmä näytteenottopinnan esikäsittelemiseksi ennen mikrobiologiseen tutkimukseen tarkoitetun näytteen ottamista.

Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 25 johdannon mukaista testipakkausta, joka 10 sisältää näytteenottimen ja näytteenottopinnan esikäsittelyyn tarkoitetun koostumuksen.

Mikro-organismit, kuten bakteerit, hiivat ja homeet, kiinnittyvät hyvin erilaisille pinnoille. Kasvaessaan ne muodostavat kerrostumia, joita sanotaan biofilmeiksi. Biofilmit voivat olla hyvin monitahoisia ja ne ovat usein eri mikrobilajien sekakasvustoja. Mikrobien taipu-15 musta muodostaa biofilmiä voidaan pitää niiden eloonjäämisstrategiana, jolla ne optimoivat saatavilla olevien ravinteiden hyväksikäytön. Tiedetään, että jos mikrobit pääsevät muodostamaan biofilmiä, niin niiden aiheuttamat terveysriskit ja saastumisongelmat tulevat hankalammiksi hoitaa. Suojaavan biofilmikerroksen sisällä mikro-organismit pystyvät tehokkaasti vastustamaan antiseptisten aineiden ja antibioottien vaikutusta ja monien 20 patogeenien tiedetäänkin säilyvän hengissä pitkiäkin aikoja biofilmi suojanaan (Costerton, . J.W., Marrie, T.J. ja Cheng, K.-J., 1985. Phenomena of bacterial adhesion. Teoksessa:

Savage, D.C. and Fletcher, M. (toim.) Bacterial Adhesion. New York: Plenum Press, s.

3-43).

25 Biofilmit aiheuttavat ongelmia eri teollisuuden aloilla. Niiden aiheuttamat ongelmat voidaan jakaa kahteen pääryhmään: hygieeniset ongelmat ja itse tuotantoprosessiin vai-' kuttavat ongelmat. Korkeaa hygieniaa vaativassa tuotannossa lieväkin mikro-organismien kasvusto voi pilata koko tuotteen. Alentunut hygienia aiheuttaa ongelmia mm. elintarviketeollisuudessa ja terveydenhuollossa sekä vesijärjestelmissä. Muunlaisia itse 30 tuotantoprosessiin vaikuttavia ongelmia, kuten limamuodostusta laitteissa ja putkistoissa, esiintyy erityisesti puunjalostusteollisuudessa sekä myös muualla prosessiteollisuudessa, 103056 2 ilmanvaihtokanavissa ja jopa desinfiointiliuosten pulloissa. Eräillä teollisuuden aloilla mikrobit voivat lisätä jopa korroosion syntyä.

Mikrobien muodostamaa biofilmiä ja niiden aiheuttamia ongelmia tavataan kuitenkin 5 muualtakin kuin pelkästään teollisuudesta, esim. kylpyhuoneen kaakeleista, saunan lauteilta ja uima-ja porealtaista.

Jos biofilmejä pääsee muodostumaan elintarvike- ja prosessiteollisuudessa, voivat niiden sisältämät mikro-organismit saastuttaa mittavia tuotemääriä. Siksi jatkuva hygienian 10 seuranta onkin, tai ainakin tulisi olla, käytössä useimmissa tuotantolaitoksissa. Usein käy kuitenkin niin, että biofilmi todetaan vasta siinä vaiheessa, kun biofilmi on silmin nähtävissä ja ongelmat ovat jo syntyneet kuten, että prosessilaitteessa on toimintahäiriö, putkisto tai venttiili on tukkeutunut, tai korroosiota muodostunut.

15 Biofilmin rakenteelle on ominaista, että suurin osa, 85 - 98 %, siitä on vettä. Lisäksi se sisältää mikrobien muodostamia polysakkarideja ja mineraalikerääntymiä ja ympäristöstä riippuen erilaista likaa (Costerton, J.W., Irvin, R.T. ja Cheng, K.-J., 1981. The bacterial glycocalyx in nature and disease. Ann. Rev. Microbiol., 35,299-324.) Kiertojäijestelmän toimiessa ja veden virratessa biofilmin määrä on huomattavan paljon suurempi kuin silloin, 20 kun veden kierrätys on keskeytynyt ja tarkkaillaan kuivaa putken pintaa. Kiertävässä nes-. teessä oleva märkä, 500 mikrometrin biofilmi kutistuu 2-5 %:iin kokonaistilavuudestaan ja 10-25 mikrometrin paksuiseksi. Tällainen biofilmi lisää kitkaa ja vastaavasti energiankulutusta vedenkiertojäijestelmissä tai muissa putkistoissa ja laitteissa, vaikka se ei välttämättä ole silmin nähtävissä. Biofilmien rakenne vaihtelee hyvin paljon, mikä johtuu 25 pintamateriaalien, ravinteiden ja mikrobien vaihtelevuudesta, kunkin tekijän tuottaessa erilaisia biofilmejä. Tästä johtuukin, että niiden syntymistavasta ja tarkasta rakenteesta ei • « · voida saada yksiselitteisen selkeätä kuvaa. Biofilmien rakenne onkin selvitettävä tapauskohtaisesti.

30 Biofilmi voidaan todeta ja tutkia mittaamalla biofilmin paksuutta sekä väijäämällä biofilmikerros. Lisäksi biofilmin sisältämät mikro-organismit voidaan määrittää ottamalla biofilmistä näyte, jota viljellään kasvualustalla.

3 103056

Biofilmin paksuuden mittaamiseen käytetään ns. suoria ja epäsuoria tutkimusmenetelmiä. Volumetrinen menetelmä perustuu märkäpainon mittaamiseen ja pinta-ala-massatiheysmit-taukset perustuvat kuivapainomäärityksiin. Lisäksi biofilmejä voidaan mitata mikroskopialla, valon läpäisykyvyn, lämmön- tai sähkönjohtokyvyn sekä oskillaation avulla. Useim-5 mat edellä mainituista menetelmistä ovat kuitenkin hankalia toteuttaa käytännön valvonta-työssä, koska käyttäjäystävällisiä laitteita ei ole olemassa (Characklis ja Picologlou, 1978). Teollisuus on kiinnostunut siitä, mistä ongelma johtuu, eikä välttämättä biofilmin paksuudesta.

10 Suoraväijäyksen tekeminen putken pinnalla olevasta biofilmistä on potentiaalisesti hyvä keino valvoa sen kasvamista, mutta väijäystä on vaikea toteuttaa suljetuissa putkistoissa, koska väriä, usein karsinogeenista, joutuu prosessiin ja värit voivat itse muodostaa saostumia ja ovat kaiken lisäksi hankalia puhdistaa. Niinpä on ehdotettu biofilmin erottamista alustastaan väkevällä typpihapolla, minkä jälkeen biofilmi värjätään ja sen rakennetta 15 tutkitaan mikroskooppisesti. Värjäyksissä on mahdollista käyttää erilaisia väriaineita, jotka tarttuvat polysakkaridiketjuihin, kuten esim. Aidan sininen, toluidiinisininen ja erytrosiini. Näin värjätyistä näytteistä onkin huomattu, että pelkästään mikrobien avulla muodostuneet biofilmit sisältävät pääasiassa mikrobien itsensä erittämiä polymeerejä, jotka ovat rakenteeltaan monimutkaisia eri sokerien polymeerejä.

20 ·. Muista käytössä olevista menetelmistä mainittakoon mittaukset biofilmin aikaansaamista muutoksista lämmönjohtavuudessa ja kitkavoimassa (Characklis, W.G. ja Picologou, B.F. 1978. Measurement of the formation and destruction of primary biofouling films. Teoksessa: Gray, R.H. (toim.). Proceedings of the Ocean Thermal Energy Conversion (OTEC) 25 Biofouling and Coosion Symposium. October 10-12, 1977, Seattle, Washington. Spring-field Va., National Technical Information Service, s. 51-61).

Biofilmin toteamiseen ja kontrollointiin on kehitetty ns. biofilmimonitori, joka mittaa esim. jäähdytyslaitteistossa virtauksen aikana mahdollisesti tapahtuvaa paineen muutosta. Pai-30 neen muutos on verrannollinen kitkavoimaan, joka puolestaan on verrannollinen jäähdytysjärjestelmän kitkavoimaan. Kuten epäsuorissa, esim. värjäyksiin perustuvissa menetelmis- 103056 4 sä, on myös monitorien ongelmana ollut epätarkkuus (Characklis, W.G. ja Marshall, K.C.

(toim.). 1990. Biofilms. New York: John Wiley & Sons, Inc. 703 s.).

t

Kuten edellä mainittiin biofilmit voidaan erottaa alustastaan väkevällä typpihapolla. Täl-5 löin erotetusta biofilmistä ei ole mahdollista osoittaa ja tunnistaa mikro-organismeja viljelemällä kasvualustalla, koska ko. käsittely tappaa mikro-organismit. Käytännössä mikro-organismien määritykseen tarkoitetut biofilminäytteet on siksi otettu vanutupoilla, jotka on kastettu peptonisaliiniliuokseen, joka sisältää mikro-organismien tarvitsemia ravinteita. Peptonisaliiniliuoksella saadaan kuitenkin vain vähäisiä mikro-organismimääriä erotetuksi 10 biofilmistä ja nipotuksen jälkeen näytteenottopintaan jää vielä yli puolet biofilmistä.

Edellä mainitut tutkimustulokset osoittavat, että biofilmien detektioon tarvitaan yksinkertaisempia ja helppokäyttöisempiä menetelmiä erityisesti prosessiteollisuudessa ja ilmas-tointiteollisuudessa. Etenkin tarvitaan menetelmä, jolla voidaan tarkistaa ovatko prosessi-15 pinnat biofilmivapaita vai ei. Edellä mainituilla teollisuuden aloilla biofilmit muodostavat erityisen ongelman, siksi biofilmien osuutta bakteerien lähteenä tutkitaan. Prosessihy-gieniapuolella riittävän hygieniatason arvioinnilla, ja tämän tason saavuttamisella, on ratkaiseva merkitys. Ilmastointipuolella vallitsee epätietoisuus pintahygienisten olosuhteiden merkityksestä ilmatilan mikrobimäärään.

20 : Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on selvittää ja poistaa edellä mainitut ongelmat ja saada aikaan uusi menetelmä biofilmien tutkimiseksi ja biofilmien toteamiseksi ennen kuin ne ovat silmin erotettavissa. Keksinnön tarkoituksena on myös aikaansaada ratkaisu biofilmien ja mikro-organismien irrottamiseksi tutkittavilta pinnoilta siten, että pinnalta irrotetut 25 mikro-organismit voidaan osoittaa ja määrittää.

Keksintö perustuu siihen ajatukseen, että biofilmiä ja mikro-organismeja irrotetaan tutkittavalta pinnalta käyttämällä sopivia kemikaaleja tai niiden seoksia, jotka levitetään pinnalle ennen näytteen ottamista. Tällainen biofilmejä ja mikro-organismeja toistettavasti irrottava 30 seos voi koostua kemiallisesti eri tavoin vaikuttavista aineista.

5 103056

Erilaisten detergenttien ja entsyymien seosten käyttö pesuaineissa on sinänsä tunnettua patenttikiijallisuudesta. Niinpä DE-hakemusjulkaisuissa 2 948 791 ja 3 003 766 on esitetty polyetyleeniglykolin, anionisten ja kationisten tensidien sekä Bacilluksen entsyymien, proteaasien, lipaasien ja amylaasien käyttö tahranpoistoaineissa ja pesuaineissa kohote-5 tuissa lämpötiloissa lian irrottamiseksi. Näissä julkaisuissa ei kuitenkaan ole selvitetty pesuaineiden tehoa mikro-organismien irrotuksessa. Käytettyjen vaikuttavien aineiden pitoisuus ja lämpötilat ovat lisäksi niin korkeat, että bakteerit ja yleensä kaikki mikro-organismit tuhoutuvat lian irrotuksen yhteydessä. Kyseiset tunnetut pesuainekoostumukset eivät siis sellaisenaan sovellu pintojen hygienian seurantaan. Toisaalta entsyymejä 10 sisältävää bakteerijauhetta on ehdotettu soveltuvaksi tukkeutuneiden viemäriputkistojen avaamiseen US-patenttijulkaisussa 5 464 766. Tunnettu menetelmä ei puolestaan sovellu mikrobien määrittämiseen tutkittavista pinnoista, koska seos jo itsessään sisältää bakteereja. Julkaisussa Nagata et ai. (Nagata, A., Sakiyama, T., Itoh, H., Toyomasu, T., Enomoto, E., Nagai, T., Saeki, T. Ja Nakanishi, K., 1995, Comparative Study on Caustic and 15 Enzymatic Cleanings of Stainless Steel Surface Fouled with β-Lactoglobulin, Biosci. Biotech. Biochem. 59,2277-2281) on selostettu keinotekoisesti proteiinilla liattujen pintojen puhdistusta alkalilla ja entsyymeillä, jolloin tutkimuksessa todettiin, että kemiallinen aine vaikuttaa sitä paremmin mitä suurempi on sen pitoisuus. Mikro-organismien irtoamista ei myöskään Nagatan julkaisussa ole selvitelty.

20 . Erona edellä esitettyihin ratkaisuihin, joissa detergenttejä ja entsyymejä on käytetty mikrobisidisinä pesuaineina tai sentapaisina koostumuksina, esillä olevassa keksinnössä käytetään irrottavia aineita sellaisissa olosuhteissa, että näytteen rakenne löyhentyy ja näytteen irrottaminen pinnalta helpottuu ilman, että mikrobit kuolevat. Tällöin biofilmit 25 voidaan tutkia ja niiden sisältämät mikro-organismit määrittää esim. viljelemällä.

Niinpä esillä olevassa keksinnössä tutkittava pinta saatetaan kosketuksiin näytteen rakenteeseen vaikuttavan aineen kanssa mikro-organismeille sopivassa pH-arvossa. Pinta saatetaan edullisesti kosketuksiin sellaisen koostumuksen kanssa, joka vaikuttavana 30 aineena sisältää kelatoivan aineen, detergentin, alkoholin, amiinin, pelkistävän aineen ja/tai hydrolyyttisen entsyymin tai hydrolyyttisten entsyymien seoksen. Erään erityisen edullisen sovellutusmuodon mukaan koostumus sisältää ainakin kaksi mainituista aineista 103056 6 fysiologisessa puskuriliuoksessa. Koostumus sisältää sopivimmin edelleen hankaavaa ainetta näytteenottopinnalta irrotettavan näytteen määrän kasvattamiseksi.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tun-5 nusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukainen testipakkaus käsittää näytteenottopinnan esikäsittelyyn tarkoitetun koostumuksen, joka sisältää vaikuttavana aineena kelatoivan aineen, alkoholin, detergentin, pelkistävän aineen, amiiniyhdisteen, hydrolyyttisen entsyymin ja/tai hydrolyyttisten 10 entsyymien seoksen fysiologisessa puskuriliuoksessa, jolloin kunkin vaikuttavan aineen pitoisuus on 0,01 -2,0 paino-%.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle testipakkaukselle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 25 tunnusmerkkiosassa.

15

Keksinnön avulla saadaan aikaan luotettava näytteenottomenetelmä, joka erityisen hyvin soveltuu hygianiavalvontaan. Etenkin esillä olevan ratkaisun avulla voidaan biofilmejä ja sentapaisia mikro-organismikerrostumia sisältäviä ympäristönäytteitä tai biologista materiaalia esikäsitellä näytteen rakennetta löyhentävän aineen avulla siten, että biofilmi ja 20 mikro-organismit saadaan paremmin irrotetuksi alustastaan, jolloin tutkittaville pinnoille . kertyneet mikro-organismit voidaan määrittää luotettavasti ja toistettavasti. Keksintö on helposti yhdistettävissä nykyiseen määritystekniikkaan, jolloin biofilmin tai mikro-organismien irrottamisen jälkeen mikro-organismit voidaan määrittää sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esim. viljelemällä joko kontaktimaljalla, kastolevyllä tai kasvumaljalla, tai 25 muilla menetelmillä, kuten mikro-organismienATP-määrityksellä, luminesenssillä, sähkönjohtokyvyn muutokseen perustuvilla impedanssimenetelmillä, tai suorilla immunologisilla, mikro-organismien antigeeneihin perustuvilla menetelmillä.

Keksinnön kohteena oleva menetelmä sopii käytettäväksi mikro-organismien irrottamiseen 3 0 elintarviketeollisuuden ja muiden prosessilaitteiden ja ilmanvaihtojäijestelmien pinnoilta sekä erilaisissa tilanteissa, missä tarvitaan hygienian jatkuvaa seurantaa, kuten 7 103056 elintarviketeollisuuden omavalvonnassa ja sairaaloissa tauteja aiheuttavien bakteerien tuhoamisen varmistamisessa.

Menetelmä on esimerkiksi sovelias irrottamaan elintarvikkeita pilaavia ja terveydelle vaa-5 rallista mikro-organismeja, kuten Pseudomonas fragia, Listeria monocytogenesta, Candida utilista, Bacillus cereusta, Aspergillus nigeriä ja myös muita bakteereja, hiivoja ja homeita. Näillä uusilla käsittelytavoilla mikrobit irtoavat toistettavasti paremmin eri ikäisistä, niin yksittäisten mikro-organismien kuin useiden mikro-organismien muodostamista kasvustoista ns. sekapopulaatioista kuin perinteisellä vanhalla tavalla, pep-10 tonisaliinikäsittelyllä.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohtaisen selostuksen ja muutamien sovellutusesimerkkien avulla. Sovellukset ovat esimerkkejä eivätkä ne missään tapauksessa rajaa keksintöä näihin esitettyihin esimerkkeihin.

15 Näytteen "rakenteeseen vaikuttavalla aineella" tarkoitetaan tässä keksinnössä sellaista ainetta, joka löyhentää mikrobien kasvualustan matriisia ja vähentää sen adheesiota tutkittavaan pintaan. Tällainen aine saattaa esim. hydrolysoida matriisin polysakkaridi-ketjuja ja vähentää ketjujen välisiä vetysidoksia. Aine voi myös vähentää matriisin 20 hydrofobisuutta, jolloin se helpommin saadaan siirretyksi vesifaasiin. Tällaisia aineita ovat detergentit, alkoholit, amiinit, pelkistävät aineet ja kelatoivat aineet. Monet keksinnössä käytettävistä aineista, ovat sellaisia, joiden tiedetään suurina pitoisuuksina estävän mikro-organismien kasvua ja lisääntymistä. Niinpä esim. kelatoivat aineet sitovat mikro-organismien metabolian tarvitsemat siirtymämetallit (Fe ja Mn) ja alkoholit ovat tunnetusti 25 mikrobisidejä yli 50 %:n pitoisuuksina. Näitä aineita käytetään kuitenkin niin pieninä määrinä, etteivät mikro-organismit käsittelyn yhteydessä kuole. On oleellista, että määritettävän aineen määrä ei aineen vaikutusaikana muutu ja ettei mikro-organismien kasvu - oleellisesti esty. Siksi keksinnön yhteydessä on todettu, että koostumuksessa kunkin vai kuttavan aineen konsentraatio on sopivimmin noin 0,01 - 2,0 paino- %.

30

Detergenttien, alkoholien, amiinien, pelkistävien aineiden ja kelatoivien aineiden lisäksi käsittelykoostumukseen voidaan lisätä sellainen hydrolyyttinen entsyymi tai mahdolli- 103056 8 simman laajaspektrinen hydrolyyttisten entsyymien seos, joka osaltaan auttaa biofilmin hellävaraisessa irrotuksessa alustastaan ja parantaa analyysien määritysherkkyyttä mikro-organismien suhteen, mutta ei myöskään tuhoa mikro-organismeja. Sopiva entsyymiseos voidaan valita käyttökohteen mukaan, koska bakteerien muodostaman biofilmin lisäksi 5 pinnat voivat sisältää monenlaista proteiini-, hiilihydraatti- tai rasvapitoista likaa.

Edellä esitetyn perusteella keksinnön mukainen koostumus sisältää esim.

a) 0 - 1,0 paino-% kelaatin muodostajaa, kuten aminotetrakarboksylaattia, b) 0 - 2,0 paino-% detergenttiä, kuten non-ionista polyoksietyleenityyppistä ainetta, non- 10 ionista alkyyliglukosidityyppistä ainetta, amfolyyttistä kak- soisionityyppistä ainetta tai anionista yhdistettä, c) 0 - 1,0 paino-% pelkistävää ainetta, d) 0 - 1,0 paino-% alkoholia, e) 0 - 1,0 paino-% amiinia, kuten trietanoliamiinia, 15 f) 0 - 1,0 paino-% hydrolyyttistä entsyymiseosta, joka sisältää pektinaasiaktiivisuutta, pektinaasi-ja proteaasiaktiivisuutta, pektinaasi-, proteaasi-ja amy-laasiaktiivisuutta, pektinaasi-ja sellulaasiaktiivisuutta, amylaasiak-tiivisuutta tai amylaasi- ja papaiiniaktiivisuutta, ja/tai g) 0 - 1,0 paino-% hankaavaa ainetta, kuten metasilikaattia, polyfosfaattia, fosfaattia tai 20 lateksipartikkeleita.

Sopivimmin yllä mainittujen komponenttien pitoisuudet ovat seuraavat: a, c - g: 0,01 - 0,95 paino-%, edullisesti 0,05 - 0,5 paino-% b: 0,01 - 1,95 paino-%, edullisesti 0,05 - 1,5 paino-% 25

Edullisesti keksinnön mukaiseen näytteen esikäsittelykoostumukseen sisältyy ainakin kaksi komponenteista a - g, jolloin vaikuttavien aineiden yhteispitoisuus on sopivimmin korkeintaan 3 paino-%, edullisesti korkeintaan 2,0 paino-%.

30 Käytettävien entsyymien aktiivisuudet ovat sopivimmin noin 0,1 - 10.000 U/mg kuiva-• ainetta, jolloin entsyymiä käytetään edullisesti noin 1 pg - 100 mg/g (näytteen) kuiva- ainetta.

103056 9

Esimerkkeinä keksinnössä käytettävistä aineista mainittakoon seuraavat:

Kelatoivat aineet: epäorgaaniset ja orgaaniset yhdisteet. Epäorgaaniset kompleksinmuodostajat ovat erilaisia syklisiä ja lineaarisia fosfaattiyhdisteitä, esim. polyfosfaatteja, 5 kuten natriumpolyfosfaatti (Na5P3O]0, STPP). Tärkeimmät orgaaniset kompleksinmuodostajat ovat aminokarboksyylihapot ja niiden suolat, joissa happo-osana on etikkahappo (esimerkkeinä mainittakoon etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), n-hydroksietyyli-etyleenidiamiinitrietikkahappo (HEDTA), dietyleenitriamiinipentaetikkahappo (DTPA), nitriloetikkahappo (NTA), etyleenidiamiini-di-(o-hydroksifenyylietikkahappo) (EDDHA), 10 dietanoliglysiini (DEG) ja etanolidiglysiini (EDG), etyleeniglykkolibistetraetikkahappo (EGTA) sekä näiden suolat, etenkin alkalimetallisuolat, hydroksihapot (glukonihappo, glukoheptonihappo ja muut sokerihapot, kuten β-glukoisosakkariinihappo, a-isosakka-riinihappo, viinihappo, omenahappo ja sitruunahappo) ja niiden suolat, sekä organofos-faatit, joissa happo-osana on fosforihappo (esimerkkeinä mainittakoon aminotrimety-15 leenifosfonihappo (ATMP), l-hydroksietylideeni-l,l-difosfonihappo (HEDP), ety-leenidiamiini-tetrametyleenifosfonihappo (EDTMP), dietyleenitriamiinipentamety-leenifosfonihappo (DTPMP) ja niiden suolat.

Detergentit: non-ioniset polyoksialkyleenityyppiset aineet, non-ioniset alkyyliglukosidi-20 tyyppiset aineet, amfolyyttiset kaksoisionityyppiset aineet sekä anioniset ja kationiset yh-• disteet. Polyoksialkyleenityyppisistä aineista voidaan etenkin mainita polyoksialkyleenien mono- ja trisorbitaaniesterit (sorbitoli ja sen anhydridien rasvahappoesterit, jotka on kopo-lymeroitu etyleenioksidin kanssa. Esimerkkeinä lueteltakoon Polysorbaatti 80 (oleaattieste-ri), Polysorbaatti 20 (lauraattiesteri), Polysorbaatti 40 (palmitaattiesteri) ja Polysorbaatti 60 25 (stearaattiesteri). Non-ionisista aineista voidan mainita alkyylifenyylipolyoksietyleeni-, yhdisteet (esim. Triton ® ja Nonidet®) ja oktyyli-beta-D-glukopyranosidi. Amfolyyttisistä aineista voidaan mainita betaiinikaakaovoihappo (esim. DEHYTON® ).Anionisia yhdisteitä ovat sappisuolat (natriumtaurokolaatti, natriumkolaatti, natriumdeoksikolaatti ja nat-riumglykokolaatti). Kationisistä yhdisteistä voidaan mainita bentsalkoniumkloridi ja amfo-30 teerisistä pinta-aktiivisista aineista sulfobetaiinit, kuten N-dodekyyli-N,N-dimetyyli-2-ammonio-1-etaanisulfonaatti.

103056 10

Amiinit: Sopivia amiineja ovat etenkin alkanolamiinit, kuten mono-, di- tai trialkanola-miinit, joissa alkanoliryhmä on metanoli-, etanoli-, propanoli- tai isopropanoliryhmä.

Pelkistävät aineet: Sopivia pelkästäviä aineita ovat vapaita SH-ryhmiä sisältävät tiolit ja 5 ditiolit, kuten N-asetyyli-L-kysteiini, L-kysteiini, natriumtioglykolaatti, 2-merkaptoetanoli, β-merkaptoetyyliamiini ja ditiotreitoli.

Hydrolyyttiset entsyymit: valmisteet, jotka sisältävät pektinaasiaktiivisuutta, pektinaasi-ja proteaasiaktiivisuutta, pektinaasi-, proteaasi-jaamylaasiaktiivisuutta, sellulaasiaktiivisuut-10 ta, hemisellulaasiaktiivisuutta, pektinaasi- ja sellulaasiaktiivisuutta, amylaasiaktiivisuutta tai amylaasi- ja papaiiniaktiivisuutta sekä edellisten seokset.

Alkoholit: etenkin alifaattiset alkoholit, sopivimmin isopropanoli, heksanoli, tridekanoli, etanoli tai metanoli.

15

Hankaavat aineet: silikaatit (esim. natriummetasilikaatti), polyfosfaatit, fosfaatit ja lateksit.

Keksinnön mukaista ratkaisua voidaan käyttää biofilmi-ja mikrobinäytteiden erottamiseksi prosessipinnoilta ja sentapaisilta pinnoilta, joiden päälle on muodostunut mikro-organismi-20 en tuottamia kerrostumia. Keksinnön avulla voidaan myös selvittää sisältääkö tutkittava i ' pinta biofilmiä ja/tai mikrobeja vai ei. Niinpä keksintö sopii ympäristönäytteiden sekä biologisten materiaalien tutkimiseen. Merkittäviä sovelluskohteita ovat hygieniatutkimuk-set terveydenhoitoalalla (sairaalat, terveyskeskukset) sekä lääke-, elintarvike-ja rehuteollisuudessa. Nämä sovellukset käsittävät itse tuotteiden mikrobiologisen laaduntarkkailun 25 lisäksi myös tilojen (mm. pöydät, hyllyt, lattiat, seinät, katot, saniteettikalusteet, viemärit) ja prosessilaitteiden (mm. koneet, laitteet, putkistot, ilmastointiputket) hygieniset tutkimukset. Kyseisiä tutkimuksia suoritetaan enenevässä määrin lääke-, elintarvike-ja rehuteollisuudessa (esim. leipomoissa, meijereissä, einestehtaissa, teurastamoissa, rehusekoitta-moissa) sekä metsäteollisuudessa.

30 103056 11

Keksinnön mukaan yllä kuvattu käsittelyliuosta levitetään tutkittavalle näytteenottopinnal-Ie 0,001 - 1 ml, edullisesti noin 0,05 - 0,5 ml näytteen neliösenttimetriä kohti. Esikäsittelyn lämpötila on 4 - 45 °C ja sen kesto 1 - 30 minuuttia.

5 Kuten edellä mainittiin asetetaan käsittelyn pH-arvo mikro-organismeille sopivaksi, jolloin yleensä toimitaan pH-alueella 4-8. Erään edullisen vaihtoehdon mukaan vaikuttavat aineet on liuotettu tai suspendoitu fysiologiseen puskuriliuokseen, esim. sitraatti- tai trisasetatti-puskuriliuokseen, jonka pH-arvo on 6-7. Puskuriliuoksen konsentraatio on sopivimmin 0,001 -1 M, edullisesti 0,005 - 0,1 M.

10

Vaikuttava aine saatetaan kosketuksiin näytteenottopinnan kanssa kostuttamalla pinta vaikuttavan aineen liuoksella ennen näytteenottoa. Kostuttaminen voi tapahtua sumutta-malla sanottua liuosta näytteenottopinnalle tai levittämällä liuosta pinnan päälle siveltimellä tai näytteenottimella. Esikäsittelyn jälkeen pinnalta irrotetaan näyte, joka liuotetaan 15 tai suspendoidaan vesifaasiin näytteen tutkimiseksi. Kun käsittelykoostumus sisältää han-kaavia aineita näytteen irrottamista voidaan tehostaa hankaamalla pintaa näytteenottimella. Näytteenoton jälkeen näyte voidaan myös viljellä ravintoagarilla tai nestemäisessä ravinto-liuoksessa. Erään erityisen edullisen sovellutusmuodon mukaan esikäsitelty näytteenotto-pinta saatetaan kosketukseen viljelyalustan kanssa, jolla se voidaan määrittää.

20 Viljelyalustana käytetään kontaktimaljaa tai kastolevyä.

« T »

Edullisesti näytteenottopinta on bakteerien tai muiden mikro-organismien tuottama biofilmi. Huomioitava on myös, että näyte voidaan ottaa pinnalta, jolle biofilmiä ei vielä ole muodostunut. Kun halutaan ottaa näytteitä homeita sisältäviltä näytteenottopinnoilta, 25 käytetään tällöin sopivimmin koostumusta, joka sisältää kompleksinmuodostajia, hydrolysoivia entsyymejä ja hankaavaa ainetta. Esimerkkinä sopivasta valmisteesta mainittakoon seuraava koostumus, joka sisältää 0,05 -1,0 paino-% EDTA:ta, 0,1 - 1,0 paino-% pek-tinaasin, amylaasin ja proteaasin seosta sekä 0,1-1,0 paino-% natriummetasilikaattia.

30 Kun halutaan ottaa näytteitä eläviä bakteereja ja biofilmiä sisältäviltä näytteenottopinnoilta nipottamalla, käytettävä koostumus sisältää sopivimmin kompleksinmuodostajaa, detergenttiä ja hankaavaa ainetta. Niinpä koostumus voi sisältää 0,05 -1,0 paino-% 103056 12 EDTArta, 0,1 - 2,0 paino-% 4-(1,1,3,3-tetrametyylibutyyli)fenolin etoksilaattia tai polysor-baatinpolyoksietyleenijohdannaistajaO,l -1,0 % natriummetasilikaattia.

Sumuttamalla voidaan bakteereja ja biofilmiä sisältävälle pinnalle levittää trietanoliamii-5 nia, hankaavaa ainetta ja detergenttiä.

Näytteestä määritetään mikro-organismien määrä, jolloin näytteestä erotellaan ja määritetään eri mikro-organismit erikseen. Mikro-organismien toteaminen voi myös tapahtua niiden metaboliittien määrityksen avulla.

10

Testipakkauksen näytteenotin käsittää edellä kuvatun esikäsittelyliuoksen sekä näytteenot-timen, jossa on sopivaan pitimeen, esim. puu- tai muovipuikkoon tai tikkuun kiinnitetyn tupon, joka on puuvillavanua, dacronia, alginaattia tai vaahtomuovia.

15 Edellä on kuvattu keksinnön soveltamista mikrobiologiseen tutkimukseen tarkoitettujen näytteiden esikäsittelyyn. On kuitenkin selvää, että keksintöä voidaan soveltaa myös kemialliseen (esim. alkuaineanalyysiin) ja fysikaaliseen tutkimukseen tarkoitettujen näytteiden käsittelyyn.

20 Seuraavat esimerkit selventävät keksintöä.

* Käytetyt lyhenteet: ATP: adenosiinitrifosfaatti 25 Brij 35: polyoksietyleenin layryylieetteri CHAPS: 3,3,-kolamidopropyylidimetyyliammonioli-l-propaanisulfonaatti CHAPSO: 3,3,-kolamidopropyylidimetyyliammonioli-2-hydroksipropaanisulfonaatti EDTA: etylendiamiinitetraetikkahappo EGTA: etyleeniglykolibisaminoetyylieetterin tetraetikkahappo 30 RLU: relative light releasing unit = suhteellinen valomäärä SDS: natriumdodekyylisulfaatti Triton-X-100: oktyylifenoksipolyetoksietanoli 13 103056

Tween 80: polyoksietylenoyylisorbitolihappo RBS: alkaalinen tensidejä sisältävä pesuaine pmy: pesäkkettä muodostava yksikkö 5 Käytetyt menetelmät.

Tässä keksinnössä biofilmit on kasvatettuja irrotetut bakteerit on määritetty maljaviljelyllä ja kastolevyillä (Wirtanen, G. 1995. Biofilm formation and its elimination from food processing equipment, Espoo: The Technical Research Centre of Finland. VTT Publications 10 251, 106 s. + liitt. 48 s.) ja ATP-menetelmällä (ATP-määrityskitti, BioOrbit). Käsittelyn jälkeen pinnalle jääneet bakteerit ja biofilmin määrä on arvioitu kuvantamistekniikalla (Wirtanen, G. ja Mattila-Sandholm, T. 1993. Epifluoresence image analysis and cultivation of foodbome biofilm bacteria grown on stainless steel surfaces. J. Food. Prot., 56,678-683; Wirtanen, G. ja Mattila-Sandholm, T. 1994, Measurement of biofilm of Pediococcus 15 pentosaceus and Pseudomonas fragi on stainless steel surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2, 33-39).

Kävtetvt kemialliset aineet ia entsyymit 20 Kelatoivat aineet: EDTA, EGTA :/ Amiinit: trietanoliamiini

Alkoholi: isopropanoli

Pelkistävät aineet: N-asetyyli-L-kysteiini (seuraavassa lyhennettynä “asetyylikysteiini”) ja ditiotreitoli 25 Detergentit: Triton-X-100, oktyyliglukosidi, SDS, CHAPS, CHAPSO, BRIJ 35

Hydrolyyttiset entsyymit: pektinaasi E.C.3.2.1.15, proteaasi E.C.3.4.21.62, amylaasi E.C.3.2.1.1, sellulaasi E.C.3.2.1.4, papaiini E.C.3.4.22.2.

103056 14

Esimerkki 1

Biofilmin esikäsittely ja näytteen ottaminen

Biofilmin kasvatus nesteessä 5

Biofilmin kasvatuspintana käytettiin ruostumatonta teräslevyä, AISI 304/2B. Teräslevyt pestiin 50 °C lämpöisellä 2% RBS-pesuliuoksella, jossa niitä ravisteltiin 20 minuutin ajan (nopeus 75 ravistelua minuutissa). Levyt huuhdottiin viidesti 45 °C:sella kaksoistislatulla vedellä ravistelemalla kuten edellä 5 minuutin ajan, minkä jälkeen levyt autoklavoitiin.

10

Biofilmin muodostajana käytettiin Pseudomonas fragi-bakteeria (ATCC 4973), jota säilytettiin -80 °C:ssa. Kanta herätettiin ennen käyttöä Iso-Sensitest Broth-liuoksessa (Oxoid).

Biofilmiä kasvatettiin puhdistetuilla teräslevyillä (n. 10 kpl), jotka olivat objektilasin ko-15 koisia (18,75 cm2), 25 °C:ssa, yleensä 5 vuorokauden ajan 200 ml:ssa kasvatusliuosta (2,4 g LAB-Lemco jauhetta (OXOID), 8 g Nutrient broth jauhetta (Difco), 50 g sakkaroosia (BDH), 10 g glukoosia (BDH) ja 10 g fruktoosia (Merck) litrassa tislattua vettä), johon siirrostettiin 2 ml bakteeriliuosta, jonka solupitoisuus oli noin 107-109kpl/ml. Kasvatusaltaita ravisteltiin nopeudella 60 kierrosta minuutissa ja uusi kasvuliuos, ilman bakteereja, 20 vaihdettiin joka toinen vuorokausi.

«

Kasvatuksen jälkeen teräslevyt biofilmeineen huuhdottiin tislatulla vedellä kahdesti ennen biofilmin irrotuskokeita. Käsittelyissä, joko tutkittavaa seosta tai peptonisaliiniin kastettua puuvillavanu-, dacron- tai alginaattipuikkoa hangattiin biofilmipintaa vasten ja näytteenot-25 timeen kertynyt biofilmi suspendoitiin peptonisaliiniin (1 g peptonia/1 + 8,5 g NaCl/1), josta tehtiin laimennussaija. Näytteenottimeen oli imeytetty noin 0,2 ml tutkittavaa seosta. Tämän jälkeen suspensioon irronneet bakteerit viljeltiin ravintoagarille ja kasvatettiin 2 vrk 25 °C:ssa ennen pesäkkeiden laskentaa. Käsitellyt levyt värjättiin 0,1 % akridiinioranssilla (BDH). Pinnalle jäänyt biofilmi värjääntyi vihertäväksi ja sen määrä kvantitoitiin kuvanta-30 maila fluoresenssimikroskoopilla. Samalla värjääntyivät myös pinnoille jääneet mikrobit keltaisina.

103056 15

Biofilmikasvatukset ilmavirrassa

Irrottavien aineiden yhdistelmillä kostutetun puuvillavanutikun kyky irrottaa eri ikäisiä Aspergillus niger homeita ja niiden muodostamia biofilmejä ilmanvaihtojärjestelmien 5 teräspinnoilta mitattiin seuraavasti:

Ensin Aspergillus niger hometta esikasvatettiin Sabouraud -maljalla, ja itiöistä tehtiin suspensio sekoittamalla. Suspensiota levitettiin teräspinnoille koko alueelle. Levyjä inku-boitiin 25 °C:ssa, vakioidussa ilmavirrassa, 70 % suhteellisessa kosteudessa eri aikoja, 10 joista 14 ja 28 vrk:n kuluttua tehtiin määritykset viljelemällä Sabouraud-maljalla ja jälleen kuvantamistekniikalla.

Esimerkki 2

Kelaatinmuodostajien kyky irrottaa bakteereja ja biofilmiä 15

Eri kelaatinmuodostajien kykyä irrottaa bakteereja ja biofilmiä pinnoilta tutkittiin käyttämällä mallina Pseudomonas fragin teräspinnoille muodostamaa biofilmiä. Tätä irrotettiin eri materiaaleista valmistetuilla vanupuikoilla, jotka oli kastettu peptonisaliiniliuokseen 20 (0,85 paino-% NaCl, vertailukoe) sekä kelatoivia aineita sisältäviin käsittelyliuoksiin.

Tulokset on ilmoitettu taulukossa 1.

103056 16

Taulukko 1. Kelaatinmuodostajien kyky irrottaa bakteereja ja biofilmiä

Vaikuttava aine % (g/g)* Pinnalta irronneiden Käsittelyn jälkeen pin- bakteerien määrä, nalle jäänyt biofilmi _ log pmy/cm2__ %:na pinta-alasta_

Peptonisaliiniliuos ja puuvillavanupuikko _6^4_ 40

Peptonisaliiniliuos ja dacronpuikko__6fr_ 42 5 Peptonisaliiniliuos ja alginaattipuikko _6^5_ 45 0,1 % EDTA ja puuvillavanupuikko 7,0 49 0,2 % EDTA ja puuvillavanupuikko__5^5__22_ 0,4 % EDTA ja puuvillavanupuikko_ 7,0 16_ 0,6 % EDTA ja puuvillavanupuikko 6,5 28 10 0,4 % EGTA ja puuvillavanupuikko_ 6,5 62 0,6 % EGTA ja puuvillavanupuikko 6,9 43 0,8 % EGTA ja puuvillavanupuikko 7,5 50 ♦pitoisuus %:na 0,02 M tris-asetaattipuskurissa, pH 7,75 15 Käytetyllä näytteenottimella, puuvillavanu-, dacron- tai alginaattipuikolla, ei ollut eroa. Kelatoivista aineista EDTA toimi parhaiten biofilmin irrottajana pitoisuuksissa 0,2 % -0,6 %, pinnalta irronneiden bakteerien määrä vaihteli 5,5 - 7,0 log yksikön välillä.

20 Esimerkki 3

Puuvillavanutikkuun kastettujen vaikuttavien aineiden kyky irrottaa bakteereja * biofilmistä

Taulukossa 2 on esitetty Pseudomonas fr agin muodostamaa biofilmiä irrottavat aineet 25 trietanoliamiini, isopropanoli ja trietanoliamiini sekä jälkimmäinen seos pelkistävillä aineilla eli asetyylikysteiinillä tai ditiotreitolilla vahvistettuina. Määrityksissä käytettiin t * _ vaikuttavaan aineeseen kastettua rayontikkua, jota käytetään yleisesti ATP-määrityksissä.

Taulukossa on esitetty irrotuksen jälkeen saadut bakteeriviljelytulokset ja bakteerien ATP- määritykset, jotka kuvaavat pinnoilta irronneita bakteereja, kun pintoja oli käsitelty eri 30 aineiden yhdistelmillä. Samoista levyistä määritettiin pinnoille jääneen biofilmin määrä.

103056 17

Koejärjestelyt olivat esimerkin 1 mukaisia ja irronnet bakteerit todettiin viljelytekniikalla sekä ATP:n määrityksellä (ATP-määrityskitti, BioOrbit). Pinnalle jääneen biofilmin määrä arvioitiin kuvantamistekniikalla esimerkki 1 mukaisesti.

5 Taulukko 2. Pseudomonas fragin muodostamaa biofilmiä irrottavat aineet; bakteerivilje-lytulokset ja bakteerien ATP-määritykset irrotuksen jälkeen

Vaikuttava aineseos % (g/g) Irronneiden bak- Irronneiden bak- Pinnoille jääneen teerien määrä teerien määrä- biofilmin määrä % log pmy/cm2 ATP:n avulla RL- pinta-alasta __U/cm2__

Peptonisaliiniliuos__5J__5J__76_ 0,02 % Trietanoliamiini* 6,7 4,1 77 10 0,02 % Trietanoliamiini, 6,4 4,2 66 0,02 % Isopropanoli *____ 0,02 % Trietanoliamiini, 7,1 7,2 55 0,02 % Isopropanoli, 0,01 % Asetylkysteiini*__ 15 0,02 % Trietanoliamiini, 4,8 7,2 47 0,02 % Isopropanoli, 0,01 % Ditiotreitoli*____ *0,02 M Tris-asetaattipuskurissa, pH 7,75 20

Taulukosta käy ilmi, että bakteereja ja biofilmiä irtosi parhaiten trietanoliamiinin, isopropanolin ja asetyylikysteiinin yhdistelmällä. ATP-määrityksen avulla voitiin todeta, että keksinnön mukaisilla seoksilla, joissa alkoholeihin tai amiineihin on lisätty pelkistäviä aineita, sekä biofilmit että bakteerit irtoavat hyvin. Nähdään myös, että alkoholilla, kuten 25 isopropanolilla, ja amiinilla, kuten trietanoliamiinilla, on vaikutusta viljeltävien bakteerien määrään. Toisaalta ne eivät yksinään irrota tarpeeksi hyvin biofilmiä. Sensijaan yhdessä pelkistävien aineiden kanssa ne irrottavat hyvin sekä bakteereja että biofilmiä.

103056 18

Esimerkki 4

Eri detergenttien kyky irrottaa bakteereja kelatoivan aineen ja pelkistävän aineen kanssa 5 Seuraavaksi verrattiin viljelytekniikan avulla eri detergenttien kykyä irrottaa bakteereja kelatoivan aineen, EDTA:n, ja pelkistävän aineen, ditiotreitolin, kanssa. Kuvantamistek-niikan avulla määritettiin samojen seosten kyky irrottaa biofilmiä. Koejärjestelyt olivat esimerkin 1 mukaisia.

10 Taulukko 3. Pseudomonas fragin muodostaman biofilmin irrotus teräspinnoilta vanu- tikkuun kastetun detergentin, kelatoivan aineen ja pelkistävän aineen yhdistelmällä.

Vaikuttava aine %(g/g) Detergentin ominaisuus Irronneiden bakteerien Pinnalle jäänyt määrä log pmy/cm2 biofilmi % (SD) pinta-alasta ___(SO)_ seos* kelatoiva ja pelkistävä 5,23 ±0,38 15,1±3,0 15 1,0 % Triton-X-100*__non-ioninen 3,96+0,30 20,1 ±6,2 10 % Triton-X-100* non-ioninen 4,56±0,02 64,8±7,1 1.0 % Oktyyliglukosidi*__non-ioninen__3,43±0,00_ 31,2±4,5 1.0 % SDS*__anioninen__4,00±0,17 9,7±5,2 1.0 % CHAPS* amfolyytti__3,52±0,11__29,7±17,5 - 20 1,0 % CHAPSO*__amfolyytti__4,20±0,34__19,2±2,1 1.0 % BRIJ 35* non-ioninen ~ I 4,61±0,32 11,9±6,9 ~ 0,01 M tris-asetaattipuskurissa, pH 7,75, jossa 0,07 % EDTA ja 1 % ditiotreitoli

Vaikka detergenttilisäykset eivät sinänsä merkittävästi lisänneet bakteerien irtoamista • - 25 pinnoilta, niiden käyttö paransi kuitenkin irronneiden bakteerien määrityksen toistetta vuutta, mikä käy ilmi määritysten pienempänä hajontana. Eräät detergentit, kuten anioninen detergentti SDS ja non-ioninen detergentti BRIJ 35, irrottivat paremmin biofilmiä kuin pelkästään EDTA:n ja ditiotreitoli.

103056 19

Esimerkki 5

Hydrolyyttisten entsyymien vaikutus biofilmeihin

Hydrolyyttisten entsyymien vaikutus biofilmeihin käy ilmi taulukosta 4; koejärjestelyt 5 olivat samat kuin esimerkissä 1. Biofilmipintaa käsiteltiin yhdellä tai useammalla entsyymillä kostutetulla vanupuikolla.

Taulukko 4. Hydrolyyttisten entsyymien vaikutukset Pseudomonas fragin ja sen muodostaman biofilmin irrotuksessa 10 Entsyymi ja sen Entsyymin laatu Irronneiden bakteerien Biofilmin määrä seoksessa määrä log pmy/cm2 peittämä %(g/g)___pinta-ala %

Peptonisaliiniliuos 6,4 40 0,16 % pektinaasi* Orion Diagnostica** 5,6 22 15 0,16 % pektinaasi, Orion Diagnostica** 6,3 18 0,16 % proteaasi*___ 0,16 % pektinaasi, Orion Diagnostica** 7,0 49 0,16 % proteaasi, 0,16 % amylaasi* 20 0,16 % pektinaasi, Orion Diagnostica,** 5,9 10 0,16 % sellulaasi* Sigma, 0,3 U/mg kuiva- _ainetta kohti 0,16 % amylaasi* Sigma, 1500-3000 U/mg 5,4 11 kuiva-ainetta • __________ ___ 0,08 % amylaasi Sigma, 1500-3000 U/mg 6,7 38 kuiva-ainetta 25 0,08 % papaiini* Sigma, 1-2 U/mg kuiva- _ ainetta kohti

* 0,01 M tris-asetaatti puskurissa, pH 7,75, jossa 0,1 % EDTA

** Puhdistettu ja aktiivisuudet määritetty Orion Diagnosticassa, Kaisu Ollilan . erikoistyö, Teessiden yliopisto, Englanti, 1995.

30

Yllä esitetyistä tuloksista käy ilmi, että entsyymiseoksista pektinaasin, proteaasin ja amylaasin seos irrotti bakteereja parhaiten, 0,6 log yksikköä paremmin kuin peptonisalii-ni. Pektinaasi yksinään, pektinaasin ja proteaasin tai pektinaasin ja sellulaasin seos, sekä amylaasi yksinään irrottivat biofilmiä 2-4 kertaa paremmin kuin pelkkä peptonisaliini- 103056 20 käsittely. Lisäksi voidaan todeta, että monet hydrolyyttiset entsyymit toimivat hyvin biofilmin irrottajina tuhoamatta bakteereja.

Esimerkki 6 5 Eri seosten kyky irrottaa eri-ikäisiä biofilmejä

Seuraavaksi kokeiltiin edellä kokeiltujen eri seosten kykyä toimia eri ikäsiten biofilmien ja homeiden irrottajana ilmakasvatuksissa. Tällöin mitattiin irrottavien aineiden yhdistelmillä kostutetun vanutikun kykyä irrottaa eri ikäisiä Aspergillus niger homeita ja niiden 10 muodostamia biofilmejä ilmanvaihtojärjestelmien teräspinnoilta.

Kokeissa käsiteltiin rinnan 3 pintaa menetelmien toistettavuuksien arvioimiseksi.

103056 21

Taulukko 5. Eri seoksilla kostutetun vanupuikon kyky irrottaa Aspergillus niger homeen itiöitä ja biofilmiä nuoresta, 14 vuorokauden ikäisestä, ja vanhemmasta 28 vuorokauden ikäisestä, biofilmistä

Vaikuttavat aineet ja pitoi- Pinnalle jäänyt Pinnalle jää- Pinnalle jäänyt Pinnalle jää- 5 suudet %:na(g/g) biofilmi %:na neiden solujen biofilmi %:na neiden solujen pinta-alasta määrä % (SD), pinta-alasta määrä % _( SD), 14 vrk 14 vrk_ (SD), 28 vrk (SD), 28 vrk

Peptonisaliiniliuos 64,2±43,9 6,6±10,6 28,9±23,8 2,4±3,8 0,2 % Tween 80 28,4±37,9 2,2±1,8 51,3±27,5 2,9±3,5 0,9 % NaCl vedessä __________ 0,2% Tween 80 28,0±38,6 1,9±2,5 12,3±10,4 0,1 ±0,1

10 0,9 % NaCI

1.0 % Triton-X-100_____ 0,2 % isopropanoli, 42,1 ±34,6 2,3+2,7 38,6±32,0 4,6±5,2 0,2 % trietanoliamiini* 0,2 % isopropanoli, 31,1 ±8,7 3,7±0,4 47,8±39,8 6,6±7,4 15 0,2 % trietanoliamiini, 0,3 % Na-metasilikaatti* 0,2 % isopropanoli, 38,0±40,8 2,2±2,6 14,0±21,8 0,1 ±0,2 0,2 % trietanoliamiini, 1.0 % Triton-X-100*_____ 20 0,2 % isopropanoli, 43,1 ±16,4 1,9±0,9 53,8±30,1 4,8±3,9 0,2 % trietanoliamiini, 0,3 % Na-metasilikaatti 1.0 % Triton-X-100*_____ 0,1 % EDTA, 35,7±50,6 6,1±10,0 32,6±44,1 3,7±6,1 25 0,4 % entsyymiseos**, * 0,1 % EDTA, 23,6± 10,3 2,3±1,6 17,3±11,6 1,5±1,3 0,4 % entsyymiseos**, 0,3 % Na-metasilikaatti* _________ 0,1 % EDTA, 24,1 ±20,6 2,0±2,6 32,7±7,9 3,0±2,4 30 0,4 % entsyymiseos**, 1.0 % Triton-X-100* • 0,2 % isopropanoli 34,4± 16,1 1,0±0,5 6,9±7,7 0,2±0,3 0,2 % trietanoliamiini 0,3 % Na-metasilikaatti 35 1,0 % Triton-X-100 0,4 % entsyymiseos**, *___ * 0,02 M tris-asetaattipuskurissa, pH 7,75 ** entsyymiseos oli esimerkissä 5 kuvattu pektinaasin, amylaasin ja proteaasin seos.

40 103056 22

Kaikki keksinnön mukaiset seokset irrottivat kahden viikon ikäisiä homeiden muodostamia biofilmejä ja homesoluja 20% - 60% paremmin kuin peptonisaliini. Vanhemmat, kuukauden ikäiset biofilmit ja homesolut irtosivat paremmin, jos Triton-X-100 oli lisättynä isopropanolia ja trietanoliamiinia tai Tweeniä sisältävään käsittelyseokseen.

5

Vertailemalla taulukon 5 ja vastaavasti taulukon 1 tuloksia voidaan todeta, että entsyymien lisääminen parantaa kelatoivaa ainetta sisältävän koostumuksen tehoa.

Hankaava aine, Na-metasilikaatti, oli tehokas biofilmin irrotuksessa kelatoivan aineen, 10 EDTA:n (eli aminotetrakarboksylaatin), ja entsyymien kanssa.

Taulukon 5 tulosten perusteella homeiden irrotukseen erityisen hyvin sopiva yhdistelmä käsittää kelatoivan aineen, kuten EDTA:n, entsyymiseoksen ja hankaavan aineen, kuten Na-metasilikaatin.

15

Esimerkki 7

Vaikuttavien aineiden seokset

Edellisten esimerkkien perusteella valittiin taulukosta 6 bakteeriseosten muodostamien 20 biofilmien irrotukseen hyvin toimivat seokset. Seokset aplikoitiin biofilmille, joko tupot-' tamalla tai sumuttamalla (0,2 ml/cm2), minkä jälkeen niiden kyky irrottaa eri bakteereja määritettiin. Bakteerit irrotettiin pinnoilta esimerkin 1 mukaisesti ja viljeltiin Pseudomonas ravinto-agarilla, Listeria lampaanveriagarilla ja Bacillus ravintoagarilla. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

25 * , 103056 23

Taulukko 6. Pseudomonas fragi, Listeria monocytogenes μ Bacillus cereus bakteerien yhteiskasvuston irrottaminen nipottamalla tai sumuttamalla ja bakteerien määrä viheltäessä

Vaikuttava aineseos, Pseudomonas fragin Listeria monocyto- Bacillus cereusn 5 pitoisuudet %(g/g) määrä log pmy/cm2 genesn määrä log pmy/cm2 __määrä log pmy/cm2__ __tupotus sumutus nipotus sumutus tupotus sumutus

Peptonisaliiniliuos__4f3__3^8__5i5__^0__-__- 0,2 % Tween 80 3,9 4,9 4,6 5,0 0,9 % NaCl vedessä 10 1,0 % Triton-X-100*_______ 0,2 % Trietanoliamiini, 2,9 5,4 4,1 5,5 0,3 % Na-metasilikaatti 1.0 % Triton-X-100*_______ 0,1 % EDTA, 3,7 4,9 4,5 5,4 15 0,3 % Na-metasilikaatti 1.0 % Triton-X-100* ______ * 0,02 M tris-asetaattipuskurissa, pH 7,75 20 Irrotettaessa bakteereja detergenttiseoksia sumuttamalla saadaan Pseudomonas bakteerit 1-2 log yksikön verran ja Listeriat 1 log yksikön verran paremmin viljeltyä verrattuna tupotuskäsittelyyn. Bacilluksia ei löytynyt viljeltäviä määriä.

* Esimerkki 8 25 Biofilmin irrotus tupotuskäsittelyllä tai sumuttamalla

Pseudomonas fragi, Listeria monocytogenes μ Bacillus cereus bakteerit muodostivat yhteiskasvuston, jonka määrä arvioitiin kuvantamistekniikalla. Tupotus- ja sumutuskä-sittelyjen jälkeen (0,2 ml/cm2) teräspinnoille jääneiden bakteerit ja solujen määrä määri-30 tettiin esimerkin 1 ohjeiden mukaan.

103056 24

Taulukko 7. Tupotus- ja sumutuskäsittelyjen jälkeen teräspinnoille jääneiden biofilmien ja bakteerien määrä

Vaikuttava aineseos, pitoi- Pinnalle jäänyt bio- Pinnalle jääneiden 5 suudet % (g/g) filmi % pinta-alasta solujen kokonais- __määrä %_ _tupotus sumutus tupotus sumutus

Peptonisaliiniliuos__94__30__11__1 0,2 % Tween 80 53 17 2 1 0,9 % NaCl vedessä 10 1,0 % Triton-X-100*_____ 0,2 % trietanoliamiini 80 7 16 1 0,3 % Na-metasilikaatti 1.0 % Triton-X-100*_____ 0,1 % EDTA, 48 37 4 3 15 0,3 % Na-metasilikaatti 1.0 % Triton-X-100* ____ *0,02 M tris-asetaatti puskurissa, pH 7,75 20 Kuten edellä esitetyistä tuloksista käy ilmi, saadaan biofilmiä parhaiten irtoamaan teräs-pinnalta sumuttamalla vaikuttavaa aineseosta. Peptonisaliiniliuoksella sumuttamalla saadaan biofilmi vähenemään kolmannekseen ja solujen määrä kymmenenteen osaan. Sumuttamalla Triton-X-100:n, trietanoliamiinin ja natriummetasilikaatin seosta saatiin biofilmi vähenemään kymmenenteen osaan. Sumuttamalla seosta biofilmin pinnalle 25 irtoaminen parani bakteereja vahingoittamatta.

Esimerkeissä 7 ja 8 on tuloksia samasta koejärjestelystä. Näiden kokeiden perusteella erittäin hyvin eläviä bakteereja ja biofilmiä irrottavana seoksena toimi tupotuskäsittelyssä kelatoivan aineen, esim. EDTA:n, ja hankaavan aineen, esim. Na-metasilikaatin, seos 30 Triton-X-100:a sisältävässä tris-asetaattipuskurissa. Sumuttamalla irtosi eläviä bakteereja ja biofilmiä erittäin hyvin trietanoliamiinin ja hankaavan aineen seoksella Triton-X-100:a sisältävässä tris-asetaattipuskurissa.

Claims (34)

103056 25

1. Menetelmä näytteenottopinnan käsittelemiseksi ennen mikrobiologiseen tutkimukseen tarkoitetun näytteen ottamista, tunnettu siitä, että pinta saatetaan kosketuksiin mikro-organismeille sopivassa pH:arvossa näytteen rakenteeseen vaikuttavan aineen kanssa, joka sisältää vaikuttavana aineena kelatoivan aineen, detergentin, alkoholin, amiinin, pelkistävän aineen ja/tai hydrolyyttisen entsyymin tai hydrolyyttisten entsyymien seoksen, ja että näytteen rakenteeseen vaikuttavaa ainetta käytetään sellainen määrä, että se riittää näytteen irrottamiseen tutkittavalta pinnalta ja että määritettävän aineen määrä ei vaikutusaikana muutu ja ettei mikro-organismien kasvu oleellisesti esty.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pinta saatetaan kosketuksiin sellaisen koostumuksen kanssa, joka sisältää ainakin kaksi mainituista aineista fysiologisessa puskuriliuoksessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään koostumusta, joka edelleen sisältää hankaavaa ainetta näytteenottopinnalta irrotettavan näytteen määrän kasvattamiseksi.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että : käytetään koostumusta, jossa kunkin vaikuttavan aineen konsentraatio on 0,01-2,0 paino ko.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuosta käytetään noin 0,001 - 1, edullisesti noin 0,05 - 0,5 ml näytteen neliösenttimetriä kohti. «

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että pinta saatetaan kosketuksiin vaikuttavan aineen kanssa 4- 45 °C:ssa, 1- 30 minuutin ajan, pH.ssa 4-8.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumus sisältää vaikuttavat aineet triasetaattipuskuriliuoksessa, jonka pH-arvo on 4-8. 103056 26

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine saatetaan kosketuksiin näytteenottopinnan kanssa kostuttamalla pinta vaikuttavan aineen liuoksella ennen näytteenottoa näytteenottopinnalta.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine sumutetaan näytteenottopinnalle ennen näytteenottoa.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kelatoivana aineena käytetään EDTA:ta.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että detergenttinä käytetään non-ionista polyoksietyleenityyppistä ainetta, non-ionista alkyyli-glukosidityyppistä ainetta, amfolyyttistä kaksoisionityyppistä ainetta tai anionista yhdistettä.

12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttavana aineena käytetään trietanoliamiinia.

13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttavana aineena käytetään hydrolyyttistä entsyymiseosta, joka sisältää pektinaasi- ’ aktiivisuutta, pektinaasi- ja proteaasiaktiivisuutta, pektinaasi-, proteaasi- ja amylaasiaktiivisuutta, pektinaasi-ja sellulaasiaktiivisuutta, amylaasiaktiivisuutta tai amylaasi- ja papaiiniaktii visuutta.

14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että : hankaavana aineena käytetään silikaattia, polyfosfaattia, fosfaattia tai lateksia.

15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottopinta on bakteerien tai muiden mikro-organismien tuottama biofilmi. «

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tutkitaan sisältääkö näytteenottopinta mikro-organismeja tai mikro-organismien tuottamaa 27 103056 biofilmiä.

17. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteestä määritetään mikro-organismien määrä.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottopinnalta otetusta näytteestä erotellaan ja määritetään eri mikro-organismit erikseen.

19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottopinnalta otetusta näytteestä määritetään mikro-organismien metaboliitteja.

20. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottopinnalta otetulle näytteelle suoritetaan mikro-organismien ATP-määritys.

21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottopinnalta määritetään irrotetun näytteen pitoisuus.

22. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikäsitelty näytteenottopinta saatetaan kosketukseen viljelyalustan kanssa, jolla se voi- ' daan määrittää.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelyalustana käytetään viljelyalustaa, kontaktimaljaa tai kastolevyä.

24. Patenttivaatimusten 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte koostuu ympäristönäytteestä tai biologisesta materiaalista.

25. Testipakkaus näytteiden ottamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä näytteenottopinnalta, joka pakkaus käsittää näytteenottimen ja näytteenottopinnan esikäsittelyyn tarkoitetun koostumuksen, tunnettu siitä, että koostumus sisältää vaikuttavana aineena kelatoivan aineen, detergentin, hapettavan aineen, pelkistävän 103056 28 aineen, alkoholin, amiinin, hydrolyyttisen entsyymin ja/tai hydrolyyttisten entsyymien seoksen fysiologisessa puskuriliuoksessa, jolloin kunkin vaikuttavan aineen pitoisuus on 0,01 - 2,0 paino-%.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää ainakin kaksi vaikuttavaa ainetta ja sen pH on 4 - 8.

27. Patenttivaatimuksen 25 tai 26 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää edelleen hankaavaa ainetta.

28. Jonkin patenttivaatimuksen 25 - 27 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää a) 0 - 1,0 paino-% aminotetrakarboksylaattia, b) 0 - 2,0 paino-% non-ionista polyoksietyleenityyppistä ainetta, non-ionista al- kyyliglukosidityyppistä ainetta, amfolyyttistä kaksoisionityyp-pistä ainetta tai anionista yhdistettä, c) 0 - 1,0 paino-% pelkistävää ainetta, d) 0 - 1,0 paino-% alkoholia, e) 0 - 1,0 paino-% trietanoliamiinia, , f) 0 - 1,0 paino-% hydrolyyttistä entsyymiseosta, joka sisältää pektinaasiaktiivi- suutta, pektinaasi- ja proteaasiaktiivisuutta, pektinaasi-, proteaasi- ja amylaasiaktiivisuutta, pektinaasi- ja sellulaasiaktiivisuutta, amylaasiaktiivisuutta tai amylaasi- ja papaiiniaktiivisuutta, ja/tai g) 0 -1,0 paino-% silikaattia, polyfosfaattia, fosfaattia tai lateksia, jolloin koostumukseen sisältyy ainakin kaksi komponenteista a - g.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen testipakkaus, joka on tarkoitettu näytteiden ottamiseen homeita sisältäviltä näytteenottopinnoilta, tunnettu siitä, että koostumus sisältää komponentteja a, f ja g tai a, d, f ja g. 103056 29

30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää 0,05 - 1,0 paino-% EDTA:ta, 0,1 - 1,0 paino-% pektinaasin, amylaasin ja proteaasin seosta sekä 0,1- 1,0 paino-% natriummetasilikaattia.

31. Patenttivaatimuksen 28 mukainen testipakkaus, joka on tarkoitettu näytteiden ottamiseen eläviä bakteereja ja biofilmiä sisältäviltä näytteenottopinnoilta, tunnettu siitä, että koostumus sisältää komponentteja a, b ja g tai a, b, c, d ja g.

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää 0,05 - 1,0 paino-% EDTA:ta, 0,1 - 2,0 paino-% 4-( 1,1,3,3-tetrametyyIibutyy-lijfenolin etoksilaattia tai polysorbaatin polyoksietyleenijohdannaista ja 0,1 -1,0 % natriummetasilikaattia.

33. Jonkin patenttivaatimuksen 25 - 32 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koostumuksen liuottimena on 0,001 - 0,1 M tris-asetaattipuskuriliuos.

34. Jonkin patenttivaatimuksen 25-33 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että näytteenotin käsittää puuvillavanua, dacronia, alginaattia tai vaahtomuovia, joka on kiinnitetty sopivaan pitimeen. 30 103056