【発明の詳細な説明】
対象表面の前処置のための方法およびキット
本発明は、微生物検査のためのサンプルを採取するに先立つ対象表面の処置に
ついての、請求項１の前文による方法に関する。
本発明は、洗浄に先立ち対象表面の前処置についての、請求項２５の前文によ
る方法にも関する。
本発明は、対象表面の前処置のためのサンプラーおよび物質を含み、請求項４
０の前文による方法にも関する。
細菌、イーストおよびかび真菌などの微生物は種々の表面に容易に付着する。
それらは成長するにつれ、バイオフィルムと呼ばれる層を形成する。種々のバイ
オフィルムがあり、しばしば、いくつかの相違する微生物種の混合集団からなっ
ている。バイオフィルムを形成するのは微生物にとって生存戦略と考えられ、そ
れによって利用できる栄養を最適に使用する。微生物にバイオフィルムを形成さ
してしまうと、それが引き起こす健康上の危険性および汚染問題に対処するのが
難しくなることが知られている。防護されたバイオフィルム層の内部で微生物は
消毒薬や抗生物質からの攻撃に効率よく抵抗することができ、多くの病原菌が長
時間バイオフィルムの保護で生存し得ることが知られている（Costerton，J.W.,
Marrie,T.J.およびCheng,K.-J:，1985．細菌付着の現象 In:Savage，D.C．およ
び Fletcher,M.(Eds.)細菌付着 New York: Plenum Press，p3-43）。
バイオフィルムは多くの産業分野で問題を起こす。その問題はふたつに大別で
きる。衛生上の問題と製造工程自体に影響する問題とである。厳密な衛生状態を
必要とする製造の問題は、僅かな微生物の生存が全製品をだめにしてしまう。弛
んだ衛生状態は、例えば食品産業で、医療界で、あるいは給水系で問題を起こす
。製造工程自体に影響する他の問題、例えば器具や管におけるヘドロ（粘液）の
形成は、特に木材および他の加工業、空気調節チャネルおよび消毒ビンにまで見
られる。いくつかの産業界において、微生物は腐食を促進することさえある。
しかしながら、微生物により形成されるバイオフィルムとそれによって引き起
こされる問題は、産業界以外において、例えば浴室タイル、サウナベンチおよび
スウィミングプールやバブルプールなど他のところにおいても存在する。
バイオフィルムが食品および加工産業において形成されると、バイオフィルム
に含まれる微生物が大量の製品を汚染するであろう。従って、衛生監視装置がほ
とんどの製造プラントで使用されているか、または少なくとも使用されるべきで
ある。しかしながら、しばしば、製造ユニットの機能的異常、管やバルブの詰ま
りまたは腐食などが明らかになり、問題が既に起きたときだけ、バイオフィルム
は発見される。
バイオフィルムは主に８５−９８％の水からなる。さらに、フィルムは、環境
により微生物および種々の汚物により形成された多糖類とミネラルの集合体を含
む（Costerton,J.W.,Irvin,R.T．and Cheng,K.-J.,1981.The bacterial glycoca
lyx in nature and disease．Ann．Rev．Microbiol.,35,299-324）。循環システ
ムが働き、水が流れると、バイオフィルムの量は断続水循環の場合および乾燥管
表面の検査よりもさらに多くなる。循環液において、５００μｍの湿潤バイオフ
ィルムは、その全体量の２−５％および１０−２５μｍの厚さに減少する。たと
え必ずしも目に見えなくても、そのようなバイオフィルムは、水循環システムま
たは他の管およびプラントにおける摩擦やエネルギー消費量を増加する。バイオ
フィルムの構造は、表面物質、栄養分および微生物の種類により様々である。こ
れは、バイオフィルムの形成メカニズムおよびその正確な構造の明確かつ特有の
全体像がないということも意味している。バイオフィルムの構造は各々の場合に
ついて別々に測定されなけらばならない。
バイオフィルムは、その厚さを測定し、バイオフィルム層を染色することによ
り発見され、研究され得る。さらに、バイオフィルムに含まれる微生物は、成長
培地上で培養されているサンプルを採取することにより測定し得る。
バイオフィルムの厚さは、直接および間接方法として知られている種々の分析
方法により測定される。容積測定方法は湿潤重量の測定を基にしており、表面マ
ス密度方法は乾燥重量測定を基にしている。さらに、バイオフィルムは、光伝導
、
熱あるいは電気誘導および振動を使用し、顕微鏡検査により測定することができ
る。しかしながら、上記のほとんどの方法は、使用しやすい機器がないことから
、実際の監視活動では実行するのが困難である(Characklis and Picologlou,197
8)。産業界は問題の原因に関心があるが、必ずしもバイオフィルムの厚さに関心
があるわけではない。
管の表面上のバイオフィルムの直接染色は、その成長を監視するのに可能なよ
い方法であるが、染料はしばしば発癌性であり、工程に入り、染料自体が沈澱物
を形成することもあり、さらにそれを除去するのが困難であることから、閉鎖管
において染色を行うことは困難である。従って、バイオフィルムを成長表面から
分離し、その後バイオフィルムを染色し、その構造が顕微鏡検査により調べるよ
うにすべきであると示唆されてきた。染色において、アルカインブルー、トルイ
ドブルーおよびエリスロシンなどの多糖鎖に付着する種々の染料を使用すること
は可能である。サンプルから充分に染色して、微生物から単独で形成されたバイ
オフィルムは、主に微生物自身により排出されるポリマーを含み、種々の糖類の
複合ポリマーからなる構造を有することが分かった。
利用に関する他の方法は、熱誘導および摩擦におけるバイオフィルムにより生
じる変化の測定である（Characklis，W.G．and Picologou,B.F．1978．Measurem
ent of the formatioin and destruction of primary biofouling film．In:Gra
y，R.H.(Ed.).Proceedings of the Ocean Thermal Energy Conversion(OTEC)Bio
fouling and Coosion Symposium.October 10-12,1977.Seattle,Washington．Spr
ingfield Va.,National Technical Information Service．p.51-61）。
バイオフィルム監視装置として知られている監視装置は、バイオフィルムを発
見および制御することに関して開発されてきた。例えば監視装置は、動いている
間に冷却装置において起こる圧力の変化を測定する。圧力の変化は摩擦と比例し
、摩擦は冷却装置の摩擦に比例する。染色を基とするものなど、間接方法におけ
る不正確さも監視装置の問題である（Characklis，W.G.and Marchall，K.C.(Eds
.).1990.Biofilms.New York:John Wiley & Sons，Inc．703p.）。
上記のように、バイオフィルムは濃硝酸により基質から分離され得る。この場
合、該方法は微生物を破壊するので、成長培地上の培養により微生物を証明およ
び認識することは不可能である。従って、微生物分析のためのバイオフィルムサ
ンプルは、コットン綿棒で採取し、微生物により利用される栄養分を含有するペ
プトンサリン溶液に浸す。しかしながら、少量の微生物のみが、ペプトンサリン
溶液でバイオフィルムから分離され、サンプル表面はまだ消毒綿で拭いた後のバ
イオフィルムの半分以上を含んでいる。
上記の結果は、単純でより使用しやすい方法がバイオフィルムの検知、特に加
工および空気調節産業において必要とされていることを示している。特に、加工
表面がバイオフィルムを有していないかどうか調べるための方法が必要である。
バイオフィルムは、上記産業分野における特殊な問題を構成し、従って、細菌源
としてのバイオフィルムの役割が研究されている。加工衛生において、十分な衛
生レベルの査定とこのレベルの達成は最も重要である。空気調節分野において、
空気中の微生物の量における表面衛生状態の影響に関する知識が不足している。
加工および空気調節産業の両方において、種々の管などの微生物成長表面を強
力な消毒剤により洗浄し、消毒することによりバイオフィルムによって生じる損
失を取り除く必要もある。しかしながら、強力な消毒剤でさえ、洗浄と消毒剤処
置を成功させるため、バイオフィルムを除去、またはその構造を遊離することは
必ずしもできない。
本発明の目的は、上記の問題を明確にし、除去することであり、視覚化する前
にバイオフィルムを調査し、観察する新しい方法を提供することである。本発明
のさらなる目的は、表面から除去された微生物を分析し、測定し得るような方法
で調査した表面からバイオフィルムと微生物を分離する方法を提供することであ
る。
本発明の目的はまた、洗浄により微生物から形成される層をより除去し易くす
るような方法で、バイオフィルムと微生物の付着をそれらが成長する種々の表面
から分離または遊離する新しい方法を提供することである。
本発明は適当な化学薬品または化学混合物を使用して、望む表面からバイオフ
ィルムおよび微生物を除去するという考えに基づいており、化学薬品または化学
混
合物は、検査の前または表面を洗浄または消毒する前に表面に塗布される。バイ
オフィルムおよび微生物を繰り返し除去するそのような混合物は、種々の方法に
おいて化学的に効果的な物質からなり得る。
洗浄物質における種々の洗浄剤および酵素の使用は、それ自体特許文献におい
て知られている。例えば、ドイツ出願番号２９４８７９１および３００３７６６
は、汚物を除去するために高温で、着色除去剤および洗浄剤中においてポリエチ
レングリコール、アニオンおよびカチオン界面活性剤およびバシラス（Bacillus
）のプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ酵素の使用を開示している。しかしな
がら、これらの公開は微生物の除去における洗浄剤の効率性を報告していない。
さらに使用される有効物質（活性剤）の濃度および温度が非常に高いため、細菌
および通常すべての微生物は汚物が除去されると、破壊される。従って、該既知
洗浄剤の組成物はそれ自体、表面衛生の監視に適当でない。一方、酵素を含む細
菌粉末は、下水管の詰まりを除去するのに適切であると米国特許第５４６４７６
６において示唆されている。この既知の方法は、混合物が細菌自体を含有してい
るので、研究する表面から微生物の測定をするのに適切でない。Nagata et al.
による刊行物(Nagata,A.,sakiyama,T.,Itoh,H.,Toyomasu,T.,Enomoto,E.,Nagai,
T.,Saeki,T．and Nakanishi,K.,1995,Comparative Study on Caustic and Enzym
atic Cleanings of Stainless Steel Surface Fouled with β-Lactoglobulin,B
iosci.Biotech.Biochem.59,2277-2281）において、アルカリ性剤および酵素を使
用して、人工的にタンパク質で汚された表面を洗浄することが報告されている。
この調査は、化学物質の濃度が高いほど、有効性が高くなると結論づけている。
Ｎagata et al.は微生物の分離について調査しなかった。
洗浄剤および酵素を殺微生物洗浄液または類似組成物として使用した上記の方
法と異なり、本発明は、サンプルの構造を弛緩し、微生物を殺さずに表面からサ
ンプルを取り除くことが容易になった状態で、引き離しのための物質を用いる。
それにより、バイオフィルムを調べることができ、バイオフィルムが含有する微
生物を培養などにより測定することできる。
Ｗirtanen(VTT Publication 251,Wirtanen,Gun:Biofilm formation and its e
limination from food processing equipment)は、化学的処置によりサンプル表
面上のバイオフィルムの構造を弛緩することが微生物の測定を高めるという考え
を打ち出した。さらに、サンプラーで微生物調査のためのサンプルを採取する前
に、各々別々に種々の洗浄液でバイオフィルム表面を処置することが提案されて
ers,vo173,1995,Cl,s.17-21）。しかしながら、先の刊行物はどんな化学的方法
を使用すべきか特定しておらず、後の方は、洗浄率、つまり各々別々に洗浄剤を
使用して表面にどのくらい残っているかを査定しているが、表面からなにが分離
されたかを全く測定していない。
サンプル表面の処置のために微生物の免疫測定の前に洗浄剤と弱酸の化合物が
（WO Application No.96/1325）、および染色による測定の前に表面の微生物を
示す洗浄剤と酵素の混合物が（米国特許５２５８３０４）提案されている。洗浄
剤および酸または酵素の化合物は微生物の測定のためにバイオフィルムを除去す
るが、微生物は刊行物に示された測定方法で生存しているはずがない。
希釈した酸またはアルカリ溶液は、微生物が液体成長タンクの表面に付着する
のを防ぐことが示唆されているが（WO Application No.95/13807）、微生物分析
の適切性は評価されていない。微生物にとって最も害の少ない条件が調査におい
て観察されている。
Ｃhemical Abstracts vol124,170466およびthe original article Infect.Imu
n.(1996),64,1035-8において、どのように細菌ストレプトコッカス ミュータン
（Ｓtreptococcus mutan）特有の酵素が活性化され、どのように細菌がバイオフ
ィルムから分離し、それ自身のバイオフィルムを分解するようになるかが示され
ている。この特有性は、事実、細菌性バイオフィルムの減少に使用することが提
案され、該細菌の除去のためにのみ適切であるだろうと推測される。
米国特許第５１２８１００は、細菌を破壊することなくカチオンポリマーを使
用して細菌の付着を防止することを目的としている。
Ｂauer-Kreisel et al.による刊行物（Appl.Env.Microbiol.Aug.1996:3050-30
52）において、ＮａＣｌ,Ｔｗｅｅｎ,ＥＤＴＡおよびＮａ−ポリホスフェートは
微生物の免疫分析のためにバイオフィルムの除去に別々に使用されてきた。
しかしながら、欧州出願第５９０７４６は、微生物を測定することなく、表面
からバイオフィルムを剥離するプロテアーゼの能力を評価した。
種々の化学薬品がバイオフィルムの構造を分解するのに使用され、微生物の量
が少なくとも免疫学的にまたは表面に残ったバイオフィルムを染色することによ
り測定し得ることは明らかである。微生物を破壊することなく、微生物の表面と
の結合を防止することも可能である。この知識は産業界において清潔な表面を維
持するためにすべて有意義である。しかしながら、現在、分離した微生物の確実
な分析方法が未だない。本発明は、そのような微生物の分析方法を記載する。そ
れにより、キレート剤、洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤および／または加
水分解酵素などの化学薬品を使用し、研究する表面から微生物マスを分離し、化
学薬品が影響する間、微生物の量が変化することなく、分離した微生物マスから
大量に微生物を分析することができ、従って、微生物の成長が本質的に妨げられ
ない。
従って、本発明において調べる表面をサンプルの構造（例えば微生物層）に、
微生物に適切なｐＨで影響する薬剤と接触せしめる。表面は、好ましくは活性剤
としてキレート剤、洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤および／または加水分
解酵素または加水分解酵素類を含有する組成物と接触する。特に好ましい実施態
様に従って、組成物は生理的緩衝液中の該物質の少なくとも２つを含有する。最
も好ましくは、サンプル表面から分離すべきサンプルの量を増加する精錬剤また
は磨き剤も含有する。
さらに特別に、本発明による方法は主に、請求項１の特徴化部分に記載された
ことにより特徴づけられる。
本発明による試験キットは、サンプル表面の前処置に指定された組成物を含み
、活性剤（有効物質）としてキレート剤、洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤
および／または加水分解酵素または加水分解酵素類を生理緩衝液中に含有し、結
果、各活性剤の濃度は０.０１−２.０重量％である。
さらに特別に、本発明による試験キットは、請求項４０の特徴化部分に記載さ
れたことにより特徴づけられる。
本発明は、特に衛生監視に十分適した確実な検査方法を提供する。特に本発明
は、バイオフィルムと微生物層を含む類似の環境サンプルを、サンプルの構造を
分解する物質で前処置することを可能にし、よってバイオフィルムと微生物がそ
の基質から容易に分離され、それにより調べる表面に蓄積していた微生物が確実
にまた複製が可能なように分析され得る。本発明は現在の分析技術で容易に応用
でき、よって、微生物はバイオフィルムまたは微生物の分離後、それ自体知られ
ている方法、例えば接触プレート、浸漬スライド、成長深皿上の培養または他の
方法、例えば微生物ＡＴＰ分析、ルミネセンス、電気誘導における変化を基とす
るインピーダンス法あるいは微生物の抗原を基とする直接免疫方法により測定し
得る。
本発明の方法は、食品産業、他の加工機器、空気調節および病理学的細菌が破
壊されることを確認するための食品産業および病院の特殊監視装置など、継続的
な衛生監視を必要とする様々な環境において、表面から微生物を除去するために
適切である。
例えば、該方法は、食物を腐敗し、健康に有害な微生物、例えば、Ｐseudomon
as fragia,Ｌisteria monocytogenesta,Ｃandida utilista,Ｂacillus cereust
a,Ａspergillus nigerおよび他の細菌、イーストおよびかび真菌の除去に適切で
ある。これらの新しい処置方法は、単一の微生物、いくつかの微生物の混合集団
の両方および異なる年令の微生物の成長から微生物を分離するための従来の旧式
のペプトンサリン処置より複写に適当である。
同時に食品産業および他の産業加工機器の表面および病院からの微生物サンプ
ルの確実な分析が必要とされており、これらの環境から微生物を除去することも
重要である。しかしながら、強力な洗浄でも、種々の表面のバイオフィルムによ
り覆われて生存している微生物を破壊することはできない。
従って、本発明の組成物はまた、表面の洗浄消毒の前に種々の表面の前処置の
ために使用され得る。表面をサンプルの構造に影響する組成物と接触させ、その
物質は活性剤としてキレート物質、洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤および
／または加水分解酵素または加水分解酵素類を含む。特に好ましい実施態様に従
って、組成物は該物質の少なくとも２つを含有する。
さらに特別には、本発明の方法は、請求項２５の特徴化部分に記載されている
ことにより主に特徴づけられる。
次に、本発明を詳細な記載と多くの実施例により詳細に考察する。実施態様は
実施例であり、決して本発明をこれらの実施例に制限するものではない。
用語“対象表面”は、本発明において微生物成長を有する／有しない、または
バイオフィルムなどの微生物により形成された層を有するサンプル表面を意味す
る。バイオフィルムの微生物は量的および／または質的に測定される。対象表面
は本発明において、微生物成長層、例えば洗浄および消毒に先立ち前処置される
バイオフィルムを有する表面も意味する。
本発明において、用語“洗浄”は機械洗浄、化学薬品または熱および消毒によ
る殺菌を意味する。“消毒剤”は、本発明において当業者に通常よく知られてい
る消毒剤を意味し、対象表面の微生物の量を減らすために使用され得る。消毒剤
は無機酸または有機酸、中性またはアルカリ性である。種々の塩化化合物（例え
ば、次亜塩素酸化合物、過酸化水素）は無機消毒剤、アルコール（例えば、メタ
ノール）および有機酸の例であり、塩基は有機消毒剤の例である。
サンプルの“構造に影響する物質”とは、本発明において微生物成長基盤の細
胞間質を分解し、研究する表面との付着を減少させる物質を意味する。このよう
な物質は、例えば細胞間質の多糖鎖を加水分解し、鎖間の水素結合を減少させる
。該物質はまた、細胞間質を低疎水性にし、それによってさらに容易に水相に移
動する。このような物質は、洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤、キレート剤
である。本発明で使用された物質の多くは、高濃度において微生物の成長と増殖
を防止することが知られている。例えば、キレート剤は微生物代謝に必要な金属
（ＦｅおよびＭｎ）と結合し、アルコールは５０％以上の濃度で殺菌性があるこ
とが知られている。しかしながら、これらの物質は少量で使用されるので、処置
の間に微生物は死なない。測定される物質の量は、処置の間は変化せず、微生物
の成長は実質的に止まらないことが重要である。従って、本発明と関連して、組
成物
の各活性剤の濃度は最も好ましくは約０.０１−２.０重量％であると考えられる
。
洗浄剤、アルコール、アミン、還元剤およびキレート剤に加え、処置組成物は
、加水分解酵素または加水分解酵素類で増加され、可能な限り広いスペクトルに
より、一部は表面からバイオフィルムが穏やかに分離し、微生物に関する分析測
定感度を改善するが、微生物を破壊しない。表面は、微生物バイオフィルムに加
えて、タンパク質、炭水化物または脂肪を含有する種々の汚物を表すので、適切
な酵素類は特異的適合により選択される。
上記に基づいて、本発明の組成物は、例えば：
ａ）０−１.０重量％ キレート剤、例えばアミノテトラカルボキシレート
ｂ）０−２.０重量％ 洗浄剤、例えばポリオキシエチレン型の非イオン物質、
非イオンアルカリグルコシド型物質、両性イオン双性イオン物質またはアニオン
化合物
ｃ）０−１.０重量％ 還元剤
ｄ）０−１.０重量％ アルコール
ｅ）０−１.０重量％ アミン、例えばトリエタノールアミン
ｆ）０−１.０重量％ ペクチナーゼ活性；ペクチナーゼおよびプロテアーゼ活
性；ペクチナーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性；ペクチナーゼおよびセ
ルラーゼ活性；アミラーゼ活性またはアミラーゼおよびパパイン活性を有する加
水分解酵素ブレンド、および／または
ｇ）０−１.０重量％ 精錬剤または磨き剤、例えばメタシリケート、ポリホス
フェート、ホスフェートまたはラテックス粒子
上記化合物の最も好ましい濃度は：
ａ，ｃ−ｇ：０.０１−０.９５重量％、好ましくは０.０５−０.５重量％
Ｂ：０.０１−１.９５重量％、好ましくは０.０５−１.５重量％
本発明の前処置組成物は、成分ａ−ｇの少なくとも２つを含み、よって活性剤
の全濃度は最も適切には多くて３重量％、好ましくは多くて２.０重量％である
。
使用される酵素の活性は、好ましくは約０.１−１０.０００Ｕ／ｍｇ乾燥重量
であり、よって酵素の好ましい使用は、約１μｇ−１００ｍｇ／ｇ（サンプル）
乾燥重量である。
本発明で使用される物質のいくつかの例は下記に挙げる。
キレート剤：無機および有機化合物。無機複合剤は、様々な環状および線状リン
酸塩化合物、例えばポリリン酸ナトリウム（Ｎａ5Ｐ3Ｏ10，ＳＴＴＰ）などのポ
リリン酸塩である。最も重要な有機複合剤は、酸の部分に酢酸を有するアミンカ
ルボキシル酸およびその塩（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
、ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミンテトラ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレ
ントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジア
ミン ジー（ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、ジエタノール グ
リセン（ＤＥＧ）およびエタノールジグリセン（ＥＤＧ）、エチレングリコール
ビステトラ酢酸（ＥＧＴＡ）およびその塩、特にアルカリ金属塩、ヒドロキシ酸
（グルコン酸、グルコンヘプトン酸および他のサッカリン酸、例えばβ−グルコ
イソサッカリン酸、α−イソサッカリン酸、酒石酸、リンゴ酸およびクエン酸）
およびその塩、および酸の部分にリン酸を有する有機リン酸塩（例えば、アミノ
トリメチレンホスホン酸（ＡＴＭＰ）、１−ヒドロキシエチリデン−１,１−ジ
ホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラメチレン ホスホン酸（ＥＤ
ＴＭＰ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）およ
びその塩である。
洗浄剤：非イオンポリオキシアルキレン物質、非イオンアルキルグルコシド物
質、両性イオン双性イオン物質および、アニオンおよびカチオン化合物。ポリオ
キシアルキレン物質の特殊な例は、ポリオキシアルキレン モノ−およびトリソ
ルビタンエステル（エチレンオキシドで共重合されたソルビトールおよび酸無水
物の脂肪酸エステル）である。これらの例は、ポリソルベート８０（オレイン酸
エステル）、ポリソルベート２０（ラウリン酸エステル）、ポリソルベート４０
（パルミチン酸エステル）、ポリソルベート６０（ステアリン酸エステル）であ
る。非イオン物質の例は、アルキルフェニルポリオキシエチレン化合物（例えば
、Ｔriton（商標）およびＮonidet（商標））およびオクチル ベータ−Ｄ−グ
ルコピラノシドである。両性イオン物質の例は、ベタインココアバター酸（例え
ば、
ＤＥＨＹＴＯＮ（商標））である。アニオン物質はコール酸塩（タウロコール酸
ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムおよびグリココ
ール酸ナトリウム）である。カチオン化合物は、例えばベンザルコニウム塩酸塩
であり、両性界面活性剤は、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ
−１−エタンスルホネートにより例示される。
アミン：適当なアミンは、特に、メタノール、エタノール、プロパノールまた
はイソプロパノール基を含むアルカノール基を有するアルカノールアミン、例え
ばモノ−、ジ−またはトリアルカノールアミンなどからなる。
還元剤：適当な還元剤は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｌ−システイン、
チオグリコール酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチ
ルアミンおよびジチオトレイトールなどの遊離ＳＨ−基を含有するチオール、ジ
チオールである。
加水分解酵素：ペクチナーゼ活性、ペクチナーゼおよびプロテアーゼ活性、ペ
クチナーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラ
ーゼ活性、ペクチナーゼおよびセルラーゼ活性、アミラーゼ活性またはアミラー
ゼおよびパパイン活性およびその混合物を含有する製品。
アルコール：特に脂肪族アルコール、好ましくはイソプロパノール、ヘキサノ
ール、トリデカノール、エタノールまたはメタノール。
精錬剤または磨き剤：ケイ酸（例えば、メタケイ酸ナトリウム）、ポリリン酸
、リン酸およびラテックス。
本発明による技術方法は、微生物の活動により層が形成された加工表面および
類似表面からバイオフィルムおよび微生物のサンプルを分離することに使用され
得る。本発明はまた、調べる表面がバイオフィルムおよび／または微生物を含む
かどうか測定することを可能にする。従って、本発明は環境サンプルおよび生物
学的物質の検査に適している。有意義な適用は、健康管理領域（病院、医療セン
ター）および医療、食品および飼料産業における衛生調査である。これらの適用
は、特殊な製品の微生物の品質監視、同様に設備（例えば、テーブル、棚、床、
壁、天井、衛生設備、下水管）および加工機器（例えば、機械、機器、管、空気
調節管）の衛生調査の両方を含む。このような検査は、医療、食品および試料産
業（例えば、製パン所、搾乳場、木炭製造所、屠殺所、試料混合所）および林業
においてますます行われている。
本発明による上記の処置溶液は、検査すべきサンプル表面にサンプルの１平方
センチメートル当たり０.００１−１、好ましくは０.０５−０.５ｍｌで適用さ
れる。前処置の温度は４−４５℃であり、時間は１−３０分間である。
上記のように、処置のｐＨ値は微生物に対して適切な値に設定され、従って初
期範囲はｐＨ４−ｐＨ８である。処置の間、ｐＨ値が変化および１０−１１近く
まで上がることもある。このような高ｐＨ値での短期間の処置は通常有害でない
。好ましい溶液に従い、活性物質は生理緩衝液、例えばトリアセテート緩衝液の
シトレート中にｐＨ６−７で溶解されるかあるいは懸濁される。緩衝液の濃度は
好ましくは０.００１−１Ｍ、特に０.００５−０.１Ｍである。
活性物質はサンプルを取る前に活性物質の溶液で表面を湿らせ、サンプル表面
と接触せしめる。サンプル表面に該溶液を噴霧するか、あるいはブラシまたはサ
ンプラーで表面に溶液を塗布することにより湿らせ得る。前処置後、サンプルは
表面から分離する。サンプルは調査のため水相に溶解または懸濁される。処置組
成物が精錬剤を含む場合、サンプラーで表面をこすることによりサンプルがより
効果的に分離し得る。
サンプルを取った後、サンプルはまた、栄養寒天培養基または液体栄養溶液で
培養され得る。特に適切な適用に従って、前処置されたサンプル表面を成長媒体
と接触せしめ、成長媒体上で測定する。接触プレートまたは浸漬スライドは成長
媒体として使用される。
サンプル表面は好ましくは細菌または他の微生物により産生されたバイオフィ
ルムである。サンプルは、バイオフィルムがまだ生育していない表面から得られ
ることもまた注目すべきである。かび真菌を含むサンプル表面がサンプルとして
採取されるべきとき、使用される最も好ましい組成物は、複合剤、加水分解酵素
、精錬剤を含む。適切な製品の例として次ぎの組成物が挙げられ、ＥＤＴＡ０.
０５−１.０重量％、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ混合物０.１−１
.
０重量％およびメタケイ酸ナトリウム０.１−１.０重量％を含む。
生存する細菌およびバイオフィルムを有するサンプル表面が消毒綿で拭いて試
験される時、使用される組成物は最も好ましくは複合剤、洗浄剤および精錬剤を
含む。例えば、組成物はＥＤＴＡ０.０５−１.０重量％、４−（１,１,３,３−
テトラメチルブチル）フェノール エトキシレートまたはポリソルベート ポリ
オキシエチレン誘導体０.１−２.０重量％およびメタケイ酸ナトリウム０.１−
１.０重量％含み得る。
トリエタノールアミン、精錬剤および洗浄剤は、細菌およびバイオフィルムを
含有する表面に噴霧することにより塗布され得る。
微生物の量はサンプルから測定され、従って種々の微生物がサンプルから分離
され、別々に測定される。微生物はまた、代謝を測定することにより発見され得
る。
試験キットに含まれるサンプラーは、上記の前処置溶液および、コットン、ダ
クロン、アルギネート、または海綿状プラスチックでつくられた消毒綿を有し、
適当なホルダー、例えば木製またはプラスチックスティックまたは針で固定され
たサンプラーを含む。
微生物検査のためのサンプルの前処置への本発明の適用は、上記してきた。し
かしながら、本発明はまた、化学的（例えば、成分分析）および物理的測定のた
めのサンプルの処置に適用され得ることも明らかである。
本発明による組成物はまた、洗浄および消毒に先立ち、種々の表面の前処置に
使用され得る。本発明に従って、上記処置溶液は望む表面にサンプルの１平方セ
ンチメートル当たり０.００１−１ｍｌ、好ましくは約０.０５−０.５ｍｌ塗布
される。処置温度は検査のための表面前処置と同じ、すなわち４−４５℃で、処
置時間は１−３０分間である。
表面が洗浄および消毒に先立ち、前処置され、微生物サンプルを得るのが目的
でない場合、処置の初期ｐＨ値は微生物に適切である必要はないが、通常ｐＨ４
−８の範囲で使用され、この範囲は酵素を活性せしめる。好ましい別法に従って
、活性物質を生理緩衝液、例えばシトレートまたはトリアセテート緩衝液にｐＨ
値
６−７で溶解または懸濁する。緩衝液の濃度は最も適切には０.００１−１Ｍ、
好ましくは０.００５−０.１Ｍである。
活性物質を洗浄または消毒に先立ち、活性物質の溶液で表面を湿らせ、望む表
面と接触せしめる。該溶液を表面に噴霧するか、あるいは溶液をブラシで表面に
塗布することにより湿らし得る。前処置後、表面は通常の方法で洗浄または消毒
される。処置溶液が精錬剤を含む場合、洗浄および消毒に先立ち、表面をこする
とより効果的に微生物を除去することができる。洗浄および消毒に先立つ前処置
に指定される組成物は、検査前の前処置に使用される組成物と同じ活性物質を含
む。
下記実施例により本発明を明らかにする。略語：
ＡＴＰ：アデノシントリホスフェート
Ｂrij ３５：ポリオキシエチレンラウリルエーテル
ＣＨＡＰＳ：３,３−コルアミドプロピルジメチルアンモニオール−１−プロパ
ン スルホネート
ＣＨＡＰＳＯ：３,３−コルアミドプロピルジメチルアンモニオール-２−ヒドロ
キシプロパン スルホネート
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＧＴＡ：エチルグリコール ビスアミノエチルエーテルテトラ酢酸
ＲＬＵ：相対光放出ユニット
ＳＤＳ：硫酸ドデシルナトリウム
Ｔriton−Ｘ−１００：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール
Ｔween ８０：ポリオキシエチレノールソルビトール酸
ＲＢＳ：アルカリ性界面活性剤含有洗浄剤
ｃｆｕ：コロニー形成単位用いた方法：
本発明において、バイオフィルムを培養し、除去細菌をディシュ・ディップス
ライド法で培養することにより（Wirtanen,G．1995．食品製造設備におけるバイ
オフィルムの形成と消失、Espoo:The Technical Research Center of Finland,V
TT Publications 251，106p.+app.48p.）、そしてＡＴＰ法（ＡＴＰ測定キット
、Bio Orbit）で測定した。処置後に表面上に残っている細菌およびバイオフィ
ルムの量を造影分析により調べた（Wirtanen,G.およびMattila-Sandholm,T.1994
.ステンレス鋼表面のPediococcus pentosaceusおよびPseudomonas fragiのバイ
オフィルムの測定、Colloids and Surfaces B:Bioinferfaces,2,33-39)で調べた
。用いた化学物質および酵素：
キレート剤：ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ
アミン：トリエタノールアミン
アルコール：イソプロパノール
還元剤：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（以下の略称“アセチルシステイン”）
およびジチオトレイトール
洗浄剤：Ｔriton−Ｘ−１００、オクチルグルコシド、ＳＤＣ、ＣＨＡＰＳ、Ｃ
ＨＡＰＳＯ、ＢＲＩＪ３５
加水分解酵素：ペクチナーゼＥ.Ｃ.３.２.１.１５、プロテアーゼＥ.Ｃ.３.４.
２１.６２、アミラーゼＥ.Ｃ.３.２.１.１、セルラーゼＥ.Ｃ.３.２.１.４、パ
パインＥ.Ｃ.３.４.２２.２
実施例１
バイオフィルムの前処置およびサンプリング液体中のバイオフィルムの培養
ステンレス鋼シート、ＡＩＳＩ３０４／２Ｂをバイオフィルム成育表面に使用
した。シートを５０℃の２％ＲＢＳ洗液で洗い、その中で２０分間揺さぶった（
１分間につき７５振動）。シートを４５℃の２度蒸留水で５回すすぎ、上記のよ
うに５分間揺さぶり、次いでオートクレーブにかけた。
Ｐseudomonas fragi-bacteria（ＡＴＣＣ４９７３）をバイオフィルム形成に
用いた。細菌を−８０℃に保った。細菌はＩso−Ｓensitest Ｂroth液（Ｏxoid
）に使用するに先立って覚醒せしめた。
バイオフィルムを対象ガラスの大きさ（１８.７５ｃｍ2）を有す清浄な鋼シー
ト上、２５℃で、通常５日間ブロス溶液（蒸留水１リットル中、ＬＡＢ−Ｌemco
パウダー（ＯＸＯＩＤ）２.４ｇ、栄養ブロスパウダー（Ｄifco）８ｇ、サッカ
ロース（ＢＤＨ）５０ｇ、グルコース（ＢＤＨ）１０ｇおよびフルクトース（Ｍ
erck）１０ｇ）２００ｍｌ中で培養し、この溶液に細菌液を１０7−１０9細胞／
ｍｌの濃度で加えた。成育器を毎分６０振動の速度で揺さぶり、細菌を含まない
新しいブロス液を２日毎に加えた。
培養後、バイオフィルム除去実験に先立ち、バイオフィルムを有する鋼シート
を蒸留水で２回すすいだ。処置において、検査した混合物か、ペプトン塩液で湿
らしたコットン、ダクロンまたはアルギネートの綿棒かのいずれかをバイオフィ
ルムに擦り付け、サンプラーに結合したバイオフィルムをペプトン塩液（ペプト
ン１ｇ／ｌ＋ＮａＣｌ８.５ｇ／ｌ）中に懸濁し、そこから希釈を行った。検査
した混合物約０.２ｍｌをサンプラー中に入れておいた。この後、懸濁により除
去した細菌を栄養寒天に培養し、コロニーを数えるに先立ち２５℃で２日間成育
せしめた。処置したシートを０.１％アクリジンオレンジ（ＢＤＨ）で乾燥した
。表面に残るバイオフィルムは緑がかった色を帯び、バイオフィルムの量を蛍光
顕微鏡の造影解析で定量した。表面に残る微生物は同時に黄色になった。空気流中でのバイオフィルムの培養
除去する物質の組み合わせで湿らしたコットン綿棒の、空気制御機器における
鋼表面から種々の年齢のかび真菌Ａspergillus nigerおよびそのバイオフィルム
を除去する能力を下記のように検査した。
まずＡspergillus nigerかびをサブロー容器に前培養し、胞子を懸濁液中に混
じた。懸濁液をシートの全表面を覆うように塗布した。シートを２５℃、一定の
空気流中、相対湿度７０％で種々の時間、インキュベートした。１４および２８
日後にシートをサブロー容器の培養により、さらに造影分析により検査した。
実施例２
細菌およびバイオフィルムを除去するキレート剤の能力
細菌およびバイオフィルムを表面から除去する種々のキレート剤の能力は、モ
デルとして鋼表面にＰseudomonas fragiが形成するバイオフィルムを用いて検査
した。バイオフィルムを種々の材質でできた綿棒で除去した。綿棒をペプトン塩
類溶液（０.８５重量％ＮａＣｌ、対照）およびキレート剤含有の処理液で湿ら
した。
結果を表１に示す。
*０.０２Ｍトリスアセテート緩衝液中の濃度％、ｐＨ７.７５
サンプラー、すなわちコットン、ダクロンまたはアルギネート綿棒の選択は、
除去された細菌の量または処置後に残存するバイオフィルムの量になんらの相違
をもたらさなかった。キレート剤については、ＥＤＴＡが０.２−０.６％の濃度
でバイオフィルムを除去するのに最も効果的であった。表面から除去された細菌
の量は５.５−７.０対数単位の間にある。
実施例３
コットン綿棒に吸着された活性剤の、バイオフィルムから細菌を引きはがす能力
表２に、トリエタノールアミン、イソプロパノールとトリエタノールアミンお
よび後者の混合液に還元剤であるアセチルシステインまたはジチオトレイトール
を加えたものについて試験した結果を示す。ＡＴＰ測定法で普通に用いられてい
るレイヨン綿棒を測定に使用し、活性物質で湿らした。表は、除去後の細菌培養
および細菌性ＡＴＰ分析の結果を示し、種々の物質の組み合わせで表面を処理し
たときの、表面から除去された細菌を記載する。表面に残るバイオフィルムを同
じシートで測定した。実験方法は実施例１と同じであり、除去された細菌を培養
およびＡＴＰ測定法（ＡＴＰ測定キット、ＢioＯrbit）により分析した。表面に
残るバイオフィルムの量は、実施例１に準じ造影分析法により調べた。
*０.０２Ｍ トリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５
トリエタノールアミン、イソプロパノールおよびアセチルシステインの組み合
わせが細菌およびバイオフィルムを除去するのに最も効果的であった。ＡＴＰ分
析法で、アルコールまたはアミンに還元剤を加えた本発明の混合物はバイオフィ
ルムと細菌の両方を除去するのに効果的であることが認められた。また、イソプ
ロパノールなどのアルコールおよびトリエタノールアミンなどのアミンが培養し
た細菌の量に影響を及ぼすことも見られた。他方、これらはバイオフィルムを十
分には除去しなかった。しかし、還元剤と共にであると、細菌とバイオフィルム
の両方を十分除去した。
実施例４
キレート剤および還元物質の組み合わせにおける種々の洗浄剤の細菌除去能力
キレート剤であるＥＤＴＡおよび還元物質であるジチオトレイトールの組み合
わせにおける種々の洗浄剤の細菌除去能力を培養により比較した。同じ混合物の
バイオフィルム除去能力を測定するために造影分析を用いた。実験は実施例１に
準じて行った。
*０.０１Ｍトリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５、０.０７％ＥＤＴＡおよび１
％ジチオトレイトールを含む。
洗浄剤の追加は表面からの細菌の除去を顕著に増加しなかったが、その結果の
変動が小さいことから分かるように、除去細菌の測定の再現性が洗浄剤の使用で
よりよくなる。アニオン性洗浄剤ＳＤＳおよび非イオン性洗浄剤ＢＲＩＪ３５な
どのいくつかの洗浄剤は、ＥＤＴＡおよびジチオトレイトールのみの混合物より
もバイオフィルムの除去に効果があった。
実施例５
加水分解酵素類のバイオフィルムに対する作用
加水分解酵素類のバイオフィルムに対する作用を表４に示す。実験は実施例１
と同様に行われた。バイオフィルム表面を１またはいくつかの酵素の湿綿棒で処
理した。
*０.０１Ｍトリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５、０.１％ＥＤＴＡを含む。
**Ｏrion Ｄiagnostica，Ｋaisu Ｏllila，Ｔeesside Ｕniversity，Ｅngland，
1995で消毒され、活性が測定された。
上記結果によると、ペクチナーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの混合物が細
菌を除去するのに最も適した酵素混合であった。ペプトン塩液のみに比べると、
この混合物は０.６対数単位優れている。ペクチナーゼのみ、ペクチナーゼとプ
ロテアーゼまたはペクチナーゼとセルラーゼの混合物およびアミラーゼのみは、
ペプトン塩類液のみでの処理よりもバイオフィルムの除去について２−４倍効果
的であった。さらに、いくつかの加水分解酵素は、細菌を破壊することなくバイ
オフィルムをよく除去することが認められる。
実施例６
種々の混合物の、相違する時間を経たバイオフィルムを除去する能力
好気性雰囲気での培養から相違する時間を経たバイオフィルムおよびかびを除
去することについても、実施例５で試験した混合物の能力を調べた。この目的の
ために綿棒を放出物質の種々の組み合わせで湿らした。異なる時間を経たＡsper
gillus nigerかびおよびそれらの真菌から形成されたバイオフィルムを空気制御
した装置中での鋼表面から除去するのに、この綿棒を使用した。種々の混合物で
湿らした綿棒の除去能力を測定した。
方法の再現性を調べるために３表面を平行的に処置した。
*０.０２Ｍトリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５
**酵素ブレンドは実施例５に記載のペクチナーゼ、アミラーゼおよびプロテアー
ゼの混合物。
本発明のすべての混合物は、ペプトン塩類よりも効率的に２週間を経たかびの
バイオフィルムおよびかび細胞を除去する。１カ月を経たバイオフィルムおよび
かび細胞はイソプロパノールとトリエタノールアミンまたはＴweenとの混合物に
Ｔriton−Ｘ−１００を加えたものでより効率的に除去された。
表５と表１の結果を比較すると、酵素類の追加でキレート剤含有のブレンドの
効率が増加することが分かる。
精錬剤のＮａ−メタシリケートは、キレート剤のＥＤＴＡ（すなわち、アミノ
テトラカルボキシレート）および酵素類とともに用いて、バイオフィルムの除去
に効果的であった。
表５の結果からすると、かび真菌の除去に特に適した組み合わせは、ＥＤＴＡ
などのキレート剤、酵素ブレンドおよびＮａメタシリケートなどの集塵剤を含む
ことが分かる。
実施例７
活性剤の混合物
混合細菌が形成するバイオフィルムをよく除去する組成物を上記の実施例に基
づき表５から選択した。組成物をバイオフィルム上に塗布または噴霧し（０.２
ｍｌ／ｃｍ2）、選択細菌を除去する能力を測定した。実施例１に従って細菌を
表面から引き離し、Ｐseudomonas栄養寒天、Ｌisteriaヒツジ血寒天およびＢaci
llus栄養寒天上で培養した。結果を表６に示す。
*０.０２Ｍトリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５
細菌の除去につき洗浄剤の噴霧は、塗布よりもよい収率の培養をもたらした。
相違は、Ｐseudomonasについて１−２対数単位、Ｌisteriaについて１対数単位
であった。培養に十分なＢcillus cereusはなかった。
実施例８
塗布または噴霧によるバイオフィルムの除去
Ｐseudomonas fragi、Ｌisteria monocytogenesおよびＢacillus cereus細菌は
共成長をなした。成長の量を造影分析により調べた。塗布および噴霧（０.２ｍ
ｌ／ｃｍ2）後に、鋼表面に残存する細菌および細胞の量を実施例１に従って測
定した。
*０.０２Ｍトリスアセテート緩衝液、ｐＨ７.７５
上記結果から分かるように、活性剤のブレンドを噴霧することが鋼表面からバ
イオフィルムを除去するのに最も効果的な方法である。ペプトン塩類溶液の噴霧
はバイオフィルムの量を１／３に、細胞の量を１／１０に低下せしめる。表面に
残存するバイオフィルムの量は、Ｔriton−Ｘ−１００、トリエタノールアミン
およびナトリウム・メタシリケートのブレンドの噴霧後は元の量の１／１０であ
った。バイオフィルム表面への噴霧は、細菌を損傷することなく、より効果的な
除去をもたらした。
実施例７と８はひとつの結果および同じ実験を示している。Ｔriton−Ｘ−１
００含有トリスアセテート緩衝液中のキレート剤、例えばＥＤＴＡおよび精錬剤
、例えばＮａメタシリケートの混合物が、実施例７および８に報告された実験結
果から分かるように、生きている細菌およびバイオフィルムを除去するのに非常
に
効果的である。噴霧処理で、生きている細菌およびバイオフィルムがＴriton−
Ｘ−１００含有トリスアセテート緩衝液中のトリエタノールアミンおよび精錬剤
の混合物により非常に効果的に除去された。
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フロントページの続き
(72)発明者 サロ，サトゥ
フィンランド、エフイーエン−02210エス
ポー、クーンセデ２セー27番
(72)発明者 シェイニン，レーナ
フィンランド、エフイーエン−02210エス
ポー、クーンセデ６デー80番
(72)発明者 ベツマン，アリ
フィンランド、エフイーエン−20290ルス
コ、クルマティエ11番
(72)発明者 レヴォ，セイヤ
フィンランド、エフイーエン−02210エス
ポー、クータモカトゥ２アー16番