KR100290746B1 - 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 그램음성균에 선택적으로 항균활성을 갖는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 항균활성을 가지는 물질로서 의약 및 생활용품의 첨가제로 개발될 수 있을 것이다.

Description

폴리펩타이드

제1도는 1차 C₁₈역상 open cloumn으로 용출한 결과이다.

제2도는 2차 C₁₈역상 open cloumn으로 용출한 결과이다.

본 발명은 항균성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 그람음성균에 선택적으로 항균활성을 갖는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

일반적으로 열악한 환경조건에서 많은 곤충들이 개체를 방어하기 위하여는 외부에서 이물질이 도입되거나, 병원성균이 침입하거나, 상처를 입을때 자신을 방어하기 위하여 생체방어 물질을 분비하는 것으로 알려져 있다. [참조 : Ann. Rev. Microbiol., 41 : 103-26(1987)]. 이러한 항생물질로서는 개구리의 표피에서의 항균성 폴리펩타이드인 마게이닌(magainin)외에도 세크로핀, 사르코톡신 등 항균작용이 있는 다수의 폴리펩타이드(Biochemical Pharmacology, No. 4, 39:625-629 (1990) 및 사코파가 페레그리나(Sarcophaga peregrina)의 배(embryo)로부터 확립된 세포주로부터 분리된 항바이러스성 폴리펩타이드 (미국 특허 제 5008371호) 등이 보고되고 있다.

한편, 본 발명의 발명자는 탁정벌레 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충에 외부에서 이물질이 주입될 때 체액으로 분비되는 항생활성을 가지는 폴리펩타이드를 분리, 정제하여 아미노산 서열을 확인한 결과 신규한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 폴리펩타이드는 열에 안정하고, 특히 그램 음성(Gram negative) 균에 탁월한 항균성을 가지고 있으며, 베로 세포(Vero cell)에 대하여 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 본 발명자는 이미 갈색거저리의 유충으로 부터 그램양성균에 탁월한 항균성을 가지는 폴리펩타이드(테네신 1이라 칭함)을 발명한 바 있다.

본 발명의 항균성 폴리펩타이드 아미노산 서열을 아래와 같다.

본 발명에 의한 신규 폴리펩타이드는 자연산 또는 배양한 갈색 거저리의 유충에 대장균(E.coli) K12를 주사한 후 채취한 체액으로 부터 분리, 정제하였으며, 본 발명에서는 ‘테네신(Tenecin) 2’라 명명되었다.

본 발명의 신규 폴리펩타이드는 통상적으로 갈색거저리의 유충으로부터 분리, 정제하거나, 펩타이드 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. (J.Chem.Soc., 85:2149-2154 (1963) ; Nature, 310:105-111 (1984))

본 발명에 의한 신규 폴리펩타이드는 탁월한 항균활성을 나타내었는데, 분리한 폴리펩타이드계 생물학적 활성물질의 활성도는 세균에 대하여 최저 억제 농도(MIC)를 측정하여 확인하였으며, 또한 이 폴리펩타이드를 50, 25, 12.5,... 0.78ug/ml 까지 희석하여 베로 세포와 혼합하여 3일간 배양한 후, 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 대조군의 세포와 비교한 결과 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 폴리펩타이드는 사람 또는 그 외의 동물에 바람직하게 사용되어질 수 있다. 항균효과를 나타낼 수 있는 충분한 양의 유효 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 비독성 완충용액 또는 생리식염수등과 같은 비독성 약리학적 기초제 및 담체 등과 조합하여 다양한 조성물의 형태로 사용되어질 수 있으며, 그 대표적인 투여형태로서는 액체, 고체, 연고제, 주사용제, 정제, 로션제 및 캡슐제 등 경구 또는 비경구로 어느 것이나 사용되어질 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 극한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[폴라펩타이드의 분리 정제]

자연산 또는 배양한 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충 4,000 내지 5,000마리에 대장균(E.coli) K12(10³내지 10⁴세포)를 마이크로시린지(microsyringe)로 취하여 주사하고, 24시간 방치하고 유충으로부터 체액 및 체세포를 채취하였다. 이 액을 4℃에서 15,000rpm으로 원심분리하여 체액만을 신속히 분리하고 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 이들 조추출한 체액을 실시예 4에 개시된 콜로니계수법으로 항균력을 측정하여 항균력이 있는 체액에 대하여만 분리, 정제에 사용하였다. 이렇게 채취한 체액 100ml를 아래 표 1과 같은 조성의 완충액 1(pH6.0)에 10배 희석한 후 4℃에서 신속하게 여과하였다.

[표 1]

50ml씩 모은 플라스틱제 튜브를 100℃의 끊는 물속에서 15분간 열처리하여, 4℃에서 24시간동안 방치시키고, 3,000rpm에서 원심 분리하여 그 여액을 취하였다. 항균력이 있는 단백질을 단일물질로 분리 정제하기 위하여, 열처리한 여액을 1차 C₁₈역상 open 컬럼 (Waters사 resin, 0.7 X 31cm)에 로딩한 후 직선구배 시스템 (A: 5% CH₃CN in 0.05% TFA, B:45% CH₃CN in 0.05% TFA)으로 용출하여 각 분획에 대하여 280nm에서 흡광도를 측정하고, 항균력을 측정하였다. 용출한(5ml) 결과를 제1도에 도시하였고, 이렇게 얻어진 항균력이 있는 폴리펩타이드를 2차 C₁₈역상 컬럼으로 상기와 동일한 조건으로 처리하여 용출한 결과를 제2도에 나타내었다.

그후, C₁₈역상 컬럼 (TSK gel, ODS-120 T, 0.5% X 30cm, Toyosoda, JAPAN)에 직선구배 (유속 : 1ml/분, A : 5% CH₃CN in 0.05% TFA, B:90% CH₃CN in 0.05% TFA)로 항균활성이 있는 활성분획만을 취하였다. 이와 같이 얻은 항균성 폴리펩타이드 분획을 더욱 순수하게 분리, 정제하기 위하여 겔여과 컬럼(TSK gel, G300SW, 1 X 30cm, Toyosoda, JAPAN)에 아이소크래틱 시스템(isocratic system, 유속 : 0.5ml/1 분, 30% CH₃CN in 0.05% TFA)으로 폴리펩타이드를 분리, 정제하였다.

[실시예 2]

[아미노산 서열의 결정]

실시예 1에서 단일 물질로 동정된 항균성 폴리펩타이드의 부분 아미노산을 결정하기 위하여, 라이신 특이적 가수분해효소(endopeptidase Lys-C, Sigma, U.S.A.)를 50mM-Tris HCl(pH 9.0)용액중에 1nmol의 항균 단백질과 0.025ug/ul 농도가 되도록 전기 효소를 가하고 30℃에서 19시간 배양 후 반응액을 C₁₈역상 컬럼(Synchrion Inc., Synchropack, 0.5 X 30cm)으로 직선 구배 (A : 0% CH₃CN in 0.05% TFA ;B: 100% CH₃CN in 0.05% TFA)로 단편화된 펩타이드를 분취하였다. 동일한 방법으로 1nmol의 테네신2를 50mM sodium phosphate buffer (pH8.0)에 녹인후 0.5ug의 endoproteinase Asp-N을 가하여 37℃에서 18시간 배양한 후 C₁₈역상 columm으로 분리하였다.

이렇게 얻은 펩타이드 단편을 동결건조시킨 후, 자동 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems, 470A, U.S.A.)로부터 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

표 1에서 endoproteinase Lys-C 및 endoproteinase Asp-N로 테네신 2를 처리한 후 얻어진 단편들의 아미노산 서열을 나타내었다.

[표 1]

표 1에서 얻어진 부분 아미노산 서열을 기초로 하여 테네신 2의 전아미노산 서열을 결정할수 있었던 근거를 표 2에 나타내고 있다. 먼저 테네신 2의 아미노산 말단을 결정하기 위하여 Proteinase를 처리하지 않은 테네신2의 아미노산서열을 결정한 결과 표 1에서 N-말단 펩타이드로 표시하였다. endoproteinase Lys-C로 얻어진 4개의 단편(Lys-1, Lys-2, Lys-3, Lys-4)의 아미노산 서열결과중 Lys-2가 아미노 말단의 아미노산을 포함하는 것을 알수 있었다.

그외의 3개의 단편의 아미노산 서열의 위치는 endoproteinase Asp-N으로 얻어진 3개 (Asp-1, Asp-2, Asp-3) 단편의 아미노산서열과 비교함으로써 완전히 결정할 수 있었다. 먼저 Asp-1 펩타이드가 역시 아미노 말단의 아미노산 서열을 포함하고 있음을 알수 있었다. ASP-2의 아미노산 서열은 Lys-1의 끝부분을 포함하는 사실로 부터 Lys-2의 위치를 결정할수 있었고, Asp-3단편의 아미노산 서열로써 Lys-3 및 Lys-4의 위치를 결정하여 테네신2의 전아미노산 서열을 결정하였다.

[표 2]

[실시예 3]

[항균성 및 세포독성 확인]

탁정벌레로부터 분리한 테네신 2의 항균성 폴리펩타이드 활성을 측정하기 위하여, 항균활성을 콜로니 계수법과 분광법으로 측정하였다.

(1) 콜로니 계수법에 의한 항균성 측정

대장균 (E,coli) K-12및 스타필로코커스 어레우스(S. aureus) 285 균을 M-3 배지에서 대수기 (log phase, 2 x 10⁸) 까지 배양시킨 후, 그 액을 1ml 취하여 8,000RPM(4℃)에서 5분간 원심분리시켰다. 균을 K- 완충액(pH 7.0, 1M-인산칼륨완충액용액 3ml, NaCl 0.35g, 증류수 100ml)에 현탁시킨 후, 그 액 100ul을 K-완충액용 900ul으로 희석시킨다. (세포주: 2 X 10⁷)그런다음, 이 액 200ul를 취하여 유충의 체액 200ul를 가하여 37℃에서 1시간 배양시키고, 다시 10ul를 취하여 100배 희석시켜 아가 플레이트에 도말하였다. (최종 500 콜로니) 이 플레이트를 37℃에서 18시간 배양시킨 후 대조구(500 콜로니 전후) 플레이트와 감소되는 콜로니수를 비교하여 항균력 시험을 하였다.

(2) 분광법

M-3 아가 플레이트에서 배양한 대장균 K-12 및 스타필로코커스 어레우스 285 균의 단일 콜로니를 취하여 37℃에서 3시간 배양하여 균이 대수기 (세포수:2 X 10⁸)에 도달한 액 1ml를 취하여 8,000rpm(4℃) 에서 원심분리하여 균을 수확하였다. 수확한 균을 전기 K- 완충용액에 현탁한 후 650nm에서 흡광도를 측정하여 0.3이 되도록 조정하고, 이 액 3ml와 M-3배지 27ml를 가하여 보관용액 (stock solution)을 제조한다. 이 보관용액 200ul와 S-BSA 완충용액 (Na H₂PO₄2H₂O 6.84g, Na₂HPO₄12H₂O 2.22g, NaCl 38g, 증류수, 953ml, BSA 분획 0.2g) 및 컬럼으로 분리한 각 분획 120ul를 실리콘으로 코팅한 시험관에 가하고 37℃에서 3시간 배양시켰다.

배양후 K-완충용액을 표준액으로하여 650nm에서 흡광도를 측정하여 항균력 시험을 하였다. 사용한 균주는 8종류 사용하여 항균력을 측정한 결과를 얻었다. 측정 방법은 agar dilution법으로 실시하였고, 사용한 medium은 Mueller Hinton Agar을, inoculum size는 10⁷colony forming unit/ml 되도록 하였고, 37℃에서 18시간 배양하여 생성된 colony수로 항균력을 판정하였다.

[표 2]

[실시예 4]

[분리된 단백질의 세포 독성실험]

분리된 단백질의 세포 독성을 측정할 목적으로 vero 세포에 독성을 측정하였다. 테네신 2를 50ug/ml, 25ug/m, 12.5ug/ml,--0.78ug/ml 까지 희석시켜 vero 세포와 혼합하여 3일간 배양한 후, trypen blue로 염색하여 대조군의 세포와 비교한 결과 세포독성이 없음을 관찰하였다.

Claims (2)

1. 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 갈색거저리(Tenebrio moliter)로 부터 분리된 것을 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.