KR100321646B1

KR100321646B1 - 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질 및 그것의유

Info

Publication number: KR100321646B1
Application number: KR1019990026408A
Authority: KR
Inventors: 이복률; 이현승; 박종진; 홍승서; 이현수
Original assignee: 김일웅; 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 1999-06-28
Publication date: 2002-01-24
Also published as: KR20010005404A

Abstract

본 발명은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질 및 그것을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

Description

혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질 및 그것의 유전자{Cell clump/cell adhesion relating protein and gene coding the same}

모든 생명체들은 외부로부터 침입하는 병원균 등의 이물질에 대하여 자신을 방어할 수 있는 면역체계를 가지고 있는데 이들 면역 반응은 크게 선천적 면역 반응과 후천적 면역 반응으로 구분된다. 이 두 면역 반응의 주된 차이점은 체내에 침입한 이물질을 어떻게 인식하느냐에서 찾아볼 수 있는데, 후천적 면역 반응은 B나 T 림포사이트가 관여하여 침입한 이물질의 개별적인 부분을 인식하고 이후 Ig 등을 생성하는 분화되고 복잡한 면역 체계인 반면, 선천적 면역 반응은 미생물 세포벽에 공통적으로 존재하는 구성성분을 인식하여 작동되는 다소 비특이적이고 분화가 덜된 면역 체계이다. 그러나 후천적 면역 반응은 선천적 면역 반응에 비해병원(pathogen)이 침입한 경우와 자기-항원과 같이 면역 반응을 필요로 하지 않는 경우의 구별 능력이 부족한 것으로 알려져 왔는데, 최근 연구 결과 포유동물의 선천적 면역 반응이 후천적 면역반응인 B나 T 림포사이트의 항원 선택에 지도적인 역할을 한다는 사실이 보고되었다.

선천적 면역 반응만을 가지고 있는 초파리 등 몇몇 곤충의 면역 체계에서 척추동물과 비교 시 많은 유사점이 발견되면서, 곤충의 면역반응은 선천적 면역 반응 연구의 좋은 모델로 생각되어지고 있다. 곤충의 방어 반응은 크게 체액성 방어 반응과 세포성 방어 반응으로 나눌 수 있는데, 이들 중 많은 부분이 밝혀져 있는 것은 체액성 면역 반응으로, 각종 항균 단백질들의 유도, 멜라닌 생성 반응인 프로-페놀옥시데이즈 활성화 시스템, 혈액 응고 반응에 관한 연구들이 그것이다.

반면 세포성 면역 반응으로는 곤충의 체내로 크기가 작은 외부 이물질, 예를 들어 박테리아나 진균 등이 들어오면 파고사이토시스(phagocytosis)에 의해 제거되고, 세포보다 그 크기가 월등히 큰 이물질, 예를 들어 진균의 균사 기생충 등이 침입하는 경우 여러 개의 혈구세포가 주변을 완전히 둘러싸는 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응(encapsulation) 반응이 일어나게 된다. 이 인캡슐레이션 반응은 현미경적 관찰만 이루어져 있을 뿐, 분자 수준에서의 연구는 극히 미약한 상태이다.

사람을 포함한 척추동물은 병원성 세균이나 진균에 감염되면 폐혈증 쇼크가 유발되어 생명이 위험하다. 선천성 면역 반응은, 후천적 면역반응에 의해 유도되는 항체가 생성되기 전에 1차적 방어 반응으로, 세균이나 진균만이 가지고 있는 성분을 선택적으로 인식하여 결합하거나 제거함으로써 급성 감염을 방지하는 것이 특징이므로 선천적 면역 반응에 관여하는 방어물질들은 급성 감염증의 치료제 개발에 유용하다.

한편, 곤충에 진균이나 대장균이 침입하면 12 시간 이내에 선택적으로 멜라닌을 생성하는 프로-페놀옥시데이즈(pro-phenoloxidase) 활성화 반응이 일어난다고 알려져 있으나 아직 그 구체적인 기작은 규명되지 않았다. 프로-페놀옥시데이즈는 비자기(non-self)를 인식한 후 활성화되어 최종적으로 페놀옥시데이즈로 활성화된 후 페놀기를 가지는 타이로신 또는 DOPA를 기질로 하여 멜라닌을 형성한다고 알려져 있다. 이러한 프로-페놀옥시데이즈 활성 기작은 인켑슐레이션 반응과 서로 연관이 있을 것으로 보고되었다(Ratcliffe. N.A. 등, (1984) Science, 226, 557∼559). 이는 현미경적 관찰에 의존한 것으로 무척추 동물의 체내에서 멜라닌성 캡슐(melanotic capsule)이 발견되면서부터이다. 하지만, 그 분자 수준에서의 연구는 전혀 뒷받침 되어 있지 않은 상태이다.

본 발명은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

도 1은 시험관 내 시스템에서, 응집 및 혈구 흡착에 관여하는 단백질들의 존재를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 2는 72 kDa 단백질의 항체를 이용한 이뮤노블라팅 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 신규한 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질은 체내에 이물질이 들어왔을 때 그 이물질들을 응집(coagulation)시키는데 관여하며, 따라서 본 발명의 페놀옥시데이즈는 자기(self)와 비자기(non-self)를 선택적으로 구별인식하는 능력을 가진 단백질로서, 외부 이물질이 체내로 확산되지 않도록 외부 이물질 주위를 자신의 혈구를 이용하여 응집이나 흡착을 유도하는 작용을 가진 단백질과 유전자이다. 이러한 성질을 이용하여, 체내로 침입하는 진균이나 박테리아를 선택적으로 제거할 수 있으며, 극미량으로 존재하는 병원성 외부 이물질의 존재를 진단하는 진단시약 개발 등에 이용할 수 있다.

본 발명은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 프로-페놀옥시데이즈 또는 페놀옥시데이즈에 관한 것이다.

프로-페놀옥시데이즈 활성화 반응은 곤충의 체액에서 척추 동물에는 존재하지 않는 미량의 진균의 세포벽 성분인 베타-1,3-글루칸을 선택적으로 인식하는 단백질이 불활성 형태의 프로-페놀옥시데이즈를 활성 형태의 페놀옥시데이즈로 활성화시켜 멜라닌을 형성하는 특이한 시스템이다. 이러한 프로-페놀옥시데이즈는 미량의 베타-1,3-글루칸 인식 신호를 증폭시키는 케스케이드(cascade) 반응으로 활성화되므로 초기 진균감염 여부를 판단하는데 이용할 수 있다. 따라서 말기 암환자나 AIDS 환자에 가장 위험한 진균 감염을 초기에 진단할 수 있는 진단 시약 개발에 이용할 수 있다.

또한 프로-페놀옥시데이즈는 멜라닌 형성 기작에 관여한다고 알려져 있으므로, 본 발명의 단백질은 멜라닌 형성 억제 물질 탐색에 이용할 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

'아미노산 서열', '폴리펩타이드' 또는 '단백질'은 완전한 천연의 아미노산서열로 한정되는 것은 아니다.

'염기서열의 변이체'는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 프로-페놀옥시데이즈 유전자 서열 중 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기 서열을 의미한다.

'아미노산 서열의 변이체'는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 프로-페놀옥시데이즈의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.

'프로-페놀옥시데이즈 유전자 유도체'는 본 발명의 프로-페놀옥시데이즈를 코딩하는 염기 서열이 그것이 코딩하는 단백질의 생물학적 특성은 그대로 유지하면서 화학적으로 변형된 것을 의미한다.

본 발명은 서열번호 1에 표시된 프로-페놀옥시데이즈 유전자, 그것의 단편, 그것의 변이체, 그것의 유도체 및 이들의 대립형질적 변이체(alleric varient)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 프로-페놀옥시데이즈 유전자는 딱정벌레목(coleopteran) 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충으로부터 분리하였다.

또한 본 발명은 서열번호 2에 표시된 프로-페놀옥시데이즈, 그것의 단편, 그것의 변이체, 그것의 유도체에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 완충액의 조성은 다음과 같다.

곤충의 생리식염수(pH 6.0): NaCl 130 mM, KCl 5mM, CaCl₂1mM

항응고 완충액(pH 4.6): 트리소디움 사이트레이트 30mM, 시트린산 26 mM, NaCl 15 mM, EDTA 20 mM

용출 완충액(pH 6.5): 유레아 6M, 10% SDS 2 %, DTT 5 mM, 트리스 50 mM

항체 정제에 사용한 스킴 밀크 용액(pH 7.9): 20 mM Tris/HCl(pH 7.9) 50 ml에 스킴 밀크 2.5 g을 녹임.

항체 정제에 사용한 10× 세척완충액: Tris 100mM, EDTA 10mM, Triton X-100 1%, NaCl 1.5M

항체 정제에 사용한 세척완충액: 1× 세척 완충액 내에 스킴 밀크 0.5%, NaN₃2mM

TBS: Tris 20mM, NaCl 153mM

TTBS: Tris 20mM, NaCl 153mM, Tween 20 0.1%

IPTG 처리용 필터: IPTG 190.6mg, 3차 증류수 40ml

high-TBST 용액: 용액 600 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH7.9) 30ml, NaCl 5.25 g, 20% Tween 20 15ml, 3차 증류수 잔여량

low-TBST 용액: 용액 2L 내에, 1M Tris-HCl(pH 7.9) 20ml, NaCl 17.5 g, 20% Tween 20 5ml, 3차 증류수 잔여량

3 % 젤라틴 용액: 용액 1L 내에, 젤라틴 12g, 10% NaN₃800μl , low-TBST잔여량

1차 항혈청 용액: 정제된 항체 1.8ml, 3% 젤라틴 용액 1.8ml, E.coli 용혈물(1mg/ml) 54μl, 10% NaN₃54μl 3차 증류수 1.7ml

2차 항혈청 용액: 염소 항-토끼 IgG(H=L)-AP conjugated(Bio-Rad 사) 5μl용액 5ml 내에, 3% 젤라틴 용액 1.7ml

AP 완충액: 용액 300 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH 9.5) 30ml, NaCl 1.74g, 1M MgSO4 1.5ml, 3차 증류수 잔여량

발색반응액: AP 완충액 100 ml, 70% DMF 내의 50mg/ml NBT 1320μl, DMF 내의 50mg/ml BCIP 660μl

LB 액체 배지: 배지 1L 내에, NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 3차 증류수 잔여량

NZY 플레이트: NaCl 5g, MgSO4.7H2O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 15 g, 3차 증류수 1L; NZY 플레이트(탑 아가): NaCl 5g, MgSO4.7H2O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 7g, 3차 증류수 1L

SM 완충액: 용액 1L 내에, NaCl 5.8g, MgSO₄.7H₂O 2g, 1M Tris-HCl(pH 7.5) 50ml, 2% 젤라틴 5ml, 3차 증류수 잔여량

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질의 분리

탁정벌레목 갈색거저리 (Tenebrio molitor)의 유충을 얼음 위에서 마취시키고 표면을 70% 에탄올 닦은 후, 머리쪽 두번째 마디에 상처를 주어 체액을 마리 당 8 ㎕씩 취했다. 페트리 디쉬에 곤충의 생리식염수와 항응고 완충액를 각각 100 ㎕씩 넣고, 각 페트리 디쉬에 위의 방법으로 즉석에서 채취한 체액 80 ㎕를 현탁시켰다. 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응이 충분히 일어나도록 실온에서 20분간 반응시킨 후 상등액을 제거하고 항응고 완충액으로 페트리 디쉬 표면을 2회 세척하였다. 광학현미경을 통하여, 갈색거저리 체액을 첨가한 페트리디쉬에서만 관찰되는 단백질이 존재함을 관찰하였다.

용출 완충액 200 ㎕으로 각 페트리 디쉬 표면으로부터 단백질을 회수하고, 3차 증류수 1 ㎖로 희석한 후 100% TCA를 시료 부피의 10 % 만큼의 가하여 4。C에서 30분 동안 반응시켜 단백질만 침전시켰다. 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 잔사는 냉각 아세톤으로 세척한 후, 다시 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 침전물을 건조시켜 2 % 2-멀캡토에탄올을 가하여 환원시킨 후 75。C에서 20분간 열처리하고, 12 % SDS-PAGE하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에서 래인 1은 곤충 체액을 TCA 침전시킨 것이고, 래인 2는 곤충의 생리식염수를 첨가한 페트리 디쉬 표면에서 얻어진 단백질이고, 래인 3은 곤충의 생리식염수를 첨가한 반응 상등액이고, 래인 4는 항응고 완충액을 첨가한 페트리 디쉬 표면에서 얻어진 단백질이고, 래인 5는 항응고 완충액을 첨가한 반응 상등액이고, 래인 6은 정제된 72 kDa 단백질이다. 곤충의 생리식염수를 첨가한 페트리 디쉬 표면에서 얻은 시료에서만 검출되는 단백질들이 존재하며, 특히 72 kDa 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 현상에 관여하는 단백질이 다량 존재함이 확인되었다.

SDS-PAGE 젤로부터 72 kDa 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 현상에 관여하는 단백질 밴드를 분리하여 일렉트로일루션(electroelution)에 의해 단일 단백질을 용출시켜 얻었다.

순수하게 분리 정제된 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 현상 관련 단백질들은 부분 아미노산 서열을 결정하기 위해 시료 30 ㎍을 함유하는 용액에 동일 용량의 8 M 유레아를 함유하는 0.4 M NH₄HCO₃완충액을 가하여 녹이고, 전체 용량의 10 %에 해당하는 양의 45 mM DTT 용액을 가하여 50 ℃에서 15분간 반응시켜 환원시킨 후, 전체 용량의 10 %에 해당하는 양의 100 mM 요도아세트아민 용액을 가하여 실온에서 15분간 반응시켜서 환원된 시스테인 잔기를 알킬화시켰다. 이를 10 % TCA 침전법으로 침전시키고, 얻어진 단백질 잔사를 8 M 유레아를 함유하는 0.4 M NH₄HCO₃완충액으로 녹인 후, 트립신 2 ㎍을 가하여 37 ℃에서 13시간 반응시켜 단편화하였다. 단편화시킨 단백질들은 C18 역상 HPLC column (chemcosorb 5-ODS-H 2.1×150/W 11660)를 이용하여 선형 농도구배 시스템[A; 0 % CH₃CN in 0.06 % TFA, B; 80 % CH₃CN in 0.052 % TFA]하에서 90분 동안 B용매가 90 %까지 증가되도록 하면서 1분당 0.2 ml의 유속으로 단편화된 단백질을 분리한 후, 에드만 분해법으로 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

분리 정제된 단백질들의 N-말단을 결정하기 위해 12 % SDS-PAGE를 실시한 후 전이 완충액 내에서 75 mA의 일정한 전류로 18시간 전기영동을 수행하여, 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 전이시켰다. 멤브레인을 코마시에 브릴리언트 블루(CBB) 염색용액(0.1 % CBB R-250, 50 % 메탄올)으로 염색하고, 탈색완충액(50 % 메탄올, 10 % 아세트산)으로 탈색시킨 후 물로 수회 세척한 후 감압 건조시켰다. 단백질 밴드만 잘라서 자동 아미노산 서열측정기를 이용하여 아미노산 서열을 결정하였다.

N-말단 아미노산 서열

F G E D A D E R I D V K K I S

부분 아미노산 서열

E Q A T V V P E G S

Y T E N Q L N F P G V T V S

P Q G G E E L A Q F N F

실시예 2. 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 단백질의 항체 제조

혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 관련 단백질의 폴리클로날 항체를 제조하기 위해, 먼저, 토끼 (백색, 숫컷, 2.7 kg)의 귀정맥으로부터 항체가 생성되기 전의 혈액을 1 ml 채취하고, 37 ℃에서 1시간 방치하여 완전히 혈액응고를 유도한 후 원심분리하여 혈청만 모아 -80。C에 보관하였다. 실시예 1에서 얻은 단백질 20μg을 동량의 완전 어드쥬번트로 현탁시켜 토끼 등에 두 군데로 나누어 피하주사하고, 일주일 간격으로 3회에 걸쳐 동량의 단백질을 동량의 불완전 어드쥬번트와 현탁시켜같은 방법으로 피하주사하였다. 최종 접종 3일 후 귀정맥 및 심장으로부터 혈액을 채취하고 원심분리하여 혈청만을 모아 -80 ℃에 보관하였다.

항체의 정제를 위해, 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 관련 단백질을 10 % SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 멤브레인에 전이시킨 후 각 단백질 밴드를 잘라 5% 스킴 밀크 용액과 12 시간 반응시킨 후 세척 용액으로 세척하고, 앞서 토끼로부터 얻은 항 혈청 2배 희석액과 하룻밤 반응시켰다. 다시 세척 용액으로 세척하고, 0.2 M Glycine/HCl (pH 2.8)로 용출시킨 즉시 1 M KOH로 pH를 7.4까지 중화시켜 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 관련 단백질의 항체를 모아 -80 ℃에 분취 보관하였다.

실시예 1에서 시험관 내 시스템에서 얻은 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 관련 단백질들을 환원 조건으로 10 % SDS-PAGE상에서 분리하고, 전이 완충액 내에서 280 mA로 4 ℃에서 4시간 동안 반응시켜 PVDF 멤브레인에 전이시켰다. 이 멤브레인을 TBS로 세척하고, 5 % 스킴 밀크와 1 % 말 혈청(horse serum)을 함유하는 TBS와 4 ℃에서 하룻밤 진탕 배양함으로써 비특이적 반응을 차단시킨 후, 분리한 항혈청을 2.5 % 스킴 밀크를 함유하는 TTBS로 100배 희석한 용액과 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. TTBS로 5회 세척하고, 2차 항체(항-토끼 Ig. 서양고추냉이 퍼옥시데이즈가 링크된 당나귀 총 항체)를 TTBS로 100배 희석한 용액과 실온에서 30분간 반응시킨 후 다시 TTBS로 5회 세척하였다. Semi-dark 조건에서 ECL blot을 1분간 실시하여 발생된 형광을 필름에 감광시켰다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 이 항체는 72 kDa 단백질 및 본 발명자에 의해 그것의 전구체로 밝혀진 76 kDa 단백질만을 선택적으로 인식하였다.

실시예 3. 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 관련 단백질의 cDNA 분리

이뮤노스크리닝 방법에 의해, 실시예 1에서 확인된 72 kDa 단백질의 cDNA를 분리하였다.

XL-1-Blue을 LB 배지 5 ml, 20 % 말토오스 50 ㎕, 1 M-MgSO₄50 ㎕의 혼합액에서 37。C에서 진탕 배양하여 회수한 균 침전물에 10 mM-MgSO₄을 가하여 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 조정하였다. Moon et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo)116, 53∼58에 기재된 방법에 따라 갈색 거저리 유충의 cDNA 라이브러리를 만들었다. cDNA 라이브러리 용액에 XL-1-Blue 200 ㎕를 가하여 37。C에서 15분간 진탕 배양한 후, 48 ℃로 예열된 3.5 ml의 탑 아가(top agar)와 혼합하여 그 액을 NZY 플레이트에 도포시켰다. 42。C에서 4시간 배양한 후 IPTG가 처리된 필터를 플레이트 위에 조심스럽게 덮고 다시 37。C에서 8시간 더 배양하였다. 반응이 종결되면 4 ℃에서 20분간 방치한 후 필터를 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 필터를 high-TBST 용액으로 실온에서 10분간 세척시킨 후, 이어 low-TBST 용액으로 실온에서 10분씩 두 차례 더 세척하였다. 세척된 필터는 완전히 물기를 제거한 후 3 % 젤라틴 용액에 넣어 30분간 27。C에서 블라킹시킨 다음, 필터의 물기를 제거하여 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응 단백질의 항체 용액과 2.5시간 동안 27 ℃에서 반응시켰다. 반응시간이 끝나면 필터를 low-TBST 용액으로 세 차례 세척한 후 2차 항체 용액에서 27 ℃에서 30분간 반응시켰다. 이 필터는 low-TBST 용액으로 세 차례 세척시킨 후 발색 반응을 수행하였다.

앞에서 제조된 필터를 AP 완충액 100ml에 50mg/ml NBT(나이트로블루 테트라졸리움 클로라이드, Bio-rad 170-6532) 1320 μl과 50 mg/ml BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트-p-톨루이딘염 Bio-rad 170-6539) 660 μl을 첨가한 발색 반응액에 담궈 발색시킨 후 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 주변과 뚜렷이 구별되어 보라색을 띄는 클론을 1차 양성 클론으로 판정하였다. 1차 양성 클론을 LB 액체 배지로 적당히 희석하여, 100개에서 200개 정도의 플라크가 생성될 것으로 예상되는 양에 XL-1-Blue (OD₆₀₀=0.5) 200 ㎕를 가하여 37。C에서 15분간 진탕 배양하였다. 여기에 예열된 3 ml의 탑 아가를 가하여 NZY 플레이트에 도포하고, 이후 실험은 1차 선별과 동일하게 실시하여 양성 클론을 2차로 선별하였다.

XL-1-Blue (OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕와 2차 선별 결과 확인된 양성 플라크 용액 (2×10⁵phage) 200 ㎕, ExAssist 헬퍼 파지 1 ㎕를 50 ml 팰콘 튜브에 넣고 37 ℃에서 15분간 배양한 후 3 ml의 LB 액체 배지를 가하고 37 ℃에서 3시간 진탕 배양시킨 다음 70 ℃에서 다시 20분간 열처리하였다. 열처리된 액을 1,000×g에서 15분간 원심분리시켜 그 상등액을 15 ml 팰콘 튜브에 취하여 4 ℃에 보관하였다.

SOLAR 세포(OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕에 LB 액체 배지로 10배 희석한 파지미드를 각각 2 ㎕, 10 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후 이들 중 50 ㎕를 취하여 LB/앰피실린 플레이트에 도말하였다. XL-1-Blue pBluescript는 앰피실린 내성 유전자를 포함하며 숙주세포인 SOLAR 세포는 앰피실린 내성이 없으므로, 앞에서 얻은 파지미드가 형질전환된 SOLAR 세포만이 앰피실린이 첨가된 배지에서 자란다. 37℃에서 12시간 배양한 후 단일 콜로니를 취하여 50 ml 팰콘 튜브 상에 LB 액체 배지 5 ml과 앰피실린(50 mg/ml) 10 ㎕를 넣고 37 ℃에서 12시간 배양하였다. DNA 정제 키트(Promega, wizard plus sv minipreps)을 이용하여 76kDa의 유전자가 삽입된 플라즈미드를 분리 정제했다.

얻어진 플라즈미드 서열은 시판되는 DNA 시퀀싱 키트(Perkin Elmer, Rhodamine terminator cycle sequencing ready reaction)을 사용하여 분석하였다. 3'-말단과 5'-말단에서부터 아래에 기입된 프라이머들을 이용하여 각각의 완전한 염기 서열을 분석한 후, 두 분석 결과를 비교하여 검증하였다(서열번호 1). 염기 서열로부터 단백질 서열을 추론하였다(서열번호 2). 얻어진 유전자는 684 개의 아미노산에 해당하는 2052 개 누클레오타이드의 오픈 리딩 플레임을 가지고 있고, 실시예 1에서 결정된 N-말단 아미노산 서열 및 3 종의 부분 아미노산 서열이 존재함을 확인하였다. 오픈 리딩 플레임의 51 번 위치(Phe)에서 혈구 응집 또는 혈구 흡착 반응에 관여하는 72 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 관찰할 수 있었다.

National center for biotechnology information (NCBI)의 단백질 서열 데이타베이스를 통해 호몰로지를 조사하였다. 다른 무척추 동물에서 알려진 프로-페놀옥시데이즈들과 높은 유사성을 보였으며, 또한 다른 프로-페놀옥시데이즈와 높은 유사성을 가진 구리 결합 자리를 가지고 있었다. 또, 프로-페놀옥시데이즈의 RFGE 서열 모티프에서 제한적인 단백질분해(limited proteolysis)가 일어남으로써 활성형인 페놀옥시데이즈가 생성된다는 사실이 알려져 있는데, 72 kDa 단백질의 N-말단아미노산 서열을 살펴본 결과 동일한 RFGE 서열 모티프를 가지고 있고 동일한 위치에서 잘리는 것을 발견할 수 있었다. 이로서 앞서 얻은 DNA 유전자는 갈색 거저리의 프로-페놀옥시데이즈의 유전자이고, 76 kDa 단백질은 비활성형인 프로-페놀옥시데이즈이며, 72 kDa 단백질은 활성형인 페놀옥시데이즈임을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 단백질 및 그것의 유전자는 진균 감염증 진단에 유효한 물질을 스크리닝할 수 있으며, 급성 감염증의 감염 진단제 개발에 유용하다. 또, 멜라닌 생성 기작을 규명할 수 있게 되어 멜라닌 생성 억제 물질을 스크리닝하는데 이용할 수 있다.

Claims

서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 유전자.
서열번호 1의 염기 번호 209 ~ 2185의 DNA 서열을 포함하는 유전자.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열 51 ~ 684의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 2의 아미노산 서열 51 ~ 684의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 2의 아미노산 서열 51 ~ 684의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 감염진단제.