KR100497122B1 - 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 갈색거저리 유충에서 분리된 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 β-1,3-글루칸 검출 방법 또는 키트에 이용하는 것이다.

Description

페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자{Protein of phenoloxidase system and gene encoding the same}

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 이용한 진균진단방법 및 진단키트에 관한 것이다.

대부분의 생물들이 병원균, 기생충, 이물질 등의 외부 유해 환경에 항상 노출되어 있으면서도 생명을 유지해 올 수 있는 이유는 이러한 외부 이물질들로부터 자신을 방어할 수 있는 면역체계를 보유하고 있기 때문이다. 이러한 면역체계는 이물질을 인식하는 방법의 차이에 따라 선천성 면역계 (innate immunity)와 후천성 면역계 (adaptive immunity)로 구분되어진다. 선청성 면역계는 다시 세포성 면역 반응 (cellular reaction)과 체액성 면역 반응 (humoral reaction)으로 나뉘어 설명된다. 세포성 면역 반응은 혈구 세포가 직접 관여하는 것으로, 파고사이토시스, 노들 형성, 인캘슐레이션 반응 등이 포함된다. 이들 반응은 모두 곤충의 혈구 세포인 혈구에 의하여 유도된다고 알려져 있으나 최근까지도 이들 반응의 분자 수준에서의 작용 기전은 아직 정확하게 규명되지 않고 있는 실정이다. 체액성 면역 작용은 체액 내에 존재하는 여러 생체 방어 물질에 의하여 유도되는 반응으로 항균성 펩타이드, 렉틴의 유도 및 멜라닌 형성의 전구 반응인 프로페놀옥시다제 활성화 반응 등을 들 수 있다.

프로페놀옥시다제 활성화에 작용하는 효소, 즉 페놀옥시다제 (PO)는 곤충의 체내에서 평상시에는 불활성화 형태인 pro-PO로 존재하다가 외부 병원성 미생물의 침입시, 미생물 세포벽을 구성하는 β-1,3-글루칸이나 펩티도글리칸, 리포폴리사카라아드와 같은 특징적인 구조물들을 인식한 후, 그 신호가 하위 단계로 전달되는 과정에 여러 단계의 pro-PO 활성화인자들이 (이하 PPAF) 활성화 되는 소위, 캐스케이드 반응을 거쳐 최종 활성화 형태인 PO로 변환되는 것으로 알려져 있다 (Leonard, 1985, Insect Biochem., 15, 803-810, Saul, 1988, Arch. Insect Biochem. Physiol., 7, 91-103 및 Ashida, 1990, Japan Sci. Soc. Press. 236-263.)

암 환자나 장기이식 수술환자, 에이즈감염 환자 등 면역기능이 저하된 환자에게 전신 진균 감염증이 증가되는 사실은 의료계에서 심각한 문제로 대두되고 있으며, 이로 인한 사망률도 점점 증가되고 있다. 전신 진균감염의 주된 형태는 캔디디아시스(candidiasis), 아스퍼질로시스(aspergillosis) 그리고 크립토코칼 메닌지티스(cryptococcal meningitis)이다. 이와 같은 균들은 건강한 사람의 경우 체내의 면역체계에 의하여 조절되고 완전히 치유되지만 암치료나 골수이식을 받은 환자, 기관이식, 화상환자 또는 AIDS 환자와 같이 면역체계가 억제되어 있는 경우 이런 감염증과 맞서 싸울 능력을 잃어버린다. 이런 환자들은 조기에 진균감염 여부를 판단하고 적절한 항진균제를 투여하는 것이 중요하지만 현재 조기 진균 감염 여부를 판단하는 것에 어려움이 있다.

진균 감염진단 방법으로 지금까지는 환자의 혈액을 채취하여 미생물학적인 동정방법으로 감염여부를 판단하고 있으나 2-5일의 배양기간이 필요하므로 치료시기를 맞추지 못하는 단점이 있다. 이를 개선하고자, 진균감염환자의 혈액 중에 존재하는 β-1,3-글루칸을 측정하여 진균 감염을 인식하는 시스템을 찾기 위하여 연구가 진행되어 왔다.

한국출원 2000-2542 및 2001-31890 에서는 곤충의 프로페놀옥시다제의 활성화 시스템을 이용하여 β-1,3-글루칸 및 펩티도글리칸을 검출하는 조성물을 보고하였다.

Pro-PO를 활성화시키는 캐스캐이드 반응에 관여하는 요소들이 한국산 참검정 풍뎅이 (Holotrichia diomphalia), 갈색거저리(Tenebrio molitor), Bombyx mori 등에서 밝혀지고 있다. 한예로, 한국산 참검정 풍뎅이의 유충을 이용하여 pro-PO 활성화 기전에 관한 연구를 수행한 결과 pro-PO를 두단계 가수분해시켜 PO로 활성화시키는 PPAF로서 세린프로테아제인 PPAF-I 및 유사 세린프로테아제인 45kDa 단백질(PPAF-II)을 분리 정제하였고, 각각의 유전자 구조를 밝혀 보고한 바 있다 (Lee et al., (1998), Eur. J. Biochem., 257, 615-621, Kwon et al., (2000), Eur. J. Biochem., 217, 6188-6196). 상기 2개의 요소들은 페놀옥시다제 조성물의 필수적인 구성요소로서, PPAF-I은 세린프로테아제로 전형적인 세린프로테아제의 특성을 지니고 있으며, 45kDa 단백질은 세린프로테아제 호모로그로 세린프로테아제의 활성화 위치 중 세린이 글리신으로 치환된 마스커레이드유사 단백질 (masquerade-like protein)이다. 그러나, 페놀옥시다제 조성물을 이루는 요소는 모두 밝혀진 상태가 아니다.

일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 이 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화반응에 의해 유도되는 내부인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시다제로 변화되어 카테콜아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버리므로 이 반응 시스템을 생체외로 분리하는데에 공정상의 어려움이 있다. 그러므로, pro-PO 활성화 시스템을 분자수준에서 이해하기 위해서는 이 시스템을 구성하는 각각의 인자들, 그리고 이들 사이의 관계를 밝히고 각 요소를 재구성하여 β-1,3-글루칸 검출용 조성물을 제조하는 것이 요구된다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규 단백질을 포함하는, 베타-1,3-글루칸 검출용 페놀옥시다제 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 이용한 베타-1,3-글루칸 검출용 페놀옥시다제 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 단백질 및 이를 포함하는 조성물은 베타-1,3-글루칸 검출 방법 및 진단키트에 유용하다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

"아미노산 서열", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 완전한 천연의 아미노산 서열로 한정되는 것은 아니다.

"염기서열의 변이체"는 본 발명의 단백질이 가지는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 유전자 서열 중 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기 서열을 의미한다.

"아미노산 서열의 변이체"는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명에서 곤충은 체내에 페놀옥시다제 시스템을 가지고 있는 곤충을 의미하며, 완전변태 곤충이 바람직하다. 예로는 가재나 새우같은 갑각류, 딱정벌레목, 참검정풍뎅이목을 들 수 있고 이들의 생체 내에는 프로페놀옥시다아제가 존재하며, β-1,3-글루칸 또는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화되는 캐스케이드반응에 의해 페놀옥시다제로 활성화된다.

본 발명에서 페놀옥시다제 시스템은 곤충 내에 존재하는, β-1,3-글루칸의 존재에 의해 일련의 반응을 거쳐 프로페놀옥시다제가 페놀옥시다제로 활성화되는 시스템을 의미한다.

본 발명에서 페놀옥시다제 조성물은 페놀옥시다제 시스템 성분의 전부 또는 일부를 포함하며, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물을 의미하고, 페놀옥시다제 조성물을 진균감염 진단조성물로 이용할 수 있다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~444로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부인 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은 페놀옥시다제의 활성화에 관여하는 새로운 단백질을 갈색거저리 유충으로부터 분리하고 그 구조를 밝혀 프로페놀옥시다제 활성화인자(PPAF)라 명명하고, PPAF가 페놀옥시다제 시스템의 필수 성분이며 새로운 프로페놀옥시다제 활성화 인자임을 밝힌다. PPAF 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분자량 약 45~50kDa 크기의 분자량을 가진다.

PPAF 단백질을 분리하기 위해서는 곤충의 체액을 사용할 수 있다. 곤충의 체액분리 공정에서 별도의 세린프로테이즈 저해제를 첨가하는 대신 킬레이팅제가 함유된 완충액을 사용하여 혈구 응집과 흡착현상을 억제할 수 있다.

본 발명은 갈색거저리 유충의 체액으로부터 pro-PO 활성화 반응의 시험관내 재구성 시스템을 구축함으로써 이 반응에 필수적인 PPAF를 분리 정제하고, PPAF가 pro-PO 활성화반응에 필요한 인자임을 알 수 있다. 예를 들어, 정제된 pro-PO 및 PPAF, 토요펄 CM-650 용출분획을 이용하여 페놀옥시다제의 활성을 조사한 결과 PPAF가 페놀옥시다제 조성물중의 한 성분임을 확인할 수 있다.

갈색거저리의 체액상에서 PO 활성 측정 및 웨스턴 블랏 분석을 수행함으로써 PO활성이 나타날 때는 불활성화 형태의 PPAF가 활성화형태로 전환됨을 알 수 있고, β-1,3-글루칸에 더욱 의존적으로 전환된다. 또한, 정제된 pro-PO, PPAF만으로는 PO활성이 나타나지 않으나, 토요펄 CM-650 용출분획과 PPAF의 혼합물로 PO활성이 나타나므로, 상기 용출분획에 pro-PO활성화에 관여하는 다른 인자가 존재함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 PPAF는 PPAF에 대한 항체를 얻고 이를 이용하여 다른 곤충의 체액에 존재하는 PPAF과 상동성이 높은 단백질을 스크링하는데 사용될 수 있다.

NCBI 데이타베이스를 이용하여 PPAF의 아미노산 서열 상동성을 조사해본 결과, 기존에 연구되어 발표된 트립신류의 세린프로테아제의 활성화 위치 중 히스티딘과 아스파르산의 위치는 정확히 일치하나, 또 하나의 활성화 위치인 세린은 글리신으로 치환된 세린프로테아제 동족체의 구조를 가진다. 또한 Holotrichia diomphalia의 PPAF-Ⅱ, Tachyplus factor D (Td-D), Drosophila melanogaster의 마스커레이드 (Dm-mas), 모기 감염반응 세린프로테아제 유사 단백질 (Ap-ispl5), Pacifastacus leniusculus 의 마스커레이드 유사 단백질, Holotrichia diomphalia 의 PPAF-I (Hd-PPAF-I), Tachyplus 프로클로팅 효소 (Td-PCE)와 유사하다.

본 발명에서 사용된 갈색거저리 유충의 체액외에, β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 페놀옥시다제 시스템을 가진 곤충의 체액에는 PPAF의 역할을 하는 유사 단백질이 있을 것으로 추측되며, 본 발명에 따른 PPAF에 대한 항체를 이용하여 다른 곤충의 체액에 존재하는 PPAF 유사 단백질을 검출, 분리할 수 있다.

PPAF는 분자생물학적 기술을 이용한 발현시스템을 이용하여, 예를 들어 PPAF 유전자를 도입한 재조합 미생물로부터 대량으로 생산할 수 있다.

또한 본 발명은 PPAF, 그것의 변이체 또는 그것의 일부를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그것의 변이체, 또는 그것의 일부를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지며, 한 예로, 서열번호 1의 염기 46~1377인 DNA 서열로 이루어진다.

본 발명에서는 갈색거저리 유충의 cDNA 라이브러리를 제조하여, 정제된 PPAF 단백질을 이용하여 제조한 PPAF의 항체를 사용한 이뮤노스크리닝을 통해 PPAF 유전자를 얻고 그 서열과 그에 의해 암호화된 아미노산의 서열을 제시한다. 얻어진 유전자는 444개의 아미노산에 해당하는 1332 개 염기의 오픈 리딩 프레임을 가지고 있다.

본 발명에 따른 PPAF, 이들의 변이체 또는 이들의 일부의 유전자는 재조합 미생물을 이용하여 PPAF, 이들의 변이체 또는 이들의 일부를 생산하는데 이용될 수 있으며, 숙주 미생물의 코돈 이용 경향을 고려하여 염기를 적절하게 변경할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 완충액 및 페놀옥시다제 활성 측정 방법은 다음과 같다.

항응고 완충액 (pH 5.5): 136mM 트리소디움 시트레이트, 26mM 시트르산, 20mM EDTA, 15mM 소디움 클로라이드.

β-1,3-글루칸 용액: β-1,3-글루칸(Curdlan, Wako Pure Chemical Industries, LTd.) 10mg을 0.1N NaOH 1ml에 녹인 용액 10ul와 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 990ul을 혼합하여 만든 용액.

항체 정제에 사용한 스킴 밀크 용액(pH 7.9): 20 mM Tris/HCl(pH 7.9) 50 ml에 스킴 밀크 2.5 g을 녹임.

항체 정제에 사용한 10 × 세척완충액: Tris 100mM, EDTA 10mM, Triton X-100 1%, NaCl 1.5M.

항체 정제에 사용한 세척완충액: 1 × 세척 완충액 내에 스킴 밀크 0.5%, NaN₃ 2mM.

TBS: Tris 20mM, NaCl 153mM.

TTBS: Tris 20mM, NaCl 153mM, Tween 20 0.1%.

IPTG 처리용 필터: IPTG 190.6mg, 3차 증류수 40 ml.

high-TBST 용액: 용액 600 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH7.9) 30ml, NaCl 5.25 g, 20% Tween 20 15ml, 3차 증류수 잔여량.

low-TBST 용액: 용액 2L 내에, 1M Tris-HCl(pH 7.9) 20ml, NaCl 17.5 g, 20% Tween 20 5ml, 3차 증류수 잔여량.

3 % 젤라틴 용액: 용액 400ml 내에, 젤라틴 12g, 10% NaN₃ 800μl , low-TBST 잔여량.

SM 완충액 : NaCl 5.8g, MgSO₄ 7H₂O 2g, 1M Tris-HCl(pH 7.5) 50ml, 2% 젤라틴 5ml, 3차 증류수로 1L.

1차 항혈청 용액: 정제된 항체 2 ml, 3% 젤라틴 용액 2ml, E. coli 용혈물(10 mg/ml) 60μl, 10% NaN3 60μl 3차 증류수 1.88 ml.

2차 항혈청 용액: 염소 항-토끼 IgG(H+L)-AP conjugate (Bio-Rad 사) 5 μl용액 5ml 내에, 3% 젤라틴 용액 1.7ml.

AP 완충액: 용액 300 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH 9.5) 30ml, NaCl 1.74g, 1M MgSO₄ 1. 5ml, 3차 증류수 잔여량.

발색반응액: AP 완충액 100 ml, 70% DMF 내의 50mg/ml NBT 1320μl, DMF 내의 50mg/ml BCIP 660μl.

LB 액체 배지: 배지 1L 내에, NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 3차 증류수 잔여량.

NZY 플레이트: NaCl 5g, MgSO₄.7H₂O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 15 g, 3차 증류수 1L.

NZY 플레이트(탑 아가): NaCl 5g, MgSO₄.7H₂O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 7g, 3차 증류수 1L.

페놀옥시다제 활성의 측정

PO 활성 측정은 Pye의 Nature, 1974, 251, 610-613의 방법을 사용하였다.

실험의 각 단계에서 얻은 분획 일정량에 250mM 4-메틸카테콜(MC) 2ul, 4-하이드록시프롤린 에틸에스테르(HP) 62.5mM) 16ul을 첨가하고 Ca²⁺이 필요한 반응조건에서는 1M CaCl₂ 5ul를 가한 후 20mM 트리스 완충액 (pH8.0)을 500ul가 되도록 가하여 30℃에서 일정 시간동안 반응시킨 후 20% 초산 500ul을 넣어 반응을 중지시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정한다. 페놀옥시다제의 1단위는 520nm에서 흡광도가 0.1 증가할 때의 양으로 정의한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.

[실시예]

실시예 1.

딱정벌레목 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충을 얼음 위에서 마취시키고 25 G 주사바늘이 연결된 5ml 멸균 주사기에 항응고 완충액을 채워 머리쪽 첫번째 마디에 찔러 유출되는 체액을 마리당 3 방울씩 모았다.

얻은 체액 10ul를 칼슘이온 존재 또는 부존재하에서, β-1,3-글루칸(10ul)에 따른 PO활성을 측정하고 도 2에 나타낸다 (-▲- : 갈색거저리 체액, -◆- : 체액 + Ca²⁺, -■- : 체액 + β-1,3-글루칸, -○- : 체액 + Ca²⁺ + β-1,3-글루칸). 갈색거저리의 체액에는 β-1,3-글루칸에 의한 캐스케이드 반응을 통한 페놀옥시다제 시스템이 존재함을 알 수 있다.

채취한 체액 100 ml을 203,006Xg 속도로 4 ℃에서 4시간 원심분리한 후 상등액을 울트라필트레이션(cut off: 10,000)하여 4ml까지 농축하였다. 50mM 트리스/5mM EDTA (pH6.5) 완충액으로 평형화시킨 토요펄 HW-55S 겔 크로마토그래피 컬럼 (1.5X50cm)에 로딩하였다. 동일 완충액을 0.2 ㎖/min의 속도로 흘려주면서 유출되는 액을 3 ㎖씩 시험관에 모아 280 nm에서의 UV 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하였고, Ca²⁺ 및 β-1,3-글루칸의 존재 유무에 따른 PO 활성반응을 520 nm에서의 UV 흡광도를 측정하는 방법으로 조사하여, β-1,3-글루칸이 있을 때 선택적으로 PO 활성이 증가하는 분획만을 모아 다음 단계의 분리에 사용하였다.

50mM 트리스/5mM EDTA (pH6.5) 완충액으로 충진된 토요펄 CM-650M 컬럼 (ø1×11 cm)에 충진시키고, 상기 분획 50㎖ (약 300 mg)를 1 ㎖/분의 유속으로 로딩하였다. 동일 완충액으로 컬럼을 충분히 씻어준 뒤 0.2 M NaCl을 함유하는 50mM 트리스/5mM EDTA (pH 6.5) 완충액을 1.7㎖/분의 유속으로 흘려주어 용출시키면서 280nm에서 단백질 농도를 측정하였다. 컬럼에 결합하지 않는 통과 분획과 0.2M NaCl 존재하에 용출되는 분획을 얻었는데, 통과분획이나 용출분획 단독으로는 PO활성이 나타나지 않고, 둘을 혼합하여야만 PO활성이 나타난다(도 3). pro-PO 항체로 웨스턴 블랏 분석를 수행한 결과 pro-PO는 용출분획에 존재함이 확인되었으므로 이하 pro-PO가 존재하는 용출 분획은 고정시키고, 통과분획에 존재하는 PPAF를 이후 여러 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리하였다.

pro-PO 활성화 반응에 세린프로테아제가 관여함이 알려져 있으므로, 세린프로테아제에 친화력를 가지는 것으로 알려져 있는 블루 세파로스 (Blue sepharose) CL-6B 흡착 컬럼 크로마토그래피에 토요펄 CM-650 통과 분획을 로딩하였다. 역시 컬럼에 결합하지 않는 통과 분획과 0.2M NaCl 존재 하에 용출되는 분획을 얻을 수 있었고 용출 분획으로부터 PO 활성 분획을 얻었다.

블루 세파로스 CL-6B 흡착 컬럼 크로마토그래피의 용출분획으로 페닐 수퍼로소 (Phenyl Superose) FPLC을 수행하였다. A 용액은 50mM 포스페이트/1.7M (NH₄)₂SO₄ (pH 7.0)로 대부분의 단백질이 컬럼에 흡착되고, B 용액은 50mM 포스페이트 (pH 7.0)를 사용하여 (NH₄)₂SO₄ 농도를 감소시키는 방법을 이용하여 농도 0-0.1 M의 용출 분획이 PO 활성에 관여함을 확인하였다.

이후 활성 분획을 가지고 모노-Q (Mono-Q) FPLC를 수행하여 대부분의 단백질을 흡착시킨 후 NaCl의 농도를 증가시키는 방법을 이용하여 PPAF를 분리하였다. 그 결과 NaCl 20-25%의 용출 분획에서 PO 활성이 나타났다.

이상으로부터 분리된 활성 분획을 모아 다시 모노-S (Mono-S) FPLC를 수행하여 0.1M의 저농도의 NaCl에서 용출되는 분획이 PO 활성에 관여함을 확인하였다. 이 분획을 가지고 전기영동을 수행한 결과 분자량 약 45 kDa의 순수한 단백질로 분리, 정제되었음을 확인할 수 있었다 (도 4, 래인 1: 토요펄 HW-55S, 2: 토요펄 CM 용출분획, 3: 토요펼 CM 통과분획, 4: 블루 세파로스 용출분획, 5: 모노-S FPLC 용출분획). 또한 분리 정제의 초기단계에는 PPAF가 불활성화 형태로 존재하는데 반해 최종 분리 정제된 PPAF는 활성화 형태임을 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다 (도 5, 래인 1: 체액, 2: 초원심분리액, 3: 토요펄 CM 통과분획, 4: 블루 세파로스 통과분획, 5: 블루 세파로스 용출분획, 6: 모노-S FPLC 용출분획).

갈색 거저리 유충의 pro-PO 활성화 반응에 관해 기 증명되어진 내용들을 토대로 분리 정제된 PPAF의 기능 및 전체적인 캐스케이드 반응을 규명하기 위해 순수하게 분리, 정제된 PPAF, pro-PO 및 토요펄 CM-650의 용출 분획으로 각 경우에 따라 PO 활성을 측정해 본 결과, 토요펄 CM-650의 용출 분획에 pro-PO 외에 또다른 PPAF가 존재함을 확인하였다 (도 6).

실시예 2. PPAF의 폴리클로날 항체 제조 및 정제.

실시예 1에서 얻은 정제된 PPAF을 토끼(백색, 숫컷, 2.7kg)에 주사하여 PPAF의 항체를 얻고 프로테인 A세파로스 컬럼을 이용하여 정제하였고, 웨스턴 블랏 분석을 수행하여 정제된 항체가 45kDa의 PPAF만을 선택적으로 인식함을 확인하였다.

실시예 3. 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 PO활성에 따른 pro-PO 및 PPAF의 거동 확인.

체액 상에서 Ca²⁺ 및 β-1,3-글루칸 존재 유무에 따른 PO 활성을 측정한 후, 그 반응 시간에 따라 PPAF가 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 동일한 시간대별로 PO 활성 측정 (도 2) 및 전기영동을 수행한 뒤 pro-PO 및 PPAF 항체를 가지고 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다 (도 7, 래인 1: 사이즈 마커, 2: 체액 (60분 반응), 3: 체액+β-1,3-글루칸 (60분 반응), 4: 체액+Ca²⁺ (10분반응), 5:체액+Ca²⁺ (20분반응), 6: 체액+Ca²⁺ (30분반응), 7: 체액+Ca²⁺ (45분반응), 8:체액+Ca ²⁺ (60분반응), 9: 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (10분 반응), 10: 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (20분 반응), 11: 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (30분 반응), 12: 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (45분 반응), 13: 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (60분 반응)).

체액 단독 또는 체액과 β-1,3-글루칸을 함께 반응시켰을 경우에는 PO 활성이 나타나지 않았으나 체액과 Ca²⁺을 함께 반응시켰을 경우에는 반응 시간 30분경 증가시부터 PO 활성이 나타나며, pro-PO 및 PPAF가 각각 PO 및 활성화형태의 PPAF로 전환됨을 알 수 있었다. 또한 체액, Ca²⁺ 및 β-1,3-글루칸을 함께 반응시켰을 경우에는 β-1,3-글루칸을 첨가하지 않을 때보다 더 빠른 20분경 부터 PO 활성이 나타나며 그때 역시 pro-PO 및 PPAF가 각각 PO 및 활성화 형태의 PPAF로 전환됨을 알 수 있다. 이로써 불활성화형태의 PPAF는 PO 활성에 의존적으로 활성화형태로 전환됨을 확인하였다.

실시예 4. 본 발명의 PPAF 서열결정

XL-1-Blue을 LB 배지 5 ml, 20 % 말토오스 50 ㎕, 1 M-MgSO₄ 50 ㎕의 혼합액에서 37 ℃에서 진탕 배양한 후 회수한 균 침전물에 10 mM-MgSO₄을 가하여 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 조정하였다. Moon et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo)116, 53~58에 기재된 방법에 따라 갈색거저리 유충의 cDNA 라이브러리를 만들었다.

cDNA 라이브러리 용액에 XL-1-Blue 200 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후, 48 ℃로 예열된 3.5 ml의 탑 아가(top agar)와 혼합하여 그 액을 NZY 플레이트에 도포시켰다. 42 ℃에서 4시간 배양한 후 IPTG가 처리된 필터를 플레이트 위에 덮고 다시 37 ℃에서 8시간 더 배양하였다. 반응이 종결되면 4 ℃에서 20분간 방치한 후 필터를 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 필터를 high-TBST 용액으로 실온에서 10분간 세척시킨 후, 이어 low-TBST 용액으로 실온에서 10분씩 두 차례 더 세척하였다. 세척된 필터는 완전히 물기를 제거한 후 3 % 젤라틴 용액에 넣어 30분간 27 ℃에서 블라킹시킨 다음, PPAF의 항체 용액과 2.5시간 동안 27 ℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 필터를 low-TBST 용액으로 세 차례 세척한 후 2차 항체 용액에서 27 ℃에서 30분간 반응시켰다. 이 필터를 low-TBST 용액으로 세 차례 세척시킨 후 다음과 같이 발색 반응을 수행하였다.

앞에서 제조된 필터를 AP 완충액 100ml에 50mg/ml NBT(나이트로블루 테트라졸리움 클로라이드, Bio-rad 170-6532) 1320 μl과 50 mg/ml BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트-p-톨루이딘염 Bio-rad 170-6539) 660 μl을 첨가한 발색 반응액에 담궈 발색시킨 후 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 주변과 뚜렷이 구별되어 보라색을 띄는 클론을 1차 양성 클론으로 판정하였다. 1차 양성 클론을 LB 액체 배지로 적당히 희석하여, 100개에서 200개 정도의 플라크가 생성될 것으로 예상되는 양에 XL-1-Blue (OD₆₀₀=0.5) 200 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양하였다. 여기에 예열된 3 ml의 탑 아가를 가하여 NZY 플레이트에 도포하고, 이후 실험은 1차 선별과 동일하게 실시하여 양성 클론을 2차로 선별하였다.

XL-1-Blue (OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕와 2차 선별 결과 확인된 양성 플라크 용액 (2×10⁵ phage) 200 ㎕, ExAssist 헬퍼 파지 1 ㎕를 50 ml 팰콘 튜브에 넣고 37 ℃에서 15분간 배양한 후 3 ml의 LB 액체 배지를 가하고 37 ℃에서 3시간 진탕 배양시킨 다음 70 ℃에서 다시 20분간 열처리하였다. 열처리된 액을 1,000×g에서 15분간 원심분리시켜 그 상등액을 15 ml 팰콘 튜브에 취하여 4 ℃에 보관하였다.

SOLR 세포(OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕에 LB 액체 배지로 10배 희석한 파지미드를 각각 2 ㎕, 10 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후 이들 중 50 ㎕를 취하여 LB/앰피실린 플레이트에 도말하였다. 37 ℃에서 12시간 배양한 후 단일 콜로니를 취하여 50 ml 팰콘 튜브 상에 LB 액체 배지 5 ml과 앰피실린(50 mg/ml) 10 ㎕를 넣고 37 ℃에서 12시간 배양하였다. DNA 정제 키트(Promega, wizard plus sv minipreps)을 이용하여 PPAF 단백질의 유전자가 삽입된 플라즈미드를 분리하였다.

얻어진 플라즈미드 DNA 염기 서열은 자동 DNA 염기 배열 결정기기를 이용하여 5'방향과 3'방향으로부터 양 방향에서 2 중으로 DNA 염기 서열을 결정하고(서열번호 1). 그 염기서열로부터 단백질 서열을 추론하였다(서열번호 2).

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 이용한 베타-1,3-글루칸 검출용 페놀옥시다제 조성물을 제공한다. 본 발명의 단백질은 베타-1.3-글루칸 검출 조성물의 제조에 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 유전자를 이용하여 베타-1,3-글루칸 검출 조성물 제조에 필요한 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 갈색거저리의 뉴클레오타이드 서열과 유추된 아미노산 서열을 나타낸다. 여기서, 폴리 (A) 추가 신호는 밑줄을 그어 표시했고, 세린 프로테아제 활성자리와 그 치환위치는 박스로 표시하였다.

도 2은 갈색거저리에서 칼슘이온과 β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시다제 활성을 나타낸다 (-▲- : 갈색거저리 체액, -◆- : 갈색거저리 체액 + Ca²⁺, -■- : 갈색거저리 체액 + β-1,3-글루칸, -○- : 갈색거저리 체액 + Ca²⁺ + β-1,3-글루칸).

도 3는 토요펄 CM-650 통과액과 용출액을 사용하여 시험관내에서 PO활성 시스템을 재구성하여 PO활성 여부를 본 그래프이다.

도 4은 PPAF의 정제중 각 단계 및 정제된 PPAF를 환원조건의 SDS-PAGE로 확인한 그림이다 (래인 1: 토요펄 HW-55S, 2: 토요펄 CM 용출분획, 3: 토요펼 CM 통과분획, 4: 블루 세파로스 용출분획, 5: 모노-S FPLC 용출분획).

도 5는 분리정제단계에서 불활성화 형태의 PPAF가 활성화 형태로 전환됨을 환원조건의 SDS-PAGE로 확인한 그림이다 (래인 1: 체액, 2: 초원심분리액, 3: 토요펄 CM 통과분획, 4: 블루 세파로스 통과분획, 5: 블루 세파로스 용출분획, 6: 모노-S FPLC 용출분획).

도 6는 토요펄 CM-650 용출액과 정제된 PPAF를 사용하여 시험관내 재구성실험하여 PO활성을 본 그래프이다.

도 7은 갈색거저리 체액에 Ca²⁺ 또는 β-1,3-글루칸을 첨가한 후 반응시간에 따른 PPAF의 변화를 pro-PO 및 PPAF의 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 관찰한 그림이다(여기서 래인 1: 사이즈 마커, 2: 갈색거저리 체액 (60분 반응), 3: 갈색거저리 체액+β-1,3-글루칸 (60분 반응), 4: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ (10분반응), 5: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ (20분반응), 6: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ (30분반응), 7: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ (45분반응), 8: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ (60분반응), 9: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (10분 반응), 10: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (20분 반응), 11: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (30분 반응), 12: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (45분 반응), 13: 갈색거저리 체액+Ca²⁺ +β-1,3-글루칸 (60분 반응)).

<110> Samyang Genex Corp. <120> Protein of phenoloxidase system and gene coding the same <130> I-129 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1451 <212> DNA <213> Tenebrio molitor <220> <221> CDS <222> (46)..(1377) <400> 1 cgcttcgatt gctttcnaat aacaagttyt tagttgttcg ataaa atg agg gtt 54 Met Arg Val 1 ttc ttt att tta cta tcg gcg agt ctg gtt ctg gcc caa aaa gat gtc 102 Phe Phe Ile Leu Leu Ser Ala Ser Leu Val Leu Ala Gln Lys Asp Val 5 10 15 gat gat gct ata aat agc att ttc ttg tca aat aat tct ctc gac aca 150 Asp Asp Ala Ile Asn Ser Ile Phe Leu Ser Asn Asn Ser Leu Asp Thr 20 25 30 35 ttt ttg tct gat tat gaa gaa atc acg ccg cca cca ctg aaa agt ata 198 Phe Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Ile Thr Pro Pro Pro Leu Lys Ser Ile 40 45 50 gga gcc ttg gag aaa tgt gga gaa ggt gaa caa agg aat cgt ttt gtt 246 Gly Ala Leu Glu Lys Cys Gly Glu Gly Glu Gln Arg Asn Arg Phe Val 55 60 65 tgt gta cca tat tat aac tgc aac gct gac acg cac acc gtg gaa gaa 294 Cys Val Pro Tyr Tyr Asn Cys Asn Ala Asp Thr His Thr Val Glu Glu 70 75 80 aat cca gat tta gat ggg tca cgc aga ata gat att agg atc aaa gag 342 Asn Pro Asp Leu Asp Gly Ser Arg Arg Ile Asp Ile Arg Ile Lys Glu 85 90 95 gat gag gaa cgt aaa tgt gat cac tat atg gaa gtt tgt tgc gaa gta 390 Asp Glu Glu Arg Lys Cys Asp His Tyr Met Glu Val Cys Cys Glu Val 100 105 110 115 agt aat tcc caa acc ggc ggt gac aat agt aat agc ggt cga atg aca 438 Ser Asn Ser Gln Thr Gly Gly Asp Asn Ser Asn Ser Gly Arg Met Thr 120 125 130 aca aaa ccg act gca gta cca aca aaa cca act gca gta cca aca aaa 486 Thr Lys Pro Thr Ala Val Pro Thr Lys Pro Thr Ala Val Pro Thr Lys 135 140 145 ccc act aaa cct tca aaa cct aca aat aat tca caa aca gga gga aat 534 Pro Thr Lys Pro Ser Lys Pro Thr Asn Asn Ser Gln Thr Gly Gly Asn 150 155 160 aat gct tca gga caa aga gta aac tgt ggt atc aga aac agc caa gga 582 Asn Ala Ser Gly Gln Arg Val Asn Cys Gly Ile Arg Asn Ser Gln Gly 165 170 175 atc gat ttt aat cta atc gga ggg acc aac gag gcc aat ttc ggt gaa 630 Ile Asp Phe Asn Leu Ile Gly Gly Thr Asn Glu Ala Asn 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Cys Leu Pro Glu Gln Asp Glu 295 300 305 cac ttt gat gca agg gag tgt ttt gcg aca gga tgg ggc aaa aat gtt 1014 His Phe Asp Ala Arg Glu Cys Phe Ala Thr Gly Trp Gly Lys Asn Val 310 315 320 ttc ggg caa cag gga cag tat gcc gtc att cct aag aaa att caa atg 1062 Phe Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Ala Val Ile Pro Lys Lys Ile Gln Met 325 330 335 cca ctg gtt cac acc aat gcc tgc caa caa gct ttg aga aaa acg cga 1110 Pro Leu Val His Thr Asn Ala Cys Gln Gln Ala Leu Arg Lys Thr Arg 340 345 350 355 tta gga aat tcg ttt att ctt cac aga tcg ttt att tgt gcc gga ggt 1158 Leu Gly Asn Ser Phe Ile Leu His Arg Ser Phe Ile Cys Ala Gly Gly 360 365 370 gaa ccc cat ctg gac act tgt act ggc gac gga gga agt cct ttg gtg 1206 Glu Pro His Leu Asp Thr Cys Thr Gly Asp Gly Gly Ser Pro Leu Val 375 380 385 tgt cct gat cgg aag aat ccc aat cgt tat tta caa gtt gga ata gtc 1254 Cys Pro Asp Arg Lys Asn Pro Asn Arg Tyr Leu Gln Val Gly Ile Val 390 395 400 gct tgg ggt att ggt tgt ggt gaa aat caa gtt cct ggg gtt tat gcc 1302 Ala Trp Gly Ile Gly Cys Gly Glu Asn Gln Val Pro Gly Val Tyr Ala 405 410 415 gat gtt gcc acg ttt agg aat tgg gtt gac gaa aaa ctg caa gaa ata 1350 Asp Val Ala Thr Phe Arg Asn Trp Val Asp Glu Lys Leu Gln Glu Ile 420 425 430 435 ggt att ggt aca tcc tct tac ctg ata tga attatttact attatatgac 1400 Gly Ile Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Ile 440 atgcgtctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaactcg agggggggcc c 1451 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Tenebrio molitor <400> 2 Met Arg Val Phe Phe Ile Leu Leu Ser Ala Ser Leu Val Leu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Val Asp Asp Ala Ile Asn Ser Ile Phe Leu Ser Asn Asn Ser 20 25 30 Leu Asp Thr Phe Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Ile Thr Pro Pro Pro Leu 35 40 45 Lys Ser Ile Gly Ala Leu Glu Lys Cys Gly Glu Gly Glu Gln Arg Asn 50 55 60 Arg Phe Val Cys Val Pro Tyr Tyr Asn Cys Asn Ala Asp Thr His Thr 65 70 75 80 Val Glu Glu Asn Pro Asp Leu Asp Gly Ser Arg Arg Ile Asp Ile Arg 85 90 95 Ile Lys Glu Asp Glu Glu Arg Lys Cys Asp His Tyr Met Glu Val Cys 100 105 110 Cys Glu Val Ser Asn Ser Gln Thr Gly Gly Asp Asn Ser Asn Ser Gly 115 120 125 Arg Met Thr Thr Lys Pro Thr Ala Val Pro Thr Lys Pro Thr Ala Val 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Thr Lys Pro Ser Lys Pro Thr Asn Asn Ser Gln Thr 145 150 155 160 Gly Gly Asn Asn Ala Ser Gly Gln Arg Val Asn Cys Gly Ile Arg Asn 165 170 175 Ser Gln Gly Ile Asp Phe Asn Leu Ile Gly Gly Thr Asn Glu Ala Asn 180 185 190 Phe Gly Glu Phe Pro Trp Ile Val Ala Ile Leu Arg Lys Asn Pro Ala 195 200 205 Pro Gly Glu Asn Leu Ala Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Gly Pro Arg 210 215 220 Val Val Leu Thr Gly Ala His Cys Val Ala Asn Val Asp Ile Ser Thr 225 230 235 240 Ile Lys Ile Arg Ala Gly Glu Trp Asp Thr Gln Thr Glu Asn Glu Arg 245 250 255 Ile Pro Tyr Gln Glu Arg Asn Ile Lys Gln Lys Ile Ile His Asn His 260 265 270 Phe Met Lys Gly Asn Leu Tyr Asn Asp Ile Ala Leu Leu Ile Leu Asp 275 280 285 Arg Asn Leu Ala Lys Thr Glu Ser Val Gly Thr Ile Cys Leu Pro Glu 290 295 300 Gln Asp Glu His Phe Asp Ala Arg Glu Cys Phe Ala Thr Gly Trp Gly 305 310 315 320 Lys Asn Val Phe Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Ala Val Ile Pro Lys Lys 325 330 335 Ile Gln Met Pro Leu Val His Thr Asn Ala Cys Gln Gln Ala Leu Arg 340 345 350 Lys Thr Arg Leu Gly Asn Ser Phe Ile Leu His Arg Ser Phe Ile Cys 355 360 365 Ala Gly Gly Glu Pro His Leu Asp Thr Cys Thr Gly Asp Gly Gly Ser 370 375 380 Pro Leu Val Cys Pro Asp Arg Lys Asn Pro Asn Arg Tyr Leu Gln Val 385 390 395 400 Gly Ile Val Ala Trp Gly Ile Gly Cys Gly Glu Asn Gln Val Pro Gly 405 410 415 Val Tyr Ala Asp Val Ala Thr Phe Arg Asn Trp Val Asp Glu Lys Leu 420 425 430 Gln Glu Ile Gly Ile Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Ile 435 440

Claims (3)

1. 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~444로 이루어지는 폴리펩타이드.
2. 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~444로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열.
3. 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~444로 이루어지는 폴리펩타이드를 포함하는 베타-1,3-글루칸의 검출용 페놀옥시다제 조성물.