CN1507924A - 以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种以人类凝血酵素生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法，尤其是指以一种来自单一捐血人或使用自体性凝血酶(Thrombin)，来产生具有生物相容性(Bio－compatible)、生物分解性(Bio－degradable)的纤维蛋白胶与血小板凝胶。本发明制备方法可以降低病毒感染及抗原性危害的机会，提高纤维蛋白胶在医学上及细胞培养方面的应用。
Description
(1)技术领域
本发明有关一种纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法，尤其有关一种以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法。
(2)背景技术
纤维蛋白胶(Fibrin glue)又称为纤维蛋白封合物(Fibrin sealant)或纤维蛋白黏着剂(Fibrin adhesive)，其可以经由混合两种血浆成份--纤维蛋白原浓缩物(Fibrinogen concentrate)和凝血酶浓缩物(Thrombin concentrate)而得，已成为人类血浆最重要的制品之一。
纤维蛋白胶是一种使用于局部的血浆制品，其为模拟凝血机制的最后一个步骤而最终行成一个纤维蛋白凝血块黏附于其所应用的局部组织。纤维蛋白胶有助于止血与伤口的愈合两种特性，因此其应用主要在医疗手术中，如伤口愈合、矫形手术、皮肤移植、骨头重建或烧烫伤治疗，在细胞培养(cell culture)方面可成为纤维原细胞(fibroblasts)、角质细胞(keratinocytes)等生医材料的培养基质。
纤维蛋白胶相较于人工合成的黏着剂，如氰丙烯酸衍生物(cyanacrylatederivatives)或明胶-苯间二酚(雷琐辛)-甲醛化合物(gelatin-resorcinol-formaldehyde composite)等，纤维蛋白胶由于由血浆衍生而来，所以具有生物相容性及生物分解性的优点。因此，不会造成发炎反应(inflammatory reactions)、异物反应(foreign body reaction)、组织坏死(tissue necrosis)或严重纤维化(extensive fibrosis)，并在使用于伤口愈合数日到数周之间自然被人体所吸收。
近年来，纤维蛋白胶已经成为医学界所注目的议题，其制造方式主要分为两种：商业化大量制造的纤维蛋白胶产品与少量由外科医生自行制作的纤维蛋白胶(Home-brew fibrin glue)。
传统商业化产品是由数千公升的人类集合血浆经工业化分馏制成，然而此种产品并不普及，同时具有病毒感染的危险性，因此在欧美有许多外科医生便发展出自制的纤维蛋白胶，由医院人员制备，把来自单一捐血者血浆的冷冻沉淀物或病患自身的血浆，与凝血酶相混合制成。
然而，因缺乏人类血浆制成的凝血酶，因此后者的方法需要使用源自小牛血浆(Fetal bovine serum)的凝血酶，此为异种蛋白质，同时有种种的抗原性疑虑及病原蛋白颗粒(prion)感染的危险性，甚至引起严重的免疫反应和致命的出血，因为部份病人会发展出抗第五凝血因子抗体(anti-FV antibody)，而与其本身自身的第五凝血因子进行交叉反应。
因此，就现阶段的纤维蛋白胶制备方法而言，仍然有其需要改进及克服的缺憾，极需新的研制方法来减轻或避免上述的问题。
(3)发明内容
本发明的目的是提供一种以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法。
本发明的生产纤维蛋白胶的方法，包括首先从单一捐血人血浆中制备凝血酶，之后与单一捐血人的血浆冷冻沉淀物混合后，即可制成单一捐血人的纤维蛋白胶；或者与病人本身血浆制成的冷冻沉淀物混合即可制成自体性的纤维蛋白胶。
本发明的以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法分为制备凝血酶与纤维蛋白胶两种，其中制备凝血酶的步骤包括：
利用全血捐血分离，或血浆分离术所得到的含正常柠檬酸盐抗凝剂血浆制备凝血酶；
使用不同的浓度辅因子(co-factor)在金属或玻璃物质存在下，将凝血系统活化，使血浆中的第二凝血因子活化为凝血酶；
决定活化的最佳条件，以控制凝血酶在最短的时间内形成，同时评估减低柠檬酸盐浓度的影响。
本发明制备纤维蛋白胶的步骤包括：
当凝血酶完成制备后，与富含纤维蛋白原的人类冷冻沉淀物相混合产生纤维蛋白胶，该纤维蛋白胶的生产同样控制在以最短的时间内产生。
本发明中制备凝血酶所用的血浆为单一捐血人的血浆，这样可以避免因血浆来源过于复杂，而受病毒污染的危险。
本发明中所使用的冷冻沉淀物可为单一捐血人所提供，或由病患本身提供，由病患的冷冻沉淀物混合凝血酶制成的纤维蛋白胶为自体性纤维蛋白胶，不会有排斥性问题。
本发明中影响活化的条件主要为决定氯化钙浓度、pH值、活化反应温度等其它辅因子的浓度。
以上的纤维蛋白胶制备方法同时可应用于它种由血浆中制备的生物性黏着剂，如血小板凝胶等。
(5)具体实施方式
本发明的以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法中，制备凝血酶时的步骤与所使用的最佳条件，以下列的实验操作来决定：
1.氯化钙(CaCl2)浓度的决定：
以20mM、50mM、80mM三种经评估过的最终浓度氯化钙溶液加入含有玻璃珠的血浆中，在数阶段时间控制下以活化血浆，的后将完成活化的血浆与冷冻沉淀物混合并测量生成纤维蛋白胶的反应时间，其结果如表一。
表一
| 20mM(10分钟) | 50mM(10分钟) | 80mM(10分钟) | |
| 形成时间 | 30～40秒 | 未形成 | 未形成 |
| 20mM(20分钟) | 50mM(20分钟) | 80mM(20分钟) | |
| 形成时间 | 30～40秒 | ＞4分钟 | 未形成 |
| 20mM(30分钟) | 50mM(30分钟) | 80mM(30分钟) | |
| 形成时间 | 30～40秒 | 80～90秒 | 未形成 |
| 20mM(40分钟) | 50mM(40分钟) | 80mM(40分钟) | |
| 形成时间 | 1分钟 | 80～90秒 | 未形成 |
| 20mM(50分钟) | 50mM(50分钟) | 80mM(50分钟) | |
| 形成时间 | ＞2分钟 | ＞2分钟 | 未形成 |
其中氯化钙溶液的适合浓度为接近20mM，与血浆的混合活化时间为少于30分钟，其形成纤维蛋白胶的时间皆短于其它浓度与其它阶段的时间控制下的情形，而当氯化钙溶液浓度在80mM时，纤维蛋白胶完全不会形成。
因此，选择决定氯化钙溶液的最适浓度范围为70-10mM，混合的最适活化时间范围为5分钟至1小时；氯化钙溶液的最适浓度约为20mM。混合的最适活化时间约为15分钟。
2.玻璃珠的存在与否：
当血浆中缺乏玻璃珠时，活化反应并不会发生，无凝血酶的产生，因为玻璃珠本身提供一带负电性质的表面有助于凝血因子的聚集活化成凝血酶。
3.冰冻实验：
本阶段实验的目的为了解是否血浆可被氯化钙与凝血酶活化后，冰冻至-20℃保存直到使用时解冻到37℃以制造纤维蛋白胶。其结果如表二：
表二
| 第一天(0小时) | 第二天(24小时) | |
| 形成时间 | 17秒 | 32秒 |
| 停止形成时间 | 少于1分钟 | 多于1.5分钟 |
因此，此种活化血浆可以被冰冻保存至须要制造纤维蛋白胶的时候。
4.温度测试：
本阶段实验的目的为了解是否血浆活化时的温度影响纤维蛋白胶形成的时间，其中以四种经评估过的温度20℃、26℃、30℃、37℃进行温度测试，氯化钙溶液的浓度为20mM，混合的活化时间为15分钟，血浆中混合有玻璃珠，其结果如表三：
表三
| 20℃ | 26℃* | 30℃ | 37℃ | |
| 形成时间 | 21秒 | 20秒 | 24秒 | 33秒 |
| 停止形成时间 | 约1.1分钟 | 约1分钟 | 约1.5分钟 | 约1.5分钟 |
*室温
本发明中，活化血浆的温度范围可介于15-40℃。表三中显示，温度介于20～30℃为活化血浆、制造凝血酶的最佳温度范围。
5.酸碱值测试：
本阶段实验的目的为确认酸碱值对血浆活化反应的影响，其中以盐酸和氢氧化钠来调整酸碱值，其它条件固定不变，如血浆中混合有玻璃珠，氯化钙溶液的浓度为20mM，混合的活化时间为15分钟等，然后经过活化的血浆与冷冻沉淀物混合，量测形成纤维蛋白胶的时间，其结果如表四。
表四
| PH | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 | 8.5 | 9.0 | 9.5 |
| 形成时间 | 12～17秒 | 12～17秒 | 12～17秒 | 14秒 | 16秒 | 未形成 | 未形成 |
表四的结果显示，当酸碱值在6.5～8.5之间对纤维蛋白胶的形成时间并无太大的影响，当酸碱值大于9时，凝血酶被抑制，因此无纤维蛋白胶的产生。
所以血浆活化的酸碱度适当范围为6～8.8之间。
6.血小板浓缩物(I)：
本阶段实验的目的为尝试以血小板浓缩物取代血浆来制造纤维蛋白胶，其中其它操作条件仍然如前面数阶段的实验相同，其结果如表五。
表五
| 结果 | |
| 形成时间 | 未形成 |
| 五分钟后 | 未形成 |
因此，即使在相同条件下，以活化后的血小板浓缩物再混合冷冻沉淀物，并不会产生纤维蛋白胶。
7.血小板浓缩物(Π)：由于前述实验中并无法产生纤维蛋白胶，因此本阶段的实验改变以血小板浓缩物取代冷冻沉淀物来制造血小板凝胶，其操作条件同样为血浆中混合有玻璃珠，氯化钙溶液的浓度20mM，混合的活化时间为15分钟，将活化后的血浆与血小板浓缩物混合观查血小板凝胶形成的时间，结果如表六。
表六
| 结果 | |
| 形成时间 | 21秒 |
| 五分钟后 | 形成胶状物(富含水份) |
因此活化血浆的条件方法同样适用于利用血小板浓缩物来制造血小板凝胶。
8.添加氯化钙与氯化钠到冷冻沉淀物中：
本阶段实验的目的为在两种冷冻沉淀物---完全冷冻(cryo-rich)的血浆和血小板血浆(PRP platelet-rich plasma)中添加氯化钙与氯化钠，以观察其能否促进纤维蛋白胶/血小板凝胶的品质。
其中分别添加0.9％氯化钠与20mM氯化钙溶液到两种冷冻沉淀物中，结果列于表七：
表七
| 完全冷冻血浆+20mMCaCl2 | 完全冷冻血浆+0.9％NaOH | 血小板血浆(PRP)+20mMCaCl2 | 血小板血浆(PRP)+0.9％NaOH | |
| 形成时间 | 12秒 | 13秒 | 14秒 | 15秒 |
| 品质 | 最佳 | 次之 | 再次 | 最差 |
纤维蛋白胶/血小板凝胶的形成时间在四种条件下几乎都相同，但质地硬度以完全冷冻血浆+20mM CaCl2为最佳，以血小板血浆(PRP)+0.9％NaOH为最脆弱。
9.添加Tris-缓冲液于PRP的影响：
本阶段实验的目的在于在冷冻沉淀物中添加Tris-缓冲液，以观察其对纤维蛋白胶形成时间的影响。
其中将PRP冷冻沉淀物以2℃水浴解冻，之后将表面悬浮物除去。
取血浆和Tris-缓冲液各为预定反应量的一半，分别加入PRP冷冻沉淀物中，然后在37℃下解冻15分钟。再加入活化的血浆(血浆中混合玻璃珠，氯化钙溶液的浓度为20mM，混合活化的时间为15分钟)，以量测纤维蛋白胶形成的时间，其结果如表八。
表八
| PRP冷冻沉淀物(未添加Tris) | PRP冷冻沉淀物+Tris*，** | |
| 形成时间 | 23秒 | 15秒 |
*Tris-缓冲液：50mM，pH7.5
**Tris-缓冲液的量为血浆溶液的半量
由表中可以得知，Tris-缓冲液的添加可以缩短纤维蛋白胶形成的时间，由实验所得的纤维蛋白胶质地较为坚硬，此外，表面悬浮物的去除减量亦可加速纤维蛋白胶的形成。
10.完整血浆的冷冻沉淀物
相较于前一阶段中所使用的血小板浓缩PRP冷冻沉淀物，本实验阶段拟以完整血浆进行Tris-缓冲液的添加测试。
其步骤与条件与第9阶段相同，其结果如表九：
表九
| 冷冻沉淀物(未添加) | 冷冻沉淀物+Tris* | |
| 形成时间 | 15秒 | 11秒 |
*Tris-缓冲液的量为血浆溶液的半量
实验结果显示，针对完整血浆而言，Tris-缓冲液的添加同样可以缩短纤维蛋白胶形成时间。
11.表面悬浮物
本阶段实验的目的在于冷冻沉淀物的表面悬浮物可否取代血浆来制作凝血酶。
以表面悬浮物来制作凝血酶需重新决定氯化钙的最佳活性浓渡，10mM、20mM、40mM、60mM的氯化钙溶液分别加入混合有玻璃珠的表面悬浮物，结果如表十：
表十
| 氯化钙 | 10mM | 20Mm | 40Mm | 60mM |
| 形成时间 | 17秒 | 15秒 | 13秒 | 未形成 |
由表十得知，氯化钙的最佳活性浓渡落于20～40mM之间，因此作进一步细部分析，列于表十一：
表十一
| 氯化钙 | 20mM | 30mM | 40mM | 50mM |
| 形成时间 | 16秒 | 13秒 | 12秒 | 60秒 |
表十一中显示，表面悬浮物同样可以用来制备凝血酶，其氯化钙最佳活性浓度约为40mM。
13.肝磷脂凝胶(I)：
本阶段实验的目的在于利用固定化肝磷脂结合血浆中的第三抗凝血酶，以减少其存量、降低抑制凝血酶生成的机会。其在血浆未被活化前添加肝磷脂凝胶，观察纤维蛋白胶形成的时间。
其中固定化肝磷脂以0.9％氯化钠溶液清洗三次，分剂量50μL、100μL、150μL、200μL混合5ml血浆反应20分钟。2ml血浆表面悬浮物混合玻璃珠以20mM氯化钙活化15分钟。最后将消除第三抗凝血酶的血浆与冷冻沉淀物混合以量测纤维蛋白胶的形成时间，其结果如表十二：
表十二
| 肝磷脂凝胶 | 50μL | 100μL | 150μL | 200μL |
| 形成时间 | 10秒 | 8秒 | 9秒 | 11秒 |
结果显示，将血浆预先以肝磷脂凝胶处理可有效缩短反应时间至10秒左右。
14.肝磷脂凝胶(Π)：
本阶段实验的目的在于确认固定化肝磷脂结合血浆中的第三抗凝血酶的方法，是否可在血浆活化过程中同时进行，以减少活化反应前的步骤。
其将50μL、100μL、150μL、200μL肝磷脂凝胶混合5ml血浆反应20分钟，该血浆混合有玻璃珠与20mM氯化钙活化，再加入冷冻沉淀物混合以量测纤维蛋白胶的形成时间，其结果如表十三：
表十三
| 肝磷脂凝胶 | 50μL | 100μL | 150μL | 200μL |
| 形成时间(1st实验) | 15秒 | 16秒 | 15秒 | 18秒 |
| 形成时间(2nd实验) | 13秒 | 15秒 | 18秒 | 17秒 |
表十三中显示，肝磷脂凝胶剂量为50μL时纤维蛋白胶形成时间较其它剂量为短。然而整体而言，并未显著地缩短纤维蛋白胶的形成时间，其原因为凝血酶会先行与肝磷脂凝胶结合而失去其效用。
15.决定纤维蛋白胶最佳凝结时间：
本阶段实验的目的在于确认可否藉由选用活化血浆的时间减少纤维蛋白胶的形成时间。
其中以活化血浆开始形成凝结小块的后的不同时间来区分，选用主要为初凝结与凝结开始后5分钟后来作测试，其结果如表十四：
表十四
| 初凝结 | 凝结开始后5分钟 | |
| 形成时间 | 10秒 | 15秒 |
其结果显示，判断选用活化血浆(凝血酶)的最简单判断方法为凝结块初形成的时候。
16.血浆抗凝结溶液中柠檬酸盐浓度对纤维蛋白胶品质的影响：
本阶段实验的目的在于比较血浆中全量浓度与半量浓度柠檬酸盐对形成纤维蛋白胶的影响。
将血浆以血浆分离法自分为两份的含有(无水)柠檬酸、柠檬酸钠与右旋葡萄糖的抗凝血溶液收集出，此为半量浓度的血浆。血浆经冷冻后于2℃下融化。
来自半量浓度血浆的冷冻沉淀物(cryo sample)与下列条件的凝血酶混合：
--半量浓度的非完全冷冻血浆；
--全量浓度的非完全冷冻血浆；
--全量浓度完全血浆(标准状态)；
来自全量浓度血浆的冷冻沉淀物同样被制备出，并与上述条件的凝血酶混合以作为对照组。
以20Mm氯化钙溶液活化血浆产生凝血酶的时间为15分钟。
针对形成纤维蛋白胶的时间及品质探讨的实验结果分为：
A.凝血时间：实验数据如下表
| 半量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度完全血浆之凝血酵素 | |
| 半量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 7秒 | 14秒 | 15秒 |
| 全量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 13秒 | 11秒 | 14秒 |
由上表可知，半量浓度血浆的冷冻沉淀物配合半量浓度非完全冷冻血浆的凝血酶活化形成纤维蛋白胶的时间较短。
B张力强度：实验数据如下表
| 半量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度完全血浆之凝血酵素 | |
| 半量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 强化 | 强化 | 强化 |
| 全量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 正常 | 正常 | 正常 |
由上表可知，由半量浓度血浆的冷冻沉淀物制成纤维蛋白胶，其强度较强。
C纤维蛋白胶形成后液体的形成：
现在一般的使用状况下，纤维蛋白胶形成后往往会发现液体的存在，进而影响黏着性，其实验情况如下表：
| 半量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度非完全冷冻血浆之凝血酵素 | 全量浓度完全血浆之凝血酵素 | |
| 半量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 无液体 | 无液体 | 无液体 |
| 全量浓度血浆的冷冻沉淀物 | 有液体 | 有液体 | 有液体 |
由上表可知，以半量浓度血浆的冷冻沉淀物来形成纤维蛋白胶可以避免液体的产生，因此可改进纤维蛋白胶的黏着性。
此部份的结果，同样可以推用血小板凝胶的制备，当血小板浓缩物源自于半量浓度血浆而得时，配合凝血酶所制成的血小板凝胶其品质及效果都较佳。
综上所述，本发明的以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法中，制备凝血酶的步骤的活化血浆最佳条件为：
1.氯化钙浓度：20mM；
2.活化时间：少于30分钟；
3.活化温度：20～30℃；
4.酸碱度：pH6.5～8.5之间；
以控制凝血酶在最短的时间内形成，其中此条件同样可以适用于血小板凝胶的制作上，完成活化的血浆可以被冰冻保存。
在制备纤维蛋白胶的步骤中，加入的冷冻沉淀物中添加20mM氯化钙可以使形成的纤维蛋白胶质地更致密，此外，添加Tris-缓冲液于PRP或完整血浆的冷冻沉淀物同样可改善纤维蛋白胶的品质。
另一方面，利用肝磷脂凝胶对血浆进行处理，可让纤维蛋白胶形成时间缩短，特别是对活化前的血浆的处理，可让形成时间减少为10秒内，或者选择使用活化血浆(凝血酶)的时机为凝结块初形成的时候，同样有效控制纤维蛋白胶在最短的时间内产生。
另外，以半量浓度柠檬酸盐血浆的冷冻沉淀物或血小板，来制成纤维蛋白胶的或血小板凝胶强度较佳，同时可以避免液体的形成，让纤维蛋白胶的黏着性更好。
本发明中制备凝血酶所用的血浆为单一捐血人的血浆，可避免受病毒污染的危险；冷冻沉淀物亦为单一捐血人所提供，或由病患本身提供，由病患的冷冻沉淀物混合凝血酶制成自体性纤维蛋白胶或血小板凝胶，因此依照本发明方法所制成的生物凝胶不会在使用上有排斥性问题。
由此可知，本发明的以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法，相较于现阶段的纤维蛋白胶生产方法，确实有其显著的效益进步。
根据本发明可作的不同修正及变化对于熟习该项技术的人员而言均显然不会偏离本发明的范围与精神。虽然本发明已叙述特定的偏好具体事实，必须了解的是本发明不应被不当地限制于这些特定具体事实上。事实上，在实施本发明的已述模式方面，对于熟习该项技术的人员而言显而易知的不同修正亦被涵盖于权利要求所限定的范围内。
Claims (20)
1.一种生产纤维蛋白胶的方法，其特征在于，包括：
从单一捐血人血浆中制备凝血酶；及
将凝血酶与单一捐血人的血浆冷冻沉淀物混合后制成纤维蛋白胶，或将凝血酶与病人本身血浆制成的冷冻沉淀物混合制成自体性的纤维蛋白胶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备凝血酶的步骤包括：
利用全血捐血分离，或血浆分离术所得到的含正常柠檬酸盐抗凝剂血浆制备凝血酶；及
使用金属或玻璃物质为辅助，将血浆中的第二凝血因子活化为凝血酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，制备凝血酶步骤中活化血浆的适当条件为：
血浆中加入玻璃珠；
氯化钙浓度：20mM；
活化时间：少于30分钟；
活化温度：20～30℃；
酸碱度：pH6.5～8.5之间。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，制备凝血酶步骤中活化血浆的温度为26℃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在制备纤维蛋白胶的步骤中，在冷冻沉淀物中添加20mM氯化钙使形成的纤维蛋白胶质地更致密。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在制备纤维蛋白胶的步骤中，在冷冻沉淀物中添加Tris-缓冲液以改善纤维蛋白胶的品质。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进而包括增加使用肝磷脂凝胶对血浆进行处理，特别是对活化前的血浆的处理，让纤维蛋白胶形成时间减少，以达到10秒内形成的目的。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进而包括选择使用活化血浆(凝血酶)的时机为凝结块初形成的时候，以有效缩短纤维蛋白胶形成时间。
9.一种以人类凝血酶生产血小板凝胶的方法，其特征在于，包括：
从单一捐血人血浆中制备凝血酶；及
将凝血酶与单一捐血人的血小板浓缩物混合制成血小板凝胶，或将凝血酶与病人本身血浆制成的血小板浓缩物混合制成自体性的血小板凝胶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，制备凝血酶的步骤包括：
利用全血捐血分离，或血浆分离术所得到的含正常柠檬酸盐抗凝剂血浆制备凝血酶；及
使用金属或玻璃物质为辅助，将血浆中的第二凝血因子活化为凝血酶。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，制备凝血酶的步骤中活化血浆的适当条件为：
血浆中加入玻璃珠；
氯化钙浓度：20mM；
活化时间：少于30分钟；
活化温度：20～30℃；
酸碱度：pH6.5～8.5之间。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，制备凝血酶步骤中活化血浆的温度为26℃。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在制备血小板凝胶的步骤中，在血小板浓缩物中添加20mM氯化钙使形成的血小板凝胶质地更致密。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在制备血小板凝胶的步骤中，在血小板浓缩物中添加Tris-缓冲液以改善血小板凝胶的品质。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，增加使用肝磷脂凝胶对血浆进行处理，特别是对活化前的血浆的处理，让血小板凝胶形成时间缩短。
16.如权利要求10所述的方法，其特征在于，选择使用活化血浆(凝血酶)的时机为凝结块初形成的时候，以有效缩短血小板凝胶形成时间。
17.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以表面悬浮物取代血浆制备凝血酶，其活化适当条件为：
血浆中加入玻璃珠；
氯化钙浓度：40mM；
活化时间：少于30分钟；
活化温度：20～30℃；
酸碱度：pH6.5～8.5之间。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，制备凝血酶步骤中活化血浆的温度为26℃。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻沉淀物是由半量浓度血浆所制成。
20.如权利要求9所述的方法，其特征在于，血小板浓缩物是由半量浓度血浆所制成。
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| CN (1) | CN1507924A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100423730C (zh) * | 2005-06-22 | 2008-10-08 | 苏正尧 | 体外保存血小板、红血球、无核细胞与含血小板组合物的反应剂和方法 |
| CN102766616A (zh) * | 2011-05-02 | 2012-11-07 | 拜欧米特生物制剂有限责任公司 | 从血液或血液级分中分离的凝血酶 |
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2002
- 2002-12-20 CN CNA021574804A patent/CN1507924A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100423730C (zh) * | 2005-06-22 | 2008-10-08 | 苏正尧 | 体外保存血小板、红血球、无核细胞与含血小板组合物的反应剂和方法 |
| CN102766616A (zh) * | 2011-05-02 | 2012-11-07 | 拜欧米特生物制剂有限责任公司 | 从血液或血液级分中分离的凝血酶 |
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| PB01 | Publication | ||
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