CN1509732A - 一种治疗冠心病的中药 - Google Patents
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Abstract
本发明是由黄芪10-20份、党参4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹参4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份组成。本发明具有显著的抗心肌缺血损伤作用及多重的作用机制,它可改善心肌细胞能量代谢,改善内皮依赖性血管舒张功能障碍,加速和增强侧肢循环的建立和血管的新生,抑制和阻断细胞凋亡的发生。本发明对冠心病的治疗疗效显著,作用持久,并且无任何毒副作用。
Description
技术领域:本发明属于一种治疗冠心病的中药。
背景技术:冠心病在发达国家和部分发展中国家是常见病、多发病。近年在我国也呈明显上升的趋势,城市人口死亡中冠心病约占10%左右,因此,冠心病已引起人们的重视,对该疾病的治疗,现代医学采取扩张血管疗法,、改善血液疗法及内皮细胞重建法三大方法,但有许多弊端和不良反应。中医药治疗冠心病以其疗效确切、副作用小、作用持久的优势已逐渐被人们所认知。中医学认为冠心病是以脏腑虚损,气血阴阳不足为本,以气滞、血瘀、痰浊和寒凝等有形之邪为标的本虚标实之证。目前已有一些治疗冠心病的中药,如地奥心血康等,对治疗冠心病有一定的疗效。
发明内容:本发明的目的是提供一种一以益气活血为原则、疗效好、无任何毒副作用、作用持久、价格低廉的一种治疗冠心病的中药。本发明的技术方案是:本发明是由黄芪、党参、桂枝、甘草、丹参、元胡、降香、三七组成,它们的重量份数比是:黄芪10-20份、党参4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹参4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份。制备工艺可按中药制取的常规工艺根据需要制成不同剂型。
由于冠心病多以气虚血瘀为主要发病机制,因此治疗应采取以补为通、补中寓通、通补兼施,着眼于整体功能的调节,达到气盈血行,血脉通利,胸痛自解的目的。本发明综合冠心病中医补中寓通的治法,提出了以益气活血为组方原则的新配方。本发明选用黄芪、党参为主药,黄芪味甘,性微温,归脾肺二经,具有补益宗气,益气固表,利水消肿作用。
《本草求真》:黄芪,入肺补气,入表实卫,为补气诸药之最。现代药理研究则揭示黄芪具有扩张血管,尤其是扩张冠状动脉的作用,减轻心肌缺血和心肌代谢及缩小梗塞面积的作用,而且还具有升降雪压,降低血液粘稠度及改善异常的血液流变学指标等功能。黄芪还具有明显赠加心排量及心脏指数、保护心肌细胞、加强心肌的的收缩力等功效。党参味甘,性平,归脾肺二经,具有益气、生津、养血之作用。《本草从新》:“主补中益气,和脾胃,涂烦渴。中气微弱,用以调补,甚为平妥。”现代药理则揭示党参能增强心肌收缩力,增强心输出量,还能扩张外周血管,调节血压。丹参为辅药,具有活血化瘀的作用。丹参能通过清除自由基而保护心肌、抗血栓形成及扩张血管作用、降低血压作用,研究还发现,丹参对心肌钙反常损伤具有明显的保护作用。丹参素具有改善微循环障碍,从而改善细胞缺血缺氧所致的代谢障碍的作用。元胡、三七为佐药,以助丹参活血化瘀之效。《本草求真》言:“三七气味苦温,能于血分化其血瘀。”三七中有效成分三七总皂甙可显著保护SOD活力的降低,减少MDA生成,有明显的抗氧化作用。三七还有改善冠脉循环和抗血小板聚集力的作用。同时三七还能明显的降低心肌耗氧量,具有改善心肌氧代谢的作用。元胡在《本草纲目》中记载:“玄胡索味苦微辛,气温;入手足太阴,厥阴四经,能行血中气滞,气中血滞,故专治一身上下诸痛。”元胡醇提物有明显的扩张离体兔心和在体猪心的冠状血管,降低冠脉阻力与增加血流量的作用,对麻醉犬冠状动脉的扩张作用最明显,颈内动脉次之。元胡醇提物还可明显提高动物对常压或减压缺氧的耐受能力、增加麻醉犬的心输出量、降低血压和外周阻力。降香、桂枝、甘草为使药,一方面助臣药丹参和佐药活血化瘀,另一方面具有行气作用。现代药理研究表明,降香主要含黄檀素,异黄檀素等,对血流变学的纤溶蛋白原有降低作用,并增加冠脉流量,减慢心率,增加心肌供氧,降低心肌氧耗量的作用。桂枝:味辛甘,性温、归心、肺、膀胱经,现代药理研究表明桂枝其成分含有挥发油,桂皮油能使血管扩张,调整血液循环,促使血液流向体表。甘草:味甘,归平,归心肺、脾胃泾,具有益气补中、调和药性、抗心率失常之功效。
研究和实验表明,本发明不仅具有显著的抗心肌缺血损伤作用,而且还具有多重的作用机制,它可改善心肌细胞能量代谢,改善内皮依赖性血管舒张功能障碍,加速和增强侧支肢循环的的建立和血管的新生,抑制和阻断细胞凋亡的发生。因而对冠心病的治疗疗效显著,作用持久,并且无任何毒副作用。
下面是动物实验结果:
(一)材料与方法
1、实验动物
Wistar雄性大白鼠100只,体重200±25g。昆明种小鼠240只,体重18-21克,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
2、实验药物:
(1)实验药物采用本发明的冲剂剂型,即复方黄芪无糖颗粒冲剂:取黄芪100g,党参30g,丹参30g,元胡50g,三七10g,降香10g,桂枝10g,甘草10g,加水煎煮3次,三次均加水8倍量,每次煎煮90min,保持80-90℃热浸1小时,合并三次煎液,滤过,滤液减压浓缩至稠膏(约占原体积的二分之一)冷却后慢慢加入2倍量的乙醇,快速充分搅拌混匀后,静置12-14小时,滤取上清液,减压回收乙醇至相对密度1.30-1.35(50℃热测)的清膏,取清膏1份,糊精1份及乙醇适量,混匀,过10目筛制成颗粒,于60-70℃干燥,然后分装。实验前制成复方黄芪无糖颗粒冲剂悬液,用蒸馏水配制成25%(100ml含生药25g)的浓度备用。
(2)地奥心血康胶囊:成都地奥制药公司批号:990415,实验前以生理盐水调成0.3/2ml浓度悬液备用。
(3)盐酸异丙肾上腺素注射液:上海禾丰制药有限公司生产,批号:991002。
3、实验仪器
研究用万能显微镜(BX60),日本OLYMPUS公司产品
摄影显微镜(CH型),日本OLYMPUS产品
透射电子显微镜(1220型),日本电子公司产品
莱卡轮转式切片机(2145型),德国莱卡公司
医用微波炉,南韩SAMSUNG
液体闪烁记录仪(FJ-210P型),国营二六二厂
电热恒温水箱(HHWZ1600),上海跃进医疗器械厂
气浴恒温振荡器(THZ-82A),江苏省金坛市医疗仪器厂
分光光度计(UV-754),上海第三分析仪器厂
干燥箱(101A-Z)型,上海市实验集器总厂
II导生理记录仪LMS-2A型,成都仪器厂
4、实验用主要试剂
一氧化氮试剂盒,北京解放军总院科技开发中心
内皮素试剂盒,北京解放军总院科技开发中心
ATPase(组织)试剂盒,南京建成生物工程研究所
原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡试剂盒,德国B·M公司
Bcl-2试剂盒,武汉博士德公司
Fas试剂盒,武汉博士德公司
血管内皮生长因子(FaVIII)试剂盒,武汉博士德公司
血脂试剂盒,黑龙江省省医院放免中心
5、实验方法
(1)动物分组:将实验用大鼠随机分为五组,每组12只大鼠,即正常组、模型组、复方黄芪无糖颗粒冲剂高剂量组、复方黄芪无糖颗粒冲剂低剂量组、地奥心血康对照组
(2)实验用药、造模及取材
实验用药前各组动物分别以II导生理记录仪测心电图,继则开始每天分别灌胃,生理盐水(10ml/kg体重)、复方黄芪无糖颗粒冲剂5g/kg体重(含生药量)、复方黄芪无糖颗粒冲剂2.5g/kg体重(含生药量)地奥心血康0.12g/kg体重,连续7天,于第5天、第6天和第7天灌药后30分钟,各组动物分别以乌拉坦(10%的乌拉坦,1ml/100g体重)麻醉,皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素(ISO8mg/kg体重,参照文献复制ISO心肌缺血损伤模型),正常对照组给予等容量的生理盐水。于第3次注射异丙肾上腺素后24小时眼眶采血2ml分离血清待测生化指标,采血之后将大鼠处死,摘取心脏,立即用予冷的生理盐水冲洗,冲洗后分别切取心肌组织行各项观察指标的检测。
(3)各组心肌组织匀浆的制备
①切取心肌组织块,用冰冷的生理盐水冲洗,除去血液,滤纸拭干,称重(300mg),放入5-10ml的小烧杯内。
②用量筒量取予冷的生理盐水2.7ml(组织重量的9倍),用滴管移取少量于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织(小烧杯放入冰水中进行)。
③将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰块的器皿中,右手将捣杆垂直插入管中,上下转动研磨数十次,充分磨碎使组织匀浆化,15分钟左右,即制成10%的心肌组织匀浆。2%的心肌组织匀浆再以生理盐水稀释。
④取少量匀浆组织作涂片,显微镜下观察细胞是否磨破。
⑤将匀浆以3000-4000转/分离心10-15分钟。
⑥取适量上清液进行各种生化指标测定:ATP酶活性,
(4)血清NO、心肌组织ATP酶活性
分别按试剂盒说明进行操作,以分光光度计测吸光度值,并结合公式计算结果。具体过程略。
(5)放射免疫法测定血浆内皮素含量
处死动物后,立即眼球取血2ml,置于含10%EDTA二钠60μl和2000IU(100μl)抑肽酶的试管中,混匀,4℃,3000rpm离心10min,取血浆2ml,按试剂盒说明测定。
(6)心肌组织常规石蜡包埋
①动物处死后,分别切取部分心尖组织置于4%多聚甲醛液中固定24小时;
②经递度酒精脱水(70%、80%、95%、100%);
③二甲苯透明;
④熔点为54℃及60℃石蜡浸透4小时;
⑤石蜡包埋
供光学显微镜检查、细胞凋亡检测及免疫组化检测。
(7)光学显微镜检测
心肌组织石蜡切片厚度5um,分别裱于用多聚赖氨酸(Poly-Lysine)处理的载玻片上,50℃恒温箱烤片24小时,备用。
苏木素-伊红染色(HE):切片入二甲苯脱蜡二次,每次15分钟,逐级酒精入水(100%-95%-80%-70%-蒸馏水)。苏木素浸染5-10min后10%盐酸酒精分化,自来水冲水15min-蒸馏水后伊红浸染1min-各级酒精脱水,二甲苯透明后树脂胶封片,于普通光学显微镜下观察病理变化。
(8)电子显微镜检测
切取1mm各组大鼠心尖部心肌组织块,于0-4℃条件下,置于3%的戊二醛液中固定。0.1M磷酸缓冲液(PBS)冲洗,0.1%锇酸固定,双蒸水连续冲洗,用50%、70%、90%、100%丙酮逐级脱水,室温下包埋剂浸透过夜,包埋修块,半薄切片Humphne染色、精确定位、超薄切片、电子染色,于透射电镜下进行超微结构观察。
(9)细胞凋亡检测
①切片常规脱蜡至水;
原位末端标记法检测心肌细胞凋亡
②磷酸缓冲液(PBS)冲洗切片2次,5分钟/次;
③滴加蛋白酶K(20ug/ml)消化5分钟,PBS洗2次,5分钟/次;
④吸干切片周围水分,滴加0.3%H2O2,灭活内源性酶,室温孵育15分钟,PBS洗2次,5分钟/次;
⑤吸干切片周围水分,滴加末端标记酶置湿盒内37℃(水浴1小时,PBS洗5分钟/次,3次);
⑥滴加抗荧光抗体,置湿盒内37℃(水浴30分钟,PBS洗5分钟/次,3次);
⑦DBA显色10分钟,蒸馏水洗;
⑧正丁醇脱水3次;
⑨二甲苯透明2次;
⑩树脂封片,于光学显微镜下观察。
阳性判定标准:以细胞核被染成棕褐色为阳性结果。
电镜形态学检测心肌细胞凋亡:细胞凋亡的主要形态学变化特征是:细胞核染色质密度高并凝聚于核膜周边,核体积缩小、畸变、核仁裂解,进行性细胞膜内陷将细胞自行分割为外有膜包裹、内有完整细胞器的细胞凋亡小体。
(10)免疫组织化学染色方法
以免疫组化(S-P)法检测VEGF、Bcl-2及Fas等细胞因子及基因的蛋白表达。
①心肌组织石蜡切片脱蜡至水(切片厚度为5um);
②蒸馏水新鲜配置3%H2O2,室温5-10分钟,灭活内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水洗3次;
③微波修复抗原:将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0),微波炉中(98℃)修复抗原10分钟。冷却后PBS洗3次,5分钟/次(0.01mol,PH7.4);
④滴加正常血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体,不洗;
⑤滴加适当稀释的一抗置湿盒内4℃冰箱过夜;0.01MPBS洗2分钟×3次。
⑥滴加生物素化山羊抗小鼠LgG,置湿盒内-37℃20分钟。0.01MPBS洗2分钟×3次。
⑦滴加试剂SABC,置湿盒内37℃20分钟。0.01MPBS洗5分钟×4次PBS洗3次,5分钟/次。
⑧DAB显色:使用DAB显色试剂盒(ED1022)。取1ml蒸馏水,加试剂盒A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般在5-30分钟之间。蒸馏水洗涤。
⑨苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。
阳性判定标准:Fa-VIII因子为血管内皮细胞胞浆染成棕褐色。
Bcl-2、Fas大部分胞浆弥漫性染成棕褐色为强阳性表达(+++);部分胞浆染为淡棕黄色,部分胞浆不着色为弱阳性表达(+)。介于两者之间的为阳性表达(++)。
6、统计学处理
计量资料以
X±SD表示,两样本均数的比较用t检验;等级资料的两样本比较用秩和检验。
(二)实验结果
1、复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性心肌缺血大鼠心电图的影响,
表1复方黄芪无糖颗粒冲剂对急性心肌缺血大鼠T波增高的影响
(X±SD)(1mv=1cm)
组别 n 给药前 给药后
空白对照组 12 5.96±0.87 5.85±1.59
模型组 12 12.33±0.32 12.54±0.45**
地奥心血康组 12 11.71±0.61 9.14±0.98*
低剂量组 12 11.78±0.42 6.10±0.78
高剂量组 12 12.10±0.66 6.00±0.97
与本组正常时比较*P<0.05,**P<0.01
表1结果显示各组动物在静脉注射异丙肾上腺素24小时后各组T波均增高,模型组与空白对照组比较有差异,地奥心血康组与正常时比较有差异,其它两组均无差异。
2、复方黄芪无糖颗粒冲剂对急性心肌缺血大鼠ST段抬高的影响
各组动物均于给药前及第3次注射ISO后24小时记录心电图(标准导联II),测量∑ST段,计算ST的mv数均值作为心肌缺血损伤程度的指标,结果见表4。
表2复方黄芪无糖颗粒冲剂对急性心肌缺血大鼠ST段抬高的影响(X±SD)
组别 n ∑ST/mv
空白对照组 12
模型组 12 0.464±0.058*
地奥心血康组 12 0.158±0.035△
低剂量组 12 0.153±0.022△▲
高剂量组 12 0.132±0.038△▲
与正常组比较*P<0.001,与模型组比较△P<0.01,与对照组比较▲P>0.05
表2结果显示,正常组∑ST段均值接近零值,模型组与正常组比差异显著(P<0.01);对照组及高低剂量组与模型组相比均有显著性差异(P<0.01),高剂量组效果尤佳,可显著对抗∑ST段的升高,但与对照组相比未显示出统计学意义(P>0.05)。说明复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血有明显改善作用,可显著减轻心肌缺血程度(∑ST)。且具有一定的剂量差别,高剂量作用尤佳。
3、耐缺氧实验
3.1对常压耐缺氧的影响:取体重18-21克健康小白鼠100只,雌雄各半,随机分为4组,每组25只,分别为空白对照组、地奥心血康组、复方黄芪无糖颗粒冲剂高、低剂量组,剂量详见表5。按剂量每日给药1次,连续给药4天,于第末次给药后50min,分别将小鼠放入容器相同(125ml)装有5g钠石灰的密闭广口瓶内,每瓶内放入2只,瓶口涂以凡士林,将瓶密闭,记录小鼠存活时间,以小鼠呼吸停止为记录终结时间。
结果见表6
表3复方黄芪无糖颗粒冲剂对小鼠常压缺氧的影响
组别 例数 剂量(g/kg) 平均存活时间 P值
(X±Smin)
对照组 25 8.36±1.508
地奥心血康 25 0.12 9.34±1.709 <0.05
低剂量组 25 2.5 9.78±2.406 <0.05
高剂量组 25 5.0 9.48±1.925 <0.05
表3可见,复方黄芪无糖颗粒冲剂,高低剂量组及地奥心血康组同对照组相比,可使小鼠在常压缺氧条件下存活时间明显延长(P<0.05)。
3.2对低压耐缺氧的影响:取小鼠100只,雌雄各半,随机分为4组,每组25只,分组、给药剂量及时间均同实验1。于末次给药1小时后,取事先做好标记的每组小鼠各4只,一同放入减压装置内,密闭玻璃容器,开动抽气泵,逐渐减压,待真空表针至负70.49Pa时(530mmHg),停止抽气。观察各组小鼠死亡数量,最后将各组总存活率进行X2检验,结果见表4。
表4复方黄芪无糖颗粒冲剂对小鼠低压缺氧的影响
组别 例数 剂量 存活数 存活率 P值
(g/kg) (只) (%)
对照组 25 20ml 7 35
地奥心血康组 25 0.12 7 35 >0.05
低剂量组 25 2.5 12 60 >0.05
高剂量组 25 5.00 88 44 >0.05
表4可见,复方黄芪无糖颗粒冲剂各组与对照组相比,可提高高小鼠在减压缺氧条件下的存活率,但统计学处理无显著差异,地奥心血康无提高存活率的作用。
4、抗疲劳实验
选小鼠40只,体重18-22g之间,雌雄各半,随机分为4组,分组及剂量见表6,每日给药1次,连续7天,末次给药后1h,在鼠尾部系鼠重10%重量砝码,将鼠放入温度为20±0.5℃水中,记录每只鼠的游泳时间,最后比较各组之间的差异性,结果见表8。
表5复方黄芪无糖颗粒冲剂对小鼠疲劳作用的影响
组别 例数 剂量 游泳时间 P值
(n) (g/kg) (X±Smin)
对照组 10 20ml 2.52±0.559
地奥心血康组 10 0.12 2.67±0.712 >0.05
低剂量组 10 2.5 3.32±0.704 <0.05
高剂量组 10 5.00 3.15±0.494 <0.05
表5结果表明,复方黄芪无糖颗粒冲剂高、低剂量组具有明显的抗疲劳作用(P<0.05),而地奥心血康组有延长的作用,但无差异性.说明复方黄芪无糖颗粒冲剂具有抗疲劳作用,其效果比地奥心血康为佳.
5、抗氧化作用
测SOD和LPO。此实验采用放免法,结果见表6。
表6复方黄芪无糖颗粒冲剂对大鼠LPO和SOD的影响(
X±SD)
组别 例数 LPO(mmol/100mg) SOD(ng/ml)
正常组 12 105.23±32.78 5.59±1.45
模型组 12 156.46±33.25 3.45±1.23
地奥心血康组 12 116.80±31.56** 4.94±1.32
低剂量组 12 122.63±38.79** 5.63±1.02*△
高剂量组 12 118.54±30.60** 5.12±1.35*
与模型组比较*P<0.05**P<0.01;与地奥心血康组比较△P<0.05。
表6结果表明复方黄芪无糖颗粒冲剂抗氧化作用优于地奥心血康组。
6、复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性心肌缺血大鼠血清NO含量的影响
利用硝酸还原酶法,以分光光度计,波长550nm,光径0.5cm下测定各吸光度OD值并计算NO含量,结果见表7。
表7复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性心肌缺血
大鼠血清NO含量的影响(
X±SD)
组别 n NO含量(μmol/L)
正常组 12 143.98±41.55
模型组 12 36.21±4.44△
对照组 12 66.93±4.26*
低剂量组 12 85.44±6.79*#
高剂量组 12 110.24±8.37*#
注:△与正常组相比P<0.01;*与模型组相比P<0.01;与对照组相比#P<0.05##P<0.01
表7结果显示:与正常组相比,模型组血清NO含量显著降低(P<0.01);对照组及高、低剂量治疗组均能显著提高心肌缺血大鼠血清NO含量,治疗组作用尤佳,与对照组相比,分别为P<0.05和P<0.01。说明实验性心肌缺血损伤能够显著降低血清NO含量,复方黄芪无糖颗粒冲剂能够显著提高实验心肌缺血损伤大鼠血清NO含量,且有一定的剂量差别。
7、复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性大鼠心肌缺血内皮素的影响
表8复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性大鼠心肌缺血内皮素的影响
组别 例数 ET含量(pg/ml)
正常组 12 60.23±19.36
模型组 12 99.47±16.59
对照组 12 64.82±13.90**
低剂量 12 69.94±8.12**
高剂量 12 59.28±7.35**△
与模型组比较**P<0.01,与对照组比较△P<0.05
表8结果显示:大鼠心肌缺血时与正常组相比,模型血浆ET含量明显升高,与模型组比较,对照组及治疗组均能降低血浆ET含量(P<0.01),与对照组比较,治疗高剂量组降低ET有差异(P<0.05)。提示复方黄芪无糖颗粒冲剂可明显降低大鼠心肌缺血时血浆ET水平,抑制ET的释放,从而减轻ET对血管和心肌组织的损伤作用。
8、复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性心肌缺血大鼠心肌细胞ATP酶活性的影响
表9复方黄芪无糖颗粒冲剂对实验性心肌缺血大鼠心肌细胞ATP酶活性的影响(
X±SD,n=10)
组别 Na+-K+ATPase Ca2+ATPase Mg2+ATPase
μmolpi/mgprot/h
正常组 3.57±0.53 3.87±0.144 3.78±0.056
模型组 1.25±0.044△ 1.12±0.059△ 1.26±0.052△
对照组 2.34±0.46* 2.32±0.05* 2.36±0.036*
低剂量组 2.85±0.49**# 3.18±0.087**## 2.85±0.48#**
高剂量 3.09±0.69**# 3.46±0.074**## 3.46±0.064**##
注:与正常组相比△P<0.01;与模型组相比*P<0.05**P<0.01;与对照组相比#P<0.05##P<0.01
表9结果显示,与正常组相比,模型组Na+-K+ATP酶、Ca2+ATP酶及Mg2+ATP酶活力均显著下降(P<0.01);与模型组相比,对照组及治疗组均能显著提高ATP酶的活力,治疗组作用尤为显著(P<0.05,P<0.01);与对照组相比,高剂量组及低剂量组均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。提示,实验性心肌缺血损伤能够显著降低心肌细胞Na+-K+ATP酶及Ca2+-Mg-ATP酶活性,复方黄芪无糖颗粒冲剂具有显著提高的作用,且具有一定的量效关系。
9、光镜下观察各组大鼠心肌细胞病理变化
光镜下观察显示正常组心肌纤维互相连接排列紧密,心肌细胞椭圆形或短梭形,位于细胞中央,肌纤维可见横纹。模型组心肌纤维萎缩呈波浪状,纤维间毛细血管有灶性炎细胞浸润。心肌纤维变性、断裂,细胞核消失。地奥组心肌纤维肿胀,部分肌纤维变性。治疗高剂量组心肌纤维排列整齐,纤维间毛细血管不同程度增多。
10、电镜下对各组大鼠心肌超微结构观察
结果显示:正常组大鼠电镜下见心肌细胞排列规则,肌节排列规整,肌丝清晰;心肌间为桥粒连接,闰盘发育较好;细胞核发育良好,核周围有大量线粒体;线粒体结构清晰,无肿胀及空泡变、髓样变等;血管内皮细胞发育正常,饮泡丰富。线粒体及肌丝间丰富的糖原颗粒。
模型组大鼠电镜下可见:心肌肌原纤维排列紊乱,肌节缩短,排列不规整,肌丝断裂、溶解、消失,Z线模糊消失,肌浆网扩张;可见细胞核体积便小,异染色质边集核膜下,核膜呈泡状芽生,亦可见核内空泡样变及核膜模糊,核周细胞器呈点状、碎片状等变化;多数线粒体肿大、嵴断裂溶解呈现絮状、水鞘图样及空泡样变,线粒体膜下及基质内含有大量片状、斑状、颗粒状电子致密物质(钙盐沉积);肌细胞线粒体间糖元散在,闰盘排列紊乱,有断裂现象;心肌细胞内出现大量溶酶体;血管内皮细胞亦可见核内染色质边集,内质网脱颗粒等现象。
对照组大鼠电镜下见:心肌肌原纤维排列较规整,肌节排列亦较为整齐,肌丝溶解较模型组明显减少,细胞核完整,未见异形变,大都可见明显的核仁,但仍可见内质网空泡变及大量肌浆网扩张,大多数线粒体发育尚可,但部分区域亦可见线粒体嵴的灶性絮状变及少量的水鞘图样及空泡样变;未见钙盐沉积;与模型组比较,肌细胞间血管增多。
治疗组大鼠电镜下可见:心肌肌原纤维大都排列整齐,肌节发育良好,明暗带分明,未见肌丝溶解,肌浆网扩张明显减少;细胞核发育良好,未见异形样变,核仁明显,核周大量丰富的发育良好的线粒体,仅可见少量灶性絮状样变,未见钙盐沉积;肌丝及线粒体间丰富的糖元颗粒;闰盘排列紧密;肌细胞间可见明显增多丰富的毛细血管,部分血管内皮细胞内含有丰富的细胞器核常染色质较多。
11、心肌细胞凋亡检测
通过电镜形态学及原位末端标记法检测了心肌细胞凋亡情况及复方黄芪无糖颗粒冲剂的干预作用。
11.1电镜形态学观察
造模24h模型组均可见心肌细胞的凋亡改变现象。其多表现为细胞核畸变,核体积缩小,核异染色质成块边集,核膜内陷,同时核周围细胞器完整,部分细胞可见核小体正在脱落;且部分血管内皮细胞亦可见类似变化
11.2原位末端标记法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况
正常组心肌纤维排列紧密,心肌细胞未见凋亡发生;模型组梗死区见大量心肌细胞凋亡(细胞核呈棕色)地奥组部分心肌细胞凋亡。治疗组低剂量组少部分心肌细胞凋亡。高剂量组心肌细胞未见凋亡。
各组大鼠造模24小时,心肌细胞凋亡情况,光镜下观察提示:连续注射异丙肾上腺素造成大鼠心肌缺血损伤,可明显引起心肌细胞凋亡,尤其以早期显著;此现象同电镜观察一致。复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗组及对照组大鼠心肌细胞凋亡发生率明显减少,其中尤以复方黄芪无糖颗粒冲剂组更为显著。
12、Fas与Bcl-2基因的蛋白表达检测
按S-P法行免疫组化检测Fas与Bcl-2基因的蛋白阳性表达及复方黄芪无糖颗粒冲剂的影响情况。判断标准:大部分胞膜及胞浆着棕褐色者为强阳性表达(+++);胞膜及胞浆着色强度减弱,呈淡棕黄色者为弱阳性表达(+);着色强度介于两者之间为阳性表达(++);极少着色为阴性表达。
异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤,可显著引发Fas基因蛋白表达增强。对照组及复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗组均可显著下调Fas蛋白表达,尤以治疗高剂量组明显。
异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤,在显著引发Fas基因蛋白表达增强的同时,亦引发Bcl-2基因蛋白表达增强。Bcl-2基因蛋白表达即免疫反应增强的程度轻于Fas基因。复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗组能够上调Bcl-2基因的蛋白表达。
13、细胞因子(Fa-VIII)的蛋白表达检测
按S-P进行免疫组化检测,用免疫组织化学方法对血管内皮生长因子(Fa-VIII)进行免疫组化染色,以检测其阳性表达情况及复方黄芪无糖颗粒冲剂对其的影响,Fa-VIII免疫组化染色为血管内皮细胞胞浆着色,阳性表达程度判定标准同Fas、Bcl-2。结果正常组阳性表达不明显(±),模型组未见阳性表达(-),对照组阳性表达(+),治疗组阳性表达(++)。
以下是临床观察结果:
一、资料和方法
1、病例选择及分组病例来源于黑龙江中医药大学科研门诊,根据WHO《缺血性心脏病的命名及诊断标准》(66)及卫生部1993年制订发布的《中药新药治疗胸痹(冠心病心绞痛)的临床研究指导原则》(67)确定冠心病分型及中医气虚血瘀型。选择经动态心电图(Holter)检查发现有心肌缺血、ST-T改变明显者60例,随机分为复方黄芪无糖颗粒冲剂组30例,地奥心血康对照组30例。复方黄芪无糖颗粒冲剂男性18例,女性12例,年龄47-70岁,平均56.4岁;病程1-10年,平均2.7年。地奥心血康组男性16例,女性14例,年龄45-69岁,平均58.5岁,病程10月-11年,平均2.9年。两组患者在年龄、性别、病程等多方面基本平衡,具有可比性。
2、治疗方法 治疗组服用复方黄芪无糖颗粒冲剂(配方及制备同动物实验),每袋含生药6g,由黑龙江中医药大学制剂室提供,每次1袋,每日3次口服。对照组服用地奥心血康,990412每次200mg,每日3次口服。
3、观察项目 观察其临床疗效及心电图改变,于疗程前后做动态心动图检测心肌缺血总负荷(TIB)、用药前后空腹取静脉血测定血浆内皮素(ET)、一氧化氮(NO)和血液流变学及血脂、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)浓度变化;
4、检测方法动态心动图用美国MARS8000型Holter System,MV1、MV5导联24h记录,ST段实时连续计算机回放分析;心肌缺血标准采用“1×1×1规则”(即ST段水平或下斜型压低幅度≥1mm,持续时间≥1min,并与上一次缺血性发作间隔至少1min,以ST段压低的最大幅度及连续压低持续时间的乘积总和作为心肌缺血总负荷mm/min);血浆ET、NO浓度测定:ET用放射免疫法,试剂药盒由中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所提供;NO用比色法,试剂盒由南京建成生物研究所提供。血脂测定应用比色法,药盒由黑龙江省省医院临床放免中心提供,血流变检测应用血清SOD、MDA均用比色法测定,药盒由南京建成生物研究所提供。
5、疗效标准
心绞痛疗效:显效:症状消失或基本消失,轻重度心绞痛症状减轻到轻度、重度心绞痛症状减轻到中度、好转,疼痛发作次数,程度及持续时间有明显减轻,中度的症状减轻到轻度,较重度减轻到中度,重度减轻到较重度。无效:症状与治疗前相同或有所加重。
心电图疗效:显效:心电图恢复至大致正常或正常,好转,ST段降低到治疗后回升0.05mv以上,但未达到正常水平,在重度导联倒置的T波变浅(达25%以上)或T波由平坦变为直立,房室或室内传导阻滞改善;无效:心电图基本与治疗前相同或有所加重。
6、统计学处理 计数资料采用x2检验,计量资料采用t检验。
7、观察结果
(1)两组治疗前后心绞痛症状比较,结果见表10。
表10两细治疗前后心绞痛症状比较
组别 例数 显效 有效 无效 总有效率
治疗组 30 6(0.2) 19(0.633) 5(0.167) 83.33%
对照组 30 4(0.133) 14(0.467) 12(0.4) 59.99%
(2)两组治疗前后心电图的变化比较,结果见表11
表11两组治疗前后心电图的变化比较
组别 例数 显效 有效 无效 总有效率
治疗组 30 12(0.4) 11(0.367) 7(0.233) 76.66%
对照组 30 4(0.133) 11(0.367) 15(0.5) 49.99%
(3)两组治疗前后血脂的变化,结果见表12
表12两组治疗前后血脂的变化(
X±SD)
组别 TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L)
疗前 疗后 疗前 疗后 疗前 疗后
治疗组 6.04±0.68 5.67±0.66**△ 2.01±0.36 1.81±0.34**△ 0.96±0.16
1.04±0.17*△△
对照组 6.06±0.7 6.03±0.74 1.99±0.34 1.99±0.33 0.97±0.15
0.94±0.16
与治疗前后自身比较*P<0.05**P<0.01;与对照组比较△P<0.05△△P<0.01
(4)两组治疗前后血液流变学变化,结果见表13
表13两组治疗前后血液流变学变化
X±SD
组别 全血比黏度(mpa.s) 血浆比黏度 纤维蛋白原红 细胞电泳时间
高切 低切 (mpa.s) (g/L) (s)
治疗组疗前 5.81±0.16 8.56±1.21 1.92±0.38 4.03±1.02 18.96±
3.24
疗后 4.77±1.18**△△ 7.64±1.18**△△ 1.67±0.36**△△3.35±0.96**△△ 17.01±
3.16**△△
对照组疗前 5.19±1.14 8.53±1.20 1.91±0.37 4.01±1.10 18.93±3.30
疗后 5.17±1.16 8.47±1.24 1.89±0.39 3.98±1.14 18.79±3.26
与治疗前后自身比较*P<0.05**P<0.01对照组比较△P<0.05△△P<0.01
(5)复方黄芪无糖颗粒冲剂对TIB、症状积分的影响结果见表14
表14复方黄芪无糖颗粒冲剂对TIB、症状积分变化比较(
X±S)
组别 例数 TIB(mm/min) 症状积分(分)
治疗组 30 疗前 74.88±17.60 13.45±1.22
疗后 15.56±3.64**△ 3.24±1.43**△
对照组 30 疗前 77.89±16.43 13.46±1.21
疗后 24.76±5.66** 4.86±1.34**
与本组疗前比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组疗后比较,△P<0.01
表14结果显示:两组治疗后TIB、症状积分下降,与治疗前比较均有显著性差异(P<0.01)。治疗后两组比较,治疗组TIB减少及症状积分下降幅度显著大于对照组(P<0.01),表明复方黄芪无糖颗粒冲剂具有较好抗心肌缺血作用。
(6)复方黄芪无糖颗粒冲剂对血浆ET、NO的影响,结果见表15。表15两组治疗前后血浆ET、NO浓度含量变化比较(
X±S)
组别 例数 ET(ng/L) NO(μmol/L)
治疗组 30 疗前 106.86±32.41 37.67±13.46
疗后 48.37±11.40**△ 85.17±14.40**△
对照组 30 疗前 101.71±35.52 42.79±11.26
疗后 94.89±24.52 67.17±11.68**
注:与治疗前比较**P<0.01;与对照组比较△P<0.01
表15结果显示:两组治疗后血浆NO浓度上升,与治疗前比较均有显著差异(P<0.01);治疗后复方黄芪无糖颗粒冲剂组血浆ET水平下降,与治疗前比较有显著差异(P<0.01),对照组ET有所下降,但无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组比较,复方黄芪无糖颗粒冲剂组血浆ET含量明显低于对照组,NO浓度明显高于对照组(P<0.01),表明复方黄芪无糖颗粒冲剂可保护血管内皮细胞的内分泌功能,在缺血缺氧状态下可调节血管活性物质代谢。
颗粒冲剂对血清SOD、LPO的影响,结果见表16。
表16复方黄芪无糖颗粒冲剂对血清SOD、LPO的影响(
X±S)
组别 例数 SOD(u/ml) MDA(nmol/L)
治疗组 30 疗前 240.76±22.44 5.61±0.85
疗后 277.70±16.85** 4.79±0.55**△
对照组 30 疗前 245.90±21.10 5.73±0.58
疗后 249.37±20.61 5.46±0.60*
注:与治疗前比较**P<0.01;与对照组比较△P<0.01
表16结果显示:复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗后血清SOD含量升高,与治疗前比较显著差异(P<0.01)。两组治疗后MDA水平降低,与治疗前比较有显著差异(P<0.05),而复方黄芪无糖颗粒冲剂组降低幅度大于对照组(P<0.01),表明复方黄芪无糖颗粒冲剂可调节自由基代谢,保护血管内皮细胞缺氧再给氧所致损伤。
(8)复方黄芪无糖颗粒冲剂对血浆tPA和PAI的影响,结果见表17
表17复方黄芪无糖颗粒冲剂对血浆tPA和PAI的影响(
X±S)
组别 例数 t-PA(Iu/ml) PA-I(Iu/ml)
治疗组 30 疗前 1.15±0.31 8.21±2.69
疗后 1.32±0.25* 6.37±2.25*△
对照组 30 疗前 1.15±0.30 8.37±2.28
疗后 1.13±0.23 8.94±2.94
与治疗前比较*P<0.05;与对照组比较△P<0.05
表17结果显示:两组冠心病心绞痛患者用药前血浆tPA水平较低,PAI水平较高,治疗后复方黄芪无糖颗粒冲剂组tPA水平提高,PAI水平下降,而地奥心血康组tPA和PAI治疗前后无明显变化。
以下是毒理实验结果
一、急性毒理实验
为了评价其临床用药的安全性,故对其进行了急性毒理实验。
[实验材料]
1、受试品:复方黄芪无糖颗粒冲剂,为处方固定、工艺条件和质量控制稳定情况下的制剂,由黑龙江中医药大学制剂室提供。规格:10g/袋,用法用量10g/次,3/日。
2、试验动物:纯昆明种小白鼠,体重18-22g,雌雄兼用,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
[实验方法与结果]
1、试验药品的处理:将复方黄芪无糖颗粒冲剂用热水溶解,制成0.5g/ml的溶液。
2、半数致死量测定
预试验用小鼠9只,分三组,但未找出100%动物死亡的剂量。
正式试验取小鼠50只,随机分成5组,每组10只,雌雄各半,一次灌胃给药,剂量按1∶0.8等比级数给药,最大剂量为1ml/20g浓缩液,给药后观察7天,未见有不良反应和死亡情况,未能测出LD50。
3、最大耐受量试验
因无法测出一次给药的LD50,故将该药做了最大耐受量试验。试验选择健康小鼠20只,雌雄各半,正常饲养2日后,按1ml/20g灌胃给予复方黄芪无糖颗粒冲剂浓缩液,24小时内给药3次,每次间隔5小时,总给药体积3ml/20g。给药后连续观察7天,未件有不良反应和死亡,小鼠反应灵敏,活动自如,皮毛光泽,无脱毛、腹泻、厌食、惊厥等生活状态改变,解剖后肉眼尸检未见异常。
最大耐受量计算如下:
小鼠服用药物量 成人平均体重(g)
(g) ×X=
小鼠平均体重 成人每日给药量(g)
(g)
1×3×0.5 5000= × =20.9
20 6×3
如果按成人每日服用18g计算,结果为正常临床剂量的20.9倍,可以认为临床用药是安全的。
二、本发明长期毒性实验研究
为观察动物连续用药而产生的毒性反应及严重程度,以及停药后的发展及恢复情况,因而采用大鼠进行了长期毒性实验研究。现报告如下:
1、试验周期:本药疗程为1个月,故实验周期为2个月。
2、受试品:复方黄芪无糖颗粒冲剂,由黑龙江中医药大学制剂室提供,规格6g/次,3次/日。
3、动物处理:选择健康Wistar大鼠,体重80±10g,60只,雌雄各半,随机分成三组,每组20只,雌雄各10只,即正常组、高剂量组、低剂量组。
4、剂量及给药途径:
高剂量组:按20g/kg剂量给大鼠灌服复方黄芪无糖颗粒冲剂水溶液,1次/日。
低剂量组:按2g/kg剂量给大鼠灌服复方黄芪无糖颗粒冲剂水溶液,1次/日。
空白对照组:灌服同体积水。
按上述剂量每天给要,连续2个月,因试验周期在30天以上,所以每周给药6天,并根据动物体重变化随时改变给药量。
5、指标及方法
(1)一般状况的观察:一般体征、外观、行为、进食量、排泄物变化等。
(2)体重变化:每半个月称体重一次。
(3)血常规测定:RBC、WBC采用普遍染色法。HB采用高铁血红蛋白测定法。
(4)肝功能测定,采用底物显色法。
(5)其它均采用实验室常规方法。
(6)重要器官的肉眼观察和病理检验。
6、实验过程:各组动物均喂饲统一制备的基础饲料,分组后各组动物观察素、饲养一天。试验组中高剂量组20g/kg/日,低剂量组2g/kg/日,灌胃给药,对照组给同体积水,给药2个月后经眼眶静脉采血分别测定各组大鼠血红蛋白浓度、红细胞数、白细胞总数及分类计数,肝肾功能及一般常规检查,然后处死动物,对各组动物器官进行较全面的肉眼尸检,其次按常规方法处理,取动物肝、心、脾、肺、肾等主要器官用10%福尔马林固定,进行病理组织学检查。
7、实验结果
(1)一般状况:在整个给药过程中,各组大鼠外观正常,皮毛光滑,运动自如,饮食及排泄物均正常,其它未见异常。
(2)体重变化:各组动物不同时期体重均有所增加,结果见表18
表18大鼠体重增长变化表(
X±SD)
组别 0天 15天 30天 45天
空白对照组 78.2±8.1 94.5±9.2 124.6±13.3 145.7±14.5
高剂量组 79.3±9.3 96.1±10.8 125.1±14.2 146.8±16.1
低剂量组 78.9±7.6 95.3±11.2 125.8±15.1 146.2±15.9
60天 75天 90天 105天 120天
166.2±18.7 181.4±21.7 194.6±28.9 212.3±31.5 224.4±32.6
168.7±19.2 183.0±25.6 197.2±29.9 214.1±29.9 227.5±42.1
166.9±16.6 182.7±23.5 195.3±29.4 212.0±26.5 225.6±29.8
将表中数据进行统计分析,各组之间无显著差异(P0.05),表明药物对大鼠体重增长无影响。
(3)血常规检测结果
血常规检测结果见表19、20、21
表19复方黄芪无糖颗粒冲剂对血常规的影响(
X±SD)
组别 动物数(只) Hb(g/L) RBC(×1012/L) WBC(×109/L)
空白对照组 20 124.5±8.9 6.60±0.89 7.8±1.1
高剂量组 20 125.6±7.8 6.65±0.91 7.7±1.4
低剂量组 20 124.7±7.9 6.62±0.88 7.7±1.2
以上统计数字经过统计学分析,各组之间血常规无显著差异,说明药物对大鼠血常规无影响。
表20复方黄芪无糖颗粒冲剂对WBC分类记数的影响(
X±SD)
组别 动物数 嗜中性 嗜酸性 嗜碱性 淋巴 单核
(只)
空白对照组 20 21.7±2.4 2.7±0.4 1.1±0.4 73±12 1.0±
0.5
高剂量组 20 21.5±3.1 2.8±0.9 1.1±0.2 73±13 1.1±
0.7
低剂量组 20 20.8±4.0 2.8±0.5 1.1±0.7 74±12 1.1±
0.5
以上结果经过统计学分析表明两用药组与对照组比较无显著性差异(P>0.05),因此该药对血中WBC分类计数无影响。
表21复方黄芪无糖颗粒冲剂对血小板计数、凝血时间的影响(
X±SD)
组别 动物数(只) 血小板计数(×109/L) 凝血时间(秒)
空白对照组 20 86±1.0 26.8±
12.5
高剂量组 20 87±1.2 25.8±
12.9
低剂量组 20 87±1.5 26.7±
15.3
以上结果经过统计学分析表明,高低两给药组与对照组比较差异不显著(P>0.05),证实该药对血小板计数及凝血时间无影响。
(4)血液生化指标测定
①对大鼠血中AST及ALT活性的影响
测定结果见表22。
表22对大鼠血中AST及ALT活性的影响(X±SD)
组别 动物数(只) AST(IU/L) ALT(IU/L)
空白对照组 20 14.9±2.3 3.2±0.8
高剂量组 20 15.0±1.8 3.2±0.7
低剂量组 20 15.0±1.9 3.1±0.6
以上结果经过统计学分析表明,高低两给药组与对照组比较差异不显著(P>0.05),证实该药对大鼠血中AST和ALT活性无影响。
②对大鼠血清中尿素氮、肌酐、血糖含量的影响。测定结果见表23。
表23对大鼠血中尿素氮、肌酐、血糖含量的影响(
X±SD)
组别 动物数 BUN Crea Glu
(只) (mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml)
空白对照组 20 27.1±4.3 1.0±0.1 88.5±15.5
高剂量组 20 27.5±4.4 1.0±0.4 87.7±11.5
低剂量组 20 27.9±3.8 1.0±0.8 88.2±15.0
以上结果经过统计学分析表明,高低两给药组与对照组比较差异不显著(P>0.05),证实该药对大鼠血中尿素氮、肌酐、血糖含量的变化无影响
③对大鼠血清中总蛋白、白蛋白、总胆固醇、总胆红素含量的影响,
表24对大鼠血清中总蛋白、白蛋白、总胆固醇、总胆红素的影响(
X±SD)
组别 动物数 TP ALB T-CHO
T-BIL
(只) (mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml) (mg/100ml)
空白对照组 20 7.4±1.0 2.5±0.8 98.4±11.0 0.15±
0.05
高剂量组 20 7.4±0.8 2.5±0.2 98.1±12.6 0.16±
0.04
低剂量组 20 7.4±0.5 2.5±0.5 98.7±9.8 0.15±
0.02
以上结果经过统计学分析表明,高低两给药组与对照组比较差异不显著(P>0.05),证实该药对大鼠血清中总蛋白、白蛋白、总胆固醇、总胆红素含量变化无影响。
(5)尿液的检查
表25对尿中隐血、蛋白、糖、尿胆原、尿胆红素的影响
组别 动物数 隐血 蛋白 糖 尿胆原 尿胆红素
(只) (mg/24h)
空白对照组 20 (-) (-) (-) 2.1±0.5 (-)
高剂量组 20 (-) (-) (-) 2.1±0.2 (-)
低剂量组 20 (-) (-) (-) 2.1±0.8 (-)
以上结果表明该药对大鼠尿中蛋白、糖、尿胆原、尿胆红素排出量无影响,亦无隐血出现。
(6)病理性组织形态学观察结果
用药2个月后,高低两剂量组与对照组之心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无论是肉眼还是病理形态学观察均未见病理变化。
脏器系数变化见表26。
表26脏器系数变化数据表(
X±SD)(n=20)
脏器 空白对照组 高剂量组 低剂量组
肝脏 4.25±0.58 4.23±0.46 4.20±0.60
肾脏 1.04±0.22 1.04±0.25 1.05±0.32
心脏 0.36±0.08 0.36±0.05 0.36±0.02
肺脏 0.67±0.06 0.66±0.09 0.67±0.04
脾脏 0.17±0.05 0.16±0.09 0.16±0.04
甲状腺 0.0135±0.0005 0.0134±0.0001 0.0132±0.0001
肾上腺 0.052±0.006 0.051±0.008 0.051±0.004
睾丸 0.50±0.04 0.51±0.06 0.51±0.01
(n=10)
以上结果显示经统计学分析表明,两个给药组与对照组比较无显著性差异(P>0.05),说明该药对各脏器重量变化无影响。
结论:复方黄芪无糖颗粒冲剂经2个月大鼠给药,结果表明各组动物一般状况、生长发育、血常规、肝肾功能等指标均未见异常改变,病理组织学及肉眼尸检亦未见病理变化,说明该药在本实验条件下是安全可靠的,无任何毒副作用。
讨论
通过结合现代科学方法对益气活血法组成本发明的方剂对治疗冠心病心肌缺血进行的实验研究及临床观察,较全面和深入地揭示了本发明防治冠心病的作用机理。
一、本发明对心肌缺血损伤的保护作用
复方黄芪无糖颗粒冲剂是以中医理论为指导,经大量临床实践总结出的中医药复方制剂,通过对其治疗冠心病进行的多项指标的临床观察和实验研究,充分肯定了其治疗冠心病可靠的疗效。
本实验研究动物模型以异丙肾上腺素(每次8mg/kg体重)连续3天大鼠皮下多点注射引起大鼠心肌发生类似于人类心肌缺血时的变化。光镜下心肌病理检查结果亦显示出,模型组动物心肌明显的缺血损伤病理变化,造模24小时模型组动物心肌细胞出现浊肿、空泡样变以及心肌内膜下局灶性肌纤维肿胀、断裂甚至溶解坏死等病理变化,对照组及治疗组造模后24小时动物心肌的病变均明显轻于模型组。此外,还进行了电子显微镜下心肌超微结构的观察,同样显示出,模型组动物心肌细胞和血管内皮细胞的渐进性病理改变,肌原纤维排列紊乱、肌节缩短、肌丝溶解、肌浆网扩张、线粒体肿胀嵴断裂呈现絮状、水鞘图样及空泡样改变以及细胞核异形变核内异染色质边集,闰盘排列紊乱,出现断裂现象,溶酶体明显增多等,而对照组和治疗组动物心肌超微结构的病变明显减轻,尤其是治疗组动物心肌电镜下超微结构清晰,几乎接近正常,而且可见明显增多丰富的发育良好的线粒体及肌细胞间显著增多丰富的毛细血管。
本发明可缓解冠心病患者的临床症状及改善心电图作用。研究结果证实了本发明可显著的防治心肌缺血损伤。
二、本发明对血脂的影响
冠心病绝大部分是由冠状动脉内粥样斑块的存在限制了对心肌的血液供应,心肌发生缺血而导致的。近年来临床病理研究证实冠状动脉的变化是冠脉粥样硬化的基础上又有血小板聚集,血管收缩,血栓形成而导致冠脉的狭窄和堵塞,而导致心肌严重缺血。冠状动脉粥样硬化性心脏与脂质代谢紊乱有密关系。高胆固醇血症可使血管内皮通透性增强,高脂血症又可使血小板聚集和血栓形成。高脂血和血小板在冠脉硬化内膜平滑肌细胞增殖和病变发生上产生协同作用,促使了冠脉粥样病灶的形成。血浆脂质过高,尤其是低密度脂蛋白(LDL)过高,已肯定是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一个发病因素。但高密度脂蛋白(HDL)对冠心病有保护作用。一是因为它所含有的脂蛋白有回收胆固醇的作用;二是因为HDL在乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)的水解过程做为一种清洁剂,以利于动脉壁的巨噬细胞对残渣的摄取,低HDL水平既可能减少对胆固醇的清除,又可能引起富含甘油三脂颗粒水解后“残渣”的积累,残渣的积累可以促进动脉粥样硬化。由此可见,血脂、血流变学的变化在冠心病的研究中是不容忽视的。本课题临床及实验研究均表明,治气虚血瘀型冠心病时可改善血流变和降低血液粘稠度作用,降低血清总胆固醇、甘油三脂,升高HDL的作用,且经统计学分析优于地奥心血康组。
三、本发明对心肌缺血损伤能量代谢障碍
正常生理条件下,心肌主要利用外源性能量基质产能;缺血条件下内源性糖原分解则成为心肌能量的主要来源。正常情况下,葡萄糖和脂肪酸分别代谢成为乙酰辅酶A,在线粒体进行三羧酸循环和氧化磷酸化产生ATP。缺血时则发生不同程度代谢变化,使脂肪酸利用增多,糖类利用减少,因脂肪酸供能较葡萄糖供能耗氧多,故使氧利用率下降,同时脂肪酸代谢产物对细胞膜有损害作用。如果缺血时间很长,则发生心肌细胞溶解和坏死。此时心脏的能源供应仍主要是脂肪酸。除非缺血十分严重,脂肪酸摄取停止。血流完全阻断时,无血液向组织运送葡萄糖,糖原成为糖酵解底物的主要来源,同时乳酸堆积致细胞内PH降低。抑制磷酸果糖激酶使糖酵解减少。
实验研究观察到大鼠缺血心肌细胞线粒体发生了明显的病理变化,ATP酶的活性亦明显低于正常组。电子显微镜下所见,模型组大鼠心肌细胞多数线粒体发生肿大、嵴断裂溶解呈现絮状、水鞘图样及空泡样改变,而且还可见线粒体膜下及基质内含有大量片状、斑状、颗粒状电子致密物质(钙盐沉积),对照组和复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗组病变均明显减轻,尤其是治疗组,镜下可见细胞内含有极丰富的发育较好的线粒体,仅可见少量的灶性絮状样变,线粒体内未见钙盐沉积;ATP酶活性的检测结果则表明,心肌缺血损伤模型大鼠心肌细胞Na+-K+ATP酶,Ca2+-Mg2+ATP酶活性均显著低于正常组大鼠。而复方黄芪无糖颗粒冲剂则具有显著提高和恢复ATP酶活性的作用,而且其作用明显优于对照组,并具有一定的量效关系。此外,在对心肌细胞超微结构的观察中,我们还发现,模型组大鼠心肌细胞内肌丝及线粒体间糖原颗粒明显减少并散在,而对照组和复方黄芪无糖颗粒冲剂治疗组大鼠心肌细胞肌丝及线粒体间糖原颗粒丰富,由此可见,心肌缺血损伤严重地损害和阻断了心肌细胞线粒体的氧化磷酸化过程,增强了无氧糖酵解途径。此研究可见,缺血损伤造成了心肌细胞严重的能量代谢障碍,同时揭示了本发明通过保护心肌细胞超微结构,尤其是线粒体,加强和恢复氧化磷酸化过程,提高ATP酶活性,从而达到显著改善缺血心肌能量代谢的作用机理。
四、本发明对心肌缺血损伤血管内皮功能障碍冠状动脉侧支循环建立、血管新生的影响
血管内皮细胞分布于全身各组织器官,其主要功能是调节心脏、循环功能和内环境的稳定,通过调节血管和血流等稳性,参与全身组织器官功能的调节。已经证明,血管内皮细胞除了完成血液和组织液的代谢交换以外,还可以产生和分泌十余种生物活性物质,是机体最大的内分泌腺,对血管舒缩功能进行调节和具有选择性渗透屏障作用之外,还在抗血栓形成、血管生长及代谢等方面起重要作用。
内皮细胞合成和释放的收缩血管活性物质包括内皮素(ET)血栓素A2(TXA2),血管紧张素II(Ang II)等。内皮素是目前所知的最强血管收缩因子。内皮素能引起冠状动脉强烈收缩,导致整个冠脉血流量明显下降。这样在内皮素作用下,一方面心肌耗氧量在增加,另一方面心肌的冠脉供氧量在下降;尽管内皮素有较强的心脏变时和变力,但与同时存在的冠脉血流量下降,及内皮素导致的外周血管阻力强烈增加,整体来讲,内皮素作用下心输出量是降低的,对心脏是呈负性作用。
内皮细胞合成与释放的舒张血管活性物质包括内皮来源的血管舒张因子(EDRF,即NO)及前列环素(PGI2)等。目前认为NO是血管平滑肌张力和血流的主要调节因子。NO和前列环素对血管有重要的保护作用,它们是血管平滑肌收缩和增生的强大抑制因子,同时也抑制血小板的聚集,抑制血小板和白细胞对内皮表面的粘附。抑制平滑肌细胞分裂增殖;减少胶原纤维、弹力纤维的产生;清除自由基,抑制脂质过氧化反应。内皮源性一氧化氮(EDNO)对血管内皮功能完整性的重要作用包括3个方面:①、保持血管内皮依赖性舒张活性;②维持血管内膜无血栓形成表面;③维持血管内膜的非增殖状态。因此改善或逆转内皮细胞功能障碍,已成为当前冠心病防治研究中的重要内容。ET、NO为内皮细胞分泌的两个主要血管活性物质,生理情况下,二者在维持血管舒缩平衡,抗血小板聚集,防止血管内凝血系统有重要的保护作用。病理情况下血管内皮细胞功能紊乱可以产生一系列负性结果。一方面各种舒血管物质如NO、前列腺素分泌减少,另一方面各种缩血管物质如内皮依赖收缩因子、ET、血管紧张素转换酶、血栓素等生成增多,引起血管痉挛、收缩反应。
近年来医学界已取得了一致认识:即冠状血管存在侧枝。正常情况下,侧枝没有功能,只有当心肌缺氧时才发挥功能,并有所发展。冠脉侧枝的发展有三种形式:(1)扩张:使原有的侧枝扩张、开放,从而从无功能发展到有功能。(2)增粗:血管壁细胞分裂、增殖,从而使血管口径增大。(3)新生:血管壁细胞高度增生,以生成新的侧枝血管。血管内皮细胞是血管张力的重要调节者。它所分泌的ET、PGI2、EDRF(NO)共同维持着血管的紧张度,调节着冠脉血流量。
通过对心肌缺血大鼠血浆ET及血清NO水平并结合病理形态学观察,结果显示,心肌缺血损伤大鼠血清NO水平显著降低,血浆ET升高,而且电子显微镜下观察可见内皮细胞数量减少、核体积变大,异染色质成块边集,甚至部分内皮细胞呈现凋亡早期的形态学改变。本发明则可显著降低心肌缺血大鼠ET和提高血清NO水平。电镜下可见治疗组大鼠心肌细胞间丰富的发育良好的内皮细胞。实验研究结果显示,本发明通过保护缺血心肌血管内皮细胞,抑制ET释放,促进NO的生成和释放,以及提高自由基清除系统活性,降低NO的灭活速率,从而达到改善内皮细胞功能障碍。
本实验应用免疫组化染色的方法,对实验各组大鼠进行了心肌血管内皮细胞生长因子(FaVIII)观察。结果显示,异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤模型动物,FaVIII的蛋白表达略强于正常组(P<0.05)。本发明治疗组大鼠心肌细胞及血管内皮细胞的FaVIII蛋白表达显著增强,与模型组相比,具有极显著性差异(P<0.005)。同时电镜下,亦观察到,治疗组肌细胞间呈现极丰富的发育良好的毛细血管和微小血管,其中含有大量管腔较大,常染色质及细胞器丰富的新生毛细血管。此结果提示,FaVIII的强表达可能在缺血心肌新血管的生成中起了重要作用。
五、本发明对心肌缺血损伤细胞凋亡的影响
细胞凋亡(apoptosis)是近年来分子生物学领域研究的热点之一。冠脉供血不能满足心肌对能量的需要时就发生心肌缺血,一旦缺血存在,心肌组织不仅缺氧和代谢障碍,同时毒性代谢产物蓄积,引起缺血性损伤,如继续发展则导致心肌死亡。近年来研究表明,细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的生理死亡过程,在机体生命活动过程中调控着细胞增殖与更新间的平衡。细胞凋亡致病的方式各异,对无再生能力的成熟心肌细胞发病主要取决于凋亡破坏的方式与范围;对有再生能力的平滑肌和内皮细胞取决于细胞增殖的平衡,事实表明血管内皮细胞凋亡具有促凝作用,能促发和加重动脉粥样硬化病变。近年研究证实心肌梗死(AMI)的梗死区及周边区有细胞凋亡发生。Kajstura等研究认为细胞凋亡是AMI时心肌损伤的主要形式,而细胞坏死是随后发生的。AMI中细胞凋亡伴有bcl-2表达降低Fax表达增加,认为心室机械负荷可能影响此二基因对存活心肌细胞的调节。动物实验发现AMI心肌细胞中Fas蛋白表达增加131倍,提示心肌细胞缺血坏死与Fas介导的细胞凋亡有关,此实验证明凋亡是AMI心肌细胞死亡的重要形式,而细胞凋亡的发生可能与抗细胞凋亡基因与促凋亡基因表达失衡有关。
本实验应用原位末端标记法进行了细胞凋亡的检测,同时应用免疫组化的方法检测了Fas、Bcl-2的基因蛋白表达,结果显示,心肌缺血模型组大鼠心肌细胞发生细胞凋亡的发生率较高,同时促凋亡基因Fas的蛋白表达明显上升。而本发明对促凋亡基因Fas蛋白表达显著减轻,而Bcl-2蛋白表达则增强,此结果显示本发明可抑制细胞凋亡或减轻细胞凋亡对心肌的损伤。
六、本发明对自由基的影响
目前许多研究表明,心肌组织缺血缺氧与自由基有密切关系。在心肌组织缺血缺氧是自由基可以从心肌细胞内外两个空间中产生。心肌中的黄嘌呤氧化酶在氧化次黄嘌呤过程中产生氧自由基。心肌组织缺血缺氧时自由基大量产生及自由基引发的脂质过氧化作用。心肌缺血改变了自由基生成和自由基清除之间的平衡。心肌组织中产生大量的自由基。自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸,使膜上脂质过氧化。膜脂过氧化后改变了膜结合酶,受体和离子通道,引起心肌胞浆的钙离子过负荷,并进而钙盐在线粒体中的积累,抑制心肌能量的产生,促使了膜上的蛋白质和磷脂交联,引起蛋白质不可逆的抑制;氧化膜结合酶活性中心上的巯基,导致酶活性的丧失;脂质过氧化过程的激活,可以使含有大量磷脂酶的溶酶体活化,释放出磷脂酶和被激活的膜结合磷脂酶能破坏磷脂双层膜并产生溶血磷脂和游离脂肪酸,通过其洗涤作用又能诱导脂质过氧化的激活,这一系列的连锁反应,引起膜对钙离子的通透性增加,而钙离子又再激活磷脂酶和脂质过氧化反应,这种急性循环的持续进行,最终导致心肌细胞从可逆性损伤发展至不可逆性损伤,直至细胞死亡。
本研究临床观察结果显示,本发明明显的提高SOD活性,减少LPO的作用,与对照组比较差异显著(P<0.01)。说明本发明有明显的抗氧化作用
七、本发明对组织纤溶系统的影响纤溶系统主要功能是清除血管中的纤维蛋白,防止血栓形成,维持血液通畅。生理状态下组织型纤溶酶原激活剂tPA和组织型纤溶酶原抑制剂(PAI)是处于动态平衡中。冠心病患者tPA释放的能力降低,而PAI活性增高,并且tPA和PAI活性呈负相关,如果两者平衡失调,均可导致血栓形成,tPA选择性溶解血栓纤维蛋白。动脉粥样硬化时,受损的内皮细胞合成和释放tPA能力下降,而PAI释放增多,导致局部纤溶功能降低,使纤溶蛋白沉积于血管壁上不能溶解,久之形成血栓,促使动脉粥样硬化的发生和发展,加重心肌缺血。实验表明,本发明治疗冠心病患者,血浆tPA水平提高,PAI水平下降,提示本药能调节tPA和PAI平衡,改善冠心病心绞痛患者纤溶功能。
八、本发明作用机制的综合分析
冠心病属于中医“胸痹”、“心痛”、厥心痛“等病的范畴,其病因病机有虚实两个方面:本虚为气虚、阳虚、阴虚、血虚;标实有瘀血、痰浊、气滞、寒凝。且在疾病发展过程中,又有阴损及阳、阳损及阴、痰瘀互结、气滞血瘀等,虚实兼见,相互夹杂。结合冠心病多发于中老年人,发病率随着年龄增高而增加,临床多有不同程度的脏气虚衰的症候,如气短、乏力、劳累后胸痛加重等,目前对其病因病机的认识,多以本虚为重点,认为瘀血阻脉是建立在内脏亏损的基础上,治疗强调以补为通、补中寓通、通补兼施,着眼于整体功能的调节,达到气盈血行,血脉通利,胸痛自解的目的。综合冠心病中医补中寓通的治法,有益气活血、温阳活血、益气养阴活血,养血活血等,其中益气活血是近年来治疗冠心病的主要治法。本发明是以益气活血为组方原则,博采众家之长,经大量临床实践总结归纳而成。
综合分析本实验研究的结果,不仅证实了本发明具有显著的抗心肌缺血损伤的作用,而且从细胞及分子水平揭示了本发明具有多重的作用机制。中医治疗冠心病的优势在于人体的整体调节,注重气血的关系,改善机体对内外环境变化、有害刺激的适应态,以调理阴阳气血,使之建立新的平衡。本发明具有以下特点:
1、本发明具有显著抗心肌缺血损伤的作用。
2、本发明具有显著的改善心肌缺血损伤大鼠心肌细胞Ca2+-Mg2+ATPase、Na+-K+ATPase活性的作用,本发明有显著改善缺血心肌能量代谢的作用。
3、心肌缺血损伤大鼠血浆ET明显上升,血清NO水平明显下降,血管内皮细胞有凋亡发生,本发明能够显著上调缺血损伤大鼠血清NO水平及降低血浆ET水平,并显著促进血管内皮细胞的再生,提示本发明具有改善缺血损伤大鼠血管内皮依赖性舒张功能障碍的作用。
4、本发明可使FaVIII表达轻度增强,具有加速和增强侧支循环的建立和新血管再生的作用。
5、本发明能够显著抑制和阻断心肌细胞发生凋亡,并显著减轻心肌损伤的程度,提示细胞凋亡在心肌缺血损伤病理演变中起重要作用,本发明能够通过抑制和阻断心肌细胞过度凋亡的发生而起到保护心肌的作用。
6、本发明可显著下调Fas基因的蛋白表达,上调Bcl-2基因的蛋白表达,提示Fas基因、Bcl-2基因可能参与了缺血损伤心肌细胞凋亡的调控过程。本发明抑制和阻断细胞凋亡发生的作用可能与调节此二基因的表达有关。
7、本发明可明显缓解冠心病患者的临床症状,可改善心电图。同时复方黄芪无糖颗粒冲剂可降低患者的LDL-C,升高患者HDL-C,改善血液流变学指标。
8、本发明急性毒性实验和长期毒性实验表明,该药安全可靠,无任何毒副作用。
9、本发明疗效确切,无毒副作用,为治疗冠心病的理想药物。
具体实施方式:本实施例是将本发明制成无糖颗粒冲剂。取黄芪100g,党参30g,丹参30g,元胡50g,三七10g,降香10g,桂枝10g,甘草10g,加水煎煮3次,三次均加水8倍量,每次煎煮90min,保持80-90℃热浸1小时,合并三次煎液,滤过,滤液减压浓缩至稠膏(约占原体积的二分之一)冷却后慢慢加入2倍量的乙醇,快速充分搅拌混匀后,静置12-14小时,滤取上清液,减压回收乙醇至相对密度1.30-1.35(50℃热测)的清膏,取清膏1份,糊精1份及乙醇适量,混匀,过10目筛制成颗粒,于60-70℃干燥,然后分装。
Claims (1)
1、一种治疗冠心病的中药,其特征在于它是由黄芪、党参、桂枝、甘草、丹参、元胡、降香、三七组成,它们之间的重量份数比是:黄芪10-20份、党参4-6份、桂枝1-2份、甘草1-2份、丹参4-6份、元胡4-10份、降香1-2份、三七1-2份。
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