CN1446078A - 一种无泡季铵化合物浓溶液及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开一种浓季铵化合物(QAC)溶液，包含一种QAC，其浓度大于约10重量％，和至少一种增溶剂，如一种醇。稀释的QAC溶液用来接触食品以防止食品上微生物生长，防止广谱食物源微生物污染。公开一种将食品与稀释QAC接触的方法，施用时间为至少0.1秒。可由此方法处理的食物是肉类和肉类制品、海产品、蔬菜、水果、奶产品、宠物食品和快餐，以及任何其他可被处理并仍然保持其外观和组织结构的食品。处理方法之一是将QAC溶液喷洒和喷雾到食品上，持续施用时间为至少0.1秒便可防止广谱食物源微生物的污染。

Description

一种无泡季铵化合物浓溶液及其使用方法
发明背景
本申请是未决美国序列号08/840288(1997年4月14日提交)的部分继续申请，该未决美国申请是美国序列号08/631578(1996年4月12日提交，现在的美国专利5855940)的部分继续申请，这两篇文献均以其全部内容在此引入作为参考。
1.发明领域
本发明涉及一种包含浓缩数量的抗微生物季铵化合物(QAC)的溶液。本发明的QAC浓液利用GRAS(通常认为是安全的)组分形成一种QAC的真溶液，而非乳液。与至少一种增溶剂合并来制备该浓QAC溶液，并且可用来制备用于稀释到一定终浓度，即工业食品加工或家庭食品制作和与食品加工相关的表面具体使用浓度的溶液。
本发明通常涉及一种包含浓缩数量的抗微生物QAC和至少一种增溶剂的溶液，该溶液适用于防止在家庭或工业环境中宽范围的微生物在食品上或食品内以及与食品接触的表面上生长的方法。更具体地说，本发明涉及一种包含浓缩数量的抗微生物QAC和至少一种增溶剂的溶液，该溶液适用于防止广谱微生物在食品上或食品内生长的方法；通过接触这些食品，如肉类食品，例如家禽、牛肉、猪肉、羊肉、鹿肉以及其他可食用的肉类食品；海产食品，例如鱼和贝虾类；水果、蔬菜、乳制品、宠物食品或快餐，诸如由动物肉、皮和其他部分制作的食品，这可以包括猪耳朵、皮和牛肉干；以及任何其他可以采用本发明的水性处理方法处理，而不会不利地影响食品的外观、质地和品质的食品。更具体地，本发明涉及一种包含浓缩数量的抗微生物QAC的溶液，该溶液适用于抑制微生物在食品上粘附、除去和/或防止微生物在食品上生长的方法。特别是，包含浓缩数量的抗微生物QAC的该溶液的使用涉及QAC对可导致食物源污染的微生物的效应。更具体地，这些微生物包括来自种类葡萄球菌、链球菌、弯曲杆菌、弓形菌、利斯特氏菌、单胞菌、芽孢杆菌、沙门氏菌、不产生毒素的埃希氏杆菌、产生病原毒素的埃希氏杆菌，如O157：H7的微生物。更特别地，本发明涉及一种以任何方式在食品上施用稀释的QAC的改进处理方法，但是优选包括将稀释的QAC喷洒或喷雾到食品上，以防止广谱微生物在这些食品上生长，其中QAC的施用时间可以缩短到至少1/10秒。该稀释QAC较短的施用时间在商业或工业环境中特别有用。
2.现有技术的描述
防止由微生物污染引起的食物源疾病是食品加工工业、管理部门和消费者关心的重大问题。来自美国农业部食品安全和检查局(FSIS)最近的报告(联邦公报，1995-2-3)估计，美国每年超过两百万例食物源疾病是由微生物污染造成的，相关花费超过10亿美元。食物源微生物污染发生在进入加工设备之前，以及由加工环境下交叉污染所致。FSIS已经制定了新的危害分析和关键控制案(HACCP)要求来减少食物源病原体的产生和数量。食品加工者必须遵守这些规章。尽管实现微生物减少的方法由加工者自行决定，但FSIS预计抗微生物处理将是HACCP计划的一个重要组成部分。本发明的处理方法使用由浓QAC溶液制备的水性制剂，可以符合HACCP的要求。
在努力提供一种完全没有微生物污染的产品时，家禽和肉类加工者遇到的主要困难是除去顽固贴附或粘附在将要作为食品的家禽和肉类组织上的微生物。如果污染微生物没有粘附在食品表面，则它们可以容易地漂洗掉。但是牢固粘附的微生物不能通过漂洗除去，并且对由化学或物理方法的去除也相当顽固。
已经提出若干化学和物理方法以减少肉类产品中的微生物，如使用氯或二氧化氯、臭氧、过氧化氢、乳酸、碳酸钠、磷酸三钠、以及电刺激。一般而言，这些方法已经表明在减少微生物污染方面效力有限，并且可能影响肉类产品的物理外观。
鼠伤寒沙门氏菌污染一向引起家禽加工工业的特别关注，因为该微生物常常存在于活的禽类中。家禽加工者在除去微生物，如粘附或贴附在家禽组织中的鼠伤寒沙门氏菌方面遇到极大困难。已经提出多种化学和物理方法用以在家禽加工期间消灭畜体的鼠伤寒沙门氏菌污染和使畜体之间的交叉污染最小化。磷酸三钠(TSP)已经用于家禽加工以抑制鼠伤寒沙门氏菌；但是有关TSP对沙门氏菌的效力的研究得出互相冲突的结果。由于其水溶性，TSP可被从家禽上洗掉，并因而不能抑制微生物的粘附。
美国专利5366983，在此引入作为参考，公开了一种通过用有效用量的QAC水溶液处理来除去或防止沙门氏菌污染肉类产品的方法。具体地说，季铵阳离子表面活性剂，如烷基吡啶鎓，特别是十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)和十六烷基溴化吡啶鎓(CPB)可有效地从家禽中除去鼠伤寒沙门氏菌。但是该专利没有公开QAC具有抗沙门氏菌之外的任何其他食品污染微生物菌属的较广抗微生物谱。此外，该专利也没有提示该处理方法对非肉类的食品将有效。另外也没有提示可以采用非常短的QAC施用时间而仍然提供有效的抗微生物处理效果。它也没有提示如本发明所公开的浓QAC的溶液，特别可用于制备稀释的QAC溶液。
食品物质因其蛋白质含量、孔隙率、亲脂性、表面pH、水渗透性、表面积、以及表面净电荷而在化学和物理性质上有所不同。食品的孔隙率对细菌的隔绝是重要的，而食品物质上坚韧、不可渗透的覆盖物可以减少食品的细菌污染。食品之间所有的这些化学和物理差别使得难以预测一种抗微生物剂对肉类食品的成功是否表示其对其他食品如水果、蔬菜、海产食品、乳制品、宠物食品或快餐也将成功。
例如，已知QAC、CPC能结合到蛋白质上；但是如果CPC对食品的抗微生物效力在很大程度上取决于蛋白质结合，那么本发明方法用于处理非蛋白质的水果和蔬菜本不该有效。
由沙门氏菌之外的其他病原体和腐败细菌引起的食物源疾病已经日益成为食品加工者面临的问题。这些细菌和已查明有这些细菌的产品的名单列于表1。
表1
病原体和腐败细菌的发病率
微生物   家禽   牛肉   猪肉  病原体 腐败细菌
嗜水气单孢菌   X   X   X X
布氏弓形菌   X   X   X
蜡状芽孢杆菌   X   X   X   X
空肠弯曲杆菌   X   X   X   X
大肠埃希氏杆菌O157：H7   X   X   X   X
单核细胞增生利斯特氏菌   X   X   X   X
鼠伤寒沙门氏菌   X   X   X   X
金黄色葡萄球菌   X   X   X   X
在表中所列的这些污染微生物中，大肠埃希氏杆菌O157：H7因其致病力、引起疾病的严重性以及相关死亡率而引起特别关注。大肠埃希氏杆菌O157：H7产生强烈的“类志贺氏”毒素，它会引起血液凝固异常、肾衰竭(溶血性尿毒综合症)以及死亡。即使从急性病症康复，15-30％的被溶血性尿毒综合症感染人群还会有慢性肾病的症状。与大肠埃希氏杆菌O157：H7污染相关的危险还伴随报道的对抗生素的抗药性。在1993年，有8,000-16,000例食物源疾病是由大肠埃希氏杆菌O157：H7引起的，估计花费2-5亿美元。
作为另一种有毒食物污染物，已经发现在肉类、蔬菜和各种奶制品中有单核细胞增生利斯特氏菌；并可能引起脓毒症、脑膜炎和扩散脓肿。单核细胞增生利斯特氏菌是一种耐寒微生物，能够在冷冻下生长。在1993年，约1700例食物源疾病是由单核细胞增生利斯特氏菌引起的，估计花费1-2亿美元。
在食品工业中另一种引起关注的微生物是嗜水气单孢菌，它会导致食品和肉类加工工业中的腐败并缩短这些产品的保质期。
近年来还没有已知的杀微生物化合物可有效地防止和除去各种各样食品中的广谱微生物污染，包括革兰氏阳性、革兰氏阴性、需氧的、兼性厌氧和微需氧微生物的污染。本发明人已经查明当微生物粘附到多种多样食品上时，QAC对抵抗引起食物源疾病的广谱不同的微生物有效。对广谱病原性微生物的此种敏感性本不能预测。
一种微生物对特定抗微生物剂的敏感性不能用于预测其他微生物对相同药剂的敏感性。据信防腐剂或杀菌剂具有连续的活性谱，但是必须考虑不同微生物的相对易感性。例如，杀菌剂六氯苯主要对革兰氏阳性微生物有效，而阳离子防腐剂对形成孢子的生物体无效。某些革兰氏阴性微生物，如葱头假单孢菌，已知在药物苯扎氯铵的溶液中生长。其他细菌已知能够在70％乙醇中生长(Harvey，S.C.，Antimicrobial Drugs，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版，Mack出版公司，1163-1241页，1990)。
至于食品的处理，已经报道了利斯特氏菌比沙门氏菌或大肠杆菌更抗TSP的作用(Somers，E.B等，Int.J.Food Microbiol.，22：269-276，1994)。此外，(Breen等，J.Food.Sciences，60：1991-1996，1995)表明TSP在抑制沙门氏菌生长方面比移除这种生物体更加低效。类似地，TSP减少了鸡畜体中大肠杆菌O157：H7的数目，但是不能有效地抑制这种微生物向其他鸡的交叉污染。
本发明表明QAC以液体形式可有效地抗悬浮液中的大肠杆菌O157：H7，当该细菌粘附在食品上时能减少这种细菌的数目，而且还能抑制这种细菌在食品上的粘附。已经报道了大肠杆菌O157：H7表现出对广谱抗微生物剂如四环素、链霉素、磺胺异噁唑(Kim等，J.Infect.Dis.，170：1606-1609，1994)和土霉素(Ciosek等，Med.Weter.，40：335，338：1984)的抗药性，而同样是这些药剂对常规的不产生毒素的大肠杆菌菌株却是非常有效的。
很明显，一种抗微生物剂或杀菌剂对一种特定微生物的效力不能根据其对不同微生物的效力预测。有许多因素要考虑，如微生物特性，这可能会在抗微生物剂对一种特定微生物的效力方面起作用。这些特性可以包括，但不限于：(1)给定种类粘附微生物形成多糖蛋白质复合物的程度，(2)在革兰氏阴性细菌中含脂多糖和磷脂的细胞外膜的存在，(3)如在多数肠细菌和假单孢菌中那样，脂蛋白的存在，和(4)孔蛋白通道的存在，例如在大肠杆菌和沙门氏菌中(Fulton等，Structure in Medical Microbiology，3版，37-54页，1991)。
食品加工工业，以及家庭、餐馆或内部食堂的食品制备中，需要更有效的产品和方法以防止宽范围的污染微生物在许多不同食品上和/或接触食品和食品流出的果汁或液体的表面上的生长。对于粘附在食品表面上的微生物尤其如此。由于因食物源病原体微生物引起的疾病数量的增加，现在食品加工工业需要更有效的方法来除去和防止更广谱的微生物，特别是对于病原体微生物，如产生毒素的埃希氏杆菌，即大肠杆菌O157：H7，已知它能由于食品污染而引起严重的人体疾病。本发明提供了一种包含浓QAC溶液和至少一种增溶剂的组合物，和防止微生物在食品上和食品中以及液体中、与食品相关的表面上和食品制作过程中生长的方法。该预防方法对防止由被感染食品产生交叉污染；从食品上除去粘附的微生物；抑制微生物在食品上的粘附；以及防止仍然粘附在食品上的微生物的生长都是重要的。此外，本发明的方法可以容易地用于食品加工厂。
另外，本发明提供了包含一种溶液的组合物，该溶液含浓缩数量的QAC和至少一种增溶剂或溶剂。本发明的浓QAC溶液提供了一种原液，由此可以制备稀释的QAC组合物以处理食品和与食品加工和制作相关的表面，包括制作食品的动物身体。例如，在挤奶前可以用浓QAC溶液的稀释溶液来处理奶牛的乳头，以提高牛奶加工和奶制品的安全性。此外，QAC的稀释溶液可以用于洗手和清洗人及宠物的身体，用本文所述的组分或者结合已知用于手和身体清洗的其他组分一起。浓QAC溶液可用于制备本方法中使用的稀释的工作溶液。本发明的配方含有增溶组分，它使得可以制备更加浓缩的QAC组合物。
美国专利5405604公开了一种浓缩的口腔清洗液，其使用方法和制作该口腔清洗液的方法。该口腔清洗液由一种水包油乳液形式的浓缩组合物组成，该乳液基本上由约0.05％～约10.0％的QAC；约30％～约85％的溶剂(起香精油载体的作用，其中溶剂是丙二醇、聚乙二醇及其混合物)；约0.2％～约9.0％的香精油和水组成。本发明的组合物不同于口腔清洗液组合物，因其含有大于10％的QAC，而且是一种真正的均质溶液，并非一种乳液，且不含香精油。
WO 98/03066公开了一种抗微生物组合物、其制备和使用方法。该组合物由亚组分(a)一种取代或未取代的C1-C4单羧酸，大约50～99.9重量％，和亚组分(b)一种杀菌或抑菌阳离子有机氮化合物，大约0.1～50重量％组成。本发明的组合物不同于WO 98/03066的组合物，因其含有增溶剂，而WO 98/03066的组合物没有。本发明不同于WO 98/03066，因其不含有机酸，如单羧酸，具体说不合取代或未取代的C1-C4单羧酸，而这是WO 98/03066组合物的主要组分。WO 98/03066的公开内容提到，含有抗微生物的未取代C1-C4单羧酸的组合物对沙门氏菌的效力可以通过加入阳离子有机氮化合物而增强。该发明的理论是阳离子杀菌氮化合物能够更好地将其效力施加到被C1-C4羧酸损伤的微生物上。此外该发明的组合物可以含有一种附加的有机酸，与阳离子有机氮化合物混合以形成“ancat”或“catan”化合物，在本发明的组合物中这些则不存在。
发明概述
本发明的浓QAC溶液提供一种浓缩的抗微生物溶液，它可以容易地稀释成与食品以及和食品相关的表面(如果是由动物得到的食品，则包括活或死动物体的部分)接触的溶液。本发明的浓QAC溶液包含一种QAC和至少一种增溶剂。优选QAC的浓度大于约10重量％。稀释该浓缩溶液以提供稀释的抑制生长有效用量的QAC水溶液和稀释的增溶剂。本发明的QAC可有效地防止广谱病原体和腐败微生物的生长，QAC，特别是十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)，对于防止广谱微生物在宽范围食品上的生长特别有效。
本发明提供了一种防止微生物在食品上生长的方法，包括将食品与抑制微生物生长有效用量的QAC接触，以防止广谱微生物在食品上的生长，其中该化合物在食品上的施用时间至少是1/10秒。防止微生物在食品上的生长旨在提供一种没有或含有少量会导致人或动物的疾病或使食品在被摄入前腐败的可存活微生物的食品。微生物在食品上生长的防止旨在包括，但不限于下列机理：(1)从食品上除去粘附的微生物；(2)抑制微生物在食品上的粘附；(3)杀灭或使食品上粘附的微生物失活；以及(4)杀灭或使并未粘附在食品上但存在于加工过程中与食品相关的液体中的微生物失活，例如在冷冻箱中或者是存在于与食品制作相关的表面上的那些，残留在诸如工作台面、案板和水池之类表面上的液体中的，以及用于食品制作和食品卫生处理的设备中的。
包括在本发明范围内的微生物是指对QAC敏感的那些微生物，更具体地，来自种类葡萄球菌、链球菌、弯曲杆菌、弓形菌、利斯特氏菌、单胞菌、芽孢杆菌、沙门氏菌、不产生毒素的埃希氏杆菌、产生病原毒素的埃希氏杆菌，以及对人或动物能够引起食品的食物源微生物污染的其他食物源微生物。
也对QAC敏感的所指其他微生物是真菌，如黄曲霉菌和产黄青霉菌，以及寄生物如内变形虫。
本发明在食品加工工业以及家庭和内部食堂的食品制作方面具有重要的应用价值。QAC易于得到，并且与现有抗微生物方法相比，本发明方法的实施成本不太昂贵。与使用如TSP的现有处理方法不同，使用QAC不会改变食品的外观、颜色、味道或质地。QAC的浓度范围应能有效地防止广谱微生物在食品上生长。QAC要用埃姆斯测验法检测诱变性。本发明的优选QAC，即CPC用埃姆斯测验法表明是非诱变的。此外，CPC已经被批准以口服制剂产品用于人体，如Cepacol锭剂，其口服用量每天最多20毫克。
本发明还涉及一种将食品与QAC接触的改进方法，其中QAC施用到食品上的时间至少数分之一秒，并且可介于约0.1秒～约5秒的时间范围，也可以采用约1～2秒的范围。重要的是QAC的施用时间应当足以导致明显防止微生物在食品上的生长。
本发明还包括一种通过将化合物喷洒或喷雾到食品上以使QAC与食品接触的改进方法。采用在水中稀释的QAC溶液可以进行喷洒或喷雾方法，或者采用QAC与至少一种增溶剂配制的新浓缩配方或用水稀释的浓QAC配方。如果浓液中QAC的百分比被批准用于食品上，则直接喷洒或喷雾该浓液也是可以的。
本发明旨在涵盖将QAC溶液与食品以任何直接方式接触的任何方法，包括喷洒、喷雾、浸渍、浸泡。但是本发明还包括将QAC溶液与食品以间接方式接触的方法，如将QAC溶液、浓液或稀释液涂布到食品加工设备上或食品在加工、制作、储存和/或包装过程中接触的制作表面上。
此外，本发明的方法可以任选地包括在食品与QAC接触之前的一个确定步骤以确定处理前食品上微生物的存在。快速确定微生物存在的任何常规方法都可以用作确定步骤，例如包括PCR和免疫测试。
此外，本发明的方法任选地包括一个在与QAC接触之后确定食品表面上QAC存在的步骤，该确定步骤在接触步骤之后或若干清洗步骤之后立即进行。例如，将QAC以适用于高效液相色谱分析(HPLC)的形式从食物的组织中提取出来。该方法包括乙醇萃取食物组织，随后采用一种弱阳离子交换柱进行固相提取，选择性地将QAC与基质中其他化合物分离开来，如若不然这些化合物干涉HPLC分析。用于QAC残余物定量的HPLC测试采用反相氰基色谱柱，并使用QAC同系物作为内标物。
附图简述
图1是表示用CPC处理后，大肠杆菌O157：H7在牛肋腹肉组织上的粘附受到抑制的条形图。
图2是表示用CPC在5％甘油水溶液中在非选择性介质上处理后，鲇鱼皮肤上存活微生物的减少的条形图。
图3是表示用CPC在5％甘油水溶液中在非选择性介质上处理后，减少鲇鱼皮肤上存活的鼠伤寒沙门氏菌的条形图。
图4是表示用CPC在5％甘油水溶液中处理后，黑葡萄上存活的鼠伤寒沙门氏菌减少的条形图。
图5是表示用CPC在5％甘油水溶液中处理后，花椰菜上存活的鼠伤寒沙门氏菌减少的条形图。
发明详述
本发明基于确认QAC可用于处理宽范围的食品，以在这些食品上和与这些食品的加工制作相关的表面上减少广谱食物源微生物污染。本发明还基于发现QAC可有效地除去、杀死宽范围的食物源病原性微生物、抑制其在食品上的粘附和使之失活。这些微生物包括，但不限于属于细菌的种属，沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、弯曲杆菌、弓形菌、利斯特氏菌、单胞菌、芽孢杆菌、不产生毒素的埃希氏杆菌、和产生毒素的埃希氏杆菌菌株，如大肠杆菌O157：H7；真菌，如黄曲霉菌和产黄青霉菌，以及寄生物如内变形虫。
本发明的组合物包含水溶液中有效数量的QAC。特别是，本发明的浓QAC溶液提供了一种用于工业领域的理想的抗微生物溶液，其中需要大量稀释的QAC溶液用于食品加工。本发明的浓缩溶液含有作种类极少的组分的GRAS(公认是安全的)组分和增溶剂。
本发明的浓QAC溶液在制备稀释QAC溶液方面提供了许多优点。大量QAC粉末投入到包含至少一种增溶剂的水性溶剂的溶液中。在单独水中制备浓QAC溶液是困难的，因为QAC会从溶液中沉淀出来。事实上，在没有增溶剂的协助下难以在溶液中得到超过约5％～约10％的QAC，并且在某些情况下那怕是超过1％的QAC，具体取决于溶液的温度。但是本发明人已经确定如果与至少一种增溶剂或溶剂合并制备的话，便可制备QAC的浓溶液，如一种醇或聚乙二醇。QAC已知是阳离子表面活性剂，因此水性QAC溶液的制备导致大量的起泡。但是当浓QAC溶液包含的QAC的浓度大于10％或大于15％且采用至少一种增溶剂来制备稀释QAC溶液时，制备QAC水性溶液时通常出现的大量泡沫就会大大减少。在浓液的制备中发生最小量的起泡，而且一旦制备后，浓液不会表现出起泡。此外，浓液在轻微搅拌下稀释，因此起泡也较小。如果浓QAC暴露于较低的温度，则浓QAC溶液抗沉淀。如果冻结，则在解冻后浓QAC溶液和至少一种增溶剂形成溶液。如果在常温或冻结下运输或储存之后仍残留有QAC沉淀物，那么升高溶液的温度，直至沉淀物消失。如果必要，较大容器或圆桶中的大量QAC浓液可以在圆桶加热器中加热。此外，与QAC的稀释水溶液相比，浓QAC溶液与高浓度的至少一种增溶剂结合，如适当的与水混溶的有机溶剂，则腐败或保质期有限的危险较小。此外，浓QAC溶液给最终用户提高了安全性，因为它避免了吸入暴露的QAC粉尘，这在使用QAC粉末时是一个问题，特别是当使用大量粉末时，因为它会导致肺、眼睛、咽喉、鼻和皮肤刺激。在QAC溶液的工业应用期间，浓QAC溶液减少了待运输和仓储的溶液的体积和质量。并且最重要的是，当浓QAC溶液在水中稀释以制备用于食品的稀释QAC溶液时，稀释后的浓缩溶液表现出非常好的抗微生物效力。
本发明特别涉及一种包含浓度大于约10重量％的季铵化合物和至少一种增溶剂的浓QAC溶液。该增溶剂是任何可与水混溶的有机溶剂，它增加QAC粉末在水溶液中的溶解度，以至形成一种浓度大于10重量％的溶液。称重10克QAC，将其溶于90克包含至少一种增溶剂和水的液体中(如果必须用水将液体的重量补充到90克)，从而制成10重量％的溶液。本发明的浓QAC溶液在溶液中包含浓度大于约10重量％的QAC，更优选浓度大于约15重量％。浓QAC溶液在溶液中包含浓度范围是大于约10重量％或大于约15重量％到约60重量％的QAC。尽管浓QAC溶液中可以采用大于约60重量％的QAC浓度，但所用的该上限由QAC的“％”(或重量)与用来制备浓缩溶液的增溶剂之间的相互作用来决定。特定的增溶剂或这些试剂的组合可能产生高于60％的QAC浓缩制剂。重要的是让所有QAC粉末溶解并在制备稀释配方以处理食品之前使之进入溶液。优选的是QAC的浓度为大于约10重量％或大于约15重量％到约50重量％，更优选的浓度是大于约10重量％或约15重量％到约40重量％。但是在该浓溶液中还可以使用的QAC浓度范围在大于约10重量％到约30重量％、或介于约15重量％到约25重量％、和在约20重量％的范围内。
本发明的QAC浓液的浓度或者以百万分之一份(ppm)表示，或者以重量％表示，其中100000ppm等于10重量％。实施例采用CPC并使用ppm或％表示浓度。
加入增溶剂或这些试剂的组合，以及必要时加水(补足溶液的剩余重量)，以达到100重量％。增溶剂是按照本发明将QAC增溶到浓度大于约10重量％的任何相容的增溶剂，但是醇是优选的增溶剂。另外，聚二醇是有用的增溶剂，如聚乙二醇。本发明考虑到使用一种或多种这些增溶剂。更优选的是醇选自一元醇、二元醇、三元醇及其组合。这些类型醇中的任何一种都可以单独使用或与一种或多种其他类型的醇组合使用，以得到增溶剂的所需重量％。如果采用一元醇，那么该类型的醇优选是一种脂肪族醇，更优选是乙醇。如果采用二元醇，那么优选二醇或其衍生物。二元醇中丙二醇是最优选的，并且可以从许多供应商得到。丙二醇提供超过其他醇的优点在于是QAC和CPC的高浓度增溶剂。三元醇，如甘油或其衍生物，也可用作该CPC浓缩溶液的增溶剂。醇的选择取决于要接触的食品，并且选择那些与在QAC和食品接触之前或之后的处理步骤相容的。如果聚二醇用作增溶剂，则优选聚乙二醇，并且特别是，众所周知的较低分子量的类型，其平均分子量小于或等于600，性质类似于聚丙二醇。
如果乙醇用作增溶剂，则其浓度最大约49重量％。在本发明中可采用约0.5重量％～约49重量％、约10重量％～约40重量％、约15重量％～约30重量％、且在约20重量％范围内的乙醇。
浓QAC溶液含有至少一种增溶剂，如浓度最高约70重量％的醇。更优选的是，醇的浓度为最高约60重量％，并且范围可以是约10重量％～约60重量％。增溶剂的浓度随将要溶解在溶液中的QAC的重量％，以及浓QAC溶液及其稀释液的特定用途而变化。
优选浓QAC溶液包含浓度为约40重量％的QAC和浓度范围介于约50重量％～约60重量％的至少一种醇以及补足剩余重量％的水。在此溶液中优选的醇是丙二醇。更优选的是，浓QAC溶液包含浓度为约40重量％的QAC和浓度范围介于约55重量％～约60重量％的至少一种醇以及约5重量％的水。最优选的浓QAC溶液包含浓度为约40重量％的QAC和浓度为约57重量％的一种醇以及约3重量％的水。在此溶液中优选的醇还是丙二醇。
但是，还可使用的一种浓QAC溶液包含浓度为约40重量％的QAC和浓度最高约50重量％，优选约50重量％的至少一种醇。在该浓缩水溶液中，增溶剂可以是醇的组合，如乙醇和丙二醇。但是甘油也可单独或者与其他醇或聚乙二醇组合用作增溶剂，用于此目的的甘油的浓度为最高且包括约20重量％，并且使用浓度范围也可以是约0.5重量％～约10重量％，且在约1重量％的范围内。在丙二醇并非用来增溶QAC的醇的方法中可使用甘油。另一种可用的浓QAC溶液包含浓度为约20重量％的QAC和浓度为约50重量％的至少一种醇，如乙醇和丙二醇的组合，并优选其中每种醇的浓度为约25重量％。
用于该浓QAC溶液的QAC选自烷基吡啶鎓、四烷基铵和烷基脂环族铵盐。
烷基吡啶鎓由结构式(I)代表：
Figure A0180440200161
其中n是9-21；X是一种卤素。
四烷基铵由结构式(II)代表：其中n是9-21；R选自CH3和C2H5；X是一种卤素。
烷基脂环族铵盐由结构式(III)代表：
Figure A0180440200163
其中n是9-21；Z是4-5；R选自CH3和C2H5；X是一种卤素。
各种各样QAC都是阳离子表面活性剂，就其从各种食品上除去粘附的微生物以及抑制微生物粘附的效力做了评估。在所研究的QAC中，十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)是最有效的，并且在下述实施例中采用，但是这并不意味着将QAC的使用限制为本发明方法中的CPC，因为其他种类的QAC也具有抗食物源病原性微生物的类似性能。在长侧链上含有12-16个碳原子的QAC具有最大的抗微生物活性。CPC作为优选的QAC，在长侧链上含有16个碳原子。
本发明还涉及浓QAC溶液的稀释，包括至少一种增溶剂，和水(如果需要，用以得到所需的CPC重量％)，以及将此稀释的QAC溶液和食品接触以防止微生物在食品上生长或粘附。该稀释QAC溶液的QAC浓度为最高且包括约1重量％QAC。此重量％是美国农业部规定的标准处理食品目前可接受的QAC浓度。残留在特定食品上的QAC的数量随所处理食品的不同种类以及施用方法而变化。本发明所述的浓QAC溶液用水稀释所得到的QAC浓度范围是约0.01重量％，最高1％且包括约1％的稀释溶液，该浓度可能增加或降低，取决于所处理的食品以及所使用的施用方法。将先前所述的按重量对重量制备的浓QAC溶液按体积对体积稀释以得到所需QAC处理溶液。例如，通过用97.5ml水来稀释2.5mlQAC浓液将40％的浓QAC溶液稀释到1％QAC。在食品加工厂中，优选该体积对体积稀释，因为它便于制作。但是，重量对重量稀释也可以用来制作稀释QAC溶液，其中2.5g 40重量％的QAC溶液和97.5g水混合得到1％的QAC溶液。浓缩溶液中QAC的稀释也导致浓缩溶液中增溶剂的稀释，稀释后的QAC浓缩溶液可用于以喷洒、喷雾、浸渍以及适用于将稀释QAC溶液和食品接触的任何其他接触方法来接触食品，包括间接接触，如接触加工、制作、储存和/或包装期间与食物接触的设备或食品加工或制作表面。QAC溶液的施用时间越短，特别是对于工业和商业食物加工而言就越好。
本发明进一步基于确定在喷洒或喷雾工艺中QAC对食品的施用时间可以减少到低至约至少0.1秒，同时对于食物源微生物仍然导致显著抑制微生物的粘附，这是一个重大的改进，并且是该方法在工业应用中的商业优点。喷雾或喷洒施用方法可使稀释QAC溶液对食品的施用时间缩短到最多20秒，但是更优选约10秒或更少，更优选约5秒或更少。QAC在食品上的施用时间的最优选范围是约0.1秒～约5秒，并且在此范围内，还可采用约0.1秒～约2秒，优选范围是约0.5秒～约2秒。应该理解的是本发明试图在物理上尽可能缩短稀释QAC溶液的施用时间，同时仍导致抑制食品上或食品接触的液体中和表面上的微生物。因此，本发明设想有少于20秒的不同时间间隔。
将QAC与食品接触的任何类型的方法均可用于本方法中，只要它能够缩短施用时间。采用一种提供喷雾或喷洒食品的室的方法可用于本发明中。食品加工厂中生产线上在这种室中所使用的机械设备可用于将施用时间减少到最小，同时仍然在食品上得到有效的抗微生物效果。所有这些缩短了的施用时间，即少于20秒，以及少到0.1秒，显著减少了这些食品上存活的食物源微生物。此外，喷洒或喷雾处理只需非常少量的QAC稀释溶液，例如用少到约1盎司稀释的QAC溶液/磅食品便可达到有效的处理。
短QAC施用时间的本方法在家禽加工厂中可用于处理冷冻后的鸡肉，鸡肉已经浸泡在冷水的冷冻浴中。从冷冻浴中取出鸡肉，然后用本发明的稀释QAC溶液处理，施用时间少于约20秒，优选少于约10秒，更优选少于约5秒，最优选少于约2秒，甚至短到0.1秒。处理后的鸡肉随后包装，而无须进一步的洗涤或漂洗。但是，如果认为需要，该方法任选地可以在包装前包括至少一个鸡肉的清洗步骤。该任选的清洗步骤可以包括用水喷洒或喷雾食品，或者将食品浸渍在水的容器或罐中。
本发明的上述各个方面将在下文某些实施例中并参考附图1～5详细描述。
以下所述的实施例作为优选实施方案用于进一步说明本发明，但不拟限制本发明。这些实施例采用家禽、牛肉、鲇鱼、花椰菜和葡萄作为本方法中所处理的食品，但是不会受该处理方法不利影响的其他食品的处理也拟包括在本发明之内。
实施例
以下实施例中采用的微生物如下：
金黄色葡萄球菌ATCC 29213、空肠弯曲杆菌ATTC 29428、大肠埃希氏杆菌(不产生毒素的菌株)ATCC 25922、大肠埃希氏杆菌O157：H7(产生毒素的菌株)ATCC 43895、布氏弓形菌ATCC 49616、单核细胞增生利斯特氏菌ATCC 49594、嗜水气单孢菌ATCC 49140、蜡状芽孢杆菌ATCC 49063、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和NCTC 12023、以及黄曲霉菌和产黄青霉菌的市售培养物。
实施例1
悬浮培养基中季铵化合物的杀菌活性(未粘附在肉类产品上)
季铵化合物的最小抑制浓度(MIC)
在Mueller Hinton肉汤(BBL微生物系统公司)中采用由国家临床实验室标准委员会于1987年建立的大规模稀释(Macrodilution)方法来确定QAC的最小抑制浓度(MIC)。对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌O157：H7、单核细胞增生利斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，在37℃孵育16小时进行实验，而对于嗜水气单孢菌和蜡状芽孢杆菌，在30℃进行孵育。由呈不可见浊度的最低稀释来确定MIC。表2表示以上实验的数据：
表2
最小抑制浓度(MIC)
  十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)μg/ml     CPC对大肠杆菌O157：H7  CPC对蜡状芽孢杆菌  CPC对金黄色葡萄球菌  CPC对鼠伤寒沙门氏菌  CPC对嗜水气单孢菌 CPC对单核细胞增生利斯特氏菌
  125     -  -  -  -  - -
  62.5     -  -  -  -  - -
  31.25     -  -  -  +  + -
  15.63     -  -  -  +  + -
  7.81     +  -  -  +  + -
  3.91     +  +  -  +  + -
  1.96     +  +  -  +  + -
  0.98     +  +  -  +  + -
  0.50     +  +  -  +  + +
  0.25     +  +  -  +  + +
  0.00     +  +  +  +  + +
                             (-)不生长，(+)生长MIC由大规模稀释肉汤法得到(国家临床实验室标准委员会)
季铵化合物的最小杀菌浓度(MBC)
QAC对空肠弯曲杆菌和布氏弓形菌的最小杀菌浓度(MBC)在Mueller Hinton肉汤(BBL微生物系统公司)中采用由国家临床实验室标准委员会于1987年建立的大规模稀释方法来确定。在37℃进行48小时微需氧孵育实验。每种稀释液的等分试样倾入琼脂盘中，在37℃微需氧条件下孵育48小时。MBC确定为无生长的最低稀释程度。表3表示以上实验的数据：
表3
最小杀菌浓度(MBC)
十六烷基氯化吡啶鎓μg/m1  CPC对空肠弯曲杆菌   CPC对布氏弓形菌
    125     -     -
    62.5     -     -
    31.25     -     +
    15.63     -     +
    7.81     -     +
    3.91     +     +
    1.96     +     +
    0.98     +     +
    0.50     +     +
    0.25     +     +
    0.00     +     +
                         (-)不生长，(+)生长MBC由大规模稀释肉汤法得到(国家临床实验室标准委员会)
MIC和MBC数据表明CPC可有效地抗宽范围的微生物。
季铵化合物在浮游生物细胞中的活性
将胰胨豆胨培养液中的每种大肠杆菌O157：H7的16小时培养物离心(15000rpm，10分钟，4℃)。移去上清液后，沉淀物用10ml 0.04M的磷酸钾缓冲液(PPB，pH7.0)洗涤，然后悬浮在PPB中至最终悬浮液为1-2×109细胞/ml。等分试样(1.0ml)离心(14000rpm，3分钟)，然后移去上清液。每个沉淀物或者悬浮在1ml测试组合物(CPC)的各种浓度(100～1000μg/ml)的水溶液中，或者在1ml PPB中，涡流混合30秒，在25℃孵育1分钟，然后离心(14000rpm，3分钟)。移去上清液后，每个沉淀物悬浮在0.5ml PPB中。使用一式两份0.05ml等分试样和标准系列稀释技术在胰胨豆胨琼脂上对每个样品的细胞进行计数，数据记录为平均集落形成单位数(CFU)/ml。
以上实验的结果表明在所有CPC测试浓度(100、250、500、和1000μg/ml)下实现了悬浮液中存活的大肠杆菌O157：H7的显著减少。该实验的结果对于防止在肉类的工业加工中大肠杆菌O157：H7的交叉污染特别重要。如上所讨论，产生毒素的大肠杆菌菌株表现出对许多广谱抗微生物剂的抵抗力。这些结果证实用QAC处理肉类产品将会防止一片被污染的肉污染其他未被污染的肉，因为QAC将杀死液体中作为导致交叉污染转移剂的生物。
实施例2
季铵化合物对于减少存活细菌粘附到鸡皮肤上的效果
鸡皮肤(2.5×2.5cm)从鸡腿上切下，用来自电子源的45KGy剂量的射线消毒，表皮侧朝上放置在六孔组织培养板的每个孔中。除背景对照组之外，每块皮肤用5ml 0.008M含有6-8×103CFU/ml细菌的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)接种，对照组只用5ml PBS处理。孵育培养板(30分钟，35℃)，然后清洗每块皮肤(2次，5ml PBS)以除去松散结合的(未粘附)微生物。每块接种后的皮肤用5ml含有CPC的PBS处理。每个CPC浓度用三块皮肤，其中包括一块只用5ml PBS处理的皮肤(0浓度)。培养板于25℃在摇动下(100rpm)孵育30分钟，孵育后，清洗每块皮肤(5ml PBS)，置于含有80ml盐水或1％蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用实验室混合器(Stomacher400，Seward Medical，伦敦，英格兰)均质化2分钟。倾注平皿并孵育(37℃，18-24小时)三等份匀浆样品(1ml)。计数细菌集落经校正稀释度，并记录为CFU/皮肤。
这些研究表明在用50-1000ppm的CPC浓度处理之后，存活的细菌(鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏杆菌(不产生毒素的菌株)和大肠埃希氏杆菌O157：H7)减少。最高至8000ppm的CPC更高浓度据测试抗大肠埃希氏杆菌O157：H7，并且发现粘附细菌的数目减少到低于0.1％，这些研究表明这5种细菌在鸡皮肤上的生长受到显著抑制。
实施例3
季铵化合物对于抑制细菌粘附到鸡皮肤上的效果
鸡皮肤(2.5×2.5cm)从鸡腿上切下，用来自电子源的45KGy剂量的射线消毒，表皮侧朝上放置在六孔组织培养板的每个孔中。每块皮肤用5ml 0.008M含有CPC的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)接种。测试化合物的每个浓度用三块皮肤，其中包括一块只用5ml PBS处理的皮肤(0浓度)。培养板于25℃在摇动下(100rpm)孵育不同时间(1分钟或10分钟)。通过抽吸除去孵育溶液，然后清洗皮肤(5mlPBS)，随后用含有6-8×103CFU/ml细菌的5ml PBS在35℃孵育30分钟。孵育后，清洗每块皮肤(2次，5ml PBS)，以除去松散结合的(未粘附)微生物。置于含有80ml盐水或1％蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用实验室混合器(Stomacher400，Seward Medical，伦敦，英格兰)均质化2分钟。倾注平皿并孵育(37℃，18-24小时)三等份匀浆样品(1ml)。计数细菌集落，校正稀释度，并记录为CFU/皮肤。
这些研究表明在用50-1000ppm的CPC浓度处理之后，抑制了细菌(鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏杆菌(不产生毒素的菌株)和大肠埃希氏杆菌O157：H7)粘附到鸡皮肤上。这些研究中的数据表明用CPC预处理鸡皮肤显著地抑制了这些微生物粘附到鸡皮肤上。
用CPC在500ppm和1000ppm下只处理鸡皮肤1分钟便显著抑制鼠伤寒沙门氏菌的粘附。QAC与肉类产品的这种较短接触时间支持采用比先前已经报道的有效接触时间更短的接触时间。一般而言，冷冻柜浸渍可最长持续60分钟，但是本文所列出的数据支持采用更短的接触或浸渍时间，仍然显著减少存活微生物的数目。本发明的CPC接触步骤可以进行约20秒到约60分钟。本发明还公开了使用的接触时间，在少于10分钟的范围内，在约20秒到约9分钟的范围内，约20秒到约5分钟，以及约20秒到约90秒。
实施例4
季铵化合物对于减少粘附在牛肋腹肉排上的存活细菌的效果
牛肋腹组织片(2.5×2.5cm)，约0.5cm厚，用来自电子源的45KGy剂量的射线消毒，放置在六孔组织培养板的每个孔中。除背景对照组之外，每块组织片用5ml 0.008M含有6-8×103CFU/ml细菌的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)接种，对照组只用5ml PBS处理。孵育培养板(30分钟，35℃)，然后清洗每块组织片(2次，5ml PBS)以除去松散结合的(未粘附)微生物。按种后的组织片用5ml含有CPC的PBS处理。测试化合物的每个浓度用三块组织片，其中包括一块只用5mlPBS处理的组织片(0浓度)。培养板于25℃在摇动下(100rpm)孵育30分钟，孵育后，清洗每块组织片(5ml PBS)，置于含有50ml 1％蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用实验室混合器(Stomacher400，Seward Medical，伦敦，英格兰)均质化2分钟。倾注平皿并孵育(37℃，18-24小时)三等份匀浆样品(1ml)。计数细菌集落，校正稀释度，并记录为CFU/组织片。
该研究的结果表明在用50-1000ppm浓度的CPC处理之后，牛肋腹组织上存活的大肠埃希氏杆菌O157：H7减少了，在500和1000ppmCPC下粘附的细菌减少了62-64％。
实施例5
季铵化合物对于抑制细菌粘附到牛肋腹组织上的效果
牛肋腹组织片(2.5×2.5cm)，约0.5cm厚，用来自电子源的45KGy剂量的射线消毒，放置在六孔组织培养板的每个孔中。每块组织片用5ml 0.008M含有CPC的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)处理。测试化合物的每个浓度用三块牛组织片，其中包括一块只用5ml PBS处理的组织片(0浓度)。培养板于25℃在摇动下(100rpm)孵育10分钟。通过抽吸除去孵育溶液，然后清洗组织片(5ml PBS)，随后用含有6-8×103CFU/ml细菌的5ml PBS孵育(35℃，30分钟)。孵育后，清洗每块组织片(2次，5ml PBS)，以除去松散结合的(未粘附)微生物，置于含有50ml 1％蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用实验室混合器(Stomacher400，Seward Medical，伦敦，英格兰)均质化2分钟。倾注平皿并孵育(37℃，18-24小时)三等份匀浆样品(1ml)。计数细菌集落，校正稀释度，并记录为CFU/组织片。
该研究的结果表明在用50-1000ppm的CPC处理之后，大肠埃希氏杆菌O157：H7的粘附受到抑制，在浓度为1000ppmCPC时粘附在牛肉上的细菌数目减少了76％。图1表明采用较高CPC浓度和相同实验程序的单独试验的结果。在20000ppmCPC时，细菌在牛肉上的粘附得到完全抑制。
实施例6
用0.1％十六烷基氯化吡啶鎓喷洒预冷冻的家禽
设计并建造喷洒测试室以用于家禽加工中试工厂。喷洒测试系统由测试室、喷水储存罐、压力泵、过滤器、压力调节器、带有位于4侧的8个喷嘴的塑料喷洒室以及用过的水的收集器组成。在用于向前和向后喷洒的每个管子上有3个喷嘴。一个喷嘴用于顶喷，一个喷嘴用于底喷。室尺寸优选为3×3×3英尺，凭借高压推进泵，压力可以调节到0-140psi。喷嘴和鸡畜体之间的距离为12-15英寸。顶部喷嘴用于喷洒鸡畜体的内部。采用扁平锥喷嘴(1/8TK-SS1，SprayingSystems公司)。
储存罐中的喷洒溶液被抽送至压力调节器中，然后通过喷嘴喷洒到室中。在喷洒室中，安装了由不锈钢喷嘴和管道组成的若干喷洒层，并且该室用塑料板覆盖以防止化学变化。使用钩环将鸡畜体悬挂在室中。
预冷冻的鸡畜体由当地家禽加工厂获得，它们取自内脏摘除加工生产线的末端，运输到科研实验室，然后立即用于试验。从加工厂到科研实验室所用的时间少于半小时，鸡畜体的温度范围是32-37℃。
通过以1×106CFU/ml喷洒1ml鼠伤寒沙门氏菌给鸡畜体接种，然后在室温下孵育30分钟。接种后的鸡畜体通过喷酒30psi、22℃自来水进行、5秒漂洗，以洗掉松散结合的沙门氏菌细胞。随后每个鸡畜体悬挂在喷洒室中，并用测试化合物之一喷洒。喷洒后，每个鸡畜体用自来水漂洗20秒。然后用装在塑料袋中于自动摇动器上的缓冲蛋白胨水清洗鸡畜体，以得到微生物分析用样品。在用测试化合物如QAC处理后的禽类与未处理的禽类之间比较目测检验鸡皮肤的颜色。
在不同喷洒压力和持续时间条件下使用浓度为1000ppm的CPC。喷洒水温设定22℃的室温。压力设定30、50和120psi，且持续时间为30和90秒。每次试验使用三个平行样品。在测试化合物喷洒、水喷洒和无喷洒组之间比较鸡畜体上鼠伤寒沙门氏菌的减少。
喷洒处理之后，每个畜体用100ml缓冲蛋白胨水(BPW)机械振荡1分钟，随后收集洗涤水。样品稀释、富集、倾注平皿到XLT琼脂或Petrifilm上(3M公司，St.Paul；MN，总需氧计数板)，并在37℃下孵育18-24小时。随后计数集落形成单位数目，采用最可几数技术来计算粘附的细菌数目。每个畜体均采用洗涤水样品进行沙门氏菌的最可几数和总需氧板计数。利用偏差分析来分析实验数据以确定处理组和对照组之间是否存在显著差异(SAS/STAT，用户手册，SAS研究公司，Cary，NC，1993)。
该实验的结果表明在压力30、50和120psi下喷洒1000ppm CPC溶液30和90秒显著减少了鸡畜体上沙门氏菌的数目。该数据表明，当压力范围是30-120psi以0.1％CPC浓度喷洒30秒-90秒时，此喷洒方法是浸渍或浸蘸鸡畜体的标准方法的可行替代方法。也可能采用更低的CPC浓度，在30-120或更大psi的公开范围内改变喷洒压力，且改变喷洒时间来得到导致食物源微生物显著减少的最有效工艺。该喷洒工艺可有利地用于工业加工，因为可以在短时间内自动喷洒许多鸡畜体，却仍显著减少病原性细菌。
实施例7
季铵化合物对鸡皮肤上鼠伤寒沙门氏菌的有效浓度和时效研究
研究了CPC对抑制和减少鸡皮肤上存活的鼠伤寒沙门氏菌的效果，测试溶液包含各种浓度CPC(Sigma化学品公司，St.Louis，MO)在5％(v/v)甘油于0.008M、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶液。通过将适当数量的CPC溶解在甘油-PBS混合物中制备这些溶液。从新鲜冷冻、未加工的鸡腿上取下的皮肤片(2.5×2.5cm)用45KGy剂量的射线消毒(来自线形加速器的电子束，爱荷华州立大学)。鼠伤寒沙门氏菌源是ATCC菌株#14028或NCTC菌株#12023。所有的集落在胰胨豆胨琼脂板中(TSA，DIFCO，Detroit，MI)进行计数。沙门氏菌储存在胰胨豆胨琼脂上。接种物的制备按如下进行。含有50ml胰胨豆胨培养基的培养瓶接种以来自一个单集落的鼠伤寒沙门氏菌，随后振荡下(150rpm)孵育(37℃)过夜。培养物的1ml等份样品用9ml PBS洗涤两次(4800rpm，10分钟)。将沉淀物重新悬浮在PBS中以得到最终的细胞浓度为(分光光度法，420nm)1-2×106集落形成单位(CFU)/ml。
从鸡腿上取下鸡皮肤并表皮侧朝上放置在六孔组织培养板的每个孔中。除背景对照组之外，皮肤片用5ml含有1-2×106CFU鼠伤寒沙门氏菌/ml的PBS接种，对照组只用5ml PBS处理。孵育有皮肤片的培养板(30分钟，35℃)，然后通过抽吸除去孵育溶液。接种后的皮肤用5ml测试溶液处理，测试溶液的每个浓度用三片皮肤为一组。其中包括一组只用5ml PBS中的5％(v/v)甘油处理的皮肤(0浓度)。培养板在25℃振荡下(100rpm)孵育1、3、或10分钟。孵育之后，每块皮肤用吸引术漂洗(5mlPBS)，置于含有50ml 0.1％(w/v)蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用Stomacher400实验室混合器(SewardMedical，伦敦，英格兰)均质化2分钟。无菌切开袋的一角，所有内容物转移至无菌离心管中，随后离心10分钟(12000rpm，20℃)。沉淀物重新悬浮在5ml 0.1％(w/v)蛋白胨/水中。三份1ml适当的稀释液倾注平皿到TSA琼脂上，随后在37℃孵育24小时，此后计数集落数，校正稀释度，并记录为CFU/皮肤。该结果表明沙门氏菌的减少取决于CPC浓度和暴露时间两者。用4000和8000ppm的CPC溶液处理、接触时间短至3分钟，可达到大约5log10的去污率。
皮肤片表皮侧朝上放置在六孔组织培养板的每个孔中。皮肤片用5ml测试溶液处理。测试溶液的每个浓度用三片皮肤为一组。其中包括只用5ml PBS中的5％(v/v)甘油处理的皮肤(0浓度)组。有皮肤片的培养板在25℃振荡下(100rpm)孵育1、3、或10分钟，通过抽吸除去孵育溶液，然后漂洗皮肤(5ml PBS)，并随后用5ml含有1-2×106CFU鼠伤寒沙门氏菌/ml的PBS孵育(30分钟，35℃)。孵育之后，每块皮肤用吸引术漂洗(5ml PBS)，置于含有50ml 0.1％(w/v)蛋白胨的消毒塑料袋中，然后采用Stomacher400实验室混合器均质化2分钟。三等份匀浆样品(1ml)倾注平皿到TSA琼脂上，并在37℃孵育24小时，此后计数集落数，校正稀释度，并记录为log10CFU/皮肤。该结果表明通过用CPC预处理来防止沙门氏菌污染也表现出浓度和时间依赖性。在10分钟的预处理时间时观察到最显著的效果，其中在浓度为8000ppm时表现出4.9log10的沙门氏菌粘附抑制率。该结果是重要的，因为防止交叉污染在食品加工中是至关重要的。
对照组的log10CFU/皮肤的数值在4.61-5.03范围内。被处理样品和对照样品之间的差异采用ANOVA进行分析，随后是Newman-Keuls多重范围分析，并具有统计学显著性(p＜0.01)。
在另一个喷洒实验中，用5000ppmCPC溶液喷洒鸡畜体90秒之后，得到3.3log10的沙门氏菌减少率。
实施例8
季铵化合物对于减少粘附到鸡皮肤上的存活单核细胞增生利斯特氏菌的效果
重复实施例2的步骤，只是采用单核细胞增生利斯特氏菌来接种鸡皮肤，并且用于Stomacher 400的塑料袋中的介质含有0.1％蛋白胨。在CPC的浓度为2000ppm或更高时，单核细胞增生利斯特氏菌，有大于4log10的减少率。
实施例9
季铵化合物对于抑制存活的单核细胞增生利斯特氏菌粘附到鸡皮肤上的效果
重复实施例3的步骤，只是采用单核细胞增生利斯特氏菌来接种鸡皮肤，并且用于Stomacher 400的塑料袋中的介质含有0.1％蛋白胨。该研究的结果表明在50ppm时粘附细菌的减少率为82％，在100ppm时减少率为92％，在500ppm和1000ppm时减少率为100％。
实施例10
季铵化合物对于减少粘附到鲇鱼、黑葡萄和花椰菜上的存活鼠伤寒沙门氏菌的效果
研究了CPC对减少鲇鱼、黑葡萄和花椰菜上存活鼠伤寒沙门氏菌的效果。测试溶液包含各种浓度CPC(Sigma化学品公司，St.Louis，MO)在5％(v/v)甘油于0.008M、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶液。通过将适当数量的CPC溶解在甘油-PBS混合物中制备这些溶液。
食物样品是小的无伤黑葡萄、花椰菜小花和从未加工、刚刚解冻的鲇鱼上取下的鲇鱼皮肤片(2.5×2.5cm)。水果和蔬菜购自当地市场，而鱼是购自当地鲇鱼供应商的冷冻鱼。鼠伤寒沙门氏菌源是ATCC菌株#14028或NCTC菌株#12023。
采用沙门氏菌选择性XLD琼脂板(DIFCO，Detroit，MI)对所有的集落进行计数。此外，在鲇鱼实验中，采用非选择性介质胰胨豆胨琼脂(TSA：DIFCO，Detroit，MI)进行总需氧集落计数。沙门氏菌储存在胰胨豆胨琼脂上。
鼠伤寒沙门氏菌接种物的制备如以上实施例7所述进行，食物样品放置在六孔组织培养板的每个孔中。随后除背景对照组之外，样品用5ml含有1-2×106CFU鼠伤寒沙门氏菌/ml的PBS接种，对照组只用5ml PBS处理。孵育有食物样品的培养板(30分钟，35℃)，然后通过抽吸除去孵育溶液。接种后的样品用5ml测试溶液处理，测试溶液的每个浓度用三个食物样品做一组。其中包括一组只用5ml PBS中的5％(v/v)甘油处理的食物样品(0浓度)。培养板在25℃振荡下(100rpm)孵育3分钟。孵育之后，制备每个食物样品，并置于塑料袋中以供如以上实施例7所述的Stomacher400实验室混合器使用。无菌切开袋的一角，所有内容物转移至无菌离心管中，随后离心10分钟(12000rpm，20℃)。沉淀物重新悬浮在5ml 0.1％(w/v)蛋白胨/水中。一式三份1ml适当的稀释液倾注平皿到XLD琼脂上(葡萄和花椰菜实验)，以及到XLD和TSA琼脂两者上(鲇鱼)。在37℃孵育24小时后，计数集落，校正稀释度，并记录为CFU/皮肤(鲇鱼)和CFU/克(其他食物样品)。这些实验的结果如图2-5所示。由于鲇鱼没有辐照，图2表示在非选择性介质上的总需氧细菌计数，而图3只表示沙门氏菌计数。
实施例11
喷洒季铵化合物对于减少整鸡上存活细菌的效果
这些实验测试使用商品化喷洒器在整鸡畜体上喷洒QAC对于减少存活细菌的效果。细菌接种溶液按如下所述制备：大肠杆菌(ATTC#25922)在脑心浸液培养基(BHI)中生长20-24小时，随后通过将0.5ml大肠杆菌培养物加入到500ml生理盐水溶液(PSS)中将其稀释到1∶1000浓度。鼠伤寒沙门氏菌在BHI中生长20-24小时，随后通过将0.1ml鼠伤寒沙门氏菌培养物加入到500ml生理盐水溶液(PSS)中将其稀释到1∶5000浓度。每个试验的预冷鸡畜体来自当地的家禽加工厂。畜体放置在钩环线上，将1ml细菌接种溶液喷洒到畜体的胸部，1ml喷洒到背部。让细菌在室温下粘附30分钟。粘附后，畜体在钩环线上用自来水漂洗20秒。畜体分成10个一组，对于每次测试，有10只鸡的一组用5000ppmCPC喷洒，而10只鸡的另一组只用自来水喷洒。在鼠伤寒沙门氏菌测试中，还有一组在接种后不喷洒，以评价喷洒的效果。
对于所有的细菌，一组畜体用JohnsonTM洗涤机和35杯自来水在60psi处理20秒。清洗之后，让畜体静置90秒，然后用20杯自来水在80psi清洗20秒。此清洗循环重复两或三次，每次清洗的间隔还是90秒。另一组畜体在JohnsonTM洗涤机中用5000ppmCPC于60psi处理20秒，随后静置90秒，然后用20杯自来水在80psi清洗20秒。此清洗循环重复两或三次。
处理后，畜体置于塑料袋中，并向每个袋中加入100ml 0.1％的缓冲蛋白胨水(BPW)。机械振荡这些袋，收集漂洗液并供最可几数(MPN)技术分析用。也采用PetrifilmTM来评价总需氧板计数(TPC)。原先存在的(未接种)空肠弯曲杆菌通过MPN技术计数，而大肠杆菌采用PetrifilmTM。
如下列出的结果表明，CPC处理可有效地减少空肠弯曲杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的数目。测试了鼠伤寒沙门氏菌所用的洗涤水，发现洗涤水中的CPC使沙门氏菌减少了1log。因此，如下列出的沙门氏菌杀灭数据可减少1log。
                              存在的细菌
    水，对照例     5000ppmCPC    减少率，Log10
    空肠弯曲杆菌   试验1     2.613     0     2.613
  试验2     2.643     0.629     2.014
    大肠杆菌   试验1     1.974     0.386     1.588
  试验2     1.380     0.460     0.920
鼠伤寒沙门氏菌     无喷洒，对照例   喷洒，对照例   5000ppmCPC       减少率，Log10CFU
    无喷洒对CPC处理     喷洒对CPC处理
1(12/02/96)     5.342   5.039   4.295     1.047     0.744
2(12/09/96)     5.304   4.932   1.977     3.327     2.955
3(12/16/96)     5.001   5.154   2.606     2.395     2.548
4(01/27/97)     4.72   4.48   1.03     3.69     3.45
5(02/03/97)     4.185   4.212   1.426     2.76     2.79
实施例12
季铵化合物对食物源真菌的效果
此研究测试CPC对食物源真菌的效果。黄曲霉菌和产黄青霉菌的斜面培养物划线接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)板上。接种后30分钟或接种(和在室温孵育)后24小时，两个圆形过滤器(直径7mm)放在每块板的表面上。200ppm、1000ppm、5000ppm和25000ppmCPC溶液，或蒸馏水和去离子水(DD)，加入到过滤器中，每个过滤器10微升。所有板盖朝上在室温下孵育48小时。测量抑制环的直径，下面列出的结果表明CPC可有效地抗食物源真菌。
            CPC对黄曲霉菌的效果
    CPC浓度(ppm)          抑制环(mm)
    立即处理     延迟处理
    25000     1.63     1.00
    5000     2.00     0.92
    1000     0.38     1.00
    200     0.25     0.33
    0     0     0
            CPC对产黄青霉菌的效果
    CPC浓度(ppm)        抑制环(mm)
  立即处理   延迟处理
    25000     4.13     1.83
    5000     3.38     1.92
    1000     1.00     1.67
    200     0     1.17
    0     0     0
CPC可有效地抗所测试的食物源真菌。
实施例13
季铵化合物采用短施用时间对鸡畜体的效果
在市售烤制加工设备中进行的两个试验中，由含有CPC(40％)、丙二醇(57％)和水(3％)的CPC浓液(所有组分均基于重量百分比)稀释得到的CecureTM制剂(0.2-0.5％CPC)，用于处理冷冻后的鸡畜体。这些研究中，设在分级和包装之前，但在浸渍冷冻之后的最后漂洗室或“fecal failure”室，经改造被用于施用CPC配方。室的改动包括改变喷嘴以使每只畜体只使用少量(1-6盎司)的该制剂，并且改动在畜体上的喷洒图案以达到最大表面积的覆盖。此外，扩展室的长度，并安装室排气装置。浓缩的CecureTM制剂或者稀释到可直接应用于畜体的正确使用浓度，或者在施用前稀释并且保存在大容器中。稀释的CecureTM溶液向每个畜体上施用约1.5秒，溶液的温度为环境室温或稍高或稍低，取决于储存条件。
畜体用稀释的CecureTM处理之后，在微生物取样之前让畜体滴流约3分钟。畜体是采用在400ml缓冲蛋白胨水中整体清洗技术取样的。用弯曲杆菌、沙门氏菌、不产生毒素的大肠杆菌以及估计总生物体的需氧板计数来评价样品。对同样这些生物体，还做了对照畜体评估，但后者是刚好在改动fecal failure室之前收集的。在两个试验中，弯曲杆菌、大肠杆菌和需氧板计数(总需氧细菌)明显减少，超过99％。在两个试验中，沙门氏菌的发生率明显减少到小于10％阳性，而对照畜体沙门氏菌的发生率在某些情况下大于60％。
以上对本发明优选实施方案的描述是出于说明的目的而作出的，并不意味着将本发明限制在实施例中使用的特定组合物，因为按照上述内容可以对本发明作出各种修改。本发明基于发现QAC在比迄今已知更为显著的程度上防止和减少由广谱食物源微生物污染引起的细菌污染。在食品加工厂，浓QAC配方提供了大规模使用的许多优点。本发明旨在覆盖可以包括在本发明的实质和范畴内、由附加权利要求规定的替代的、修改的和等同的内容。

Claims (43)

1.一种季铵化合物浓溶液，包含：
一种季铵化合物，其浓度为大于约10重量％；和
至少一种增溶剂。
2.权利要求1的溶液，其中所述增溶剂是一种醇或一种聚二醇。
3.权利要求2的溶液，其中所述增溶剂选自一元醇、二元醇、三元醇、聚乙二醇及其组合。
4.权利要求3的溶液，其中所述一元醇是一种脂肪族醇，所述二元醇是一种二醇或其衍生物，所述三元醇是甘油或其衍生物。
5.权利要求4的溶液，其中所述季铵化合物的用量范围是大于约10重量％～约60重量％。
6.权利要求5的溶液，其中所述季铵化合物的用量范围是大于约10重量％～约50重量％。
7.权利要求6的溶液，其中所述季铵化合物的用量范围是大于约10重量％～约40重量％。
8.权利要求7的溶液，其中所述季铵化合物的用量范围是大于约10重量％～约30重量％。
9.权利要求8的溶液，其中所述季铵化合物的用量范围是约15重量％～约25重量％。
10.权利要求5的溶液，其中所述增溶剂的存在浓度为最高约70重量％。
11.权利要求10的溶液，其中所述增溶剂的存在浓度范围是约10重量％～约60重量％。
12.权利要求6的溶液，其中所述醇的存在浓度范围是约10重量％～约60重量％。
13.权利要求7的溶液，其中所述醇的存在浓度范围是约10重量％～约60重量％。
14.权利要求13的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，且所述醇的存在浓度范围是约50重量％～约60重量％。
15.权利要求14的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，且所述醇的存在浓度范围是约55重量％～约60重量％，且其中所述溶液进一步包含最高约5重量％的水。
16.权利要求15的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，所述醇的存在浓度是约57重量％，且存在约3重量％的所述水。
17.权利要求14的溶液，其中所述醇是丙二醇。
18.权利要求15的溶液，其中所述醇是丙二醇。
19.权利要求16的溶液，其中所述醇是丙二醇。
20.权利要求5的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，且所述醇的存在浓度是约50重量％。
21.权利要求5的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约20重量％，且所述醇的存在浓度是约50重量％。
22.权利要求20的溶液，其中所述醇是乙醇和丙二醇的组合。
23.权利要求21的溶液，其中所述醇是乙醇和丙二醇的组合。
24.权利要求5的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，且所述醇是甘油，其存在浓度为最高约20重量％。
25.权利要求1的溶液，其中所述季铵化合物选自烷基吡啶鎓盐、四烷基铵盐和烷基脂环族铵盐。
26.权利要求25的溶液，其中所述季铵盐是一种烷基吡啶鎓盐。
27.权利要求26的溶液，其中所述烷基吡啶鎓盐是十六烷基氯化吡啶鎓。
28.权利要求16的溶液，其中所述季铵化合物选自烷基吡啶鎓盐、四烷基铵盐和烷基脂环族铵盐。
29.权利要求28的溶液，其中所述季铵盐是一种烷基吡啶鎓盐。
30.权利要求29的溶液，其中所述烷基吡啶鎓盐是十六烷基氯化吡啶鎓。
31.一种季铵化合物浓溶液，它基本上由：
一种季铵化合物，其浓度为大于约10重量％；和
至少一种增溶剂组成。
32.权利要求31的溶液，其中所述季铵化合物的存在浓度是约40重量％，且所述增溶剂的存在浓度范围是约50重量％～约60重量％。
33.权利要求32的溶液，其中所述季铵化合物是十六烷基氯化吡啶鎓，且所述增溶剂是丙二醇。
34.一种季铵化合物溶液，它基本上由：
一种季铵化合物，其浓度为最高约1重量％；
至少一种增溶剂；和
水组成。
35.权利要求34的溶液，其中所述季铵化合物的浓度为约0.01％～约1％。
36.权利要求35的溶液，其中所述增溶剂是一种醇或一种聚二醇。
37.权利要求36的溶液，其中所述增溶剂选自一元醇、二元醇、三元醇、聚乙二醇及其组合。
38.权利要求37的溶液，其中所述一元醇是脂肪乙醇，所述二元醇是一种二醇或其衍生物，所述三元醇是甘油或其衍生物。
39.权利要求34的溶液，其中所述溶液呈可喷洒或可喷雾的形式。
40.一种防止微生物在食品上生长的方法，它包括：
将所述食品与抑制微生物生长有效用量的季铵化合物接触，其中所述化合物的施用时间为至少几分之一秒，便可防止微生物在所述食品上的生长。
41.权利要求40的方法，其中所述施用时间为约0.1秒～约5秒。
42.权利要求41的方法，其中所述施用时间为约1秒～约5秒。
43.权利要求40的方法，其中所述接触是通过喷洒或喷雾进行的。
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