KR100497123B1 - 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 β-1,3-글루칸을 측정하는 방법 또는 키트에 이용하는 것에 관한 것이다.

Description

페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자 {Protein of phenoloxidase system and gene encoding the same}

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 이용하는 베타-1,3-글루칸 검출 방법 및 진단키트에 관한 것이다.

대부분의 생물들이 병원균, 기생충, 이물질 등의 외부 유해 환경에 항상 노출되어 있으면서도 생명을 유지해 올 수 있는 이유는 이러한 외부 이물질들로부터 자신을 방어할 수 있는 면역체계를 보유하고 있기 때문이다. 이러한 면역체계는 이물질을 인식하는 방법의 차이에 따라 선천성 면역계 (innate immunity)와 후천성 면역계 (adaptive immunity)로 구분되어진다. 선청성 면역계는 다시 세포성 면역 반응 (cellular reaction)과 체액성 면역 반응 (humoral reaction)으로 나뉘어 설명된다. 세포성 면역 반응은 혈구 세포가 직접 관여하는 것으로, 파고사이토시스, 노들 형성, 인캘슐레이션 반응 등이 포함된다. 이들 반응은 모두 곤충의 혈구 세포인 혈구에 의하여 유도된다고 알려져 있으나 최근까지도 이들 반응의 분자 수준에서의 작용 기전은 아직 정확하게 규명되지 않고 있는 실정이다. 체액성 면역 작용은 체액 내에 존재하는 여러 생체 방어 물질에 의하여 유도되는 반응으로 항균성 펩타이드, 렉틴의 유도 및 멜라닌 형성의 전구 반응인 프로페놀옥시다제 활성화 반응 등을 들 수 있다.

프로페놀옥시다제 활성화에 작용하는 효소, 즉 페놀옥시다제 (PO)는 곤충의 체내에서 평상시에는 불활성화 형태인 pro-PO로 존재하다가 외부 병원성 미생물의 침입시, 미생물 세포벽을 구성하는 β-1,3-글루칸이나 펩티도글리칸, 리포폴리사카라아드와 같은 특징적인 구조물들을 인식한 후, 그 신호가 하위 단계로 전달되는 과정에 여러 단계의 pro-PO 활성화인자들이 (이하 PPAF) 활성화 되는 소위, 캐스케이드 반응을 거쳐 최종 활성화 형태인 PO로 변환되는 것으로 알려져 있다 (Leonard, 1985, Insect Biochem., 15, 803-810, Saul, 1988, Arch. Insect Biochem. Physiol., 7, 91-103 및 Ashida, 1990, Japan Sci. Soc. Press. 236-263.)

암 환자나 장기이식 수술환자, 에이즈감염 환자 등 면역기능이 저하된 환자에게 전신 진균 감염증이 증가되는 사실은 의료계에서 심각한 문제로 대두되고 있으며, 이로 인한 사망률도 점점 증가되고 있다. 전신 진균감염의 주된 형태는 캔디디아시스(candidiasis), 아스퍼질로시스(aspergillosis) 그리고 크립토코칼 메닌지티스(cryptococcal meningitis)이다. 이와 같은 균들은 건강한 사람의 경우 체내의 면역체계에 의하여 조절되고 완전히 치유되지만 암치료나 골수이식을 받은 환자, 기관이식, 화상환자 또는 AIDS 환자와 같이 면역체계가 억제되어 있는 경우 이런 감염증과 맞서 싸울 능력을 잃어버린다. 이런 환자들은 조기에 진균감염 여부를 판단하고 적절한 항진균제를 투여하는 것이 중요하지만 현재 조기 진균 감염 여부를 판단하는 것에 어려움이 있다.

진균 감염진단 방법으로 지금까지는 환자의 혈액을 채취하여 미생물학적인 동정방법으로 감염여부를 판단하고 있으나 2-5일의 배양기간이 필요하므로 치료시기를 맞추지 못하는 단점이 있다. 이를 개선하고자, 진균감염환자의 혈액 중에 존재하는 β-1,3-글루칸을 측정하여 진균 감염을 인식하는 시스템을 찾기 위하여 연구가 진행되어 왔다.

한국출원 2000-2542 및 2001-31890 에서는 곤충의 프로페놀옥시다아제의 활성화 시스템을 이용하여 β-1,3-글루칸 및 펩티도글리칸을 검출하는 조성물을 보고하였다.

Pro-PO를 활성화시키는 캐스캐이드 반응에 관여하는 요소들이 한국산 참검정 풍뎅이 (Holotrichia diomphalia), 갈색거저리(Tenebrio molitor), Bombyx mori 등에서 밝혀지고 있다. 한예로, 한국산 참검정 풍뎅이의 유충을 이용하여 pro-PO 활성화 기전에 관한 연구를 수행한 결과 pro-PO를 두단계 가수분해시켜 PO로 활성화시키는 PPAF로서 세린프로테아제인 PPAF-I 및 유사 세린프로테아제인 45kDa 단백질(PPAF-II)을 분리 정제하였고, 각각의 유전자 구조를 밝혀 보고한 바 있다 (Lee et al., (1998), Eur. J. Biochem., 257, 615-621, Kwon et al., (2000), Eur. J. Biochem., 217, 6188-6196). 상기 2개의 요소들은 페놀옥시데이즈 조성물의 필수적인 구성요소로서, PPAF-I은 세린프로테아제로 전형적인 세린프로테아제의 특성을 지니고 있으며, 45kDa 단백질은 세린프로테아제 호모로그로 세린프로테아제의 활성화 위치 중 세린이 글리신으로 치환된 마스커레이드유사 단백질 (masquerade-like protein)이다. 그러나, 페놀옥시다아제 조성물을 이루는 요소는 모두 밝혀진 상태가 아니다.

일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 이 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화반응에 의해 유도되는 내부인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시다아제로 변화되어 카테콜아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버리므로 이 반응 시스템을 생체외로 분리하는데에 공정상의 어려움이 있다. 그러므로, pro-PO 활성화 시스템을 분자수준에서 이해하기 위해서는 이 시스템을 구성하는 각각의 인자들, 그리고 이들 사이의 관계를 밝히고 각 요소를 재구성하여 베타-1,3-글루칸 검출용 조성물을 제조하는 것이 요구된다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규한 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규한 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 프로페놀옥시다제 활성화에 관여하는 신규 단백질을 포함하는, 베타-1,,3-글루칸 검출용 페놀옥시다제 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 이용한 베타-1,3-글루칸 검출용 페놀옥시다제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 또는 이를 포함하는 조성물은 베타-1,3-글루칸 검출 방법이나 키트에 유용하다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~351로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부인 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 잔기 97-351로 이루어진 아미노산 서열, 또는 그것의 변이체로서, 활성형 페놀옥시다제 활성화 인자인 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~351로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 97-351로 이루어진 아미노산 서열, 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부로서, 활성형 페놀옥시다제 활성화 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일례에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 121~1176 염기로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다, 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 409~1176 염기로 이루어진, 활성형 페놀옥시다제 활성화 인자을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 아미노산 잔기 1~315로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부인 폴리펩타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 잔기 97-315로 이루어진 아미노산 서열, 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부인 폴리펩타이드를 포함하는, 베타-1,3-글루칸의 검출용 페놀옥시다제 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

"아미노산 서열", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 완전한 천연의 아미노산 서열로 한정되는 것은 아니다.

"염기서열의 변이체"는 본 발명의 단백질이 가지는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 유전자 서열 중 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기 서열을 의미한다.

"아미노산 서열의 변이체"는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명에서 곤충은 체내에 페놀옥시다제(PO) 시스템을 가지고 있는 곤충을 의미하며, 완전변태 곤충이 바람직하다. 예로는 가재나 새우같은 갑각류, 딱정벌레목 등을 들 수 있고 이들의 생체 내에는 pro-PO가 존재하며, β-1,3-글루칸 또는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화되는 캐스케이드반응에 의해 PO로 활성화된다.

본 발명에서 페놀옥시다제 시스템은 곤충내에 존재하는, β-1,3-글루칸의 존재에 의해 일련의 반응을 거쳐 프로페놀옥시다제가 페놀옥시다제로 활성화되는 시스템을 의미한다.

본 발명에서 페놀옥시다제 조성물은 페놀옥시다제 시스템 성분의 전부 또는 일부를 포함하며, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물을 의미하고, 한 예로 본 발명에서는 G 용액을 들 수 있다.

본 발명은 페놀옥시다제의 활성화에 관여하는 새로운 단백질을 분리하고 그 구조를 밝혀, 페놀옥시다제 시스템의 필수 성분이며 새로운 프로페놀옥시다제 활성화 인자(PPAF-III)임을 밝힌다. pro-PO을 활성화시키지 않는 조건하에서 한국산 참검정풍뎅이 유충의 체액을 채취하고 덱스트란 설페이트 세파로스 칼럼을 이용하여 Ca²⁺에 의해서 PO활성이 나타나는 분획을 얻고, 여러가지 칼럼으로 정제한다.

본 발명의 PPAF-III은 pro-PO, PPAF-I, II와 반응시 Ca²⁺에 의존적인 PO활성을 나타내며, 이로부터 본 발명의 PPAF-III 단백질이 PO활성에 필수적인 성분임을 확인한다 (도 2, 도 4 및 도 5). 또한, PPAF-I, II, III 에 의해 PO활성이 나올 때, 79 kDa pro-PO가 76 kDa PO와 60 kDa PO로 두번 절단됨이 SDS-PAGE 상을 통해 확인가능하며, 상기 76 kDa PO는 pro-PO1 및 pro-PO2에서, 60 kDa PO2에서 유래됨을 N-말단 결정으로 알 수 있다.

본 발명은 SDS-PAGE에 의해 PPAF-III는 분자량 약 40 kDa 크기의 분자량을 가지는 세린프로테아제이고(도 3), 활성화된 상태의 PPAF-III는 페놀옥시다제 시스템에서 페놀옥시다제 조성물의 한 요소인 45kDa 단백질, 즉 PPAF-II (한국출원 2000-49207 호)를 절단하여 35kD의 분자량을 갖는 단편을 생산한다.

NCBI 데이터베이스를 이용하여 PPAF-III의 단백질의 서열 상동성을 조사해 본 결과, Holotrichia diomphalia PPAF-I과 44.2%로 가장 높은 유사성을 보이고, House crab proclotting enzyme, Manduca sexta pro-PPA, Bombyx mori의 pro-PPA과 구조적으로 유사하다.

본 발명의 PPAF-III은 세린프로테아제에서 기질 특이성을 결정짓는 기질 결합 포켓이 존재하고 대부분의 세린프로테아제에서 보존되어 있는 시스테인이 보존되어 있다. 또한 N-말단 도메인과 활성도메인(catalytic domain)의 2개가 존재하여, N-말단 도메인에 6개의 시스테인이 존재하여 하나의 디설파이드-노티드 모티프 (disulfied knotted motif)를 형성한다.

PPAF-III는 곤충의 체내에서 불활성형태로 존재하고, 외부의 이물질에 의한 캐스케이드 반응에 의해 라이신-96과 발린-97 사이가 절단된 활성화 형태로 전환되는데, 본 발명의 정제과정에서 덱스트란 설페이트 세파로스 컬럼 수행시 불활성형태에서 활성화 형태로 전환됨을 알 수 있었다. 그러므로, 곤충에 체액으로부터 정제된 PPAF-III은 N-말단이 발린-97으로 시작되는 단백질이 활성화 형태이다.

PPAF-III를 분리하기 위해서는 곤충의 체액 즉, 플라즈마 또는 혈구를 시료로 사용할 수 있다. 곤충의 체액분리 공정에서 별도의 세린프로테아제 저해제를 첨가하는 대신 킬레이팅제가 함유된 완충액을 사용하여 혈구 응집과 흡착현상을 억제할 수 있다. 체내에 불활성상태로 존재하는 PPAF-III는 본 발명의 덱스트란 설페이트 세파로스 컬럼을 통한 분리과정에서 활성화된다.

본 발명에 따른 PPAF-III는 PPAF-III에 대한 항체를 얻고 이를 이용하여 다른 곤충의 체액에 존재하는 PPAF-III 유사 단백질을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 PPAF-III는 페놀옥시다제 시스템 또는 이 시스템을 기초로 한, β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물의 기질을 제조하는 데 이용될 수 있다. 즉, PPAF-III는 캐스캐이드 반응으로 진행되는 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 한 인자로 세린프로테아제의 활성을 띤다. 그러므로 이 단백질이 작용할 수 있는 기질, 예를 들어 펩타이드를 제조하여 PPAF-III의 활성을 측정함으로써 페놀옥시다제 조성물을 이용하여 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, PPAF-III, 그것의 변이체, 또는 그것의 일부를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그것의 변이체, 또는 그것의 일부를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지며, 한 예로, 서열번호 1의 염기 121~1176인 DNA서열로 이루어진다.

본 발명에서는 곤충의 cDNA 라이브러리를 제조하고 정제된 PPAF-III의 부분 아미노산서열을 결정한 것을 토대로 한 DNA 프로브를 제조하여 PPAF-III의 유전자를 얻고 그 서열과 그에 의해 암호화된 아마노산의 서열을 제시한다. 얻어진 유전자는 315개의 아미노산에 해당하는 945개 염기의 오픈 리딩 프레임을 가지고 있다.

본 발명에서 사용한 pro-PO, PPAF-I, PPAF-II(45kDa 단백질)은 공지된 방법에 따라 정제하였다(Kwon et al., (1997), Mol. Cells., 7, 90-97, Lee et al., (1998), Eur. J. Biochem., 257, 615-621, Kwon et al., (2000), Eur. J. Biochem., 217, 6188-6196).

본 발명에서 사용하는 완충액 및 페놀옥시다제 활성 측정 방법은 다음과 같다.

항응고 완충액 (pH 4.6): 30mM 트리소디움 시트레이트, 26mM 시트르산, 20mM EDTA, 15mM NaCl).

β-1,3-글루칸 용액: β-1,3-글루칸(Curdlan, Wako Pure Chemical Industries, LTd.) 1mg을 0.1N NaOH 1ml에 녹인 용액 10ul와 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 990ul을 혼합하여 만든 용액.

항체 정제에 사용한 스킴 밀크 용액(pH 7.9): 20 mM Tris/HCl(pH 7.9) 50 ml에 스킴 밀크 2.5 g을 녹임.

항체 정제에 사용한 10 × 세척완충액: Tris 100mM, EDTA 10mM, Triton X-100 1%, NaCl 1.5M.

항체 정제에 사용한 세척 완충액: 1 × 세척 완충액 내에 스킴 밀크 0.5%, NaN₃ 0.01%, 10X 세척 완충액 10%.

Denhart's 용액 : 피콜 2g, 폴리비닐피롤리돈 2g, BSA 2g을 milli-Q로 200ml까지 채움.

LB 액체 배지: 배지 1L 내에, NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 3차 증류수 잔여량

NZY 플레이트: NaCl 5g, MgSO₄.7H₂O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 15 g, 3차 증류수 1L

NZY 플레이트(탑 아가): NaCl 5g, MgSO₄.7H₂O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 7g, 3차 증류수 1L

SM 완충액: 용액 1L 내에, NaCl 5.8g, MgSO₄.7H₂O 2g, 1M Tris-HCl(pH 7.5) 50ml, 2% 젤라틴 5ml, 3차 증류수 잔여량

페놀옥시다제 활성의 측정

정제 기타 각 실험단계에서 얻은 분획 일정량에 최종농도가 1mM 4-메틸카테콜(MC), 2mM 4-하이드록시프롤린 에틸에스테르(HP)가 되도록 가하고 칼슘이온이 필요한 반응조건에는 최종농도가 5mM이 되도록 가한 후 20mM 트리스 완충액 (pH8.0)을 가하여 500ul가 되도록 하여 30℃에서 일정시간 반응시킨 후 20% 초산 500ul을 넣어 반응을 중지시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정한다. 페놀옥시다제의 1단위는 520nm에서 흡광도가 0.1 증가할 때의 양으로 정의한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.

실시예1. 곤충의 체액 채취

한국산 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphlia) 유충 약 3,000마리를 얼음위에서 마취시키고 10 ml 주사기에 항응고 완충액을 채워 1ml을 주입하고 유충의 복부를 잘라 얼음위 시험관에 체액을 모았다. 채취한 체액을 420 x g 속도로 4℃에서 20분간 원심분리하여 플라즈마와 혈구를 분리하였다. 혈구는 항응고 완충액으로 세척하여 -80℃에서 보관하여 실험에 사용하였다. 혈구 약 0.5 g씩을 5mL의 완충액 A(트리스 완충액(pH 6.5, 50mM 트리스 + 1 mM EDTA))에 현탁 후 초음파분쇄기로 5초간 5회 혈구를 파쇄하여 균질화시킨 후 4℃, 22,000 x g에서 20분간 원심분리하고 그 상등액을 혈구용해물로 사용하였다.

체액을 원심분리한 후의 상등액은 플라즈마로 얻어 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 플라즈마 45 ml씩을 203,006g 속도로 4℃에서 4시간 원심분리하여 얻은 상등액 40 ml을 울트라필트레이션(cut off: 10,000)으로 하여 2 ml로 농축하였다. 완충액 A로 평형화시킨 토요펄 (Toyopearl) HW-55S 컬럼(1.4X50cm)에 로딩하였다. 완충액 A로 1.5 mL/시간의 속도로 용출시키면서 3.5 ml씩 분획하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하였다. 칼슘 및 β-1,3-글루칸 용액을 첨가하였을 때 페놀옥시다제 활성을 나타내는 분획만을 모아 페놀옥시다제 조성물을 얻었으며 이를 G 용액으로 명명하였다.

실시예 2. β-1,3-글루칸에 의한 PO활성화

PO 활성화에 대한 G용액 내 성분들의 관련성을 확인하기 위하여, G 용액과 혈구용해물에 대하여 β-1,3-글루칸에 의한 PO 활성을 측정하고 그 결과를 도 2에 나타냈다 (컬럼 1: CaCl₂ 함유 기질용액 (CaCl₂ 5mM, 트리스 완충액 50mM, 4-MC 1mM, 4-HP 2mM), 컬럼 2: G 용액 5ul (50ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질용액, 컬럼 3: 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질용액, 컬럼 4: G 용액 5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂를 함유하지 않는 기질 용액, 컬럼 5: G 용액 5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질 용액). β-1,3-글루칸에 의한 PO활성화에 G용액 내 성분들이 관여함을 알 수 있다.

실시예 3. PPAF-III의 정제

실시예1의 G 용액으로부터 PPAF-III를 정제하였다.

덱스트란 설페이트 세파로스 CL-6B 컬럼 (Φ1.5 X 50 cm)을 완충액 A로 미리 평형화시킨 후 G 용액을 완충액 A로 두 번 10 배 희석시켜 60 ml로 만든 후 1 ml/분의 유속으로 컬럼에 로딩하여 280 nm에서 흡광도가 없어질 때까지 세척하였다. 그 후 선형구배 [ A: 1 mM EDTA/50 mM Tris/HCl (pH 6.5), B : 1 mM EDTA / 1M NaCl / 50 mM Tris/HCl (pH 6.5) 각 250 ml씩 ]로 1 ml/분의 속도로 용출하여 시험관 1 개당 7 ml씩 모았다.

각 분획에 대한 PO 활성 측정을 통해 PPAF-III가 포함된 분획을 찾기 위해 통과분획 15ug을 사용하여, pro-PO와 PPAF-II가 포함되어 있는 혈구용혈물 150㎍과 이 단계에서의 PPAF-I 포함된 분획을 함께 Ca++ 존재하에서 30℃에서 15분간 반응시켜 PPAF-III를 포함하는 분획을 얻었다.

PPAF-I도 또한 혈구용혈물과 이 단계의 PPAF-III 가 포함하는 분획을 이용하여 Ca++ 존재하에서 30℃에서 15 분간 반응시켜 PPAF-I 을 포함하는 분획을 확인하였고 이후 PPAF-III 분리를 위한 마커로 이 분획을 Dex-Grl로 명명하고 이를 사용하여 PO활성측정을 통해 PPAF-III을 분리하였다.

상기의 PPAF-III의 활성 분획을 모아 울트라필트레이션(cutoff : 10,000)하여 3 ml로 농축시킨 후 0.1 M NaCl을 포함하는 완충액 B [ 50mM Tris/HCl, 1mM EDTA, pH 6.5 ]로 평형화시킨 세파크릴 S-200 컬럼(Φ2 x 120cm)에 로딩하였다. 0.2 ml/분의 속도로 컬럼을 수행하여 280 nm에서 흡광도를 측정 후 각 분획 3 ug을 사용하여 혈구용혈물과 Dex-Gr1을 5 mM CaCl₂ 존재하에서 30℃에서 15분 반응시켜 PO 활성 측정으로 PPAF-III 포함하는 분획을 얻었다.

세파크릴 S-200 컬럼에서 얻은 PPAF-III의 활성분획을 1.7M (NH₄)₂SO₄를 포함하는 50 mM 인산완충액 (pH7.0)로 10배 희석하여 이미 1.7M (NH₄)₂SO₄를 포함하는 50 mM 인산완충액 (pH7.0)로 평형화시킨 페닐-수퍼로스 FPLC에 0.4 ml/분의 유속으로 로딩하여 280 nm에서 흡광도가 없어질 때까지 세척하였다. A 용액은 1.7M (NH₄)₂SO₄를 포함하는 50mM 인산완충액 (pH7.0), B 용액은 50mM 인산완충액 (pH 7.0)를 사용하였으며 0.4 ml/분의 유속으로 60분에 B 용액의 농도가 0M까지 떨어지는 구배를 이용하여 용출하였다. 얻어진 각 분획 1ug을 사용하여 혈구용혈물과 Dex-Gr1을 5 mM CaCl₂가 있는 조건에서 30℃에서 15분간 반응시킨 후 PO 활성 측정으로 PPAF-III 포함하는 분획을 얻었다.

페닐-수퍼로스 FPLC에서 얻은 PPAF-III의 분획을 50mM 인산완충액(pH6.5)으로 10배 희석하여 이미 50 mM 인산완충액(pH6.5)로 평형화시킨 모노-S FPLC에 0.4 ml/분의 유속으로 로딩하였다. A 용액은 50mM 인산완충액 (pH6.5), B 용액은 1M NaCl을 포함하는 50mM 인산완충액(pH6.5)를 사용하여 55분에 0.4M NaCl까지 증가시키는 구배를 이용하였고 얻어진 각 분획은 0.7㎍을 사용하여 혈구용혈물과 Dex-Gr1을 5 mM CaCl₂가 있는 조건에서 30℃에서 15분간 반응시킨 후 PO 활성 측정으로 PPAF-III 포함하는 분획을 얻었다.

모노-S FPLC에서 얻은 PPAF-III 분획을 최종적으로 순수하게 분리 정제하기 위해 모노-Q FPLC 컬럼을 수행하였다. 20 mM 트리스 완충액 (pH7.4)로 시료를 10 배 희석한 후 이미 20 mM 트리스 완충액 (pH7.4)로 평형화 된 모노-Q FPLC 컬럼에 0.4 ml의 유속으로 로딩하였다. 여기서 사용한 A 용액은 20 mM 트리스 완충액 (pH 7.4), B 용액은 1 M NaCl을 포함하는 20 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)를 사용하였고 55분에 B 용액의 농도를 0.4 M NaCl까지 증가시키는 구배를 이용하여 순수하게 분리 정제하였다.

정제된 PPAF-III의 10% SDS-PAGE를 실시하여 분자량 및 그 순도를 확인하였다 (도 3).

실시예 3. 활성화된 PPAF-III의 N 말단 결정

분리 정제된 PPAF-III의 N-말단을 결정하기 위해 3ug의 시료를 12 % SDS-PAGE를 실시한 후 PVDF막에 이전시키기 위해 전이완충액(CAPS 10mM, 메탄올 10%) 내에서 300 mA의 일정한 전류로 1시간동안 전기영동을 수행하였다. 겔의 단백질이 이전된 막은 CBB 염색용액 (0.1% CBB R-250, 50% 메탄올)으로 염색하고, 탈색용액 (50% 메탄올, 10 % 아세트산)로 탈색시킨 후 물로 수회 세척하여 감압건조 시켰다. 단백질 띠만 잘라서 자동 아미노산 서열기를 이용하여 아미노산 서열을 결정하였다.

N-말단 아미노산 서열

5'-VLGGEDTDLGEYPWMALLQQTK-3'

실시예 4. PPAF-III 염기서열 및 단백질 서열 결정

A. PPAF-III의 부분 아미노산 서열 결정

정제된 PPAF-III을 트립신으로 잘라 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

시료 30㎍을 함유하는 용액에 동일 용량의 8 M 우레아를 함유하는 0.4 M NH₄HCO₃ 완충액을 가하여 녹이고, 전체 용량의 10%에 해당하는 양의 45 mM DTT 용액을 가하여 50℃에서 15분간 반응시킴으로써 환원시킨 후, 전체 용량의 10 %에 해당하는 양의 100mM 아이오도아세트아미드용액을 가하여 실온에서 15 분간 반응시켜서 환원된 시스테인을 알킬화시켰다. 이를 10% TCA 침전법으로 침전시키고, 얻어진 단백질 잔사를 8M 우레아를 함유하는 0.4M NH₄HCO₃ 용액을 가하여 녹인 후, 트립신 2 ㎍을 가하여 37℃에서 12시간 반응시켜 단편화하였다. 단편화시킨 단백질들은 C18 역상 HPLC 컬럼 (chemcosorb 5-ODS-H 2.1 × 150/W)를 이용하여 선형구배시스템 [A; 0 % CH₃CN in 0.06 % TFA, B; 80 % CH₃CN in 0.052 % TFA] 하에서 90분 동안 B용매가 90 %까지 증가되도록 하여 0.2㎖/분의 유속으로 단편화된 단백질을 분리한 후, 에드만분해법으로 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

부분 아미노산 서열

5'-SFGCGGSLISD-3'

5'-ATQDCVGSGSYQYCS-3'

5'-NKYVQPIC-3'

5'-TPVGENLLVAG-3'

5'-LKLPVTDLPA-3'

상기 부분 아미노산 서열 NKYVQPIC에 해당하는 DNA 프로브 AAYAARTAYGTICARCCIATHTG를 제조하고 5'말단을 γ-³²P-ATP로 라벨링하여 한국산 참검정풍뎅이의 cDNA 라이브러리로부터 PPAF-III을 선택하기 위한 프로브로 사용하였다.

B. 참검정풍뎅이의 cDNA 라이브러리 제조

XL-1-Blue을 LB 배지 5 ml, 20 % 말토오스 50 ㎕, 1 M-MgSO₄ 50 ㎕의 혼합액에서 37 ℃에서 진탕 배양한 후 회수한 균 침전물에 10 mM-MgSO₄을 가하여 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 조정하였다. Moon et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo)116, 53~58에 기재된 방법에 따라 한국산 참검정풍뎅이 유충의 cDNA 라이브러리를 만들었다. cDNA 라이브러리 용액에 XL-1-Blue 200 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후, 48 ℃로 예열된 3.5 ml의 탑 아가(top agar)와 혼합하여 그 액을 NZY 플레이트에 도포시켰다. 37 ℃에서 13시간 배양한 후 레플리카를 취하였다. 4 ℃에서 1 시간 방치한 후 플레이트에 NEF-978을 5분간 방치하고 실온에서 5분이상 방치시켰다. 두번째 막을 다시 플레이트에 15분간 방치한 후 공기 중에서 건조시켰다. 0.5N NaOH로 2분간 처리하고 중화는 1M Tris/HCl (pH7.5)로 처리한 다음 건조시켰다. 동일한 방법으로 알카리, 중화처리를 다시 한번 처리하였다. 막을 세척완충액 (3XSSC /0.1%SDS)으로 적신후 SDS를 완전히 제거 하였다.

C. 혼성화 및 PPAF-III 단백질의 유전자가 삽입된 플라즈미드를 분리

상기의 DNA 프로브를 하이브리디제이션 용액 ( 20XSSC 6ml, 50Xdenhart's sol'n 6ml, 5mg/ml ssssDNA 0.15ml → 30ml까지 milli-Q) 에 1 ml당 5 ng의 DNA량이 되도록 가한 후 상기 막과 함께 44 (Tm-5)℃의 항온조에서 하루동안 하이브리디제이션시켰다. Tm값은 49℃ 로 선정하였다. 하이브리디제이션 후 막을 30℃로 예열된 세척완충액 ( 20XSSC 100㎖, 20%SDS 2.5㎖ →500ml까지 milli-Q )으로 막을 5분씩 3회 씻고, 44 (Tm-5)℃에서 5분동안 같은 세척완충액으로 1-2회 씻었다. 막은 Wattman 사의 3MM여지 위에 붙여 -80℃에서 18시간 노출시켰다. 현상 후 1차 양성플라크를 선별하였고 2차 스크리닝을 통해 최종 1개의 플라크을 얻을 수 있었다.

XL-1-Blue (OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕와 2차 선별 결과 확인된 양성 플라크 용액 (2×10⁵ phage) 200 ㎕, ExAssist 헬퍼 파지 1 ㎕를 50 ml 팰콘 튜브에 넣고 37 ℃에서 15분간 배양한 후 3 ml의 LB 액체 배지를 가하고 37 ℃에서 3시간 진탕 배양시킨 다음 70 ℃에서 다시 20분간 열처리하였다. 열처리된 액을 1,000×g에서 15분간 원심분리시켜 그 상등액을 15 ml 팰콘 튜브에 취하여 4 ℃에 보관하였다.

SOLR 세포(OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕에 LB 액체 배지로 10배 희석한 파지미드를 각각 2 ㎕, 10 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후 이들 중 50 ㎕를 취하여 LB/앰피실린 플레이트에 도말하였다. 37 ℃에서 12시간 배양한 후 단일 콜로니를 취하여 50 ml 팰콘 튜브 상에 LB 액체 배지 5 ml과 앰피실린(50 mg/ml) 10 ㎕를 넣고 37 ℃에서 12시간 배양하였다. DNA 정제 키트(Promega, wizard plus sv minipreps)을 이용하여 PPAF-III 단백질의 유전자가 삽입된 플라즈미드를 분리하였다.

D. 염기서열 결정

얻어진 플라즈미드 DNA 염기 서열은 자동 DNA 염기 배열 결정기기를 이용하여 5'방향과 3'방향으로부터 양 방향에서 2 중으로 DNA 염기 서열을 결정하고(서열번호 1). 그 염기서열로부터 단백질 서열을 추론하였다(서열번호 2).

실시예 5. PPAF-III와 PO활성

정제된 PPAF-III이 PO 활성을 나타내는데 필수적인 요소인지를 확인하기 위해 순수 분리 정제된 pro-PO 1ug, PPAF-I 0.5 ug, PPAF-II 0.5 ug 과 PPAF-III 단백질 0.5 ug과 반응시켜 PO 활성의 변화를 관찰하고 도 4에 나타낸다. PPAF-I, PPAF-II, PPAF-III, pro-PO가 모두 존재하는 막대 9에서만 PO활성이 나타나는 것으로 PPAF-I, PPAF-II, PPAF-III가 모두 필수적인 단백질임을 확인하였고 특히 칼슘이온에 의존적으로 PO활성을 나타내었다.

실시예 6. PPAF-III의 PPAF-II 절단활성

PO활성이 나타나는 조건하에서, 칼슘이온의 존재 유무에 따라 PPAF-I, PPAF-II, PPAF-III 각각 1ug을 사용하여 40분간 반응시켜 12% SDS-PAGE를 분석하여 각각의 밴드변화를 관찰하였다.PPAF-I, PPAF-II 간에는 아무런 변화가 없으나, PPAF-III가 PPAF-II를 절단하는 현상을 관찰하였다 (도 5, 래인 1: 정제된 PPAF-I, 2: 정제된 PPAF-II, 3: 정제된 PPAF-III, 4: PPAF-I + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 5: PPAF-I + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 6: PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 7: PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 8: PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 9: PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가).

실시예 7. PPAF-I, II, III의 의한 PO활성화

PO 활성이 나타나는 조건에서 반응시킨 후 12% SDS-PAGE를 수행하여 각각의 밴드변화를 관찰하였다. 순수하게 분리 정제된 PPAF-I, II, III 각각 1 ug, pro-PO 2 ug을 Ca++존재유무에 따라 반응을 시켜 충분히 PO 활성이 나타나는 조건인 30℃에서 40 분간 배양을 한 후 TCA 침전을 시켜 12 % SDS-PAGE를 수행하였다 (도 6, 래인 1: Pro-PO + PPAF-I + Ca2+ 무첨가, 2: Pro-PO + PPAF-I + Ca2+ 첨가, 3: Pro-PO + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 4: Pro-PO + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 5: Pro-PO + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 6: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 7: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 8: Pro-PO + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 9: Pro-PO + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 10: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 11: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가).

그 결과 PPAF-I에 의해 Ca++ 비의존적으로 79 kDa pro-PO를 76 kDa PO로 잘림을 확인하였고, PPAF-II, III에 의해서는 pro-PO 가 거의 변함이 없음을 관찰하였다. 특히, Ca++ 의존적인 PO 활성 나올 때의 밴드변화는, Ca++ 없는 조건에서는 PPAF-I에 의한 76 kDa PO가 한 번 절단됨을 관찰했고 이 때 PO 활성은 나타나지 않는다. Ca ++있는 조건에서는 PPAF-I, II, III에 의해 79 kDa pro-PO가 76 kDa PO와 60 kDa PO로 두 번 절단됨을 관찰하였으며, PO 활성을 나타내는 데에는 60kDa의 새로운 PO 밴드가 생성되어야함을 알수 있다. 결론적으로 76 kDa PO는 PPAF-I에 의해 기인된 것이나 PO 활성에는 관여하지 않고, 60 kDa PO는 어떤 한 팩터로 인한 것이 아니라 PPAF-I, II, III와 Ca++이 어떤 컴플렉스를 이루어야만 생성되고 이 때 PO 활성도 나타난다. 76kDa, 60kDa PO의 N-말단을 결정한 결과, 76kDa PO는 pro-PO1 및 pro-PO2에서, 60kDa는 pro-PO2에서 유래됨을 알수 있었다.

본 발명은 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 단백질에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충의 페놀옥시다제 시스템을 구성하는 페놀옥시다제 활성화 인자 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 베타-1,3-글루칸 검출 방법 또는 키트에 이용하는 것에 관한 것이다.

도 1은 PPAF-III의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타내는 도면이며, 박스로 표시한 것은 세린 프로테아제의 활성부위를 나타낸다.

도 2은 G 용액과 혈구용해물에 대하여 베타-1,3-글루칸에 의한 PO활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 여기서 칼럼은 다음과 같다.

컬럼1: CaCl₂ 함유 기질용액(CaCl₂ 5mM, 트리스 완충액 50mM, 4-MC 1mM, 4-HP 2mM),

컬럼 2: G 용액 5ul (50ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질용액,

컬럼 3: 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질용액,

컬럼 4: G 용액 5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂를 함유하지 않는 기질 용액,

컬럼 5: G 용액 5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl₂ 함유 기질 용액.

도 3은 본 발명의 정제된 활성형 PPAF-III을 환원조건 또는 비환원조건의 10% SDS-PAGE 전기영동한 결과를 나타낸다.

도 4는 정제된 pro-PO, PPAF-I, PPAF-II 과 PPAF-III 단백질과 반응시켜 얻어진 PO 활성의 변화를 나타낸다.

도 5는 PO활성이 나타나는 조건하에서, 칼슘이온의 존재 유무에 따라 PPAF-I, PPAF-II, PPAF-III을 반응시켜 환원조건의 12% SDS-PAGE를 분석하여 나타난 PO활성을 나타내는 그래프이다 (래인 1: 정제된 PPAF-I, 2: 정제된 PPAF-II, 3: 정제된 PPAF-III, 4: PPAF-I + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 5: PPAF-I + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 6: PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 7: PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 8: PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 9: PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가).

도 6은 PO 활성이 나타나는 조건에서 정제된 PPAF-I, II, III를 pro-PO에 반응시킨 후 12% SDS-PAGE를 수행하여 나타난 결과를 나타낸다 (래인 1: Pro-PO + PPAF-I + Ca2+ 무첨가, 2: Pro-PO + PPAF-I + Ca2+ 첨가, 3: Pro-PO + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 4: Pro-PO + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 5: Pro-PO + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 6: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + Ca2+ 첨가, 7: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 8: Pro-PO + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 9: Pro-PO + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가, 10: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 무첨가, 11: Pro-PO + PPAF-I + PPAF-II + PPAF-III + Ca2+ 첨가).

<110> Samyang Genex Corp. <120> Protein of phenoloxidase and gene coding the same <130> I-128 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1293 <212> DNA <213> Holotrichia diomphalia <220> <221> CDS <222> (121)..(1173) <400> 1 agtactttta taaatattcg aatagacgta cagtatatct gtaatcgaaa acaagaatcc 60 aaacttatac gatataaagt attgcaagga ggcccagtac ctccacttaa actcgtgaac 120 atg tgg ttg tcc tta gtg att ctt ggt gta gca agc gcc atc gtc aat 168 Met Trp Leu Ser Leu Val Ile Leu Gly Val Ala Ser Ala Ile Val Asn 1 5 10 15 gtt agc act cag gaa agt tgt aca acg ccg aat ggg gag aca gca aca 216 Val Ser Thr Gln Glu Ser Cys Thr Thr Pro Asn Gly Glu Thr Ala Thr 20 25 30 tgc ctt ccg ata gaa tct tgc aag ata ttt tgg gac tat gtc gtc acc 264 Cys Leu Pro Ile Glu Ser Cys Lys Ile Phe Trp Asp Tyr Val Val Thr 35 40 45 tcg ggc gct gat cca gag ata aat agt ttc tta aga gcc tca cta tgt 312 Ser Gly Ala Asp Pro Glu Ile Asn Ser Phe Leu Arg Ala Ser Leu Cys 50 55 60 cgc cag ggt aac tat gta gtt tgc tgt gga agc acc tta aaa ttt aac 360 Arg Gln Gly Asn Tyr Val Val Cys Cys Gly Ser Thr Leu Lys Phe Asn 65 70 75 80 agc gct tta cca gac agg acc gaa tgt gga ctt cag gat gat ttc aaa 408 Ser Ala Leu Pro Asp Arg Thr Glu Cys Gly Leu Gln Asp Asp Phe Lys 85 90 95 gta cta ggt ggt gaa gat aca gat tta ggc gaa tat cct tgg atg gct 456 Val Leu Gly Gly Glu Asp Thr Asp Leu Gly Glu Tyr Pro Trp Met Ala 100 105 110 tta cta cag cag acc aaa acg tcg ggt gca aaa tcg ttc gga tgc ggt 504 Leu Leu Gln Gln Thr Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ser Phe Gly Cys Gly 115 120 125 gga tct cta att agc gat aga tac gtt tta act gca gct cac tgt gtc 552 Gly Ser Leu Ile Ser Asp Arg Tyr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val 130 135 140 gtt agc tcc agc tat acg gtg acc atg gtg cga ctt gga gaa tgg gat 600 Val Ser Ser Ser Tyr Thr Val Thr Met Val Arg Leu Gly Glu Trp Asp 145 150 155 160 ttg cgt gcc aca caa gat tgt gtc ggg tct ggt agc tat cag tat tgc 648 Leu Arg Ala Thr Gln Asp Cys Val Gly Ser Gly Ser Tyr Gln Tyr Cys 165 170 175 agt ccg cct cct caa gat ata gga ata gaa tca ata acc tct cat ccc 696 Ser Pro Pro Pro Gln Asp Ile Gly Ile Glu Ser Ile Thr Ser His Pro 180 185 190 aac tat gag aaa agc agt cgt gga gta ttc aat gac att gct ctc att 744 Asn Tyr Glu Lys Ser Ser Arg Gly Val Phe Asn Asp Ile Ala Leu Ile 195 200 205 cgt ctt gcc aga cct gta aat aga aat aaa tac gtc caa ccc att tgc 792 Arg Leu Ala Arg Pro Val Asn Arg Asn Lys Tyr Val Gln Pro Ile Cys 210 215 220 tta ccc tta ccg acg gaa aga acc cca gtt ggc gaa aat cta ctt gtt 840 Leu Pro Leu Pro Thr Glu Arg Thr Pro Val Gly Glu Asn Leu Leu Val 225 230 235 240 gct ggt tgg ggc gcc acg gaa acc aaa gct cag agt gac aaa aaa cag 888 Ala Gly Trp Gly Ala Thr Glu Thr Lys Ala Gln Ser Asp Lys Lys Gln 245 250 255 aaa ctg aaa ctc ccc gtt act gat ctg cct gcc tgt aaa aca cta tat 936 Lys Leu Lys Leu Pro Val Thr Asp Leu Pro Ala Cys Lys Thr Leu Tyr 260 265 270 gct aaa cac aat aaa att att aat gat aaa atg att tgc gct ggc ggg 984 Ala Lys His Asn Lys Ile Ile Asn Asp Lys Met Ile Cys Ala Gly Gly 275 280 285 ttg aag ggt aaa gat tct tgc aaa ggt gac agt ggc gga cca ctg ttc 1032 Leu Lys Gly Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Phe 290 295 300 gga cag aca ggg gcc gga aat gca caa ttt tac atc gaa ggc ata gtg 1080 Gly Gln Thr Gly Ala Gly Asn Ala Gln Phe Tyr Ile Glu Gly Ile Val 305 310 315 320 tct tac ggc gca ata tgc ggt acc gaa gga ttc cct gct att tat act 1128 Ser Tyr Gly Ala Ile Cys Gly Thr Glu Gly Phe Pro Ala Ile Tyr Thr 325 330 335 aga gtt tcg gat cat cta gat tgg att aag caa aac gta aga gta 1173 Arg Val Ser Asp His Leu Asp Trp Ile Lys Gln Asn Val Arg Val 340 345 350 taatacg gaaagaattg cgactagatt taagtttaca tgtatattta aattatatat 1230 tttatatttg tatttttcaa tatatttaca taatactcgt tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa 1290 aaa 1293 <210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Holotrichia diomphalia <400> 2 Met Trp Leu Ser Leu Val Ile Leu Gly Val Ala Ser Ala Ile Val Asn 1 5 10 15 Val Ser Thr Gln Glu Ser Cys Thr Thr Pro Asn Gly Glu Thr Ala Thr 20 25 30 Cys Leu Pro Ile Glu Ser Cys Lys Ile Phe Trp Asp Tyr Val Val Thr 35 40 45 Ser Gly Ala Asp Pro Glu Ile Asn Ser Phe Leu Arg Ala Ser Leu Cys 50 55 60 Arg Gln Gly Asn Tyr Val Val Cys Cys Gly Ser Thr Leu Lys Phe Asn 65 70 75 80 Ser Ala Leu Pro Asp Arg Thr Glu Cys Gly Leu Gln Asp Asp Phe Lys 85 90 95 Val Leu Gly Gly Glu Asp Thr Asp Leu Gly Glu Tyr Pro Trp Met Ala 100 105 110 Leu Leu Gln Gln Thr Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ser Phe Gly Cys Gly 115 120 125 Gly Ser Leu Ile Ser Asp Arg Tyr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val 130 135 140 Val Ser Ser Ser Tyr Thr Val Thr Met Val Arg Leu Gly Glu Trp Asp 145 150 155 160 Leu Arg Ala Thr Gln Asp Cys Val Gly Ser Gly Ser Tyr Gln Tyr Cys 165 170 175 Ser Pro Pro Pro Gln Asp Ile Gly Ile Glu Ser Ile Thr Ser His Pro 180 185 190 Asn Tyr Glu Lys Ser Ser Arg Gly Val Phe Asn Asp Ile Ala Leu Ile 195 200 205 Arg Leu Ala Arg Pro Val Asn Arg Asn Lys Tyr Val Gln Pro Ile Cys 210 215 220 Leu Pro Leu Pro Thr Glu Arg Thr Pro Val Gly Glu Asn Leu Leu Val 225 230 235 240 Ala Gly Trp Gly Ala Thr Glu Thr Lys Ala Gln Ser Asp Lys Lys Gln 245 250 255 Lys Leu Lys Leu Pro Val Thr Asp Leu Pro Ala Cys Lys Thr Leu Tyr 260 265 270 Ala Lys His Asn Lys Ile Ile Asn Asp Lys Met Ile Cys Ala Gly Gly 275 280 285 Leu Lys Gly Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Phe 290 295 300 Gly Gln Thr Gly Ala Gly Asn Ala Gln Phe Tyr Ile Glu Gly Ile Val 305 310 315 320 Ser Tyr Gly Ala Ile Cys Gly Thr Glu Gly Phe Pro Ala Ile Tyr Thr 325 330 335 Arg Val Ser Asp His Leu Asp Trp Ile Lys Gln Asn Val Arg Val 340 345 350

Claims (6)

1. 서열번호 2의 아미노산 잔기 1-351로 이루어진 폴리펩타이드.
2. 서열번호 2의 아미노산 잔기 97-351로 이루어진 활성형 페놀옥시다제 활성화 인자인 폴리펩타이드.
3. 제 1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열번호 1의 121~1176염기로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 잔기 97-351로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
6. 제 1항 또는 2항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는, 베타-1,3-글루칸의 검출용 페놀옥시다제 조성물.