CN1475506A - 具有抑制血管生成及抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv-LDP-AE - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv－LDP－AE，主要通过融合蛋白的基因工程构建和分子强化两条技术路线制备而成，融合蛋白Fv－LDP的基因全长1119bp，编码372个氨基酸，分子量为38.7kDa，它对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成，动物实验证实，其对小鼠移植性肝癌H22有非常显著的疗效，使用可耐受剂量，其抑瘤率可达95.9％(P＜0.001)，该强化融合蛋白显示了抗体靶向药物的小型化与高效化特点，可望成为一种用于临床治疗肿瘤的新型靶向药物。

Description

具有抑制血管生成及抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv-LDP-AE
技术领域：
本发明涉及一种具有抑制血管生成作用、强烈杀伤肿瘤细胞活性和抗肿瘤治疗效果的新型抗体导向药物。
背景技术：
基质金属蛋白酶在癌细胞侵袭转移进程中扮演着重要角色，尤其明胶酶MMP-2和MMP-9可降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，有助于肿瘤细胞的侵袭与转移，在肿瘤新生血管内皮细胞的表达量高于正常组织血管内皮细胞。抑制基质金属蛋白酶的活性可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移和肿瘤血管生成。因此，以基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-9单抗做为导向药物的载体不仅可以提供肿瘤的靶向性，而其本身就具有抗肿瘤效应。本发明所涉及的抗MMP-2/MMP-9单抗3G11对多种肿瘤细胞均呈免疫学阳性反应，并与多种人体肿瘤组织尤其消化道肿瘤组织有特异性结合能力。单链抗体(scFv)通常是用一段柔性肽链将VH和VL连接构成的具有完整抗原结合位点的最小抗体功能片段。scFv较Fv片段更稳定，并且scFv分子较完整抗体对实体瘤的渗透能力强，因而更适于作为单抗导向药物的载体。
高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM)，亦称C-1027或C1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的由一株球孢链霉菌(Streptiomyces globisporus，菌种保藏号为：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物实验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人体移植肿瘤均有显著疗效(中国抗生素杂志1994，19<2>：164-168)。LDM的分子由两部分组成：其一为烯二炔结构的发色团，具有细胞毒作用，但不稳定；其二为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定性起保护作用。LDM分子中的发色团以两种形式存在：活性型发色团(即活性型烯二炔活性形式active enediyne，AE)和失活型发色团(inactivatedchromophore)，前者易于经过芳构化变为后者。LDM分子中AE含量的高低决定其作用的强度。由于LDM分子中的发色团由活性型向失活型的转化，为使LDM具有高强度的生物活性，必须保持高含量的AE。发色团与辅基蛋白通过非共价键结合，两者的结合具有特异性和牢固性。LDM可以拆分和进行分子强化，并以其独特的分子结构可以成为构建新型单抗导向药物的理想的“弹头”药物(中国医学科学院学报2001，23<6>：563-567)。
单抗靶向药物的小型化、高效化以及寻找新的特异性肿瘤靶标是解决当前单抗治疗剂存在问题的主要有效途径。运用基因工程技术构建获得的单链抗体scFv与力达霉素制备的免疫导向融合蛋白能够有效地将效应分子导向特异性肿瘤靶部位，较用化学偶联技术获得的免疫偶联物更具有分子均一性及高效小型化等优点。本实验室以往制备了组装型融合蛋白LDM-Fv(药学学报2000，35<7>：488-491)，但由于当时使用的发色团来源于一般的LDM，未能获得具有更强杀伤肿瘤细胞活性的融合蛋白，未能观察到对血管生成的抑制作用，亦未能在动物实验证明其疗效。研究证明，强化融合蛋白对肿瘤细胞显示强烈的杀伤活性，有高度的抑制血管生成作用，动物实验有非常显著的治疗效果。经检索，迄今国内外尚未见有类似的强化融合蛋白的有关报道。
本发明的目的是在构建新的融合蛋白Fv-LDP的基础上，严格控制所用发色团的质量，使用具有极强活性的活化型烯二炔(AE)进行分子强化，以制备强化型融合蛋白Fv-LDP-AE，作为抗肿瘤效果更佳的新型抗体导向药物。
发明内容：
本发明所说的强化融合蛋白Fv-LDP-AE是由抗明胶酶单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组胺酸六聚体尾形成的融合蛋白Fv-LDP(分子量约为38.7kDa)以及活化型烯二炔发色团AE(分子量为843kDa)构成的，基因全长1119bp，编码372个氨基酸，其制备技术路线为：
本发明采用DNA重组与分子强化等技术路线构建的强化融合蛋白Fv-LDP-AE，集中体现了小型化、高效化以及免疫原性较低的特点。该融合蛋白利用抗明胶酶单链抗体scFv的结合特异性将强化的力达霉素靶向于抗原高表达的肿瘤组织部位，发挥对肿瘤细胞的强杀伤活性，具有强烈的抑制血管生成作用，在体内试验有显著的治疗效果，展示了良好的应用前景。
1.力达霉素辅基蛋白LDP/抗明胶酶单链抗体scFv基因的克隆构建：重组质粒pPIC-9kFv1027和pIJ1027GRGDS分别含有scFv基因和LDP基因，由本实验室保存。pGEM-T vector为美国Promega公司产品，大肠杆菌菌种E.coli DH5a系本实验室保存。PCR引物由赛百盛公司合成，分别引入相应的酶切位点。scFv 5’端引物(PH1)：5’CG CATATG  CAGGTGAAGCTGCAGCAGTCT 3’
                                   Nde I      VHscFv 3’端引物(PL2)：5’CG GAATTC  TGAACCGCCTCCACC  ACGTTTGATTTCCAG 3’
                                   EcoR  I                    spacerVLLDP 5’端引物(PLD 1)：5’CG GAATTC  GCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTCCC 3’
                                      EcoR I    LDPLDP 3’端引物(PLD2)：5’CCG CTCGAG  TCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG 3’
                                       Xho I     LDP
以重组质粒pPIC-9kFv1027为模板，PH1为5’引物，PL2为3’引物进行PCR扩增，获得C端带有一段小肽spacer的单链抗体scFv基因片段；同时以重组质粒pIJ1027GRGDS为模板，PLD1为5’引物，PLD2为3’引物进行PCR扩增，获得LDP基因片段。PCR反应体系为94℃预变性2分钟，然后进行25轮PCR循环：94℃变性1分钟，55℃(scFv基因的扩增)或58℃(LDP基因的扩增)退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后一个循环后在72℃保温10分钟。
两种PCR产物利用DNA片段玻璃奶回收试剂盒(BioDev公司产品)纯化回收后，依Promage公司试剂盒提供方法与Promage公司的pGEM-T载体相连，转化大肠杆菌DH5α，筛选出重组T载体pGEM-T-Fv和pGEM-T-LDP进行酶切鉴定(图1)，分别由上海生工生物公司进行序列测定，scFv基因全长738bp，编码246个氨基酸，LDP基因全长345bp，编码115个氨基酸，二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸，编码羧基端的组胺酸六聚体尾的基因为18bp，编码6个氨基酸以及终止密码子3bp，基因总数1119bp，编码372个氨基酸。
2.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pEFL的构建：本发明选用的大肠杆菌表达质粒pET30a(+)(Invitrogen公司产品)为本实验室保存。将重组克隆质粒pGEM-T-Fv用Nde I和EcoR I、重组克隆质粒pGEM-T-LDP用EcoR I和Xho I进行双酶切获得酶切后片段，经琼脂糖凝胶电泳分离回收。将上述两个片段克隆至经Nde I和Xho I酶切的表达载体pET30a(+)内，转化入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司产品)的感受态细胞，筛选获得转化子并提取重组质粒。将获得的重组表达质粒进行酶切鉴定，表明其中含有正确的插入片段(图2)。应用两条T7通用引物进行测序，结果表明该融合基因Fv-LDP序列与预期的序列完全一致。本发明使用的表达质粒pET30a(+)，在其多克隆位点的3’端融合有一段编码组氨酸六聚体尾(His6-Tag)的基因序列，经翻译表达后，His6-Tag便于融合蛋白的表达鉴定与分离纯化。
3.融合蛋白Fv-LDP在大肠杆菌BL21(DE3)starTM中的诱导表达：从LB平板上挑取上述转化子接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜；次日按1∶50转种，37℃振荡培养至OD 600为0.9，向培养物中加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG(中文含义)，诱导培养4-6小时，取1ml培养液，12000rpm离心1分钟收集菌体，去上清，菌体细胞重悬在300μl PBS中，超声破碎菌体后，12000rpm离心10分钟，分别收集上清，沉淀重悬在300μl PBS中；以12％SDS-PAGE电泳分析外源蛋白的表达情况，融合蛋白以不可溶的包涵体形式得到表达(图3)。凝胶成像系统定量分析显示，以最佳条件诱导表达获得的融合蛋白的表达量占转化子菌株总蛋白的30％以上，最终挑选出最优表达融合蛋白的转化菌株，其中含有能够表达融合蛋白Fv-LDP的pEFL质粒，命名为CAMS/FLDFP，于2003年7月××日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.0960。
以Western Blot检测分析，12％SDS-PAGE电泳后在Bio-Rad电转移槽中进行半干电转，电转移条件为：恒电流0.65mA/cm2，时间约1.5-2小时。电转结束后的PVDF膜分别与含有封闭液稀释的一抗F9或抗His-Tag单抗孵育，以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，转化菌株CAMS/FLDFP成功表达了融合蛋白Fv-LDP(图4)。
4.融合蛋白Fv-LDP的亲和层析纯化及分离制备：采用His·bind纯化试剂盒(Novagen公司产品)于变性条件下纯化蛋白样品。经预处理亲和柱后，以3体积含6M尿素的1×Binding Buffer平衡层析柱，再以变性蛋白样品上柱后，依次以10体积的含尿素1Xbinding buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，6M Urea，pH7.9)，6体积含尿素1Xwashing buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，60mM咪唑，6M Urea，pH7.9)洗涤层析柱，最后以6体积含6M尿素的1xElute Buffer进行洗脱，收集洗脱组份获得纯化后的融合蛋白(图5)。继而行透析复性，蛋白样品依次对复性缓冲液I(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，3M Urea，5mM EDTA，pH8.0)、复性缓冲液II(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1M Urea，5mM EDTA，0.2mM GSSG，2mM GSH，0.4M L-Arg，pH8.0)和复性缓冲液III(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM EDTA，pH8.0)进行透析，再以PBS(pH7.4)透析、浓缩，经PD-10(Sephadex G25商业柱)脱盐、冷冻干燥，于-70℃保存备用。
5.强化融合蛋白Fv-LDP-AE的制备分离：取AE高含量的LDM冻干品10mg，加5ml冷甲醇振摇5min，-20℃放置1h，中间振摇1次；在0℃，12000r/min离心20min，上清液富含AE，沉降物为肽链，重复提取2次。自然蒸发浓缩甲醇溶液，实验需低温(具体温度？)、避光进行。取一定体积和浓度的Fv-LDP溶于0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(体积比为1∶50)，混合振摇，室温放置12小时，将混合液以PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经A280nm紫外监测后弃过量未反应的AE，收集强化融合蛋白Fv-LDP-AE(图6)。
6.融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性：用间接ELISA检测，以10μg/ml明胶酶(溶于PBS中)100μl/孔包被96孔酶标板，置4℃过夜作为抗原；以104/孔的密度将HT-1080细胞或HT-29细胞接种于96孔板中37℃培养过夜；弃上清后，以0.25％戊二醛固定细胞，作为细胞抗原；以100μl 10％脱脂奶粉进行封闭，每孔加入100μl不同浓度梯度的融合蛋白Fv-LDP，37℃孵育后以100μl 1μg/ml的抗LDM单抗F9为一抗，HPR标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，每孔加入100μl OPD底物反应液进行显色反应，酶标仪测定490nm处吸光值。结果显示，融合蛋白与明胶酶、HT-29和HT-1080肿瘤细胞的免疫反应性均为阳性(图7)。
7.融合蛋白Fv-LDP与人体肿瘤组织的免疫学活性：采用博士德免疫组化试剂盒提供的链霉卵白素-生物素-酶联复合物(SABC)染色方法，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20分钟；吸取多余液体，不洗，直接滴加适当稀释的一抗融合蛋白Fv-LDP，室温孵育；再依次滴加适当稀释的二抗F9单抗和生物素化的羊抗鼠IgG抗体，最后滴加试剂SABC，以DAB试剂盒室温显色，常规苏木素轻度复染，脱水透明封片。观察染色结果(图8)发现，Fv-LDP可与人体结肠腺癌组织中的MMP-2/MMP-9发生免疫反应而呈阳性染色，其阳性染色颗粒位于结肠腺癌腺细胞样肿瘤细胞的胞浆内。
8.融合蛋白Fv-LDP抑制肿瘤细胞分泌明胶酶的活性：取对数生长期的人纤维肉瘤HT-1080细胞，按1×105/ml/孔加于24孔培养板，37℃，5％CO2培养24小时；弃培养液，加入200μl无血清RPMI 1640(中文含义)培养液，继续培养2小时后，加入100μl的融合蛋白Fv-LDP于37℃孵育24小时后，吸取培养液，500×g离心5分钟，取少量细胞上清以Bradford法(中文含义)测定蛋白含量，绘制标准曲线及测定样品的浓度，以相应体积取上清进行非变性PAGE电泳。电泳完毕后将凝胶放入100ml 2.5％Triton X-100溶液中漂洗30分钟，重复一次，蒸馏水漂洗2次，加入100ml明胶酶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2)，37℃孵育16小时；考马斯亮蓝R250染色脱色后观察负染的明胶水解条带。结果表明，融合蛋白Fv-LDP明显地抑制肿瘤细胞HT-1080分泌明胶酶的活性(图9)。
9.强化融合蛋白Fv-LDP-AE抑制血管生成作用：以鸡胚尿囊膜法检测其对血管生成的抑制作用。将新鲜受精的白皮来航鸡种蛋气室端朝上，37℃，60％湿度的恒温室中孵育7天后再消毒鸡蛋外壳，以针刺入气室，将2ml空气吸入气室内以使鸡胚尿囊膜与血管卵膜分离，同时以砂轮磨壳小心剥去外壳形成一个2×2cm2小窗，立即用透明胶带封好，继续于37℃，60％湿度的恒温室中孵育24h。至孵育第九天小心吸取10μl的bFGF(中文含义)滴加于预先准备好的二甲基纤维素载体盘中，同时加入不同浓度的强化融合蛋白Fv-LDP-AE，将载体盘置于大血管及胚心远端，封窗，继续于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育48h后观察，结果显示，Fv-LDP-AE能明显抑制bFGF刺激鸡胚尿囊膜新生血管的生成(图10)。
10.强化融合蛋白Fv-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用：用克隆形成法测定，取对数生长期的HT-29细胞加入96孔培养板，每孔50个细胞/0.2ml，培养24h。10倍稀释各药物和组装偶联物，每浓度设3个平行孔，每孔50μl，37℃温育1h，无血清PRMI 1640培养液洗2次，加入新鲜培养液，继续培养7天，第7天于镜下计数细胞集落。结果表明，Fv-LDP-AE的对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，半数克隆抑制浓度IC50为1.65×10-16M(图11)。
11.强化融合蛋白Fv-LDP-AE的动物实验治疗方案：根据剂量初筛结果设计动物实验治疗的给药方式和剂量。领取体重为18-22g的昆明小鼠60只，随机分为6组，每组10只。实验第0天，取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为1.5×106/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。小鼠皮下接种H22肿瘤24h后，分别于实验第1和第10天给予生理盐水、Fv-LDP、游离LDM以及三个剂量的Fv-LDP-AE，尾静脉注射给药2次。实验期间每3-4天测定肿瘤大小，以公式1/2ab2(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)计算肿瘤体积和抑瘤率。实验第21天结果表明，强化融合蛋白Fv-LDP-AE体内有显著的疗效，于0.8、1.6、3.2mg/kg的剂量，可明显抑制肝癌H22皮下瘤的生长，如下表所示：
         Fv-LDP-AE对小鼠移植性肝癌H22的生长抑制作用
                                     体重变
             剂量      小鼠数量               肿瘤体积     抑制率组别                                     化
           (mg/kg)   实验开始/结束          (cm3) x±S)  (％)
                                       (g)空白对照          -         10/10          22     14.6±4.3LDM              0.05       10/10          19.5   4.3±2.6     70.3*Fv-LDP           2.4        10/10          15.7   11.9±5.8    18.7Fv-LDP-AE        3.2        10/10          4.5    0.6±0.3     95.9*▲Fv-LDP-AE        1.6        10/10          8.7    1.8±1.2     87.8*▲Fv-LDP-AE        0.8        10/10          9.7    2.1±1.1     85.7*▲ *与空白对照组相比，P＜0.01，▲与LDM组相比，P＜0.05。
从肿瘤生长曲线(图12)可见，Fv-LDP-AE在3.2mg/kg剂量时疗效尤其显著，其第14、17、21天的抑制率分别为92.2％、95.2％、95.9％。治疗期间，动物的体重无明显变化，一般状况良好，表明动物可耐受所用剂量。发明效果：
本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程技术和分子强化相结合的技术路线制备获得的强化融合蛋白Fv-LDP-AE是一种新型高效小型化免疫导向药物，以基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-9为靶点的scFv片段与力达霉素构成的强化融合蛋白Fv-LDP-AE，基本保留了完整单抗的抗原结合活性，能抑制肿瘤细胞对明胶酶的分泌活性，同时显示对肿瘤细胞的强杀伤活性以及抑制血管生成作用，在动物体内实验治疗有显著疗效，展示其具有良好的应用前景。
附图说明：图1：scFv和LDP基因的PCR扩增及重组克隆载体的限制性内切酶分析
其中：1-DNA分子量标准  2-scFv的PCR产物
      3-LDP的PCR产物   4-重组质粒pGEM-T-scFv/Nde I+EcoR I
      5-重组质粒pGEM-T-LDP/EcoR I+Xho I图2：转化菌株BL21(DE3)starTM/pEFL中重组表达质粒pEFL的限制性内切酶分析
其中：1-DNA分子量标准        2-质粒pET-30a(+)
      3-重组质粒ppEFL        4-pET-30a(+)/Nde I+EcoR I
      5-pEFL/Nde I+EcoR I    6-pET-30a(+)/EcoR I+Xho I
      7-pEFL/EcoR I+Xho I    8-pET-30a(+)/Nde I+Xho I
      9-pEFL/Nde I+Xho I图3：融合蛋白Fv-LDP表达产物的SDS-PAGE分析
其中：1-蛋白分子量标准
      2-BL21(DE3)starTM/pET-30a(+)IPTG诱导前全菌蛋白
      3-BL21(DE3)starTM/pET-30a(+)IPTG诱导后全菌蛋白
      4-转化菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导前全菌蛋白
      5-转化菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后全菌蛋白
      6-转化菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后菌体上清
      7-转化菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后菌体包涵体沉淀图4：融合蛋白Fv-LDP的Western-blot分析
其中：A：以抗力达霉素辅基蛋白单抗F9为一抗
      B：以抗组氨酸标记尾单抗为一抗
      1-BL21(DE3)starTM/pET-30a(+)IPTG诱导前全菌蛋白
      2-BL21(DE3)starTM/pET-30a(+)IPTG诱导后全菌蛋白
      3-重组菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导前全菌蛋白
      4-重组菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后全菌蛋白
      5-重组菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后菌体包涵体沉淀
      6-重组菌株CAMS/FLDFP经IPTG诱导后菌体上清图5：融合蛋白Fv-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析
其中：1-蛋白分子量标准
      2、3-未上亲和层析柱前样品
      4-结合缓冲液洗柱后收集的液体
      5-以20mM咪唑漂洗缓冲液洗柱后收集的液体
      6-10-以1M咪唑洗脱缓冲液洗柱后先后收集的蛋白组分图6：强化融合蛋白Fv-LDP-AE的分离纯化
其中：峰1-纯化的强化融合蛋白Fv-LDP-AE
      峰2-未反应的过量的AE图7：ELISA分析融合蛋白Fv-LDP与明胶酶和不同肿瘤细胞的免疫反应性
其中：▲明胶酶
      ■HT-29细胞
      ◆HT-1080细胞图8：免疫组化染色分析融合蛋白Fv-LDP与人体结肠癌组织的免疫学活性
其中：A：FvLDP在人结肠癌组织中的免疫组化染色
      B：阴性对照，PBS替代FvLDP为一抗
      放大倍数为200×，图中标尺为20μm。图9：融合蛋白Fv-LDP对HT-1080细胞的明胶酶谱分析
其中：1-PBS
      2-BL21(DE3)/pET-30a(+)IPTG诱导后全菌蛋白
      3-完整单抗3G11(6μM)
      4-融合蛋白Fv-LDP(30μM)图10：强化融合蛋白Fv-LDP-AE对bFGF刺激鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用
其中：A：仅PBS处理后的鸡胚尿囊膜血管
      B：以bFGF为刺激物，PBS处理后的鸡胚尿囊膜血管
      C：以bFGF为刺激物，LDM(0.1μg/鸡胚)处理后的鸡胚尿囊膜血管
      D：以bFGF为刺激物，Fv-LDP-AE(0.4μg/鸡胚)处理后的鸡胚尿囊膜血管图11：强化融合蛋白Fv-LDP-AE对肿瘤细胞HT-29的杀伤活性
其中：◆Fv-LDP-AE
      ■LDM图12：强化融合蛋白Fv-LDP-AE对小鼠体内肝癌H22生长的抑制作用
其中：◆对照              ▲FvLDP组
      ■LDM组             △Fv-LDP-AE3.2组
      ◇Fv-LDP-AE1.6组    □Fv-LDP-AE0.8组
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>具有抑制血管生成及抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv-LDP-AE<140><141><160>1<170><210>1<211>1119<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222><223><400>1atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag     60ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag    120acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa    180tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc    240tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg    300gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca    360ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact    420cagtctccag cttctttggc tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatatc ctgcagagcc    480agtgaaagtg ttgatactta tggcgatact tttatgtact ggtaccagca gaaaccagga    540cagccaccca aactcctcat ctatcttgca accaacctag gatctggggt ccctgccagg    600ttcagtggca gtgggtctag gacaaacttc accctcacca ttgatcctgt ggaggctgat    660gatgctgcaa cctattactg tcagcaaaat aatgaggatc cgtacacgtt cggagggggc    720accaagctgg aaatcaaacg tggtggaggc ggttcaccat gggcgcccgc cttctccgtc    780agtcccgcct cgggtctgag tgacggacag agcgtgtcgg tgtcggtcag cggtgccgcc    840gccggcgaga cctactacat cgcccagtgc gctccggtcg gtggccagga cgcgtgcaac    900ccggcgaccg cgacgtcctt caccacggac gcgtccggag cggcgtcgtt cagcttcgtc    960gtgcgcaagt cgtacacggg ctccacgccc gaaggcacgc cggtcggcag cgtcgactgc   1020gccacggccg cctgtaacct cggcgccggc aactccgggc tcgacctcgg ccacgtggct   1080ctgaccttcg gcctcgagca ccaccaccac caccactga*                         1119

Claims (9)

1.一种强化融合蛋白Fv-LDP-AE，其特征在于它是由抗明胶酶单链抗体scFv、.力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白Fv-LDP(分子量约为38.7kDa)以及活化型烯二炔发色团AE(分子量为843kDa)构成的，基因全长1119bp，编码372个氨基酸。
2.如权利要求1所述的强化融合蛋白Fv-LDP-AE，其特征在于其中的scFv基因全长738bp，编码246个氨基酸；LDP基因全长345bp，编码115个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因为18bp编码6个氨基酸；终止密码子为3bp。
3.强化融合蛋白Fv-LDP-AE的制备方法，其特征在于所说方法主要采用DNA重组和分子强化两条技术路线，具体步骤如下：
A.力达霉素辅基蛋白LDP与抗明胶酶单链抗体scFv的融合基因构建；
B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pEFL的构建；
C.融合蛋白Fv-LDP在大肠杆菌CAMS/FLDFP(保藏编号：CGMCC No.0960)
中的诱导表达；
D.融合蛋白Fv-LDP的亲和层析纯化及分离；
E.强化融合蛋白Fv-LDP-AE的制备分离。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和抗基质金属蛋白酶MMP-2/9单链抗体scFv基因，将二者以编码一段柔性小肽的DNA序列相连构建成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同时在spacer区引入特异性酶切位点。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是将所得到的融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)中，构建重组表达质粒pEFL。
6.如权利要求3或5所述的制备方法，其特征是将pEFL转化入大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达获得包涵体形式的融合蛋白Fv-LDP，并进行条件优化获得最佳表达。
7.如权利要求3或6所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白Fv-LDP，再进行透析复性，浓缩冻干，制备功能性融合蛋白。
8.如权利要求3或7所述的制备方法，其特征是将纯化分离得到的融合蛋白Fv-LDP与经甲醇提取制备的力达霉素发色团的活性型烯二炔AE，按一定分子比和时间进行分子强化，获得强化融合蛋白Fv-LDP-AE。
9.强化融合蛋白Fv-LDP-AE在制备抑制血管生成和抗肿瘤新型抗体导向药物中的应用。
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