CN1502625A - 基质金属蛋白酶2的小肽抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基质金属蛋白酶2的小肽抑制剂的氨基酸序列及一组具有基质金属蛋白酶2结合活性的小肽，属于生物医学领域。在表达并纯化了基质金属蛋白酶－2(MMP－2)的催化区MCD的基础上，以MCD为靶标筛选噬菌体随机环七肽库和十二肽库，得到了一种能够抑制基质金属蛋白酶2水解活性的小肽，此小肽具有抑制肿瘤细胞体外侵袭活性。另外，还得到了一组具有基质金属蛋白酶2结合活性的小肽。这些小肽在肿瘤的导向治疗以及抑制肿瘤血管生成方面具有潜在的应用价值。
Description
本发明涉及一种基质金属蛋白酶2的小肽抑制剂及其在肿瘤治疗中的应用。
发明背景
肿瘤的侵润和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。在肿瘤的侵润和转移过程中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)发挥了重要作用。MMPs在肿瘤转移中的作用可概括如下：(1)破坏局部组织结构，促进肿瘤生长；(2)破坏基底膜屏障，有利于肿瘤转移；(3)通过对细胞外基质的重构促进肿瘤新生血管的形成。
基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)是基质金属蛋白酶家族成员，又叫明胶酶A。MMP-2能够降解基底膜的主要成分-IV型胶原。MMP-2是通过细胞表面的ανβ3整合素而结合到血管内皮细胞和肿瘤细胞上的。血管内皮细胞和肿瘤细胞结合了MMP-2之后，细胞本身的水解能力增强，导致细胞侵袭能力增强，抑制MMP-2的活性可以有效抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的侵袭和迁移，进而抑制肿瘤转移和肿瘤新生血管生成。
MMP-2基因敲除小鼠的血管发生及肿瘤的进展水平明显下降。许多证据表明，MMP-2在肿瘤细胞介导的细胞外基质降解中发挥关键作用。临床研究表明，MMP-2表达的增加与人类多种恶性肿瘤的侵袭潜能及预后密切相关。
目前已有许多MMPs抑制剂正进行临床试验，但这些MMPs抑制剂多具有广谱的MMPs抑制活性。由于MMPs在许多组织和细胞中均有表达，因此，这些广谱的MMP抑制剂存在明显的毒副作用。因此，特异性已成为设计或寻找MMPs抑制剂的关键。
噬菌体表面展示技术是一种在噬菌体表面展示外源蛋白的技术，目前已广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物开发等各个方面。这项技术通过“吸附——洗脱——扩增”的亲和筛选过程，可以将展示特异性外源肽的噬菌体从噬菌体肽库筛选出来，经扩增可以得到上千倍乃至108的倍的富集，从而可以很容易地对所筛选的克隆进行序列测定，最终确定表达的外源肽的氨基酸序列。
本发明的目的是利用噬菌体表面展示技术，以MMP-2的催化结构域(MCD)为靶标，筛选具有MMP-2抑制活性的小肽，并用于肿瘤的治疗，或作为先导化合物设计MMP-2特异抑制剂。
本发明的详细描述
本发明的主要内容是通过表达、纯化基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的催化区(MCD)，得到MCD蛋白质，然后以MCD蛋白质为靶标筛选环七肽库和十二肽库，得到了6种与MCD结合活性较高的环七肽，通过与GST融合表达，得到了相应的GST融合表达肽，将GST融合表达肽用Glutathione SepharoseTM4B亲和树脂进行纯化。通过竞争ELISA、酶抑制实验、体外侵袭实验检测了融合表达肽的活性。其中GST-C7-1能够竞争抑制噬菌体单克隆C7-1与MCD的结合，能够抑制MCD水解其底物β-casein的活性，并且对人成纤维肉瘤细胞HT1080的体外侵袭有明显的抑制作用。通过合成两端无半胱氨酸的GST-C7-1融合蛋白，发现该融合蛋白也具有抑制MCD水解β-casein的活性，证明环七肽C7-1分子中的二硫键并不是其发挥抑制MMP-2活性所必需的。C7-1小肽在肿瘤的导向治疗以及抗肿瘤新生血管生成方面具有潜在的应用价值。
结合附图说明本发明的具体实施方法如下：
图1重组表达载体pET-MCD的构建图谱
图2MCD纯化的SDS-PADE图谱
1.Marker 2-5.不同浓度咪唑洗脱下的MCD蛋白
6. 8M尿素裂解的包涵体 7.全菌(IPTG诱导)
图3明胶酶谱法分析MCD活性的SDS-PADE图谱
图4具有MCD结合活性的小肽序列
C7-1～C7-6为环7小肽；L12-1～L12-11为线性12肽。氨基酸序列从左到右为N端到C端。
图5噬菌体单克隆与MCD结合活性的ELISA检测结果
图6GST-MCD结合肽融合蛋白重组质粒的构建图谱
图7GST-C7-1和GST-125蛋白表达鉴定的SDS-PAGE图谱
1.Marker 2，4，6，8.GST-C7-1 3，5，7，9.GST-L125
2-5：全菌体(2，3.诱导前 4，5.诱导后)
6，7：超声上清 8，9：超声沉淀
图8GST-MCD结合肽融合蛋白纯化产物的SDS-PAGE图谱(一)
1.Marker 2.GST 3.GST-C7-1 4.GST-C72 5.GST-C76
图9GST-MCD结合肽融合蛋白纯化产物的SDS-PAGE图谱(二)
1.GST-L129 2.GST-L125 3.GST-L126 4.Marker
图10GST-MCD结合肽抑制MCD水解活性的SDS-PAGE图谱
1.GST 2.GST+β-casein 3.GST+MCD+β-casein
4.GST-C7-1 5.GST-C7-1+MCD+β-casein 6.GST-C7-1+β-casein
7.MCD+β-casein 8.β-casein 9.Marker
图11GST-C7-1抑制MCD水解的SDS-PAGE图谱
1.GST-C7-1+β-casein 2-6.GST-C7-1+MCD+β-casein(从2到6GST-C7-1的浓度依次升高，浓度分别为：21.25μg/ml，42.50μg/ml，85μg/ml，170μg/ml，340μg/ml)7.MCD+β-casein 8.Marker 9.β-casein10.GST-C7-1(340μg/ml)
图12GST-L7-1抑制MCD水解的SDS-PAGE图谱
1.Marker 2.GST-L7-1(0.6mg/ml)3-5.GST-L7-1+MCD+β-casein(GST-L7-1的浓度依次是150μg/ml，300μg/ml，600μg/ml)6.MCD+β-casein 7.β-casein 8.GST-L7-1+β-casein
图13GST-C7-1竞争抑制噬菌体单克隆C7-1与MCD结合的ELISA结果
图14GST-C7-1对HT1080细胞侵袭能力的影响
图15不同浓度GST-C7-1对HT1080细胞侵袭能力的影响
实施例一：MMP-2催化区(MCD)的克隆与表达
本实施例的实验步骤如下：
应用PCR方法从含有人MMP-2全长cDNA的质粒中扩增MMP-2的催化结构域(MCD)，然后构建MCD的表达载体pET-MCD(图1)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达重组的MCD。经SDS-PAGE分析，重组人MMP-2催化区(MCD)以包涵体形式存在。8000r/min收集菌体，用10倍培养物体积的TE缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)悬浮。加入溶菌酶(1mg/ml)于4℃裂解，然后置于冰水中超声破碎，10000g离心10min，回收沉淀即包涵体。包涵体经TE缓冲液(pH8.0)、1％ Triton X-100、1mol/LNaCl和2mol/L尿素依次洗涤后，用溶解于20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)的8mol/L尿素裂解包涵体，8000g离心10min，回收裂解上清。将上述裂解上清用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释至尿素浓度为2mol/L，加入NaCl至终浓度0.5mol/L，然后上样于Ni2+螯合层析柱，纯化后得到了电泳纯的样品MCD(图2)。将纯化的MCD用溶解于20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)的2mol/L尿素稀释至蛋白浓度为50-100μg/ml，4℃放置过夜。次日，用透析缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，1μmol/L ZnCl2，5mmol/LCaCl2)于4℃充分透析复性。通过明胶酶谱检测发现MCD具有良好的明胶水解活性(图3)，说明MCD已成功复性，可以用作靶蛋白进行后续的噬菌体肽库筛选工作。
实施例二：MCD抑制剂的筛选
在得到纯化的有生物活性的MCD蛋白的基础上，以MCD为靶标从噬菌体随机环七肽库和十二肽库中，分别经过三轮筛选得到了MCD特异的结合肽。通过DNA序列分析，推断出相应的结合肽氨基酸序列，共得到了16种MCD结合肽(图4)。
通过ELISA方法检测得到6种与MCD结合最强的噬菌体(图5)，它们分别是C7-1、C7-2、C7-6、L12-5、L12-6、L12-9。
实施例三：GST-小肽融合蛋白的表达和纯化
为了探讨我们筛到的MCD结合肽能否具有抑制MMP-2的活性，我们以GST融合表达的方式将C7-1、C7-2、C7-6、L12-5、L12-6、L12-9分别与GST融合表达。
本实施例的实验步骤如下：
a、GST-小肽融合蛋白重组质粒的构建(图6)
为了不影响结合肽本身的结构，在合成结合肽编码序列时引入了两个甘氨酸密码子，并在此序列的两端加上了EcoRI和HindIII酶切位点。将合成的小肽基因片段的两互补序列分别溶于灭菌的去离子水中，使其终浓度为1μg/μl，各取5μl，加入40μl灭菌去离子水中，终体积为50μl，混匀后放入95℃水浴中5分钟，然后缓慢降至室温使两互补片段退火。将经EcoRI/HindIII酶切回收的pGEX-KG载体片段与上述退火的MCD结合小肽基因片段按1∶5的摩尔比连接，并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑单克隆测序。
b、GST-结合肽融合蛋白的表达
将经鉴定正确的重组菌菌液按1∶100接种于含有氨卞青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.5，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG诱导表达3小时，离心后，弃去上清，将菌体进行超声破碎，将超声处理后的菌液于4℃，12,000r/min离心10min。SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式(图7)，证明目的蛋白以可溶性形式存在。
c、GST-结合肽融合蛋白的纯化
将离心上清用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化树脂进行纯化。首先将样品结合于Glutathione Sepharose 4B树脂，然后用10倍体积的PBS洗去非特异结合的杂蛋白，用10mmol/L还原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制，pH8.0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE检测纯化效果(图8，图9)。
实施例四：GST融合蛋白抑酶活性的检测
为检测GST-小肽的抑制活性，取纯化的MCD(50μg/ml)与不同浓度的融合肽孵育1-2小时，然后加入基质金属蛋白酶的底物-β-casein(终浓度为0.8mg/ml)，22℃孵育1-2小时。β-casein的降解通过SDS-PAGE分析。结果发现6种GST融合蛋白中，GST-C7-1具有明显的抑制活性，且具有量效关系(图10，图11)。为了检测GST-C7-1中的两个半胱氨酸是否是发挥其活性必须的，我们又设计了不带半胱氨酸的GST-L7-1，其中的半胱氨酸用甘氨酸取代，将纯化后的GST-L7-1也进行了MMP-2抑酶活性的检测，结果发现GST-L7-1仍然具有抑制MCD水解其底物β-casein的活性(图12)，这说明小肽C7-1两端的二硫键并不是C7-1发挥其MMP-2抑制活性所必需的。
实施例五：GST-C7-1竞争抑制噬菌体单克隆C7-1与MCD的结合
以50μg/ml的MCD包被96孔板，4℃过夜，PBST(0.1％Tween 20的PBS)洗涤3次后用0.5％的BSA封闭，室温3小时，每孔加入不同浓度的GST-C7-1与固定浓度(1010pfu/ml)的噬菌体C7-1的溶液100μl，每一浓度设3个平行孔，37℃结合1小时，PBST洗板6次，加HRP标记的M13单抗，37℃结合1小时，PBST洗板6次，加入TMB底物显色5-15min，2M H2SO4终止反应，酶联仪测OD450。结果表明随着GST-C7-1蛋白浓度的提高，噬菌体单克隆C7-1与MCD的结合逐渐降低，而不同浓度的GST则对噬菌体单克隆C7-1与MCD的结合没有明显影响(图13)，证明GST-C7-1能够竞争抑制噬菌体单克隆C7-1与MCD的结合。这一实验结果表明，表达在噬菌体表面的小肽与表达在GST蛋白C末端的小肽具有类似的空间结构，都能与MCD特异性结合。
实施例六：GST-C7-1抑制HT1080细胞体外侵袭实验
胰酶消化HT1080细胞，以培养液调节细胞浓度为2×105cell/ml，取0.5ml细胞悬液，种植于0.8μm膜孔径的小杯(MATRIGEL Invasion Chambers)内，同时加入不同浓度的GST-C7-1(GST蛋白作对照)；24孔培养板的孔内加入含有各种浓度的GST-C7-1的培养液DMEM 0.7ml，然后将小杯放入培养孔内，37℃，5％CO2培养18小时，取出小杯，PBS轻轻冲洗膜内外，用棉签擦去内层细胞，95％乙醇固定外层细胞后，结晶紫染色，待膜干燥后可从小杯上揭下并用树胶固定封片。40×10显微视野下数5个不同视野的细胞数，取平均值。结果表明GST-C7-1通过抑制HT1080细胞降解基底膜，抑制了HT1080细胞的迁移(图14，图15)。
Claims (8)
1、一种具有基质金属蛋白酶2抑制活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：A-S-R-S-S-L-T。
2、一组具有基质金属蛋白酶2结合活性的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末端为：
C7-1、A S R S S L T
C7-2、Q S K N R K M
C7-3、K K S Q T R Q
C7-4、S T L K H N T
C7-5、S P S Q Y P R
C7-6、R T P S S K R
L12-1、K P I P K P N H P H H L
L12-2、A P P H K H H A P T P R
L12-3、K P H P H H T T W S S A
L12-4、H T D T S R L H P F P G
L12-5、Q V P D V H P L R K R R
L12-6、K P R P S M K P Q D L L
L12-7、D H R P L Q G A F S R S
L12-9、S P I K K N Y T F A A S
L12-10、L P H H K H R V P P P T
L12-11、A T K V H H Q H A T H R
3、一组根据权利要求1和2所述小肽的变异体。
4、一组根据权利要求1和2所述小肽的的基因序列。
5、一种根据权利要求1和2所述小肽的融合蛋白。
6、一种根据权利要求1和2所述小肽作为肿瘤导向治疗的载体。
7、一种根据权利要求1和2所述小肽作为载体的肿瘤体内造影的诊断方法。
8、一种根据权利要求1所述小肽作为基质金属蛋白酶抑制剂治疗肿瘤的方法。
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