JP5670783B2 - バイオフィルムの除去方法 - Google Patents
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Description
工程1:(a1)アニオン性界面活性剤〔以下(a1)成分という〕及び(a2)金属イオン捕捉剤〔以下(a2)成分という〕を(a1)成分/(a2)成分=1/9〜9/1の質量比にて含有する組成物(A)を、バイオフィルムの形成された固体表面に接触させる工程
工程2:(b)糖質分解酵素〔以下(b)成分という〕を含有する組成物(B)を、前記固体表面に接触させる工程
黄色ブドウ球菌はTSB No.2液体培地(シグマ社製)で、アシネトバクターはMHB液体培地(和光純薬社製)で、緑膿菌はLB培地(和光純薬社製)で、それぞれ、37℃、20時間培養した。各種菌の培養液を滅菌生理食塩水で100倍に希釈後、黄色ブドウ球菌はTSB No.2寒天培地に、アシネトバクターはMHB寒天培地に、緑膿菌はNAC寒天培地(栄研化学社製)に各10枚塗抹し、それぞれ、37℃で48時間培養した。140 mM NaCl、10 mM EDTAを含むpH 7.5の水溶液(A液と略す)を各寒天培地上に5 ml添加し、菌層部をコンラージ棒で掻きとる操作を各プレートに対し2回実施し、菌液を回収した。回収した菌液を30分間攪拌し、8000 rpm、20 min 15℃で遠心分離した。上澄みを回収し、0.2 μmのメンブレンフィルター(Nalgene filtration product社)でろ過した。一方、菌層にA液100 mlを加え、同様に攪拌し、液を遠沈管に集め、1分間ボルテックス(Scientific Industry社、G-560)にて攪拌を行い、遠心分離、ろ過する操作を3回行った。ろ液を集め、透析セルロースチューブに封入し、5Lのイオン交換水下で48時間(2回イオン交換水を交換)透析し、低分子化合物を除いた。
回収した液体をLowry法(測定キットはナカライテスク社製)で測定し、ウシ血清アルブミン(BSA)による検量線からタンパク質濃度を定量し、タンパク質由来のバイオフィルム量とした。また回収した液体をフェノール硫酸法によって、黄色ブドウ球菌及びアシネトバクターはマンノースによる検量線から、緑膿菌はアルギン酸による検量線から多糖類濃度を定量し、多糖類由来のバイオフィルム量とした(非特許文献1)。さらに、回収した液体について260nmの吸収極大を測定して核酸の存在を確認後、透析分の固形分からタンパク質量と多糖類量を引いて核酸量とし、核酸由来のバイオフィルム量とした。
〔非特許文献1〕Hodge,J.E. and Hofreiter,B.T.1962. Methods in Carbohydrate Chemistry vol.1,pp.380-394
本発明においては、後述する実施例記載の評価方法において、バイオフィルム除去率としては、80%以上である場合にバイオフィルムが「除去」される効果として良好であり、90%以上である場合に更に良好である。
(a1)成分はアニオン性界面活性剤である。本発明において、(a1)成分は、バイオフィルムを構成する微生物産生物質、とりわけタンパク質に作用し、バイオフィルムの構造を脆弱化させるよう働くものと推察される(比較例1の結果を参照のこと)。
(a2)成分は金属イオン捕捉剤である。本発明における(a2)成分の作用機構は明らかではないものの、そのキレート能に起因して、バイオフィルムを構成する微生物産生物質間の結合に関与しているとされる金属イオンに作用し、バイオフィルムの構造脆弱化に寄与するものと推察される(比較例2を参照のこと)。
(b)成分は糖質分解酵素である。本発明において、(b)成分は、バイオフィルムの構造体の形成に寄与していると推察される糖鎖を分解し、固体表面からバイオフィルムを除去するよう働く。かかる酵素の特性を利用してバイオフィルムの除去を試みた従来技術(例えば、上記特許文献1及び2)は存在するものの、バイオフィルム(とりわけ、タンパク質構成比率の高いバイオフィルム)の除去効果は満足できるレベルにはなかった。本発明者は、かかる(b)成分による処理工程の前に、あらかじめ上記(a1)成分及び(a2)成分を用いてバイオフィルムを処理することにより、タンパク質構成比率の高低によらず、バイオフィルムを効果的に除去し得ることを見出したものである。
本発明のバイオフィルムの除去方法は、下記工程1の後に下記工程2を行うことを特徴とする。
工程1:(a1)成分及び(a2)成分を(a1)成分/(a2)成分=1/9〜9/1の質量比にて含有する組成物(A)を、バイオフィルムの形成された固体表面に接触させる工程
工程2:(b)成分を含有する組成物(B)を、前記固体表面に接触させる工程
(1)サンプルの吸光度の測定
5mLの緩衝液(Britton-Robinson Buffer、pH8.5、50mM(阿南功一ら著. 基礎生化学実験法6、p277、丸善株式会社))にネオ.アミラーゼテスト「第一」〔第一化学薬品(株)より入手、製品番号701501-005〕を1錠添加し、約10秒間攪拌した後、2mM塩化カルシウム水溶液で希釈した1mLの酵素溶液を添加して、50℃にて15分間反応させた。1mLの0.5N水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌することで反応を停止させた後、遠心分離(400×g、5分間)にて不溶成分を沈殿させ、得られた遠心上清の620nmにおける吸光度を測定した。
5mLの緩衝液(Britton-Robinson Buffer、pH8.5、50mM(阿南功一ら著. 基礎生化学実験法6.p277.丸善株式会社))にネオ.アミラーゼテスト「第一」を1錠添加し、約10秒間攪拌した。これに1mLの0.5N水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌した後、1mLの酵素溶液を添加し、50℃ にて15分間インキュベートした後遠心分離(400×g、5分間)を行った。得られた遠心上澄みの620nmにおける吸光度を測定した。
ネオ.アミラーゼテスト「第一」同封の国際単位の検量線を基準とし、これに(1)と(2)の吸光度の差をあてはめることでアミラーゼの活性を算出した。
(1)サンプルの吸光度の測定
0.5%ローカストビーンガム溶液(シグマ社製、pH10.0、50mM-炭酸ナトリウム緩衝液)200μLに酵素溶液50μLを添加し、40℃で10分間反応させた。反応後10分間煮沸して酵素を失活させ、系中の還元糖量をソモギー・ネルソン法により定量した。つまり、ソモギー試薬を250μL添加し、さらに30分間煮沸した後、直ちに氷冷し、その液に、ネルソン試薬500μLと純水3mLを加えて、500nmの吸光度を測定した。
0.5%ローカストビーンガム溶液(シグマ社製、pH10.0、50mM-炭酸ナトリウム緩衝液)200μLに50mM-炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)50μLを添加し、40℃で10分間反応させた。反応後10分間煮沸し、系中の還元糖量をソモギー・ネルソン法により定量した。
マンナナーゼ活性は上記の条件で1分間に1μmolの還元糖を生成する酵素量を1ユニット(U)とした。
実施例及び比較例で用いたバイオフィルム検体は以下の方法により調製した。即ち、緑膿菌(NBRC13275)、アシネトバクター(環境単離菌)、黄色ブドウ球菌(NBRC13276)をそれぞれLB培地(和光純薬社製)で37℃、18時間振盪培養した各菌の前培養液を、混合培地(MHB培地(日本製薬(株)製)とTSB培地(日本製薬(株)製)に2mM塩化カルシウムを添加したもの)に1/100量になるよう添加したものを、96ウェルマイクロプレート(ファルコン社製、ノントリートタイプ)の各ウェルに0.15mLずつ分注し、37℃、48時間培養した。培養後、上澄みを廃棄し、滅菌水0.2mLで各ウェルを3回濯ぎ、マイクロプレート壁に形成されたものをバイオフィルム検体として得た。
表2に示す成分を用い、以下に示す方法で表2に示す組成の組成物(A)及び組成物(B)を調製した。得られた組成物(A)及び組成物(B)を用いて、下記方法によりバイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を下記要領で評価した。結果を表2に示す。
なお、表2中の濃度は各組成物全量に対する有効分濃度(質量%)を示す。また、以下の記載においては、特に断りのない限り、「%」は「質量%」の意を示す。
100mLのガラスビーカーに、スターラーピース(直径8mm×30mm、増田理化工業製)を挿入し、組成物(A)の出来上がり質量が100gとなるように、表2に示す質量比率にて、全ての成分を投入した。ウォーターバスにて80℃まで昇温し、100rpmで30分間撹拌した。組成物の外観が均一になったことを確認し、室温(25℃)まで冷却した。
100mLのガラスビーカーに、スターラーピース(直径8mm×30mm、増田理化工業製)を挿入し、組成物(B)の出来上がり質量が100gとなるように、表2に示す質量比率にて、全ての成分を投入した。室温(25℃)下、100rpmで5分間撹拌し、組成物の外観が均一になったことを確認した。
表2に示す組成物(A)0.2mLを、バイオフィルム検体の形成されたマイクロプレートのウェルに注加し、25℃で10分間接触させた(「工程1」)。その後、上澄みを廃棄し、イオン交換水を高圧蒸気滅菌(121℃、20分間)することで調製した滅菌水0.2mLでマイクロプレートのウェルを1回濯ぐ洗浄を行った。
次いで、表2に示す組成物(B)0.2mLを、マイクロプレートのウェルに注加し、30℃で90分間接触させた(「工程2」)。
上記<バイオフィルム検体の処理>に従って処理したマイクロプレートのウェルから上澄みを廃棄し、滅菌水0.2mLで1回濯いだ後、クリスタルバイオレット(和光純薬社製)の0.1%水溶液0.2mLを注加し、室温(25℃)で10分放置した。上澄みの廃棄後、滅菌水で3回濯ぎ、100%エタノール(シグマ社製)0.2mLを注加し、バイオフィルムを染色したクリスタルバイオレットを均一に溶解させた。次いで、各ウェルに関し、570nmの吸光度を測定した(「サンプル吸光度」;As)。
なお、組成物(A)及び組成物(B)による処理を行わず、滅菌水0.2mLを用いて3回濯ぎ処理を行ったものを処理前サンプルとして用い、上記と同様にクリスタルバイオレットによる染色処理並びに吸光度測定を行った(「初期吸光度」;Ai)。
また、菌培養液を注加せず、滅菌水0.2mLのみを注加し培養処理を行った後、滅菌水0.2mLを用いて3回濯ぎ処理を行ったものをブランクサンプルとして用い、上記と同様にクリスタルバイオレットによる染色処理並びに吸光度測定を行った(「ブランク吸光度」;Ab)。
得られた各吸光度値を下記式に代入し、バイオフィルム除去率を算出した。表2記載の値は、かかる操作を6回行い、その平均値を示したものである。
表2に示す組成物(A)を用いた以外は、実施例1と同様にして、バイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を評価した。結果を表2に示す。
表2に示す組成物(A)を用い、且つ工程1のみを行った以外は、実施例1と同様にして、バイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を評価した。結果を表2に示す。
表2に示す組成物(B)を用い、且つ工程2のみを行った以外は、実施例1と同様にして、バイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を評価した。結果を表2に示す。
表2に示す組成物(A)及び組成物(B)を用い、且つ工程1と工程2の順序を入れ替えた以外は、実施例1と同様にして、バイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を評価した。結果を表2に示す。
・AS−Na:ラウリル硫酸ナトリウム(エマールO、花王(株)製)
・EDTA−3Na:エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム(和光純薬(株)製)
・POE8(C12):ポリオキシエチレン(8)ラウリルエーテル(エマルゲン108、花王(株)製)
・ATAC:ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド(コータミン24P、花王(株)製)
・アミラーゼ:ターマミル(ノボザイムス社製):20000IU/g(ファデバス法による)
・マンナナーゼ:マンナウェイ(ノボザイムス社製):3.76MIU/g(ノボ技術資料による)
表3に示す組成物(A)を用いた以外は、実施例1と同様にして、バイオフィルム検体を処理し、バイオフィルム除去性能を評価した。結果を表3に示す。
Claims (5)
- 下記工程1の後に下記工程2を行う、バイオフィルムの除去方法。
工程1:(a1)アニオン性界面活性剤〔以下(a1)成分という〕及び(a2)金属イオン捕捉剤〔以下(a2)成分という〕を(a1)成分/(a2)成分=1/9〜9/1の質量比にて含有する組成物(A)を、バイオフィルムの形成された固体表面に接触させる工程
工程2:(b)セルラーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ぺクチナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、シアリダーゼ、マンノシダーゼ、サッカラーゼ、フコシダーゼ、アルギン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼから選ばれる1種又は2種以上の糖質分解酵素を含有する組成物(B)を、前記固体表面に接触させる工程 - 工程1と工程2の間に、水、又は、ノニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる界面活性剤を含有する水混合物(C)を用いて、工程1が終了した固体表面を洗浄する工程を有する、請求項1に記載のバイオフィルムの除去方法。
- 組成物(A)中の(a1)成分と(a2)成分の質量比が、(a1)成分/(a2)成分=3/7〜7/3である、請求項1又は2記載のバイオフィルムの除去方法。
- 組成物(A)中の(a1)成分の含有量が、0.3〜9.0質量%である、請求項1〜3の何れか1項記載のバイオフィルムの除去方法。
- 組成物(A)中の(a2)成分の含有量が、0.02〜3.0質量%である、請求項1〜4の何れか1項記載のバイオフィルムの除去方法。
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