CN101928740B

CN101928740B - Mmp14双靶点高效结合肽及多肽结构序列的获取和用途

Info

Publication number: CN101928740B
Application number: CN 200910167829
Authority: CN
Inventors: 茆灿泉; 黄敬双; 梁志娟
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN101928740A

Abstract

本发明公开了一种MMP14双靶点高效结合肽及多肽结构序列的获取方法和目标物的用途。从MMP14蛋白诱导表达的人成骨肉瘤MG63细胞中筛选和获得一组新型的双靶点MMP14和Zn²⁺的多肽，包括：基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的噬菌体随机十二肽库体外消减筛选，经3-5轮筛选，获得富集的双靶向MMP14和Zn²⁺的结合肽噬菌体和多肽结构序列。目标物作为先导分子用于疾病治疗药物研发和用于肿瘤诊断，还可用于蛋白质分离纯化、分子标签以及重金属污染生物修复、采矿等。

Description

MMP14双靶点高效结合肽及多肽结构序列的获取和用途

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域。尤其是MMP14高效结合肽和确认的MMP14分子作用靶点目标物的获取和应用。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类生命和健康的疾病，寻求肿瘤早期诊断和有效预防治疗的方法和药物一直是生命科学家们追求的目标。在肿瘤相关的各类重要靶蛋白中，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。

MMPs是一类Zn²⁺依赖的内切蛋白酶家族，与肿瘤细胞侵袭、转移相关的细胞外基质(ECM)降解过程密切相关。研究表明，恶性肿瘤细胞的侵袭和转移与肿瘤细胞及基质诱导产生的MMPs水平呈正相关，MMPs在肿瘤侵袭、转移中起着重要的作用。获得高效MMPs结合肽、深入研究MMPs结合肽与肿瘤抑制的关系，对肿瘤的预防和治疗，具有重要的意义和价值。

由于MMPs与肿瘤的发生、增殖和血管生成密切相关，近20年来基于MMPs靶点的多种抗肿瘤药物先后进入临床研究，也取得了较好的成效。但也面临很多的问题，其中之一就是药物副作用大、选择性差。人工合成的不同类型的MMPs抑制剂治疗肿瘤，临床使用效果并不理想，其中的一个重要原因是因为这些抑制剂具有广谱的特异性，不仅抑制了靶酶，也抑制了一些有益酶。

MMP14是MMPs家族中重要的一员，与pro-MMP2结合进一步激活MMP2，本身降解ECM成分，被认为是MMPs家族中与肿瘤侵袭关系最密切的酶，成为抗肿瘤药物的新靶标。随着MMP14调节的多向机制逐渐被揭示，发现其复杂的调控系统可能与它在不同情况下的功能有关，阻断MMP14多向调节机制中的某一环节，可能是一种调控MMP14活性的有效方式，而这种方法在体内将更具有酶特异性和组织特异性。

MMP14以膜蛋白的形式表达在细胞膜表面，一方面可以在细胞表面直接进行筛选，同时相对于其它MMPs，这种方法筛选获得的结合多肽可望更接近于内源性的抑制剂，用于治疗则可能副作用更小，疗效更好。

双及多靶点药物的发现和设计一直是药物研发的热点，本发明利用MMP14含Zn²⁺和细胞表面表达的特点消减筛选和获得一组双靶点MMP14和Zn²⁺的新型多肽序列，并发现其在MMP14上的分子对接位点，可望用于基于MMPs靶点的肿瘤先导药物研发、诊断及蛋白亲和纯化应用等领域，目前国内外尚无相关文献报道。

发明内容

鉴于现有技术的如上缺点或不足，本发明的目的在于研究一种MMP14双靶点高效结合肽及多肽结构序列的获取途径，采用如下的方法：

MP14双靶点高效结合肽及多肽结构序列的获取方法，从MMP14 蛋白诱导表达的人成骨肉瘤MG63细胞表面筛选和获得一组新型的双靶点MMP14和Zn²⁺的多肽，包括：基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的噬菌体随机十二肽库体外消减筛选，通过“吸附-消减-吸附-洗脱-扩增”的循环筛选获得富集噬菌体，经3-5轮筛选，将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板，挑取单克隆噬菌体制备ssDNA并测序。

本发明的目的还在于，所获得结合肽及多肽结构序列在作为先导分子用于疾病治疗药物研发和用于肿瘤诊断，以及用于蛋白质分离纯化、分子标签以及重金属污染生物修复、采矿等方面的用途。

采用本发明的技术内容，从MMP14蛋白诱导表达的人成骨肉瘤MG63细胞表面筛选和获得一组新型的双靶点MMP14和Zn²⁺的多肽序列，序列含A-H-Q/_s-L-H/_P、P-E/_Q-P-L、A-L-H/_R-H-H/_T-H、L/_I/_E-P-L-L、P-X-P、H-H-X-H、M-P-K-S、M-K-P-S等多肽结构序列，并与MMP14、MMP15等蛋白的重要结构域His-Asn-Glu、Asn-His-His良好对接，对MG63细胞增殖有较好的抑制生长作用。本发明所获得的全序列或多肽结构序列可望作为先导分子用于疾病治疗药物的研发和用于肿瘤等疾病的诊断以及蛋白质分离纯化、分子标签以及重金属污染修复、采矿等领域。

附图说明如下

图1是MG63细胞消减筛选的噬菌体富集图。

图2是MMP14结合肽结构序列分析图。

图3是MTT法测定合成多肽对MG-63细胞抑制作用效果图。

表1是富集测定的结合肽序列。

表2是单克隆结合肽噬菌体针对Zn²⁺Ni²⁺的亲和力测定。

具体实施方式

本发明建立了基于细胞消减技术的双靶点MMP14和Zn²⁺高效结合多肽的筛选方法，并获得一组新型的双靶向MMP14和Zn²⁺的高效结合多肽和多肽结构序列，更且确定了其在MMP14上的分子对接靶点。本发明通过如下思路和途径实现了双靶点MMP14和Zn²⁺高效结合多肽和多肽结构序列的获得及用途：1)有效利用MMP14的细胞表面膜蛋白和诱导大量表达的特性；2)利用全细胞消减筛选技术进行靶向MMP14的噬菌体随机肽库筛选和小分子结合多肽的获得，共获得25条不同的目的序列；3)通过生物信息分析和序列比对、分子对接等计算机辅助药物设计确认筛选获得的序列的原始创新性、重要多肽结构序列以及MMP14上分子对接的目标靶点；确认AHQ/_sLH/_P、PE/_QPL、L/_I/_EPLL、ALH/_RHH/_TH、PXP、HHXH、MPKS(MKPS)等多条多肽结构序列，并发现其在MMP14上的分子对接靶点是His-Asn-Glu，在MMP15上的分子对接靶点是Asn-His-His；4)采用亲和力反筛测定、免疫荧光、金属螯合树脂亲和测定、MTT生物学活性测定等方法确认筛选得到的多肽对双靶点MMP14和Zn²⁺等金属离子的较高亲和力和专一性以及对MG63肿瘤细胞增殖的抑制作用；5)所述结合肽及所含多肽结构序列的其它用途。I，用于蛋白质分离纯化：利用结合肽及所含结构序列对Zn²⁺、Ni²⁺等金属离子的亲和力，可如同现有商品化的6×组氨酸的作用方式，将其构建于蛋白质融合表达载体中，用于基于金属螯合树脂的蛋白质亲和纯化分离；II，用作分子标签：如同现有商品化的6×组氨酸的分子标签方式，将其构建于蛋白质表达载体中，通过Western等免疫检测方法，用于蛋白质表达的测定；III，用于重金属污染的生物修复、采矿：利用结合肽及所含结构序列对Zn²⁺、Ni²⁺等重金属离子的亲和力，通过基因工程方法将其重组和展示在生物体(微生物(细菌、酵母、噬菌体等)、植物细胞的表面，用于重金属的吸附修复或矿区重金属离子的吸附分离采矿。下面结合实例，对本发明作进一步的描述，但其不代表为本发明的唯一实施方式。为了实现以上目的，本发明共采用三种技术手段。1)基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的细胞消减筛选技术和方法；2)靶向结合肽序列的确定、分析及分子对接；3)双靶向单克隆结合肽噬菌体的生物学特性等测定。

(一)基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的细胞消减筛选技术和方法

1.MG63细胞的复苏培养以及雌二醇诱导的MMP14细胞表面大量表达。

2.MMP14表达的免疫荧光检测：

a.雌二醇诱导MG63细胞大量表达MMP14；

b.多聚甲醛固定；

c.PBS洗2×1min；山羊血清封闭，室温孵育20min；

d.滴加兔抗MMP14抗体，轻微振摇过夜；

e.PBS洗3×2min，滴加二抗鼠抗兔IgG，轻微振摇孵育30min；

f.PBS洗3×2min，加入SABC-FITC复合物，轻微振摇孵育30min；

g.PBS洗4×5min；

h.荧光显微镜观察发现大量MMP14的诱导表达。

3.基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的噬菌体随机十二肽库体外消减筛选

a.MG63细胞的6孔板培养；

b.换1％FBS、DMEM的培养；

c.换含0.25％BSA的DMEM的培养；

d.预冷的PBS洗两次，除去残余液体；

e.噬菌体十二肽库加至培养有细胞的6孔板孔内，4℃振摇孵育1.5h；

f.4℃预冷的PBS洗板，收集所有未结合噬菌体；

g.4℃预冷Gly-HCl缓冲液洗脱，Tris-HCl中和洗脱液；

h.测定步骤f的未结合噬菌体(记为D)，步骤g的洗脱噬菌体(记为T)滴度，并扩增，测定扩增后噬菌体滴度；

i.重复步骤a-d，培养MG63细胞，雌二醇诱导；

j.0.25％BSA的DMEM洗板2次，0.25％BSA的DMEM、37℃封闭1h；

k.PBS洗2次，以步骤h获得的扩增后噬菌体重复步骤e，PBS洗板，g-h，获得记号D、T的洗脱噬菌体。

l.测定D、T洗脱噬菌体滴度，扩增后测定扩增噬菌体滴度，进入下一轮筛选。

m.重复步骤i，跳至步骤d-g，获得洗脱噬菌体(记为X)，滴度测定、扩增，进入下一轮筛选。各轮噬菌体富集见附图1(第一轮R1，第二轮R2.....)。经3-5轮筛选，噬菌体总体呈现富集的特性，在第5轮噬菌体得到高度富集。

(二)靶向结合肽序列的确定、分析及分子对接

1.本发明根据噬菌体随机肽库目标序列确定的原理和方法，将最后一轮筛选噬菌体铺板，共挑取27个单克隆噬菌体，制备ssDNA并送公司测序。获得25条不同序列，见表1。

表1

2、结合肽的生物信息分析与序列比对

对筛选得到的结合肽序列进行文献检索和和分析，未发现与已知序列完全相同的序列，NCBI GeneBank Blast搜索，也未发现与其他生物体存在同源序列，说明本发明筛选获得的25条序列为新序列。对所获结合肽序列进行ClustalX1.81多重序列比对，结果发现AHQ/_SLH/_P、PE/_QPL、L/_I/EPLL、ALH/_RHH/_TH、PXP、HHXH、MPKS(MKPS)等多肽结构序列的存在。见附图2。

3.结合肽的计算机模拟分子对接

本发明为了确定发现的多肽结构序列对MMP14靶向特性，利用Molegro.Virtual.Docker分子对接软件和Swiss-PDB Viewer对确认的多条多肽结构序列(AHQLH、PQPL、LPLL、PEPL、HHHH)与MMP14的ZnMc-MMP(aa.118-284)进行计算机模拟分子对接分析，结果确认其与ZnMc-MMP(aa.118-284)的保守结构域aa.121-123位置的His-Asn-Glu实现有效对接，而后者又恰是MMP14的Zn²⁺结合区域。不仅如此，该多肽结构序列还与MMP15对接成功，对接位置位于aa.36-38的Asn-His-His处，推断MMP15的Asn-His-His序列极有可能成为MMP15抑制剂筛选的一个重要靶向结构域。

(三)双靶向单克隆结合肽噬菌体的生物学特性等测定

1.MG-63细胞表面单克隆结合肽噬菌体的亲和力反筛测定

筛选获得的结合肽序列之单克隆噬菌体扩增后，如(一)/步骤3操作，测定部分结合肽噬菌体的P/N值，(P：噬菌体与诱导细胞结合的洗脱噬菌体滴度，N：噬菌体与对照细胞结合的洗脱噬菌体滴度)，P/N值越高则亲和力越强。结果显示，VSFYHVSDPSAP、TSIHLATASTHN、SVSVGMKPSPRP、LMPKSRMLPLLL、SSPLYHLISSAL等序列具有较强的亲和力。

2.单克隆结合肽噬菌体的免疫荧光测定

MG63细胞培养板接种和诱导，加入扩增的单克隆结合肽噬菌体，经孵育、洗涤、固定等步骤，加入鼠抗M13单克隆抗体，经结合、洗涤等步骤，加入FITC标记羊抗鼠二抗IgG，甘油封片，荧光显微镜观察筛选获得的单克隆结合肽噬菌体与细胞表面分子 MMP14的结合，计算荧光细胞率。结果显示与对照相比，加入结合肽噬菌体的处理样品，其荧光细胞数大大增加，呈现显著差异。

3.单克隆结合肽噬菌体的金属离子结合特性

选取部分序列对金属离子Zn²⁺、Ni²⁺进行亲和力测定(测定方法参见：易卓林，茆灿泉，微生物学报，2006，46(5)：745-748)，结果见表2。

表2

可见筛选获得的各条序列对Zn²⁺、Ni²⁺均具有一定的亲和力，其中序列EREAHQLHSHHK、ALHHHHRTGHSP、DPALRHTHHNLR具有很高的亲和力，结合对MMP14的亲和力和含Zn²⁺的特性，确定筛选获得的多肽为双靶点结合肽。P/N：含金属离子树脂结合的洗脱噬菌体滴度与去除金属离子树脂结合的洗脱噬菌体滴度的比值。

4.单克隆结合肽噬菌体的体外细胞生物学初步测定。

根据综合分析结果，我们对两条多肽序列(AHQLH和LPLL)进行多肽合成，并进行浓度梯度下的MG63细胞抑制效率测定，细胞显微观察和48孔板MMT细胞增殖曲线显示：1)随着处理浓度的增加，两条多肽序列对MG63细胞生长的抑制作用逐渐增强，死亡细胞逐渐增多，合成多肽对MG-63细胞的抑制作用，见图3。2)随着处理时间的增加，死亡细胞也逐渐增多，细胞生长抑制率增高。

Claims

1.MMP14双靶点高效结合肽的获取方法，从MMP14蛋白诱导表达的人成骨肉瘤MG63细胞中筛选和获得一组双靶点MMP14和Zn²⁺的多肽，包括：基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的噬菌体随机十二肽库体外消减筛选，通过“吸附-消减-吸附-洗脱-扩增”的循环筛选获得富集噬菌体，经3-5轮筛选，将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板，挑取单克隆噬菌体制备ssDNA并测序；所述基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的细胞消减筛选技术和方法具体实现过程包含：

1).MG63细胞的复苏培养以及雌二醇诱导的MMP14细胞表面大量表达；

2).基于MG63细胞靶向诱导表达MMP14的噬菌体随机十二肽库体外消减筛选

a.MG63细胞的6孔板培养；

b.换1％FBS、DMEM的培养；

c.换含0.25％BSA的DMEM的培养；

d.预冷的PBS洗两次，除去残余液体；

f.4℃预冷的PBS洗板，收集所有未结合噬菌体；

g.4℃预冷Gly-HCl缓冲液洗脱，Tris-HCl中和洗脱液；

h.测定步骤f的未结合噬菌体D，步骤g的洗脱噬菌体T滴度，并扩增，测定扩增后噬菌体滴度；

i.重复步骤a-d，培养MG63细胞，雌二醇诱导；

j.0.25％BSA的DMEM洗板2次，0.25％BSA的DMEM、37℃封闭1h；

k.PBS洗2次，以步骤h获得的扩增后噬菌体重复步骤e，PBS洗板，g-h，获得记号D、T的洗脱噬菌体；

l.测定D、T洗脱噬菌体滴度，扩增后测定扩增噬菌体滴度，进入下一轮筛；

m.重复步骤i，跳至步骤d-g，获得洗脱噬菌体X，滴度测定、扩增，进入下一轮筛选；经3-5轮筛选，噬菌体总体呈现富集的特性，在最后一轮噬菌体得到高度富集。