CN1439426A

CN1439426A - 一种药物组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN1439426A
Application number: CN 03117578
Authority: CN
Inventors: 陈云华; 李军; 刘艳
Original assignee: LIER PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU CITY
Current assignee: LIER PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU CITY
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2003-09-03
Anticipated expiration: 2023-03-31
Also published as: CN1175899C

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，它是一种单位制剂，其中每单位制剂中含有甘露聚糖肽5～30mg。本发明的甘露聚糖肽是从α－溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus－α－hemolysis)的发酵产物中，提取精制而成。该药物组合物的剂型是胶囊剂。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物成分清楚、疗效确切、服用量小，生产工艺较简单，质量稳定、易于控制等优点；服用、运输、贮存与携带方便。

Description

一种药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明提供了一种药物组合物及其制备方法和用途，具体的说，是含有甘露聚糖肽的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

随着环境的改变，人类肿瘤的发生率不断提高，发生年龄也较过去降低，寻找安全、有效的抗肿瘤药物是人类一直努力的目标。

通过人体防御机理进行肿瘤治疗，是70年代末期由美国国立癌症研究所提倡，80年代在世界范围内逐渐开展，日本在采用免疫激活剂抗肿瘤的研究和开发方面走在前列，已批准生产上市的溶血性链球菌(OK-432)的链球菌制剂1975年上市，云芝胞内多糖(PSK即Krestin)真菌多糖制剂1977年上市，两种药品的销售额每年达1000亿日元，行销世界，销售额占日本抗肿瘤药品的一半，1985年十二月又批准上市的香菇多糖注射剂，正在申请批准的Sohizop-hyllan(SPG)系列皱菌属提取的葡聚糖注射剂、ruburatin诺卡氏菌菌体注射剂和bestatin(苯丁异亮氨酸)口服剂，还有十种类似的免疫激活剂正在临床研究。这类药物能激活机体的免疫功能，通过改变肿瘤宿主对肿瘤细胞的反应能力，改变肿瘤细胞与宿主的关系，以达到治疗肿瘤疾患的效果。日本的溶血性链球菌SU(OK-432)是减毒的溶血性链球菌菌体悬浮于青霉素中的一种生物制剂，副反应较重，主要副反应是发热，注射部位疼痛及细胞减少而应用受限。

中国专利98121898公开了“一种复合甘露聚糖肽口服液”，该口服液中含有多种成分，其甘露聚糖肽分别来自担子真菌、隔担子真菌、多孔目真菌，伞科真菌，成分较为复杂，口服剂量大。

寻找一种新的疗效确切、成分清楚、方便服用的抗肿瘤药物十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的药物组合物。

本发明的另一目的是提供这种药物组合物的制备方法。

本发明的药物组合物是一种单位制剂，每单位制剂中含有甘露聚糖肽5～30mg。

本发明所述的甘露聚糖肽是由以下方法制备得到：

a、以α-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)为生产菌进行发酵；

b、收集发酵液，提取纯化甘露聚糖肽。

步骤b的提取全过程的PH值保持为1.5至5.0，所使用的溶剂为60％-99.9％的乙醇。

本发明的甘露聚糖肽是从α-溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus-α-hemolysis)发酵产物中提取精制而成的一种具有药理活性的甘露聚糖肽类物质。有关专家在克山病的研究中，根据日本采用溶血性链球菌菌体制剂(OK-432)作为抗肿瘤免疫增强剂的基础上提出采用溶血性链球菌代谢产物抗肿瘤的设想，经过菌种选育和鉴别，发酵生产工艺的研究，发现自人口腔分离得到的α-溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus-α-Hemolysis)的发酵产物中含有的α-甘露聚糖肽具有能增强机体的免疫功能、抗炎，升高白细胞，保护和增强骨髓干细胞等多种生理活性。

本发明的药物组合物的制剂是胶囊。

所述的胶囊是由以下方法制备的：

取甘露聚糖肽溶解后，加入药学上常用的辅料制成软材，制粒，干燥，整粒，加入药学上常用的润滑剂混合均匀，填充胶囊，分装，使每粒胶囊含有甘露聚糖肽5～30mg。

本发明还提供该药物组合物是能增强人体免疫机能的药物，具体的说它是肿瘤辅助治疗药物；它还是治疗反复呼吸道感染的药物，它也是治疗白细胞减少症的药物，它还是治疗再生障碍性贫血的药物。

本发明的甘露聚糖肽的副反应轻微，特别是经口服具有与注射相同的药效而应用较广，日本的云芝胞内多糖(PSK)与甘露聚糖肽均为多糖类物质，但成份复杂，口服用药量大(为甘露聚糖肽的200倍)，其费用较高，而甘露聚糖肽口服用药量小，费用较低，疗效确切。

胶囊剂与片剂、注射液、冻干粉针剂、口服液等相比较，具有生产工艺较简单，质量稳定、易于控制等优点。与注射剂、冻干粉针剂、口服液相比较，其服用、运输、贮存与携带更为方便，所以本发明选用胶囊剂。本发明的胶囊剂在临床上主要用于免疫功能低下，反复呼吸道感染，白细胞减少症的治疗，及再生障碍性贫血及肿瘤治疗的辅助治疗。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式实例1甘露聚糖肽的制备：

发酵过程：i、菌种的制备：选用菌种是α-溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus-α-hemolysis)；

培养基：菌种培养基：葡萄糖0.4-0.8％、氯化钠0.4-0.8％、蛋白

胨0.4-1％、牛肉膏0.1-0.5％、绵羊血10％、琼脂1.5-2％、

PH7.2-7.8

发酵培养基：葡萄糖0.1-0.5％、蛋白胨0.4-0.7％、酵母膏0.4-0.6％、

氯化钠0.4-0.8％、泡敌0.01％

提取、精制过程所需原辅材料：酒精、丙酮、三氯乙酸、无水乙醇

a、母瓶制备：启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面。18-45℃恒温培养24h；

b、子瓶制备：将培养好的血斜面菌种在无菌条件下按1-8％接种量接入肉汤培养基内，18-45℃恒温培养10-24h；

c、菌种培养基灭菌温度为120-124℃，灭菌时间30分钟，灭菌蒸汽压力0.12-0.14Mpa；

d、发酵：将优良的子瓶菌种在无菌条件下按0.2％接种量接入发酵罐，全过程18-45℃恒温培养，无菌空气进气量以能翻动培养液为宜，罐压不超过0.01Mpa，发酵周期20-100小时。发酵培养基灭菌温度为120-124℃，蒸汽压力为0.12-0.14Mpa，时间30min；发酵至20-100小时，灭活放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到80℃，恒温30-50分钟后再降温放罐，进行浓缩，使浓缩液比重控制在1.20-1.22即可；

ii、提取：

a、将i步骤的浓缩液加入1-5倍体积量的乙醇，充分搅拌静置后离心去除上清液即得到沉淀物；

b、将所得沉淀物用蒸馏水溶解，调PH，得到溶解液并将溶解液静置并控制静置后的溶解液PH值；

c、将溶解液离心去除杂质得到清液，准确量取清液体积，调PH值，按清液体积计算出所需酒精量，将酒精缓慢加入到清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物；

d、以上提取方法按从b-c步骤反复操作至中间检测合格为止，即得到的沉淀物为甘露聚糖肽半成品；

iii、精制：将ii步骤反复提取得到的甘露聚糖肽半成品沉淀物，取样检测符合质量标准后，用无水乙醇进行一次脱水，充分研磨成粉状，得到一次湿粉，再用丙酮进行二次脱水，充分搅拌得到二次湿粉，将二次湿粉在60-100℃烘烤4-10小时即得甘露聚糖肽。

其中ii步骤的提取过程中活性炭的使用方法：使用量为1L溶解液所需活性炭1-10g，加入活性炭后调溶解液PH值，将该液体在40-100℃温度下保温20-70min，离心，并控制炭脱液PH值。

上述提取全过程中的PH值保持为1.5至5.0。

ii步骤的提取过程中的乙醇浓度为60-99.9％。实例2上述方法得到的半成品和成品的鉴定1、半成品的鉴定：

i、吸收度测定：取半成品小样适量，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VI A)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

ii、含量测定：

a、对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50μg。

b、供试品的制备取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。

c、标准曲线的制备精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0m，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖μg数对相应的吸收度，计算回归方程。

d、测定法精密量取供品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。2、成品的鉴定：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并，加水溶解并稀释成每

1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版

二部附录VIE)，比旋度为+70°至+80°。

[鉴别]

i、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5→100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

ii、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10μl点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高碘酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后，加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红亚硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

iii、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]

i、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0~5.0。

ii、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VI A)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

iii、总氮量度：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D第二法)测定，按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

iv、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

v、干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIII队L)。

vi、重金属取本品1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H)，含重金属不得过百万分之二十。

vii、异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XI C)，按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

[含量测定]

b、供试品的制备取不同含量的甘露聚糖肽供试品5份，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。

d、测定法精密量取供品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

经测定，上述方法得到的产品为甘露聚糖肽，含量分别为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg。甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)1、试液

磷酸盐缓冲液(pH7.2)取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g、枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃灭菌容器中，4℃保存)。

1％羊血红细胞悬液的制备取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65~0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液。取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃、30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血单位的测定取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血素等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭菌)。

抗体单位的测定取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4~8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。2、免疫原性测定法

取甘露聚糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4~8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

使用上述方法制备的甘露聚糖肽进行相关的药理实验。这些试验包括药效学试验，临床疗效观察试验，药理毒理学试验。试验例1药理学试验1、本发明药物对免疫活性的影响1-1对小鼠网状皮系统吞噬功能的影响1-1-1实验动物：昆明种小鼠，由四川抗菌素工业研究所动物房提供。1-1-2受试药物：本发明药物1-1-3实验方法：

正常小鼠分组，分别灌胃不同的剂量的本发明药物，每日一次，连续5日，于末次给药后次日，各组动物ivl：2-5(广州墨水厂绘图墨水，用0.5％明胶溶解稀释)按Biolli方法测定和计算吞噬指数K值。

小鼠皮下接种S₁₈₀肉瘤后次日，分别灌胃或肌注本发明药物，每日一次，连续10日，于末次给药后次日，按上法测定和计算K值。1-1-4实验结果

正常小鼠的结果见表1，表2。

表1口服本发明药物对小鼠RES吞噬功能的影响

剂量(MG/KG.DX5D)	N	K值	P值
剂量(MG/KG.DX5D)	N	K值	P值	400	10	0.1199±0.0240	＜0.05
200	10	0.1427±0.0335	＜0.05	400	10	0.1199±0.0240	＜0.05
200	10	0.1427±0.0335	＜0.05	100	10	0.0979±0.0223	＞0.05
对照	0.0993±0.0265			100	10	0.0979±0.0223	＞0.05

表2口服本发明药物对小鼠RES吞噬功能的影响

剂量(MG/KG.DX5D)	途径	N	K值	P值
剂量(MG/KG.DX5D)	途径	N	K值	P值	200	口服	10	0.1187±0.0166	＜0.05
100	肌注	10	0.1229±0.0131	＜0.05	200	口服	10	0.1187±0.0166	＜0.05
100	肌注	10	0.1229±0.0131	＜0.05	对照		10	0.960±0.0131

结果显示，正常小鼠灌胃本发明药物200mg/kg连续五日，与肌注本发明药物100mg/kg一样，网状皮质系统吞噬功能亦显著增强。

S180荷瘤小鼠的结果见表3

表3口服本发明药物对S180荷瘤小鼠RES吞噬功能的影响

剂量(MG/KG.Dx5D)	途径	N	K值	P值
剂量(MG/KG.Dx5D)	途径	N	K值	P值	200	口服	10	0.1205±0.0130	＜0.05
100	肌注	10	0.1056±0.260	＜0.05	200	口服	10	0.1205±0.0130	＜0.05
100	肌注	10	0.1056±0.260	＜0.05	对照		10	0.0780±0.0170

由表五可见，本发明药物无论是灌胃还是肌注，均能显著提高S180荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能。1-2对腹腔巨噬细胞(M)吞噬功能的影响1-2-1实验方法

小鼠分组后，分别灌胃本发明药物40和200mg/kg，每日一次，连续三日，于停药后第二日处死各组动物，以Hanks液洗出腹腔渗出细胞，加入鸡红细胞(CRBC)，混匀后滴于载玻片上，湿盆中37℃孵育30分钟，漂洗去掉未粘附细胞，Mφ则粘在玻片上，Giemas染色后在油镜下数计吞噬率(吞噬CRBC的Mφ占总Mφ的百分率)及吞噬指数(平均每个Mφ吞噬的CRBC数)1-2-2实验结果，见表4。

表4口服本发明药物对小鼠吞噬功能的影响

剂量(MG/KG.DX3D)	N	吞噬率(％)	吞噬指数
剂量(MG/KG.DX3D)	N	吞噬率(％)	吞噬指数	对照	7	17.1±4.7	0.217±0.080
40	8	33.9±5.9^**	0.501±0.179^*	对照	7	17.1±4.7	0.217±0.080
40	8	33.9±5.9^**	0.501±0.179^*	200	8	37.3±8.2^**	0.526±0.171^**

^**：与对照组比较P＜0.001；^*P＜0.01。

结果表明，小鼠灌胃本发明药物40mg/kg连续3天，能显著提高Mφ对cRBC的吞噬率和吞噬指数。

1-3对小鼠溶血素生成的影响

1-3-1实验动物：同1-2-1项下。

1-3-2受试药物：同1-2-2项下。

1-3-3实验方法：

小鼠肌注sRBC4×10⁸/只免疫后，随机分为两组，一组立即灌服本发明药物40mg/kg，每日一次，连续三日；另一组为生理盐水对照组。两组动物于免疫后3、5、7、10、15、20天，从尾静脉取血，按溶血素连续测定法测定血中抗sRBC抗体—溶血素水平。

1-3-4实验结果，见表5。

表5口服本发明药物对小鼠溶血素水平的影响

免疫后天数	HC50		P值
	HC50			对照组(N＝8)	本发明药物组(N＝9)
	3	1.8±1.7		对照组(N＝8)	本发明药物组(N＝9)	3.1±1.2	＞0.005
5	3	1.8±1.7	174.2±43.5	479.4±57.4	＜0.001	3.1±1.2	＞0.005
5	7	108.1±45.0	174.2±43.5	479.4±57.4	＜0.001	294.7±63.4	＜0.01
10	7	108.1±45.0	71.3±31.1	114.4±33.5	＜0.05	294.7±63.4	＜0.01
10	15	68.6±42.1	71.3±31.1	114.4±33.5	＜0.05	138.3±38.3	＜0.01
20	15	68.6±42.1	6.9±15.2	18.1±21.1	＜0.01	138.3±38.3	＜0.01

注：本发明药物剂量：40mg/kgd×3d.

结果显示，小鼠灌服本发明药物40mg/kg，连续三日，在免疫后3～20天，溶血素水平一直显著高于正常对照组，两组都于免疫后5天达到峰值，表明本发明药物口服也能增强机体的体液免疫反应。

1-4对小鼠脾淋巴细胞白介素2(IL-2)生成的影响

1-4-1实验动物：C57BL/6J小鼠，体重20～24克，14周龄，由川抗所动物房提供。

1-4-2受试药物：本发明药物。

1-4-3实验方法：

正常小鼠分为两面三刀组，一组灌服本发明药物200mg/kg，每日一次，连续10天；另一组给生理盐水作对照组。于末次给药后次日，处死动物，无菌制备脾淋巴细胞1×10⁷/ml，加入ConA(10μg/ml)，混匀，置CO₂培养箱37℃培养36小时，离心，取上清液，置于96孔微板，加入CTLL细胞1×10⁴/孔，再培养24小时，后加入3H-TdR1μci/孔，培养16小时后，测量3H-TdR掺入CTLL细胞的量(cpm值)，并计算生长指数GI。

C57BL/6J小鼠皮下接种Lewis肺癌后次日，按上述方法分组，给药和测量3H-TdR掺入CTLL细胞量，并计算GI。

1-4-4实验结果：见表6。

表6口服本发明药物对C57BL/6J Lewis的肺癌生长及IL-2生成的影响

动物	药物	给药方案	瘤重(mg)	IL-2水平
				IL-2水平		GI	P
				正常小鼠	本发明药物	GI	P	200mg/kg.d×10d		33.47±5.3	＜0.01
生理盐水			19.15±1.2		本发明药物			200mg/kg.d×10d		33.47±5.3
生理盐水			19.15±1.2		荷瘤小鼠	本发明药物	200mg/kg.d×10d	43.2±17.9^*	20.05±2.1	＜0.01
生理盐水		63.4±21.6	13.17±2.7			本发明药物	200mg/kg.d×10d	43.2±17.9^*	20.05±2.1

^*：与对照组比较P＜0.01。

结果表明，连续灌服本发明药物200mg/kg十日，可明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长；能显著提高正常小鼠脾细胞产生IL-2的能力；小鼠接种Lewis肺癌后，产生IL-2的能力大大降低，灌服本发明药物后，可使其生成IL-2的能力恢复到正常水平。2、本发明药物对造血干细胞的作用

2-1实验动物：同1-2-1项下。

2-2受试药物：同1-2-2项下。

2-3实验方法：

小鼠分供体组和受体组，供体组又分为给药组和对照组，两供体组小鼠分别灌服本发明药物(40mg/kg，每日一次，连续六日)及生理盐水，第七天取出各鼠股骨骨髓细胞，制单细胞悬液，分别静脉注射给经⁶⁰Co照射750rad的受体组小鼠，9天后计数受体鼠脾脏集落(CFU-S)数。2-4实验结果：见表7。

表7口服本发明药物对小鼠造血干细胞的作用

组别	N	CFU-S数/脾	P值
组别	N	CFU-S数/脾	P值	对照组	6	20.8±9.6	＜0.01
给药组	6	40.3±6.4		对照组	6	20.8±9.6

注：本发明药物剂量40mg/kg。

由表可见，连续灌服本发明药物40mg/kg三日的供体组小鼠，其相应的受体鼠平均脾脏CFU-S数显著高于对照组，说明口服本发明药物也可促进造血干细胞的增生。3、结论

口服本发明药物对小鼠艾氏腹水癌实体瘤的生长有明显抑制作用；能增强正常及荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能、巨噬细胞吞噬功能，增加小鼠抗体一溶血素生成，显著提高正常及荷瘤小鼠脾细胞产生IL-2能力等免疫活性；还可促进小鼠造血干细胞的增生。实验例二本发明药物临床验证资料总结

白细胞减少症及免疫功能低下，特别是放化疗后白细胞减少及免疫功能低下，在临床上较为多见。本类病人具有病症较重，难于恢复的特点，治疗上较为棘手。由此，研究治疗放化疗后白细胞减少及免疫功能低下，在临床上具有重要的意义。本临床验证药物系甘露聚糖肽胶囊，目的是对其胶囊制剂的疗效和安全性进行观察和评定。

通过对200例白细胞减少及免疫功能低下患者的临床治疗对照观察，用本发明的药物组合物，用不同含量的药物给药，选择治疗组分别为单位制剂中含有甘露聚糖肽6mg、10mg、15mg、24mg、30mg，对照组为甘露聚糖片剂(成都利尔药业)，结果表明：1、本发明药物各剂量组对白细胞减少症，具有较好疗效，其临床显效率42.8％，有效率49.5％，总有效率92.3％。与对照组比较，P＜0.05，有显著性差异；2、两组患者治疗后，T细胞亚群(OKT4、OKT8、OKT4/OKT8)，均有一定提高，其有效率68.4％，两组疗效比较，P＜0.05，无显著性差异；3、两组患者治疗后免疫球蛋白(IgM、IgA、IgC)比较，经统计学处理，P＞0.05，无显著性差异，其有效率为67.3％；4、两组患者NK细胞的比较，P＞0.05，无显著性差异，其有效率为79.3％。

根据以上结果，说明选择不同剂量的甘露聚糖肽胶囊治疗放化疗后白细胞减少及免疫功能低下，在临床上，具有较好疗效。

在临床疗效观察的同时，各剂量的甘露聚糖肽胶囊对部分病员分别进行了治疗前后肝、肾功等检测及临床症状的观察，均未见毒副作用存在。

本发明药物作为治疗放化疗后白细胞减少及免疫功能低下的一种制剂，其疗效满意，服用方便、安全，为临床放化化白细胞减少及免疫功能低下的治疗，提供了新的治疗选择。实验例三本发明药物的的毒理研究

1、急性毒性

小鼠和大鼠口服本发明药物5g/Kg后，均无不良反应；小鼠和大鼠肌注本发明药物2g/Kg后，仅出现个别小鼠死亡，表明口服或肌注该药，毒性都很低。

小鼠和大鼠静脉注射本发明药物，其死亡率与剂量大小不成正比关系。犬静脉注射本发明药物5.2mg/Kg(相当于人用量的25倍)，仅出现短暂四肢无力等轻微反应，当剂量提高至25mg/Kg后，则出现四肢无力、卧地、呕吐、大便失禁、呼吸减弱最后死亡的严重毒性反应。提示在临床上作静脉注射时应慎用。

2、长期毒性

大鼠肌注本发明药物4mg/Kg，每天一次，连续2个月和4个月；犬肌肉注射10mg/Kg，每天一次，连续3个月，动物的肝肾功能、血象、尿常规检查和各脏器的组织形态均无异常改变。说明该药的亚急性毒性亦很小。

3、过敏试验和刺激性试验均为阴性。

4、特殊毒性

(1)致突变：本发明药物对小鼠多染红细胞微核发生率无明显影响1。肌注本发明药物50mg/Kg(相当于人用量的250倍)小显性致死结果为阴性。

(2)致畸胎：

多次静脉注射本发明药物100mg/Kg对小鼠妊鼠的生育力、胎仔骨骼和内脏发育均无显著影响^[28]。小鼠口服本发明药物200mg/Kg(相当于人用量的300多倍)连续六天，对母鼠平均增重、胚胎发育、胎鼠平均体重及尾长、外观、内脏和骨骼畸形检出率均无显著影响。

通过实施例的方式来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

甘露聚糖肽 50g 淀粉 720g

蒸馏水适量硬脂酸镁 20g

取甘露聚糖肽50g，用50～60℃蒸馏水适量溶解后，加淀粉制成软材，用14目尼龙筛制粒，50℃干燥，用12目筛整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀，填充胶囊，分装制成1000粒即得。

实施例2

甘露聚糖肽 100g 淀粉 682g

蒸馏水适量硬脂酸镁 8g

取甘露聚糖肽100g，用50～60℃蒸馏水适量溶解后，加淀粉制成软材，用14目尼龙筛制粒，50℃干燥，用12目筛整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀，填充胶囊，分装制成1000粒即得。

实施例3

甘露聚糖肽 300g 淀粉 480g

蒸馏水适量硬脂酸镁 20g

取甘露聚糖肽300g，用50～60℃蒸馏水适量溶解后，加淀粉制成软材，用14目尼龙筛制粒，50℃干燥，用12目筛整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀，填充胶囊，分装制成1000粒即得。

Claims

1、一种药物组合物，其特征是：每单位制剂中含有甘露聚糖肽5～30mg。

2、根据权利要求1所述的药物组合物，其特征是：所述的甘露聚糖肽是由以下方法制备得到：

b、收集发酵液，提取纯化甘露聚糖肽。

3、根据权利要求2所述的药物组合物，其特征是：制备甘露聚糖肽的方法步骤b的提取全过程的PH值保持为1.5至5.0。

4、根据权利要求2所述的药物组合物，其特征是：制备甘露聚糖肽的方法步骤b中所使用的溶剂为60％-99.9％的乙醇。

5、根据权利要求1所述的药物组合物，其特征是：所述的制剂是胶囊。

6、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征是：所述的胶囊是由以下方法制备的：

7、权利要求1所述的药物组合物，其特征是：它是能增强人体免疫机能的药物。

8、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征是：它是肿瘤辅助治疗药物。

9、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征是：它是治疗反复呼吸道感染的药物。

10、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征是：它是治疗白细胞减少症的药物。

11、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征是：它是治疗再生障碍性贫血的药物。