CN1871931A - 一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含松籽壳或松籽粉及其提取物的、能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂及其制备方法。本发明所述松籽粉饲料添加剂含有下列组分：松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣经粉碎得到的松籽粉和/或残渣经提取得到的松籽提取物粉末。其中松籽粉或者松籽提取物粉末中含有0.1％～0.8％的多糖，10％～40％的蛋白质和/或氨基酸，和/或0.5％～15％的脂肪酸。松籽提取物粉末中含有5％～40％的多糖；含有40％～70％的蛋白质和/或氨基酸。所述多糖中包括60％～90％的水溶性多糖和10％～40％的酸性多糖。所述松籽壳或松籽为：云南松、思茅松、马尾松、油松、红松、华山松、黑松或湿地松。松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣采用6～10倍量(w/w)的水加热提取2～3遍后，再以6～10倍量(w/w)的pH＞10的碱性水溶液提取2～3遍，调提取液pH中性后，浓缩提取液，然后喷雾干燥获得提取物粉末。

Description

一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂及其制备方法

技术领域：本发明涉及一种含松籽壳或松籽粉及其提取物的、能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂及其制备方法。

背景技术：在现代规模化畜禽养殖生产中，人们普遍在畜禽饲料中添加抗生素、激素和化学合成药物等。抗生素作为促生长剂用于预防动物病原菌感染及疾病发生具有重要意义，对促进畜牧业的发展有积极作用。但是，随着抗生素的广泛使用，抗生素在禽畜养殖业中的负面影响也逐渐显现出来，抗生素的长期使用对禽畜养殖可产生严重的不良后果，这主要表现在：长期使用抗生素导致细菌产生抗药性。抗生素滥用导致耐药菌株增加，而抗生素饲料添加剂长期、大量不合理使用是其中一条主要原因。长期使用抗生素造成畜禽机体免疫力下降，慢性病例增多，以致引起畜禽内源性感染和二重感染；抗生素导致的抗原质量降低，还会直接影响疫苗接种的效果。长期使用抗生素在禽畜产品中造成残留，并直接威胁到人类自身的健康和生活质量。

畜禽饲料中长期使用抗生素、激素和化学合成药物所引发的问题日益突出，新型天然产物，特别是中草药饲料添加剂的研制和使用愈来愈受到重视。天然产物具有天然性、毒副作用小的特点，可避免药物残留问题。天然产物通常是多种有机体的复合物，它们可以呈现包括营养作用、维生素样作用、增强免疫作用、抗应激和“适应原”样作用等多种生物学作用。天然产物饲料添加剂的研究和开发已取得了一一定进展，并且在一定范围内对提高畜禽生产性能和疾病控制等方面取得了较好效果。

松籽兼具食用和药用价值。我国有数千年食用松子的历史，松籽既被视为美味食物，又作食疗佳品，颇受医家、营养家的推崇。历代医家著述中松籽被认为具有美容、长寿、抗衰老的记载。

目前对于松籽的开发利用多在于榨制松籽油并由此进一步配制各种形式的营养保健品。榨制松子油后的以松籽壳为主的松籽残渣一般多作为废料丢弃。有少数报道涉及利用松子残渣制备营养性食品者，也主要是进一步利用残存于松籽壳中的蛋白质类物质。

发明内容：本发明目的在于提供一种增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂及其制备制备方。本发明的另一个目的是提供一种可作为饲料添加剂的松籽提取物。变废为宝，所得松籽提取物和松籽粉饲料添加剂具有强效免疫增强活性，可以有效提高饲养动物的抗病能力，具有显著的增强饲养动物的抗病活性作用。

本发明一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂是通过下列配方和提取方法完成发明目的：松籽粉饲料添加剂含有下列组分：松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣经粉碎得到的松籽粉和/或残渣经提取得到的松籽提取物粉末。其中松籽粉或者松籽提取物粉末中含有0.1％～0.8％的多糖，10％～40％的蛋白质和/或氨基酸，和/或0.5％～15％的脂肪酸。松籽提取物粉末中含有5％～40％的多糖；含有40％～70％的蛋白质和/或氨基酸。所述多糖中包括60％～90％的水溶性多糖和10％～40％的酸性多糖。所述松籽壳或松籽为：云南松、思茅松、马尾松、油松、红松、华山松、黑松或湿地松。

所述一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂制备方法，其特征在于松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣，或者将残渣进一步用有机溶剂脱脂，经机械粉碎获得松籽粉。松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣采用6～10倍量(w/w)的水加热提取2～3遍后，再以6～10倍量(w/w)的pH＞10的碱性水溶液提取2～3遍，调提取液pH中性后，浓缩提取液，然后喷雾干燥获得提取物粉末。所述脱脂过程所用有机溶剂为乙醇、甲醇或汽油。

尽管后述本发明实施方案中多以云南松松籽粉或其提取物说明本发明饲料添加剂的制备方法及其用途，但是，本领域内技术人员容易理解，同属植物的种子可具有类似的功效。

本发明的一个方面是提供可作为饲料添加剂的松籽粉，所述松籽粉具有显著的增强饲养动物的抗病活性。所述松籽粉是松籽经压榨或提取油脂后的残渣，通过机械粉碎获得。松籽粉榨油后的松籽残渣的主要组分是松籽壳。因此，松籽壳可以直接用于制备松籽粉。

经考察，由松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣经机械粉碎所得松籽粉中一般含有0.1％～0.5％的多糖；10％～35％的蛋白质和/或氨基酸；0.5％～15％的脂肪酸。

进一步分析松籽粉所含多糖的化学组成，可见松籽粉多糖中包括约60％～90％的水溶性多糖和约10％～40％的酸性多糖。脱脂后粉碎的松籽粉中含有约0.2％～0.8％的多糖；约10％～40％的蛋白质和/或氨基酸。

松籽经压榨或提取油脂后的残渣，可以进一步采用有机溶剂脱脂，然后再经机械粉碎获得。进一步脱脂后的松籽渣更容易被机械粉碎。所述脱脂有机溶剂优选乙醇和汽油，也可以采用甲醇、丙酮等有机溶剂脱脂。

经药理学检验，上述松籽粉和松籽粉饲料添加剂都具有显著的强效免疫增强活性，可以有效提高饲养动物的抗病能力。

本发明的另一方面是提供一种可作为饲料添加剂的松籽提取物，所述松籽提取物具有显著的增强饲养动物的抗病活性。所述松籽提取物的制备方法是：松籽经压榨或提取油脂后的残渣，采用水和/或碱性水溶液提取，所得提取液经浓缩、干燥和/或粉碎。

本发明的一种实施方案中，所述提取方法是，松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣以6~10倍量(w/w)的水加热提取2～3遍，然后再以6～10倍量(w/w)的pH＞10的碱性水溶液提取2～3遍，调提取液pH中性后，浓缩提取液，然后喷雾干燥获得提取物粉末。经考察，所述松籽提取物粉末中含有5％～40％的多糖；含有40％～70％的蛋白质和/或氨基酸。进一步考察所述提取物所含多糖的组成，可见多糖中包括约60％～90％的水溶性多糖和约10％～40％的酸性多糖。

显然，上述松籽粉和松籽提取物可以直接用作饲料添加剂，亦可通过添加可接受的载体和/或辅料进一步制备成其它形式的饲料添加剂，例如粉剂、颗粒剂等。所述载体和/或辅料可以包括，但不限于蔗糖、淀粉、微晶纤维素、滑石粉等。

同样，上述松籽粉和松籽提取物也可以联用其它活性成分形成新型饲料添加剂。显然，所有这些含有本发明所述松籽粉和松籽提取物的饲料添加剂均在本发明的权利要求范围之内。

本发明在将松籽榨油后的残渣粉碎后所得的松籽粉喂养动物期间，经检验用松籽粉喂养的动物，其抗病能力显著增强；进一步追踪发现，松籽粉所含多糖类物质可产生了类似的效果。松籽粉所含多糖具有强效免疫增强活性，这可能是松籽粉提高饲养动物抗病能力的重要原因之一。由此，本发明人提出，松籽粉及其提取物可作为有用的饲料添加剂应用于禽畜饲养业。

下面通过具体实施例进一步说明本发明内容。这些实施例仅仅是本发明之饲料添加剂、其来源、制备方法及其用途的特例说明，显然，本发明之范围不受这些实施例的限制。

图1为本发明凝胶色谱法检测图。其中上幅图为松籽粉所含多糖成分检测，下幅图为分子量分布标尺。

具体实施方式：实施例1：松籽粉制备及成分检测

挑选云南松松籽原料10kg，用水清洗、干燥、粉碎，过12目筛，投入到6YL-80自动榨油机中压榨得粗油后所剩油粕，风干，得残渣9.2kg。

此残渣经球磨粉碎机粉碎，过100目筛，得松籽粉8.8kg。

经高效凝胶色谱法检测，所得松籽粉含多糖0.3％；采用GB/T50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸20％；采用索式提取法测定，所得松籽粉含油脂7％。

实施例2：松籽粉制备及成分检测

挑选云南松松籽原料10kg，用水清洗、干燥、粉碎，过12目筛，投入到6YL-80自动榨油机中压榨得粗油后所剩油粕，风干，得残渣9.2kg。

所得残渣中加入10L95％乙醇加热浸提2hr，过滤，滤渣再加入10L95％乙醇浸提3hr，过滤，滤渣风干，称量，得滤渣8.5kg。

此滤渣经球磨粉碎机粉碎，得松籽粉8.1kg。

经高效凝胶色谱法检测，所得松籽粉含多糖0.4％；采用GB/T50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸20％；

实施例3：松籽粉制备及成分检测

挑选云南松松籽原料10kg，用水清洗、干燥、粉碎，过12目筛，投入到6YL-80自动榨油机中压榨得粗油后所剩油粕，风干，得残渣9.2kg。

所得残渣中加入5升6号汽油采用索氏提取器进行脱油处理3hr，降温，残脱油后残渣风干，称量，得滤渣8.3kg。

此滤渣经球磨粉碎机粉碎，得松籽粉8.0kg。

经高效凝胶色谱法检测法检测，所得松籽粉含多糖0.4％；采用GB/T50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸20％。

实施例4：松籽粉制备及成分检测

经脱仁华山松松籽壳10kg，经球磨粉碎机粉碎，得松籽粉9.7kg。

经高效凝胶色谱法检测，所得松籽粉含多糖0.1％；采用GB/T50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸15％；采用索式提取法测定，所得松籽粉含油脂0.5％。

实施例5：松子提取物制备及成分检测

挑选云南松松籽原料10kg，用水清洗、干燥、粉碎，过12目筛，投入到6YL-80自动榨油机中压榨得粗油后所剩油粕，风干，得残渣9.2kg。所得残渣中加入10L水煮沸提取4hr，过滤，滤渣再以等量的水重复提取2遍，过滤，滤渣继以8L0.1N NaOH浸提过夜，过滤后，以等量NaOH水溶液重复提取2遍，1N HCl调至中性，合并提取液，浓缩，喷雾干燥，得松籽提取物0.6kg。

经高效凝胶色谱法检测，所得松籽粉含多糖30％；采用GB/T 50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸40％。

实施例6：松子提取物制备及成分检测

华山松松籽壳10kg，同实施例5，得松籽提取物0.4kg。

经高效凝胶色谱法检测，所得松籽粉含多糖19％；采用GB/T50095-2003法检测，所得松籽粉含氨基酸28％。

实施例7：松籽粉所含多糖提取与检测

实施例1所得松籽粉，以10L水煮沸提取3次，每次4hr；过滤，合并水提液；残渣继以8L0.1N NaOH浸提3次，过滤，合并所得碱提液，1N HCl调pH中性。分别将水提取液、碱提液浓缩至至0.5L后，加95％乙醇使乙醇终浓度达60％，4℃下静置过夜，离心；所得沉淀分别顺次用60％、90％以及无水乙醇洗涤，真空干燥。水提液所得产物约600g，此产物称为水溶性多糖，碱提液所得产物约150g，此产物称为酸性多糖。

经高效凝胶色谱法检测，水溶性多糖含总多糖约60％；经高效凝胶色谱法检测，酸性多糖含总多糖约30％。

高效凝胶色谱法检测水溶性多糖，可见其主要由3种不同分子量得多糖组成，其分子量分别为约：9.11×10⁴、4.53×10⁴、3.71×10⁴。

高效凝胶色谱法检测酸性多糖，可见其主要由2种不同分子量得多糖组成，其分子量分别为约：9.11×10⁴、4.53×10⁴。

凝胶色谱图参见附图1。

实施例8：松籽粉提高饲养动物抗病力试验：填鹅免疫抗病、耐受性试验

(1)填鹅耐受性试验

饲料及用法：实施例1所述松籽粉，批号20041015；以2∶98的比例与普通饲料混合使用。

动物及饲养：试验鹅为同一批购入的朗德鹅，在鹅场同调节饲养，挑选体重相当健康者。填鹅由同一填鹅者操作并记录情况。

试验设计与分组：受试鹅随机分为试验组和对照组，尽可能进行均衡性检查，以保证组间的可比性。对照组60只，试验组40只。

添加剂的食用量及受试时间：试验组每天四次，每次以2％-3％的量与饲料同时填入。对照组采用同量的普通饲料填入。连续试验23天。

试验观察及测试指标

一般情况：填鹅的精神状况、食欲、排泄等，每天由填鹅者观察和记录。

急宰及死亡情况：由填鹅者记录。

试验结果

一般情况：据填鹅者观察结果，试验组鹅较对照组鹅活跃。

急宰及死亡情况：见表1

结论：填食23天后，试验组鹅对大量填食的耐受性优于对照组，其存活率明显高于对照组。

表一：填鹅试验记录

日期	存栏鹅数		死亡记录		急宰鹅数
							实验组	对照组	实验组	对照组	实验组	对照组
	10月21日	40只	60只	0	0	0							0
10月22日							40只	59只	0	0	0	1只
	10月23日	40只	59只	0	0	0							0
10月24日							40只	58只	0	0	0	1只
	10月25日	40只	55只	0	0	0							3只
10月26日							39只	53只	0	1只	1只	1只
	10月27日	36只	50只	0	0	0只							2只
10月28日							34只	48只	0	0	2只	3只
	10月29日	34只	48只	0	0	1只							0
10月30日							34只	46只	0	0	2只	2只
	10月31日	33只	43只	0	0	1只							3只
11月1日							32只	43只	1只	0	0只	0
	11月2日	31只	42只	0	0	2只							2只
11月3日							29只	40只	0	0	1只	2只
	11月4日	29只	38只	0	0	2只							0
11月5日							27只	38只	0	0	2只	0
	11月6日	25只	35只	0	0	1只							3只
11月7日							24只	32只	0	0	0只	3只
	11月8日	24只	29只	0	0	0只							3只
11月9日							24只	28只	0	0	0只	1只
	11月10日	24只	24只	0	0	0只							4只
11月11日							24只	24只	0	0	0只	2只
	11月12日	24只	21只	0	0	0只							3只
11月13日							24只	18只	0	0	0只	3只
	存活率	60％	30％

(2)填鹅免疫力影响试验

饲料及用法：实施例1所述松籽粉，批号20041015；以2∶98的比例与普通饲料混合使用。

动物及饲养：试验鹅为同一批购入的朗德鹅，在鹅场同调节饲养，挑选体重相当健康者。填鹅由同一填鹅者操作并记录情况。

试验设计与分组：试验鹅为同一批购入的朗德鹅，在鹅场同条件饲养，挑选除残障外非健康者，随机抽取分为两组，每组100只。

添加剂的食用量及受试时间：每次以2％～3％的量与饲料同时喂食。。

观察及测试指标：病鹅的精神状况、病态恢复状况，正常鹅免疫、抗病能力，每天由养试验观察及测试指标

试验结果：实验过程中，养鹅者观察到验组非健康鹅食欲不振、精神萎靡、不活跃状态得到明显缓解或消除。三个月喂养试验后的结果表明，试验组非健康鹅的存活率显著高于对照组。结果见表2。

表2非健康鹅三个月饲养记录

日期	鹅数		死亡记录
					实验组	对照组	实验组	对照组
	10月21日	100只	100只	0					0
10月30日					96只	98只	4	2
	11月11日	96只	92只	2					6
11月21日					95只	88只	1	4
	11月31日	94只	83只	0					5
12月11日					94只	75只	0	8
	12月21日	92只	70只	2					5
12月30日					92只	68只	0	2
	1月11日	91只	62只	1					6
1月21日					91只	59只	0	3
	1月31日	90只	55只	1					4
存活率					90％	55％

           实施例9：松提取物提高饲养动物抗病力试验：锦鲤免疫抗病力试验

饲料与用法：实施例5之松籽提取物，批号20040415；普通鱼饲料在市场购买。松籽提取物和普通鱼饲料等量适量喂养。

动物与饲养：试验锦鲤为同一批购入的锦鲤，在不同鱼缸中同条件喂养，每月统计并记录受试动物情况情况。

试验分组：受试锦鲤随机分为试验组和对照组。对照组锦鲤25尾，试验组锦鲤25尾。

添加剂的食用量及受试时间：试验组用松籽提取物喂养，每天三次，每次10g。对照组采用同量的市场购买的普通鱼食喂养。连续试验12个月。

观察及测试指标

观察锦鲤一般情况，包括锦鲤的精神状况、食欲、排泄等，每天观察并作记录；同时观察记录锦鲤死亡情况及锦鲤重量增长情况。

结果：观察结果表明，试验组锦鲤较对照组锦鲤明显活跃。锦鲤死亡情况见表3之锦鲤试验记录。

结论：两组锦鲤喂养12个月后，其平均体重并无显著的差异。在无其它外因(添加杀菌剂等市售的鱼类抗病、治疗、消毒产品)干扰的情况下，实验组锦鲤的成活率(排除其它因素，其成活率为100％)明显高于对照组，而对照组的锦鲤先后死亡，表明实施例5所述松籽提取物能够显著提高锦鲤的免疫抗病能力，大大提高了锦鲤在喂养过程中的成活率。另外，实验组锦鲤全采用实施例5所述松籽提取物饲喂一年，其间没有喂食任何其它的食物，一年后鱼的体重与对照组相比无显著的差异，鱼的形态也并无任何异常，表明实施例5之松籽提取物作为饲料添加剂甚至饲料都非常的安全。综上所述，实施例5之松籽提取物是一种有效、安全的饲料添加剂。

表3锦鲤试验记录(2004-5-12～2005-5-12)

日期	鱼缸锦鲤数(尾)		死亡记录(尾)		锦鲤平均重量(克)		喂养用量
								实验组	对照组	实验组	对照组	实验组	对照组
	2004年
5月12日									25只	25只	0	0	11±0.7	10±0.9	适量
	6月15日	25只	22只	0	3	12±0.3	11±0.8	适量
7月13日									25只	21只	0	1	11±0.8	12±0.2	适量
	8月15日	25只	19只	0	2	10±0.9	11±0.7	适量
9月14日									24只	16只	1	3	11±0.5	12±0.1	适量
	10月12日	24只	16只	0	0	11±0.1	11±0.4	适量
11月13日									23只	12只	1	4	12±0.6	10±0.7	适量
	12月15日	23只	10只	0	2	10±0.7	12±0.5	适量
2005年
								1月12日	23只	9只	0	1	11±0.4	11±0.5	适量
2月15日	21只	5只	2	4	12±0.2	12±0.2	适量
								3月14日	21只	2只	0	3	11±0.8	11±0.6	适量
4月11日	21只	0只	0	2	11±0.3	10±0.7	适量
								5月12日	21只	0只	0	0	10±0.9	11±0.3	适量

               实施例10：松籽多糖对饲养动物免疫功能得影响试验

试验材料

供试样品及供试液制备：实施例7所述水溶性多糖及酸性多糖。试验前用生理盐水将样品分别配成6.3、12.5、25.0mg/ml浓度的溶液作为供试液。免疫组1~2采用水溶性多糖样品；免疫组3～4采用酸性多糖样品；免疫组5～7采用混合多糖样品。

实验动物：选用广西医科大学医学实验动物中心【批准号为：桂动许字(2000)第001号】繁殖的清洁级健康成年昆明种雄性小鼠332只，体重为18～22克，分为7批，每批44～48只。本中心实验动物房合格证号：桂医动字第23003号。动物室温度：22～25℃，相对湿度：55～70％。

剂量选择与受试物给予方式：25、50、100mg/kg 3个剂量的实验组，另设一个阴性对照组(生理盐水)。每组11～12只动物。采用经口方式给予受试物，按0.2mL/10g RW的容量灌胃。

仪器：全自动酶标仪、754紫外可见光分光光度计、冷冻离心机、二氧化碳培养箱、微量血凝试验板、电子分析天平、显微镜、打孔器、恒温培养箱、微量注射器等。

试剂：NaCl、ConA、MTT、2-ME、异丙醇、青霉素、链霉素、盐酸、SRBC、补体、Hank’s液、PBS缓冲液、SA缓冲液、琼脂糖、Na₂CO₃、RPMI1640细胞培养粉、丙酮、甲醇、DNFB、硫化钡、印度墨汁、乳酸锂、硝酸氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、YAC-1细胞等。

实验方法

依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范-2003》中增强免疫力功能检验方法。实验设4个组，即3个实验组和1个阴性对照组，每组11～12只小鼠。采用灌胃法，每天以0.2mL/10g BW的容量给小鼠灌胃不同剂量的受试物，阴性对照组给予等量生理盐水。每天一次，连续30～38天。末次给样1h以后进行各项免疫指标的测定。

(1)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(免疫一组)：末次给样1h后处死动物、无菌取脾，制成脾细胞悬液(3×106个/mL)，将每一份悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLconA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃二氧化碳孵箱中培养72h。培养至68h时，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血请的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将溶解液移入1mL比色杯中，用754紫外可见光分光光度计波长570nm处测定OD值。用加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的OD差值高于阴性对照组且差异有显著性的，可判断该项实验结果阳性。

(2)二硝基氟苯诱导的小鼠DTH实验(耳肿胀法)(免疫二组)：给样至25天将小鼠腹部皮肤脱毛后用DNFB溶液涂抹致敏，5天后将DNFB涂抹于小鼠右耳攻击，24小时后处死小鼠，取8mm直径的耳片称重，左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的左右耳重量之差值高于阴性对照组且差异有显著性的可判定该项实验结果阳性。

(3)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)(免疫三组)：末次给样前5天给受试小鼠每只腹腔注射0.2mL 2％(v/v)SRBC细胞悬液进行免疫，5天后处死，无菌取脾制成脾细胞悬液。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45~50℃水浴保温，与等量Ph7.2～7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配置)，25μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，待凝固后，将其水平倒扣于片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。样品组的空斑数高于阴性对照组且差异有显著性的可判定该项实验结果阳性。

(4)血清溶血素的测定(凝集法)(免疫四组)：末次给样前5天给受试小鼠每只腹腔注射0.2mL2％(v/v)SRBC细胞悬液进行免疫，5天后从眼内眦取血分离血清用生理盐水倍比稀释，分别置于微量血凝板内，37℃孵育3h，观察血球凝集程度(0~IV级)。受试样品组的抗体积数高于阴性对照组且差异有显著性的可判定该项实验结果阳性。

(5)小鼠碳廓清实验(免疫五组)：

末次给样后1小时经尾静脉给小鼠注射稀释的印度墨汁(用生理盐水稀释4倍)(10mg/kgBW)，墨汁注入后立即计时，2min和10min分别从眼内眦取血20μL加到2mL 0.1％Na₂CO₃溶液中，用754紫外可见光分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)。处死小鼠，取肝脏和脾脏称重。按下式计算吞噬指数a。

a＝K1/3×体重/(肝重+脾重)式中K＝(lgOD₁-lgOD₂)/(t₂-t₁)

受试样品组的吞噬指数高于阴性对照组且差异有显著性的可判定该项实验结果阳性。

(6)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)(免疫六组)：末次给样后1h，给小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，注射后30分钟处死小鼠，腹腔注入2mL生理盐水，取腹腔洗液制片，放37℃培养箱内孵育30分钟，取出于生理盐水中漂洗后晾干，用1∶1丙酮甲醛溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3分钟，再用蒸馏水晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，观察记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，并同时观察记录鸡红细胞被消化的程度(分I-IV级)。

受试样品组的吞噬率或吞噬指数高于阴性对照组且差异有显著性的可判定该项实验结果阳性。

(7)、NK细胞活性测定(LDH测定法)(免疫七组)：末次给样1h后处死动物、无菌取脾，制成脾细胞悬液(2×107个/mL)，取靶细胞(4×105个/mL)和效应细胞各100μL，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100uL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100uL，上述各项各设3个平行孔，置5％CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500转/分离心5分钟，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应8分钟，每孔加入1mol/L的HCL30uL，在酶标仪490nm处测定OD值。按下式计算NK细胞活性。受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项试验结果阳性。

NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％

【注】脏器/体重比值测定：试验结束处死动物，解剖取小鼠胸腺、脾脏，用电子分析天平称量后计算脏器/体重比值。

实验数据统计：应用SPSS统计软件进行方差分析统计处理。

结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

结果

(1)样品对小鼠体重的影响

表4各组小鼠的初始体重( x±s)

剂量组(mg/kg BW)	免疫I组		免疫II组		免疫III组		免疫IV组
								体重(g)	n	体重(g)	n	体重(g)	n	体重(g)
	1005025阴性对照	20.1±1.219.8±1.220.3±1.119.3±0.8	12121212	19.4±1.419.9±1.120.1±0.820.1±1.1	12121212	20.4±1.319.7±1.120.3±1.220.2±1.1	12121212								20.1±1.419.6±1.220.1±1.619.8±1.5

剂量组(mg/kg BW)	免疫V组		免疫VI组		免疫VII组
							体重(g)	n	体重(g)	n	体重(g)	n
	1005025阴性对照	20.1±0.819.6±1.120.1±1.520.4±1.3	12121212	20.5±0.819.6±1.319.6±1.320.1±1.1	12121212	19.6±0.820.1±0.819.9±0.820.4±0.9							11111111

注：表中各剂量组小鼠初始体重与阴性对照组的差异均无显著性(P＞0.05)。

表5各组小鼠试验终末体重及增重量( x±s)

免疫I组

剂量组(mg/kg BW)	n	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	37.1±1.837.8±1.138.2±2.337.4±2.5	17.0±1.718.0±1.217.9±1.918.1±2.0	＜0.05＞0.05＞0.05-

免疫II组

剂量组(mg/kg BW)	n	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	36.1±2.337.1±1.836.9±2.237.2±2.7	16.7±2.517.2±1.616.8±2.117.1±2.6	＞0.05＞0.05＞0.05-

免疫III组

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	38.4±1.938.0±1.739.7±3.538.8±2.3	18.0±1.218.3±1.219.4±3.018.6±1.8	＞0.05＞0.05＞0.05-

免疫IV组

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	37.7±3.338.8±2.537.8±2.237.5±2.5	17.6±3.019.2±1.717.7±2.417.7±1.5	＞0.05＞0.05＞0.05-

免疫V组

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	38.3±2.237.8±2.137.8±2.237.2±2.7	18.3±2.218.3±2.117.7±1.616.8±1.8	＞0.05＞0.05＞0.05-

免疫VI组

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	12121212	38.1±2.237.3±2.438.1±2.537.8±1.9	17.6±2.017.7±1.818.5±1.817.7±1.9	＞0.05＞0.05＞0.05-

免疫VII组

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	终末体重(g)	增长值(g)	P值
					1005025阴性对照	11111111	36.4±3.237.5±2.336.9±1.636.5±2.1	16.7±2.517.4±1.717.0±1.816.2±2.1	＞0.05＞0.05＞0.05-

由表4可见，小鼠的初始体重在各实验组与阴性对照组间比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。

由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的样品30~38d后，免疫I～VII组的样品各剂量组的小鼠体重均数与阴性对照组的比较，差异均无显著性(P＞0.05)，表明该样品对小鼠的体重增长无明显影响。

(2)样品对小鼠的脏器/体重比值的影响由表6和表7可见，样品各剂量组的胸腺/体重及脾脏/体重比值与阴性对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)，提示该样品对小鼠的免疫器官重量无明显影响。

表6各组小鼠胸腺/体重比值结果(％， x±s，n＝12)

剂量(mg/kg)	免疫一组	免疫二组	免疫三组	免疫四组	免疫五组	免疫六组	免疫七组
								1005025阴性对照	0.20±0.030.21±0.030.20±0.030.21±0.03	0.22±0.030.21±0.030.20±0.030.22±0.03	0.21±0.030.21±0.040.21±0.040.21±0.04	0.21±0.040.21±0.050.22±0.050.22±0.04	0.20±0.050.21±0.030.21±0.050.21±0.04	0.21±0.040.20±0.050.20±0.080.21±0.06	0.22±0.030.20±0.050.22±0.040.22±0.05

与阴性对照组相比，P均大于0.05

表7各组小鼠脾/体重比值结果(％， x±s，n＝12)

剂量(mg/kg)	免疫一组	免疫二组	免疫三组	免疫四组	免疫五组	免疫六组	免疫七组
								1005025阴性对照	0.41±0.060.39±0.060.40±0.080.41±0.04	0.41±0.070.40±0.080.41±0.060.41±0.05	0.40±0.090.40±0.090.41±0.070.40±0.08	0.40±0.070.39±0.040.39±0.050.41±0.10	0.41±0.070.38±0.060.39±0.080.41±0.09	0.41±0.070.41±0.060.40±0.100.42±0.07	0.40±0.040.40±0.070.41±0.050.42±0.05

与阴性对照组相比，P均大于0.05

(3)样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响从表8可见，样品各剂量组的OD差值的均数均大于阴性对照组，中剂量组与阴性对照组的差异有显著性(P＜0.05)，表明该样品具有刺激小鼠的脾淋巴细胞增殖、转化的作用。

表8ConA诱导的脾淋巴细胞转化实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	加ConA与未加ConA OD差值	P值
				1005025阴性对照	12121212	0.146±0.0870.179±0.0450.140±0.0550.104±0.047	0.2330.0120.345---

(4)样品对小鼠的细胞免疫功能的影响由表9可见，样品各剂量组小鼠的左右耳重量差值均大于阴性对照组，且高剂量、中剂量组与对照组的差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，表明该样品能提高DNFB诱导的小鼠耳肿胀程度，即具有促进迟发型变态反应的作用。

表9迟发型变态反应(DTH)实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	左右耳重量差值(mg)	P值
				1005025阴性对照	12121212	5.2±2.035.8±1.973.4±1.923.8±1.43	0.0370.0050.997---

(5)样品对小鼠的抗体生成细胞数的影响从表10可见，样品各剂量组小鼠的抗体生成细胞数均值均高于阴性对照组，且与对照组的差异均有显著性(P＜0.05)，表明该样品具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。

表10抗体生成细胞检测实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	空斑数(个)	P值
				1005025阴性对照	12121212	181.3±21.4184.0±24.6179.6±24.6154.9±22.8	0.0230.0110.035---

(6)样品对小鼠的体液免疫的影响从表11可见，样品各剂量组小鼠的抗体积数均值均高于阴性对照组，中剂量组与对照组的差异具有显著性(P＜0.01)，表明该样品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。

表11小鼠血清溶血素的测定结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	抗体积数	P值
				1005025阴性对照	12121212	170.7±6.4189.3±14.9169.0±15.0162.6±13.1	0.2960.0000.477---

(7)样品对小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响从表12可见，样品各剂量组的吞噬指数(a)均大于阴性对照组，且高剂量组与对照组的差异具有显著性(P＜0.05)，表明该样品具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。

表12小鼠碳廓清实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	吞噬指数(a)	P值
				1005025阴性对照	12121212	7.15±0.787.02±0.687.00±0.516.43±0.47	0.0190.0660.073---

(8)样品对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能的影响从表13可见，样品各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数均高于阴性对照组，高剂量组的吞噬率及吞噬指数与对照组的差异均具有极显著性(P＜0.01)，表明该样品具有促进小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。

表13小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	吞噬率(％)	数据转换(X)	P值	吞噬指数	P值
							1005025阴性对照	12121212	27.1±4.722.3±4.823.7±3.820.6±5.3	0.55±0.050.49±0.060.51±0.040.47±0.07	0.0040.6400.219---	0.74±0.190.55±0.130.58±0.100.50±0.15	0.0010.7510.453---

(9)样品对小鼠的NK细胞活性的影响从表14可见，样品各剂量组小鼠的NK细胞活性均高于阴性对照组，高、中剂量组与对照组的差异具有显著性(P＜0.01)，表明该样品具有提高小鼠的NK细胞活性作用。

表14小鼠NK细胞活性实验结果( x±s)

剂量(mg/kg)	动物数	NK细胞活性(％)	数据转换(X)	P值
					1005025阴性对照	12121212	39.9±8.9237.7±6.7632.6±11.525.8±6.00	0.682±0.0920.660±0.0690.601±0.1340.531±0.069	0.0020.0070.216---

小结分别以25、50、100mg/kg BW剂量的实施例7之松籽提取物给予小鼠连续灌胃30～38天，能促进小鼠的脾淋巴细胞增殖、转化作用，提高小鼠的抗体生成细胞数和血清溶血素水平，促进小鼠的单核-巨噬细胞的碳廓清和腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进小鼠的迟发型变态反应，提高小鼠的NK细胞活性作用。由此可见，该样品具有增强免疫力功能作用。

Claims (10)

1、一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于所述松籽粉饲料添加剂含有下列组分：松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣经粉碎得到的松籽粉和/或残渣经提取得到的松籽提取物粉末。

2、根据权利要求1所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于松籽粉或者松籽提取物粉末中含有0.1％～0.8％的多糖，10％～40％的蛋白质和/或氨基酸，和/或0.5％～15％的脂肪酸。

3、根据权利要求1或2所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于松籽提取物粉末中含有5％～40％的多糖；含有40％～70％的蛋白质和/或氨基酸。

4、根据权利要求3所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于松籽提取物粉末中含有5％～40％的多糖；含有40％～70％的蛋白质和/或氨基酸。

5、根据权利要求1或2所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于所述多糖中包括60％～90％的水溶性多糖和10％～40％的酸性多糖。

6、根据权利要求3所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于所述多糖中包括60％～90％的水溶性多糖和10％～40％的酸性多糖。

7、根据权利要求1或2所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂，其特征在于所述松籽壳或松籽为：云南松、思茅松、马尾松、油松、红松、华山松、黑松或湿地松。

8、根据权利要求1至2所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂制备方法，其特征在于松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣，或者将残渣进一步用有机溶剂脱脂，经机械粉碎获得松籽粉。

9、根据权利要求8所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂提取方法，其特征在于松籽壳或松籽经压榨或提取油脂后的残渣采用6～10倍量(w/w)的水加热提取2～3遍后，再以6～10倍量(w/w)的pH＞10的碱性水溶液提取2～3遍，调提取液pH中性后，浓缩提取液，然后喷雾干燥获得提取物粉末。

10、权利要求8所述的一种能增强饲养动物抗病能力的松籽粉饲料添加剂提取方法，其特征在于所述脱脂过程所用有机溶剂为乙醇、甲醇或汽油。

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