CN1455003A

CN1455003A - 一种sars冠状病毒荧光分子信标pcr检测技术

Info

Publication number: CN1455003A
Application number: CN03142615A
Authority: CN
Inventors: 王虹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-06-07
Filing date: 2003-06-07
Publication date: 2003-11-12

Abstract

表面刺突蛋白(spike protein)是冠状病毒特征性的结构。此种SARS冠状病毒荧光分子信标PCR检测技术是在SARS－Cov的表面刺突蛋白基因区域设计一对基因扩增引物，PCR扩增片段长度约为140bp。在上下游引物中间设计一条荧光分子信标探针，探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL，探针的5’端和3’端有6个碱基能反折互补，使荧光分子信标探针在游离状态下不发出荧光信号。此技术采用逆转录PCR的方法检测靶基因片段，适用于定性、定量检测呼吸道分泌物、血清、病检组织和各种排泄物等标本中的SARS－Cov RNA。荧光的检测可采用实时检测和终点检测两种方法。终点检测方法结果判定标准是：荧光值(Ax)≥2.5倍阴性对照荧光值(An)为阳性，而当Ax＜2.1An时为阴性。2.1An≤Ax＜2.5An为实验灰区，需重复实验进一步确认。

Description

一种SARS冠状病毒荧光分子信标PCR检测技术

一、技术领域：生物医药体外分子诊断技术

二、技术背景：

传染性非典性肺炎是最近半年来在我国部分省市及世界多个国家流行的一种传染性强、危害较大的传染病。主要以呼吸系统损伤为主，因此，世界卫生组织(WHO)将其命名为严重急性呼吸道综合征(SARS)。今年四月中旬，几个研究机构先后确认，一种新的冠状病毒的变种是引起SARS的病原，因而将其命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。SARS-CoV与已知的几种冠状病毒在基因和蛋白的组成上基本一致。但其基因组DNA序列及各种蛋白质的氨基酸序列与已知的冠状病毒基因同源性较低。基于聚合酶链反应(PCR)技术的分子诊断技术是目前较高效、灵敏的SARS-CoV快速诊断方法。

分子信标(molecular beacon)或称分子灯塔，是一种特殊的荧光标记寡核苷酸探针，可用于检测聚合酶链反应(PCR)产物数量和效率，具有灵敏度高、特异性好、能定性定量的优点，并可采用实时检测和终点检测两种方式检测PCR扩增的靶核苷酸数量。目前WHO推荐的几种PCR检测引物大都设计在SARS-CoV的聚合酶基因区域，而且尚未见采用荧光分子信标PCR方法进行SARS-CoV检测的报道。冠状病毒表面刺突蛋白(Spike Protein)是冠状病毒特征性的结构蛋白，对该蛋白进行基因诊断对于鉴定冠状病毒类病毒具有较高的特异性。各地对SARS-CoV的表面刺突蛋白基因的测序结果表明：刺突蛋白基因的同源性和稳定性非常高，同样是检测SARS-CoV的适宜区域。

三、发明内容：

在SARS-CoV的刺突蛋白设计一对引物，上游引物为：5’-GTGGAC CCA CAG ATT CAA CTG AC-3’下游引物为：5’-TGG GTTCCT CCT TGC CAT GCT G-3’PCR扩增片段的长度约为140bp。在上下游引物中间设计一条分子信标探针。探针的序列为5’- CAT CGC AAA ACA GCG ACC CCA AGG TTT GCG ATG A-3’(划线部分系人为加上的分子信标的茎部)，探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团DABCYL，探针在游离状态下5’端和3端5个碱基能反折互补，使荧光基团与淬灭基团在空间上非常靠近，FAM发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。基因扩增反应以临床血清、呼吸道分泌物及病检组织总RNA为模板，标本处理及运送按国家疾病预防控制中心制定的程序进行，并以正常人血清为阴性对照，以SARS标准血清为阳性对照，通过逆转录PCRSARS-CoV表面刺突蛋白基因片段。荧光检测是待PCR反应停止后，让反应液温度降至28℃后放入荧光检测仪在激发波长为487nm，检测波长为525nm读取并记录荧光值。

四、具体实施方式：

本技术主要用于SARS可疑患者呼吸道分泌物、血清、病检组织及排泄物的SARS-CoV基因诊断。上述样本首先采用裂解液和RNA抽提液处理，抽提SARS-CoV基因组RNA，接着将SARS-CoV表面刺突蛋白的基因扩增引物、荧光分子信标探针和模板RNA加入到逆转录PCR反应体系中，经逆转录合成cDNA后，PCR扩增靶基因片段。PCR扩增反应可以在定量荧光PCR仪上进行扩增并实时检测；也可等扩增产物反应完全结束后用荧光检测仪检测扩增产物的量，称为终点检测，其结果的判定标准是：荧光值Ax值≥2.5时为阳性，荧光值＜2.1为阴性。An2.1≤Ax＜2.5An为灰区，宜重复检测。如Ax≥2.1An可判为阳性。(其中An＝样本荧光值-空白对照荧光值An＝阴性对照荧光值-空白对照荧光值)。

Claims

1、以SARS-Cov表面刺突蛋白基因为检测目标的荧光分子信标PCR检测技术。

2、以上述目标进行检测的其它基因诊断技术，包括聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RF-PCR)，核酸杂交、基因芯片等技术。

3、上述检测技术在呼吸道分泌物、血清、组织细胞、排泄物等各种样本的检测。