CN1434795B - 带官能化辅助支链的酰化假二肽 - Google Patents

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Abstract

本发明特别涉及假二肽，它是由官能化氨基酸得到的，它由固定在酰胺形式的假二肽的胺官能团上的脂肪酸链组成，所述假二肽的一端带有官能化的辅助支链，另一端是中性或带电荷的酸基团。本发明的化合物作为佐剂使用时具有免疫调节的性质。本发明的化合物也可以接枝在抗原上，以调节免疫反应，或接枝在药效基团上，以改善其治疗作用，或其靶向作用。最后，本发明化合物因此可以用于人药和兽药，作为免疫剂和作为诊断工具。

Description

带官能化辅助支链的酰化假二肽
引言
本发明涉及有关化学领域，更特别地涉及肽化学的领域。确切地，本发明涉及带官能化辅助支链(bras auXiliaire)的酰化假二肽，该化合物可接枝或不接枝成缀合物(con jugués)形式，其辅助支链赋予该分子原始的生物活性及物理化学性质。辅助支链的化学性质通过微调其肽的原始性质或赋予其新性质，赋予酰化假二肽额外尺寸。这些带有官能化辅助支链的分子可缀合接合到药效团、抗原或媒介物分子。生物缀合涉及偶合两种或两种以上的化学实体，以形成具有与单个组成性质不同的新分子配合物。具有固有药理性质的天然或合成产物可彼此组合，得到具有原始化合物或比原始化合物改善的物理化学与药理性质的新实体。生物缀合作用的应用涉及人的药物、动物药物以及诊断方法的各个领域。
曾经叙述多种相同双官能或异双官能类偶合剂，其可用于接合各种分子，其分子包括氨基酸、肽、蛋白质、糖类、寡醣、多醣、核酸、寡核苷酸、多核苷、脂类，以及实际上每一种带有一个可能形成键的官能团的分子。近年来对由两个带有不同信息的分子组成的抗原构建体的合成进行过相当多的研究。Good等人[(1987)，《Science》，235：1059-1662]例如合成过含有同时被辅助T淋巴细胞和B淋巴细胞识别的抗原决定簇的肽。Bessler及Jung[(1992)《Res.Immunol》，5：548-553]描述由肽以及免疫刺激剂组成的缀合物。Hoffmann等人[(1997)《FEMS Immunol.Med.Microbiol.Microbiology》，17：225-234]描述了在脂肽与由峰毒肽衍生的合成肽之间形成的缀合物。Ulrich和Myers[(1995)《Vaccine Design》，Plenm出版，纽约，495-524]观察到除非半抗原和MPL添加剂处在相同的脂类体内(一磷酰基脂类A)，否则免疫反应无效。Ulrich及Myers提示MPL佐剂与半抗原间可能存在有共价键。事实上，证实半抗原-佐剂缀合物用作疫苗的佐剂是非常有效的。Ikeda等人[(1999)《Chem.Pharm.Bull》，47(4)，568-568]报告了脂类A的结构类似物与具有肽性质的肿瘤抗原之间的合成，且证实其具有体外致有丝分裂的活性。
这种缀合概念对于蛋白质，甚至对于蛋白质-多糖对都是有效的。的确，人们知道，单独使用多糖作为疫苗对于5岁以下的儿童仅能产生微弱的免疫反应，原因在于该反应取决于T细胞。[Gotschlich等人，(1977)；《Antibodies in Human Diagnosis and Therapy》，Peltola等人，(1977)，《Pediatrics》：60：730-737]。相反地，与媒介蛋白质连接的多糖类没有给出特别强的免疫反应。这种现象于1931年由Avery及Goebel发现[(1931)，《J.Exp.Med.》，54：437-447]。这些年来开发的多种疫苗反映出在这个领域所取得的进展。特别地应提到为抗流行性感冒嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)以及不同血清型的肝炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的疫苗[Powell及Newman，(1995)，《Vaccine Design》，Plenum出版，纽约]。对于后者，己经开发多效价疫苗[Sood及Fatton，(1998)，《Exp，Opin.Invest.Drugs》，7：(3)，333-347]。
使用由与多糖-蛋白质单元结合的佐剂组成的配合物产生了新前景。化学合成生物缀合物的技术已获得很好发展，今天能够进行多项几年前认为无法进行的研究主题，同时可使用大量可利用的相同或异双官能反应剂，以及使用在大量参考文献中描述的缀合方法[Hermanson，(1996)，《Bioconjugate Techniques》，Academic出版，纽约]。
例如，可以提及还原胺化方法[Roy等人，(1984)，《Canad.J.Biochem.Cell Biol.》62：270-279，Hermansson，(1995)，472页]，该方法允许载带醛官能团的分子，与在肽或蛋白质分子上的伯胺，与肽-多糖缀合物或与药效(基)团缀合。这种反应导致形成极为稳定的二烷基胺。
发明的描述
更确切地，本发明的目的是由官能化氨基酸得到的假二肽(pseudodipeptide)，其游离的胺基官能被脂肪酸酰胺化，假二肽的一端载有官能化辅助支链。
更明确地，本发明的目的是N-酰化假二肽，该假二肽的一端部带有一个呈中性或带电荷的酸基，其另一端部带有一个官能化辅助支链，该化合物具有通式I：
其中R1及R2各自表示由含有2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸得到的酰基，该酰基未被取代的或带有一或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基。
下标m、n为0至10的值，
下标p及q为1至10的值。
Y表示O或NH，
X及Z表示官能化辅助支链或呈中性或带电荷的酸基，其选自下述基团：
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫基]
-膦酰基[(C1-C5)烷氧基]
-膦酰基[(C1-C5)烷硫基]
-二羟基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羟基磷酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
-二羟基磷酰氧基
-羟基磺酰氧基
-羟基磺酰基[(C1-C5)烷氧基]
-羟基磺酰基[(C1-C5)烷硫基]
-羟基磺酰氧基[(c1-C5)烷氧基]
-羟基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
-[羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[氨合(C1-C5)烷基]氨基羰基
-{羧基[氨基(C1-C5)烷基)氨基羰基
但限制条件为取代基X或Z中至少一个表示官能化辅助支链。
X或Z辅助基具有通式(II)：
               A-(CO)r-(CH2)s-W           (II)
式中A表示O、S或NH
下标r为0或1的值，
下标s为1至10的值。
W选自下述基团
-甲酰基
-乙酰基
-氰基
-卤素(卤代)
-氨基
-溴-或碘-乙酰氨基
-酰基酰氨基(acylamido)
-二酰基亚胺基
-巯基
-烷硫基(alkylthio)
-羟基
-1，2-二羟基乙基
-烷氧基
-酰氧基
-乙烯基
-乙炔基
-游离羧基
-呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基，
-叠氮基
-氰硫基(thiocyano)。
本发明特别涉及新的N-酰化假二肽，该假二肽的一端部带有一个呈中性或带电荷的酸基，其另一端部带有一个官能化辅助支链，该化合物具有通式I：
Figure S00819149219950321D000051
其中R1及R2各自表示由含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸得到的酰基，其为未被取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基(acylamino)、酰硫基(acylthio)以及(C1-C24)烷硫基的取代基。
下标m、n为0至10的值，
下标p及q为1至10的值，
X及Z各自表示呈中性或带电荷的酸基或官能化辅助支链，
但限制条件为取代基X或Z中至少一个表示官能化辅助支链。
Y表示O或NH，
酸基X或Y优选地选自下述基团：
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫基]
-膦酰基[(C1-C5)烷氧基]
-膦酰基[(C1-C5)烷硫基]
-二羟基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羟基磷酰氧基
-羟基磺酰氧基
-羟基磺酰基[(C1-C5)烷氧基]
-羟基磺酰基[(C1-C5)烷硫基]
-羟基磺酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-羟基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
以及含X或Z的辅助基团满足通式II，但二羟基乙基除外。
若取代基X或Z表示呈中性酸基，涉及游离羧酸、磺酸、膦酸或磷酸。若酸基呈电荷形式，则涉及盐化的羧酸、磺酸、膦酸或磷酸形式，特别地，通过添加无机或有机碱盐化，优选地治疗上相容的无机或有机碱进行盐化。若这些碱不是治疗上相容的，这些碱可按识别、纯化及分离的方式使用。
在治疗上相容的盐化碱中，特别列举例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂的碱金属碱，铵盐，碱土金属碱，例如氢氧化钙或氢氧化锶，镁盐，亚铁金属盐等，有机碱，例如由伯、仲、叔胺得到的碱，碱性反应的氨基酸，例如赖氨酸或鸟氨酸或氨基糖。
治疗上不可使用的碱例如是马钱子碱、番木鳖碱、N-甲基葡萄糖胺或N-甲基吗啉。如前述，由此衍生的盐类将作为分离、鉴定或纯化的手段。
当m等于1，而n等于0时，该分子由丝胺酸或天冬氨酸得到。m等于2，而n等于0时，该分子特别地衍生自高丝氨酸或谷氨酸。
若Y＝NH、p＝3以及q＝1，则可能涉及瓜氨酸、鸟氨酸或粗氨酸衍生物。
若p等于4及q等于1，则特别地涉及高精氨酸或赖氨酸。
若取代基X或Z表示通式(III)的辅助基
O-CO-(CH2)s-W           (III)
下标s为1至10的值，但更特别等于4、5或6
W优选地选自下列基团：
-甲酰基
-氨基
-羟基
-1，2-二羟基乙基
-羧基。
在本发明的目的假二肽中，特别值得注意的为实际优选通式IV化合物：
Figure S00819149219950321D000061
式中R1及R2各自分别表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或分支链羧酸的酰基，其酰基未被取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下标m及n为0至10的值，
下标p及q为1至10的值，
以及其中取代基X或Z中的一个为羧基或二羟基磷酰氧基或羧基[(C1-C5)烷氧基]或羧基[(C1-C5)烷硫基]或{羧基[(C1-C5)烷基]氨基羰基或[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基或{羧基[氨基(C1-C5)烷基}-氨基羰基；以及其中另一个取代基为酰氧基，它选自6-氨基己酰氧基、6-氧代己酰氧基、6-羟基己酰氧基、6，7-二羟基庚酰氧基或3-羧基丙酰氧基。
R1及R2定义包括具有含2到24个碳原子的、相同或不同的、饱和或不饱和的、支链或直链的不同链长的酰化衍生物，其可带有一个或多个选自烷基、氨基、酰氨基、羟基、烷氧基、酰氧基、酰硫基及烷硫基的取代基。在相关的酰化基团中，由月桂酸、2-羟基辛酸、3-羟基肉豆蔻酸、2-癸酰氧基辛酸、3-月桂氧基肉豆蔻酸、3-肉豆蔻氧基肉豆蔻酸以及3-棕榈氧基肉豆蔻酸得到的酰化基团是目前优选的酰化基团。
本发明特别涉及作为优选化合物的在下表列出的假二肽：
Figure S00819149219950321D000081
本发明特别涉及下列实际优选的化合物：
-N-[[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例1.2)
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.1)
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.2)
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-0-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.3)
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺5-0-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.4)
-(3RS，9R)，(3R，9R)及(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.6、2.7及2.8)
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-羟基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.9)
-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.10)
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.16)
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.19)
-N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐(实施例2.22)
-N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐((实施例2.24)
这些化合物的区别在于原本令人感兴趣的药理性质，主要有关免疫调理方面的药理性质。它们在制备混合配方的疫苗组合物，或作为与多肽或多糖性质的抗原或与由与多糖缀合的多肽构成的化合物形成的共价缀合物方面是特别有意义的。它们特别可以用于预防原虫、微生物及病毒感染或用于治疗某些自体免疫病。
这些化合物因其辅助支链具有或多或少的亲水或疏水特性，通过它们形成非共价缔合物的性质而用作有意义的治疗分子的载体。能使它们与有意义的治疗分子偶合的化学性质及其两亲特性，可促进缔合它们的分子配制及输送至细胞膜受体以及输送至细胞壁及胞质。
本发明的化合物可单独使用，或呈与治疗有利的分子共价或非共价结合使用，可采用口服、肠胃外、直肠、局部、皮下或粘膜下用药。
它们可单独使用，或呈与治疗有利的分子共价或非共价结合使用，可采用活体外与血细胞同时培育，以便促进形成免疫合格的细胞，随后通过肠胃道途径将其细胞注回到活体内。
这些分子具有类似的性质，当例如用于疫苗接种时，可作为免疫系统的佐剂，与适当抗原共价或非共价结合，可用作抗病毒、寄生虫、微生物或真菌来源的疾病。这些缀合或缀合的分子还可能用于治疗某些自体免疫病。
相反地，若干本发明的化合物，在共价或非共价结合后，显示出在它们诱导产生细胞分裂素，或来自造血器官及淋巴器官的免疫活性干细胞成熟的能力方面具有不同的性质。
若干本发明的化合物可在有或没有适当抗原存在下促进单核细胞成熟且分化成为功能性树状细胞，且对增强体液及细胞的免疫力有作用。
若干本发明的化合物促进属于造血系统的一部份细胞，特别是骨髓内部细胞的分化，并且能改善及校正某些免疫系统的病症。它们特别显示出抗病毒的性质。
根据本发明的化合物由于毒性低故特别令人感兴趣。它们与抗原呈共价或非共价结合使用，用于预防或治疗人体及动物体传染病，依据特定适应症以及个体体重，使用剂量为每单位剂量0.005毫克至100毫克，以及每日0.005毫克至200毫克。
本发明还有一个目的是一种N-酰化假二肽的制备方法，该假二肽一端带有一个呈中性或带电荷的酸基，另一端带有一个官能化辅助支链，该化合物具有通式I，该方法包括下列步骤：借助正交保护剂(blocage orthogonaux)保护(bloque)于位置(q+1)的胺官能团和于ω-官能化氨基酸的位置ω的YH，还包括使余下呈游离的羧酸官能团与还原剂反应而获得对应的醇，还包括释放出位置(q+1)的胺官能团，然后利用式R2OH(其中R2如前面所定义)的羧酸的官能衍生物进行酰化，以及随后释放末端官能团，而获得通式V的官能化氨基醇：
        
Figure S00819149219950321D000121
式中Y表示HO或优选地NH2，
R2表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，该酰基为未经取代的或带有一个或多个如上定义的取代基，
p及q各自表示1至10的整数，
该氨基醇在肽缩合剂存在下于惰性溶剂中与通式VI的ω-官能化的氨基酸衍生物缩合
      
式中R1为衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
m及n为0至10的整数，
以及X为如上定义的可呈酯形式的酸基，
而获得通式VII假二肽
式中取代基R1及R2以及下标m、n、p及q如前面所定义，若有所需要，可使用通式VIII的取代、烷基化或酰化的试剂使该游离末端醇官能团进行取代、烷基化或酰化，
A-(CO)r-(CH2)s-W          (VIII)
式中A是离去基团、OH、SH或NH2官能
下标r优选地等于1，但也可等于0。
下标s优选地为2至6，但一般可取1至10的值
W优选地选自下列一个基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘乙酰基氨基、-酰基酰氨基(acylamido)、-二酰基
亚氨基、-巯基、-烷硫基、-羟基、-1，2-二羟基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游离或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-叠氮基、-氰硫基或其前体。
若有所需，于偶合剂存在下，该产物进行催化氢化或若干其它去保护处理，获得通式I衍生物：
式中取代基及下标X、Y、Z、R1、R2、n、m、p及q具有前述相同定义。
本发明还涉及一种获得通式IV的膦酰基假二肽化合物的方法
Figure S00819149219950321D000141
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基(acylthio)以及(C1-C24)烷硫基(thio)的取代基，
下标m、p及q为1至10的值，
下标n为0至10的值，
X及Z各自表示呈中性或带电荷的酸基或官能化辅助支链，
其特征在于使用通过酸解或氢解不稳定的保护剂(blocage)，分别保护(bloque)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸的于(q+1)位的胺官能团以及于ω位的胺官能团，将仍然呈游离的羧酸官能团与还原剂反应而获得对应的醇，使(q+1)位胺官能团游离，然后利用式R2OH(其中R2已如前定义)羧酸的官能衍生物酰化，然后通过氢解释放出末端胺官能团而获得通式IX的氨基醇：
Figure S00819149219950321D000142
式中R2表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
p及q表示1至10的整数，
其特征还在于在肽缩合剂存在下，于惰性溶剂中与通式VI的ω-羟基化氨基酸衍生物缩合：
Figure S00819149219950321D000151
式中R1为衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
m为1至10的整数，
n为0至10的整数，
以及X为式的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰氧基基团，以获得通式X的假二肽
式中取代基R1、R2以及下标m、n、p及q如前定义，以及R为氢解不稳定基，若有所需，可使用通式VIII的取代、烷基化或酰化试剂，以取代、烷基化或酰化游离末端醇官能团：
A-(CO)r-(CH2)s-W          (VIII)
A为离去基，OH、SH或NH2官能团
下标r为优选地等于1，也可取0值，
下标s优选地为2至6的值，也可取1至10的值，
W优选地选自下列基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亚氨基、-巯基、-烷硫基、-羟基、-1，2-二羟基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游离羧基，或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-叠氮基、-氰硫基或其前体，
若有所需，在偶合剂存在下，将该化合物进行催化氢化或若干其它去保护处理，因而获得通式XI衍生物：
Figure S00819149219950321D000161
式中取代基W、R1、R2以及下标m、n、p、q、r、s具有前述相同定义。
本发明进一步涉及一种获得通式XII的磷酰基假二肽化合物的方法：
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下标m、p及q为1至10的值，
下标n为0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化辅助支链，
该方法包括使用酸解或氢解不稳定的保护剂，分别保护式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1CO-OH二氨基酸于(q+1)位的胺官能团以及于ω位的胺官能团，将仍然呈游离的羧酸官能团与还原剂反应而获得对应的醇，使(q+1)位胺官能团游离，然后利用式R2OH(其中R2已如前定义)羧酸的官能衍生物酰化，然后通过氢解释放出末端胺官能团，然后通过ω官能化烷基反应性(活性)酯，如三氟甲基磺酸酯，进行胺官能团的烷基化，而获得通式XIII的氨基醇：
Figure S00819149219950321D000171
式中R2表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
p及q表示1至10的整数，
下标s优选地包括2至7，但可取1至10，
其中氨基醇在缩合剂存在下于惰性溶剂中与通式VI的ω-羟基化氨基酸衍生物缩合：
Figure S00819149219950321D000172
式中R1衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
m为1至10的整数，
n为0至10的整数，
以及X为式
Figure S00819149219950321D000173
的二烷氧基一或二芳氧基一磷酰氧基基团，获得通式XIV的假二肽：
式中取代基R1、R2以及下标m、n、p、q及s定义如前，以及R为氢解不稳定基团，然后进行催化氢化反应或去保护处理，因而获得通式XV衍生物：
式中W、R1、R2以及下标m、n、p、q、r及s如前面所定义。
W选自下列基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亚胺基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游离或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-叠氮基、-氰硫基或其前体。
本发明进一步涉及一种制造通式IV的羧基假二肽的方法：
Figure S00819149219950321D000182
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和直链或支链羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下标m、p及q为1至10的值，
下标n为0至10的值，
以及其中X及Z各自表示酸基或官能化辅助支链，
其方法包括使用酸解或氢解不稳定的保护剂，分别保护式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸于(q+1)位的胺官能团以及于ω位的胺官能团，将仍然呈游离的羧酸官能与还原剂反应而获得对应的醇，使(q+1)位胺官能游离，然后利用式R2OH(其中R2已如前定义)羧酸的官能衍生物酰化，然后通过氢解释放出末端胺官能团而获得通式IX的氨基醇：
式中R2表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
p及q表示1至10的整数，
其方法包括在肽缩合剂存在下于惰性溶剂中，氨基醇与通式VI的ω-羧基氨基酸官能衍生物缩合：
式中R1为衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个如前面定义的取代基，
m为1至10的整数，
n为0至10的整数，
以及X为RO-CO-基
形成通式XVI的假二肽
Figure S00819149219950321D000193
式中取代基R1、R2以及下标m、n、p及q定义如前，以及R为进行氢解的不稳定基团，例如像苄基，
若有所需，使用通式VIII的取代、烷基化或酰化剂，使其游离末端醇官能取代、烷基化或酰化：
A-(CO)r-(CH2)s-W          (VIII)
式中A为离去基团，OH、SH或NH2官能，
下标r优选地等于1，但也可取0的值，
下标s优选地为2至6的值，但可取1至10的值，
W优选地选自下列基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亚胺基、-巯基、-烷硫基、-羟基、-1，2-二羟基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游离或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-叠氮基、-氰硫基或其前体，
若有所需，在偶合剂存在下，将其进行催化氢化或去保护处理而获得通式XVII衍生物：
其中取代基W、R1、R2以及下标m、n、p、q、r及s如前面所定义。
本发明还涉及一种获得通式IV的膦酰基二肽的方法：
Figure S00819149219950321D000202
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下标m、p及q为1至10的值，
下标n为0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化辅助支链，
该方法包括使用不稳定保护基团通过酸解使通式XVI假二肽的游离羟基官能保护：
式中取代基R1、R2以及下标m、n、p及q定义如前，以及R为进行氢解的不稳定基团，例如像苄基，
然后释放呈酯形式存在的羧酸官能，将任选地呈活性形式的这种羧酸官能与还原剂反应，生成相应的伯醇，这种醇官能团用磷酰化剂处理转化成磷酸酯，用酸处理释放被保护的羟基官能团，然后用通式VIII反应剂进行取代、酰化或烷基化反应
A-(CO)r-(CH2)s-W           (VIII)
式中A为离去基、OH、SH或NH2官能，
下标r优选地等于1，但也可取0的值，
下标s优选地为2至6的值，但一般可取1-10的值，
W选自下列的基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亚胺基、-巯基、-烷硫基、-羟基、-1，2-二羟基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游离或呈酯或其它衍生物形式的羧基。
若有所需，在偶合剂存在下，例如通过氢解将生成的产物去保护，以获得通式XI的产物：
式中取代基W、R1、R2以及下标m、n、p、q、r及s具有前面的意义。
本发明还涉及一种获得通式IV的膦酰基二肽的方法：
Figure S00819149219950321D000221
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链羧酸的酰基，其酰基为未经取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下标m、p及q为1至10的值，
下标n为0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化辅助支链，
该方法包括将通式XVI假二肽中以酯形式存在的羧酸官能去保护：
式中取代基R1、R2以及下标m、n、p及q定义如前，以及R是氢解时不稳定的基团，例如像苯甲基，
然后在肽偶合剂存在下，如此生成的酸与部分保护的二氨基链烷或氨基酸进行肽偶合反应，例如像3-苯甲氧基羰基氨基-1-氨基丙烷、天冬氨酸二苯甲酯或ε-N-苯甲氧基羰基-L-赖氨酸苯甲酯，然后，如果希望，偶合产物与通式VIII反应剂进行取代、酰化或烷基化反应：
A-(CO)r-(CH2)s-W            (VIII)
式中A为离去基团、OH、SH或NH2官能团，
下标r优选地等于1，但也可取0的值，
下标s优选地为2至6的值，但一般可取1-10的值，
W优选地选自下列的基团：-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-卤素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亚胺基、-巯基、-烷硫基、-羟基、-1，2-二羟基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游离或呈酯或其它衍生物形式的羧基。
若有所需，在活性剂存在下，例如通过氢解将如此生成的产物去保护，以获得通式XVIII的产物：
式中取代基W、R1、R2以及下标m、n、p、q、r及s具有前面的意义，R3代表氨基烷基、羧基烷基、二羧基烷基或氨基羧基烷基。
有酰氨基的中心的立体化学是由最初使用的氨基酸的构型决定的，而酰氨基的立体化学由最初使用的脂肪酸构型决定。可从具有L或D构型的二氨基酸或外消旋混合物开始。可始于L，D构型的羟基化氨基酸或其外消旋混合物。全部通式I或IV或XII或XVI化合物的立体异构体或非对映异构体都是本发明的一部分。
通常本发明化合物的制备方法是将ω-官能化的含N-酰基的氨基酸的酸官能与氨基醇(由还原单-N-酰化二氨基酸的羧基得到)的胺官能团偶合，接着O-酰化或-烷基化仍然呈游离的醇官能团，以加入官能化辅助支链，它在联结后可任选地进行改性而释放出反应性的官能团。最终产物去保护而释放出酸官能团。
本发明化合物的实际优选地制备方法(图1)中，ω-官能化氨基酸是ω-羟基化的α-氨基酸，例如丝氨酸或高丝氨酸，其进行一系列N-保护反应(例如呈叔丁氧基羰基衍生物形式)，通过O-烷基化羧酸酯形成苄酯以及磷酸化OH官能团，以引入保护的磷酸酯基。典型的磷酸酯保护基可以是苯基、苄基或邻-二甲苯基。苯基是实际优选的基团。其次通过去除保护基(例如使用三氟乙酸处理叔丁氧基羰基衍生物)释放出胺官能团，然后用活化的脂肪酸衍生物进行酰化，该衍生物优选地为3-羟基十四酸衍生物，例如3-十二酰基氧十四酸。活化形式可是酰基氯、活性酯、混合酐或任何其它允许形成酰胺键的化学形式。然后，通过任选地氢解除去可能存在的苄酯，而获得于α位置带有一个酰基酰氨基以及ω位置带有一个(RO)2P(O)O-基的羧酸。
根据在有机制备中[Organic Preparations and ProceduresInternational，23(1992)：191-194]描述的方法，利用铜配合物，通过一系列在ω位胺官能团的选择性保护反应，例如呈苄氧羰基衍生物形式，去除铜配合物，以及保护α位置的胺官能团，例如呈叔丁氧基羰基衍生物形式，优选地由α，ω-二氨基酸，例如鸟氨酸或赖氨酸获得肽偶合反应的对偶(partenaire)。可使用其它的保护基。根据在《四面体通讯》[Tetrahedron Letters，32(1991)928-926]中描述的方法，使用例如硼烷-二甲基硫化物配合物或通过用硼氢化钠预制的混合酐处理，将游离羧酸官能团还原转成伯醇。α位置的胺官能在酸性介质(例如经由三氟乙酸处理)释放，然后用活化脂肪酸衍生物，优选地3-羟基十四酸衍生物，如3-苄氧基十四酸进行N-酰化。若有所需，游离OH官能团在这个阶段例如呈苄氧基甲基醚形式保护。ω-氨基官能可通过用对存在的其它保护基为惰性的反应剂处理而释放，若保护基为苄氧基羰基，例如像在含三乙胺的羟基溶剂中进行选择性氢解反应。
在实际优选合成方法中，在IIDQ或其它肽偶合剂存在下，如此所得胺与如前述制备的α-酰胺化ω-磷酰化羧酸偶合，获得经保护的假二肽化合物。在EDC1或其它酯化剂存在下，使用ω-官能化酸，例如6-庚烯酸，对该产物的仍为游离的羧基官能团进行O-酰化(图5)。该酯的烯基官能在催化量或立体化学计算量的四氧化锇存在下进行二羟基化反应，然后任选地呈苄基醚形式存在的磷酸酯及羟基官能团的保护基在适当催化剂存在下通过氢解去除(实施例2.1)。在后述步骤，邻二醇使用例如高碘酸进行氧化反应，产生反应性醛官能(实施例2.2)。醛官能团还原成为伯醇，结果获得带有ω-羟基酰基基团的衍生物(实施例2.9)。
在该方法的一种实施方案中，该肽偶合产物可使用ω-氨基链烷酸衍生物，例如6-苄氧基羰基氨基己酸进行O-酰化(图11)。如此所得产物在催化剂存在下通过氢解反应进行完全的去保护反应，获得带有氨基链烷酰基辅助支链的假二肽(实施例2.6)。
在第二种优选方法中，肽偶合反应的酸对偶(配对)化合物为D-或L-天冬氨酸，或必要时D-或L-谷氨酸衍生物(图2)。天冬氨酸衍生物可使用脂肪酸，优选地3-羟基化脂肪酸衍生物，例如3-十二酰基氧十四酸，在酰化剂存在下，由该氨基酸β-苄酯的胺官能团进行N-酰化反应得到。此种产物与前述类型的氨基醇偶合，然后让如此得到的假二肽在催化剂，例如在钯/碳或在载体上的铂存在下进行氢解反应，得到带有羧酸官能团的假二肽(实施例1.2)；或例如使用亚氨基磷酸盐方法进行磷酰化反应，接着氢解反应，获得带有一个羧酸官能团以及一个磷酸官能团的假二肽(实施例1.3)。
在一种实施方案中，先前获得的假二肽的羟基官能团(图2)可使用ω官能化酸进行酰化。优选地，ω-官能化酸是ω-烯酸或ω-氨基烷酸。在庚烯酸的情况下(图8)，假二肽得到O-庚酰基衍生物，其随后在四氧化锇存在下相继地进行二羟基化反应，随后去保护(实施例2.3)以及高碘酸氧化反应(实施例2.4)；使用还原剂，例如像硼氢化钠还原如此形成的醛官能团，得到带有ω-羟基链烷酰基官能团的假二肽(实施例2.5)。在ω-氨基链烷酸，例如6-氨基己酸或甘氨酸的N-苄氧基羰基衍生物的情况下(图24)，假二肽进行酰化反应，获得经保护的0-氨基酰基衍生物，其随后通过氢解进行去保护反应(实施例2.16及2.18)。
在第二个实施方案中(图13)，图2所述的中间假二肽进行游离羟基官能的保护反应，优选地呈四氢吡喃基醚形式，然后以酯形式存在的羧基官能通过氢解或其它去保护方法去保护，然后优选地呈混合酐形式活化后，使用还原剂，例如硼氢化钠还原；如此生成的羟基官能团进行磷酸化反应，优选地采用亚氨基磷酸盐(Phosphoramidite)方法进行磷酸化反应，然后在酸性介质中水解四氢吡喃基醚，如此再生的羟基官能团用ω-官能化羧酸进行酰化反应。优选地ω-官能化酸为ω-烯酸或ω-氨基链烷酸。在6-苄氧基羰基氨基己酸的情况下，假二肽获得经保护的O-氨基酰基衍生物，其随后进行氢解反应(实施例2.7，实施例2.8)。另外，前一节的单磷酸化中间体(图15)可通过如下步骤得到：天冬氨酸β-苄酯的N-酰化衍生物与一种保护形式，例如呈苄氧基甲基醚、四氢吡喃基醚或由鸟氨酸得到的氨基醇硅甲基醚形式(图1)的肽进行偶合反应(图2)，接着释放出呈苄酯形式的酸官能团，将酸官能团还原成伯醇，磷酸化这种官能团，以及将呈苄氧基甲基醚、四氢吡喃基醚或甲硅烷基醚形式的被保护醇官能团去保护。
在第三个实施方案中，图2所示的中间假二肽使用二羧酸衍生物，优选地丁二酸酐，且在碱或偶合剂存在下进行O-酰化反应(图27)，然后如此形成的新酯通过氢解进行去保护反应(实施例2.19)。使用丁二酸酐处理去保护的O-氨基酰基衍生物，获得带有丁二酰基胺基酰基的假二肽(实施例2.17)。
在第三个优选实施方案法中，由前述鸟氨酸或赖氨酸所得的氨基醇用ω-烯基三氟甲烷磺酸酯，如庚-6-烯基三氟甲烷磺酸酯进行烷基化(图17)。这种带有仲胺的氨基醇与前述α-酰胺化ω-磷酸化酸于EDC1或其它酰化剂存在下反应获得酯。然后烯基在四氧化锇存在下进行二羟基化反应，然后保护基在适当催化剂存在下通过氢解去除，邻二醇官能团通过高碘酸钠氧化，得到反应性醛官能团(实施例2.10)。
在第四种优选方法中(图19)，根据Synthesis(1989)，36-37中描述方法制备的N-保护丝氨酸衍生物，例如对甲氧基苄氧基羰基衍生物，使用溴乙酸苄酯进行O-烷基化。胺官能团的保护基例如可使用在二氯甲烷中的三氟乙酸处理去除，胺官能团优选地使用3-羟基脂肪酸衍生物，例如3-十二酰基氧十四酸，在酰化剂存在下，或使用酰基氯或脂肪酸的任何其它活化形式进行N-酰化反应。如此所得丝氨酸的N-酰化O-烷基化衍生物在肽偶合剂，如IIDQ存在下与前述氨基醇(图1)偶合，游离的OH官能团然后用ω-官能化链烷酸在活化反应剂，例如碳化二亚胺存在下进行酰化。优选地，这种官能化酸为ω-烯酸或ω-氨基链链烷酸衍生物。例如，使用庚-6-烯酸，假二肽获得O-(6-庚烯酰基)衍生物，其循序地在四氧化锇存在下进行二氢化反应，接着通过氢解以及高碘酸氧化反应去保护(实施例2.11)。
在第五种实际优选的方法中，起始氨基酸为半胱氨酸或高半胱氨酸(图20)。例如，半胱胺使用溴乙酸对甲氧基苄酯进行S-烷基化，然后优选地，使用3-羟基化脂肪酸衍生物，如3-十四酰基氧十四酸，在酰化剂存在下，或使用酰基卤或任何其它脂肪酸活化形式进行N-酰化。如此所得半胱氨酸S-烷基化N-酰化衍生物在IIDQ或其它肽偶合剂存在下与5-氨基-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊-1-醇偶合。游离的OH官能然后用ω-官能化链烷酸，其以活化酯，如O-苯并三唑基酯形式进行O-酰化。优选地，这种酸为ω氨基链烷酸，如7-(对-甲氧苄氧基羰基氨基)庚酸。如此所得产物在含水酸性环境下进行完全去保护反应，如此获得带有7-氨基庚酰基辅助支链的假二肽(实施例2.12)。
在另一优选方法(图21)中，丝氨酸的N-对-甲氧基苄氧基羰基衍生物在强碱介质中使用亚甲基丙二苄酯进行O-烷基化。氨基保护基通过酸处理去除，然后如此释放出的胺官能团，优选地在酰化剂存在下，使用3-酰基羟基化脂肪酸，例如3-十二酰基氧十四酸，或使用脂肪酸官能衍生物，如酰基氯，或任何其它脂肪酸活化形式进行N-酰化。如此所得丝氨酸的N-酰化O-烷基化衍生物在IIDQ或任何其它肽偶合剂存在下与前述氨基醇偶合(图1)。然后假二肽的游离OH官能用ω-官能化链烷酸进行O-酰化。优选地，这种酸为ω-烯酸或ω-氨基链烷酸衍生物，例如庚-6-烯酸。如此假二肽获得O-(6-庚烯酰基)衍生物，其随后在四氧化锇存在下进行二羟基化反应，然后通过氢解及高碘酸氧化反应进行去保护，获得带有6-氧代己酰基辅助支链以及丙二酰基的衍生物(实施例2.13)。
在另一个也是优选的方法(图22)中，前述6-氨基己酰基衍生物(图11)使用例如溴乙酸O-丁二酰亚氨基酯作为酰化剂，使用溴乙酰氨基进行N-酰化。这种反应获得带有6-(溴乙酰氨基)己酰基辅助支链衍生物(实施例2.14)。
在第八个优选方法(图23)中，O-磷酸化的高丝氨酸苄酯(参考图1)使用3-苄氧基十四酸进行N-酰化，优选地使用由3-苄氧基十四酸及氯甲酸异丁酯制备的混合酐进行N-酰化。然后苄酯如前述进行选择性氢解。衍生自鸟氨酸的二氨基醇ω-N-苄氧基羰基衍生物(参考图1)用3-十二酰基氧十四酸在偶合剂存在下或使用活化酯或其它脂肪酸活化形式进行Nα-酰化，以及ω-氨基官能通过选择性氢解释放。这种胺在IIDQ或其它肽偶合剂存在下与高丝氨酸的N-(3-苄氧基十四酰基)O-(二苯基-氧磷酰基)衍生物偶合。如此所得假二肽使用ω-官能化链烷酸，例如在碳化二亚胺存在下进行O-酰化。优选地，这种酸为ω-烯酸或ω-氨基链烷酸衍生物。例如，使用庚-6-烯酸，假二肽得到0-(6-庚烯酰基)衍生物，其接着在四氧化锇存在下进行二羟基化反应，然后在适当催化剂存在下通过氢解进行去保护以及高碘酸氧化反应，最终获得带有6-氧代己酰基辅助基的衍生物。
在第九种优选方法(图29、31和34)中，图2所述的中间假二肽进行呈酯形式存在的羧基官能的去保护反应，然后，这种羧基官能团在偶合剂存在下与官能化氨基链烷偶合。优选地，官能化氨基链烷是α，ω-二氨基链烷或氨基酸的衍生物。在1-氨基-3-苄氧基羰基氨基丙烷的情况(图29)下，偶合反应产物随后进行氢解反应(实施例2.20)。在Nε-Z-赖氨酸苄酯(图31)以及天冬氨酸α，β-二苄酯的情况下(图34)，偶合反应产物优选地通过氢解进行去保护反应(实施例2.21及2.23)，或利用ω-官能化链烷酸，优选地6-氨基己酸的N-苄氧基羰基衍生物进行O-酰化反应。然后，如此所得的酯可通过氢解或采用其它的去保护方法进行去保护(实施例2.22及2.24)。
本发明还涉及呈纯对映异构体和/或立体异构体或立体异构体混合物形式的通式V、VI、IX、XIII及XVI中间产物。
本发明还涉及含有至少一种呈中性或带电形式的通式I化合物作为活性组分的药物组合物，它与无毒的，在药学上可接受的惰性赋形剂或载体结合或混合。
更特别地，本发明涉及药物组合物，它含有至少一种通式I化合物的盐作为活性成分，还有一种治疗上相容的有机或无机碱。
本发明涉及以通式I化合物为主要成分的药物组合物，它与药学的赋形剂或载体结合或混合，呈纯对映异构体形式，或呈立体异构体混合物形式。
在所要求的药物形式中，可以列举适合经粘膜、经皮、局部、吸入、肠胃道外、消化道用药方式，例如片剂、糖衣剂、胶囊、可注射溶液或悬液、气雾剂、凝胶、膏剂或渗透液剂。
优选地，根据本发明的化合物可接枝于抗原上，调节免疫反应，也可接枝在药效基团，改善治疗效果或靶向作用(ciblage)，优选地可采用注射途径施用，例如呈含水溶液或含水悬浮液的缀合物形式，任选地使用胺或羟烷基胺中和的缀合物形式。作为实例，可以列举H1N1抗原，Plasmodium的SYVPSAEQI九肽抗原以及药效基团，例如AZT，d4T以及抗生素，例如大环内酯类(macrolides)以及具有作用于中枢神经系统(SNC)的物质。
用图1至86中列出的以下实施例将说明本发明，但不限制其范围。
实施例
第一系列实施例：合成中间产物的制备
实施例1.1
1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧-十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-10-醇(图1)。1.1.14-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)3-十二酰基氧-十四酰基 氨基]丁酸
a.N-叔丁氧基羰基-DL-高丝氨酸
往高丝氨酸氢溴化物(2克；16.78毫摩尔)在水(20毫升)中的溶液，加入1M氢氧化钠溶液(16.78毫升)，然后加入碳酸铯(3.01克，9.23毫摩尔)。搅拌5分钟后，溶液于冰/水浴中冷却。然后加入二噁烷(60毫升)及焦碳酸叔丁酯。反应混合物于冰-冷水浴中维持搅拌1小时，随后于室温维持搅拌5小时。真空蒸去溶剂，无水残余物直接用于下面步骤。
b.N-叔丁氧基羰基-DL-高丝氨酸苄酯
往前一步骤的残余物内加入二甲基甲酰胺(20毫升)，进行蒸发至干。然后往反应混合物内加入二甲基甲酰胺(60毫升)及苄基溴(4.5毫升；20.13毫摩尔)。此时形成白色沉淀。混合物于搅拌下维持16小时。然后真空去除溶剂，残余物使用乙酸乙酯(2×20毫升)纯化。有机相先用水(20毫升)，然后用盐水(20毫升)洗涤。用硫酸镁干燥后，蒸去溶剂，残余物可用于下面步骤。
c.N-叔丁氧基羰基-O-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸苄酯
往前一步骤无水残余物在二氯甲烷(60毫升)中的溶液，加入4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)(4.11克；33.56毫摩尔)。反应混合物搅拌10分钟。然后加入吡啶(12毫升)及氯磷酸二苯酯(6.95毫升；33.56毫摩尔)。溶液于室温搅拌18小时，然后先用1N盐酸(5×20毫升)，然后用水(30毫升)，再用盐水(30毫升)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，在真空下蒸去溶剂。使用硅胶柱闪式色谱纯化(使用己烷/乙酸乙酯混合物洗脱，4/1)，回收磷酸化产物(7.49克；82.4％)，呈结晶固体状。熔点：63.5-64.0℃。
d.O-(二苯氢基磷酰基)-DL-高丝氨酸苄酯，三氟乙酸盐
前一步骤磷酸化产物(7.88克；15.4毫摩尔)在三氟乙酸(15毫升)中的溶液，于室温维持搅拌2.5小时。然后在高真空下蒸去溶剂，采用硅胶柱闪式色谱纯化(甲醇/二氯甲烷洗脱，10/1)，回收去保护胺的三氟乙酸盐(7.17克；88.9％)，呈结晶固体。熔点＝73.0-73.5℃。
e.2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二苯氧基磷酰氧基) 丁酸苄酯
制备根据在[Bull.Chem.Soc.Jpn.，60(1987)，2205-2214]中描述的方法得到的(R)-3-十二酰基氧十四酸(4.284克；10.07毫摩尔，1当量)在四氢呋喃THF(30毫升)中的溶液，该溶液冷却直到-15℃。然后加入N-甲基吗啉(1.108毫升；10.07毫摩尔，1当量)及氯甲酸异丁酯(1.31毫升；10.07毫摩尔，1当量)。反应混合物在-15℃维持搅拌30分钟。然后加入O-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸苄酯(5.724克；10.07毫摩尔；1当量)在THF/Et3N混合物(30毫升/5毫升)中的溶液。于室温搅拌18小时后，在真空下蒸去溶剂。残余物用水(20毫升)稀释，然后使用乙酸乙酯(2×30毫升)萃取。合并有机相，相继地用水(20毫升)、盐水(20毫升)洗涤，然后在蒸去溶剂前用硫酸镁干燥。用硅胶柱闪式色谱纯化(己烷/乙酸乙酯洗脱液，2/1)，回收期望的苄酯(7.455克；87％)，呈结晶固体状。熔点(PF)＝31.0°-32.1℃.1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δ，ppm：7.4-7，1(m，15H)；6.90(2d，1H，3J＝7.6Hz，NH)；5.3-5.1(m，3H)；4.7(m，1H)；4.35(m，2H)；2.45(m，2H)；2.4-2.1(m，4H)；1.6(m，4H)；1.4-1.1(m，34H)；0.9(t，6H)13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm：173.01；171.08；169.66；150.18(d，2JP，C＝7.1Hz)；135.01；129.60；128.33；128.14；127.96；125.21；119.80(d，3JP，C＝5.0Hz)；70.69；67.05；65.19(d，2JP，C＝5.6Hz)；49.13；40.97；40.77(2diast.)；34.20；33.98；33.82；31.70；29.42；29.34；29.14；28.94；25.01；24.77；22.47；13.91.
f.4-(二苯基氧磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基] 丁酸
前一步骤所得苄酯(2.23克，26毫摩尔)在HPLC级甲醇MeOH(300毫升)中的溶液置于三颈圆底烧瓶中，在室温及氢的大气压下，在10％碳载钯(1克)存在下氢化1小时。然后过滤去除催化剂，滤液经浓缩获得无色液体。薄层层析及NMR时使其液体均化，未经进一步纯化处理直接用于偶合步骤：
                         Rf＝0.75(CH2Cl2/MeOH/Et3N10/1/0.5).1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δ，ppm：7.4-7.1(m，10H)；6.85(d，1H，NH)；5.15(m，1H)；4.6(m，1H)；4.35(m，2H)；2.45(m，2H)；2.4-2.15(m，4H)；1.6(m，4H)；1.4-1.1(m，34H)；0.9(t，6H).13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm：173.35；173.30(2diast.)；172.75；170.37；150.0(d，2JP，C＝7.5Hz)；129.55；125.28；119.71(d，3JP，C＝4.4Hz)；70.78；65.65(d，2JP，C＝5.9Hz)；49.00；40.77；40.63(2diast.)；34.13；33.86；33.76；31.59；29.31；29.25；29.03；28.82；24.88；24.68；22.36；13.76.
1.1.2(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇 a.D-鸟氨酸铜盐
往D-鸟氨酸(5.25克，30毫摩尔)在1N氢氧化钠(30毫升)中的溶液，加入硫酸铜五水合物(3.814克，15.3毫摩尔)在水(50毫升)中的溶液。在室温下搅拌2小时后，蒸去熔剂至干。这时，往残余物加入甲醇(60毫升)，形成紫色固体，固体经分离后，相继地用二噁烷及甲醇洗涤，以便直接用于下面步骤。
b.(2R)-2-氨基-5-(苄基氧羰基氨基)戊酸铜
紫色固体溶解于1N氢氧化钠(40毫升)及二噁烷(70毫升)。反应混合物在冰冷水浴中冷却，然后加入氯甲酸苄酯(5.14毫升，36毫摩尔)。在冰-冷水浴中搅拌3小时，然后在室温下搅拌15小时后，紫色沉淀采用过滤回收，相继地用95％乙醇(40毫升)、水(50毫升)及乙醇(60毫升)洗涤。沉淀物在烘箱中干燥(温度小于45℃，于真空下)，二步骤的产率为8.27克，即93％理论产率。(参考文献：OrganicPreparations and Procedures International，23：(1992)191-194)。
c.(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸
前一步骤所得铜盐溶解于2N盐酸(400毫升)中，然后加入乙二胺四乙酸(EDTA)(8.15克，27.8毫摩尔)。混合物搅拌2.5小时后，通过加入5N氢氧化钠(约160毫升)，中和至pH7。此时形成白色沉淀。然后混合物在冰-冷水浴中搅拌2.5小时。沉淀经过滤，用冷水洗涤至流出液是无色的，然后在烘箱在60℃以下干燥。此固体溶解于1N氢氧化钠(156毫升)，溶液在冰-冷水浴中冷却。然后，往这种溶液加入在二噁烷(160毫升)的焦碳酸叔丁酯(7.7克，35.2毫摩尔)。反应混合物于0℃搅拌45分钟，随后于室温下搅拌16小时。蒸去有机溶剂，残余物溶解于乙酸乙酯(70毫升)中。然后水相通过加入2N盐酸酸化至pH约3，用乙酸乙酯(100毫升)洗涤。有机相合并，用水(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤，然后在真空下蒸发。采用硅胶柱闪式色谱纯化(二氯甲烷/甲醇洗脱液，20/1)，可回收需要产物，呈无色油状(二步骤产率：8.42克，即理论产率的76.6％)(Rf＝0.19，CH2Cl2/MeOH，20/1)。
d.(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊-1-醇
往前面所得二氨基戊酸衍生物(5.45克，14.8毫摩尔)在THF(60毫升)中的冷溶液(-15℃)，加入N-甲基吗啉(1.65毫升，14.8毫摩尔)及氯甲酸异丁酯(9.6毫升，14.8毫摩尔)。反应混合物于-15℃搅拌1分钟，接着加入硼氢化钠(5.1克，44.6毫摩尔)在10毫升水中的溶液。在-15℃搅拌10分钟后，往混合物加水(400毫升)以终止反应。溶液随后用乙酸乙酯AcOEt(100毫升×2)洗涤。有机相合并，用水(50毫升)及盐水(60毫升)洗涤，然后用硫酸镁干燥。蒸去溶剂，残余物在乙酸乙酯/己烷混合物中结晶，获得预期的结晶产物(4.94克，94.9％产率)。熔点＝47.5-48℃。
e.(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-氨基-戊-1-醇，三氟乙酸盐
制备前面获得的(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊-1-醇(6.32克，18毫摩尔)在三氟乙酸(25毫升)中的溶液，然后在室温下搅拌2.5小时。随后蒸去溶剂，残余物用硅胶柱闪式色谱纯化(甲醇/二氯甲烷洗脱液，10/1)，可以回收三氟乙酸盐，呈油状(5.45克，82.7％)。盐酸盐化合物在133.0-134.3℃熔化(由甲醇再结晶)。
f.(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄基氧十四酰基氨基] 戊-1-醇
往(R)-3-苄基氧十四酸(5.27克，15.8毫摩尔)[Bull.Chem.Soc.Jpn.，60：(1987)，2197-2204]在THF(30毫升)中冷却至-15℃的溶液，加入N-甲基吗啉(1.89毫升，15.8毫摩尔)及氯甲酸异丁酯(2.21毫升，15.8毫摩尔)。反应混合物在-15℃搅拌30分钟后，加入如前获得的三氟乙酸盐(15.25克，14.4毫摩尔)在THF/三乙胺混合物(30毫升，1.44毫摩尔)中的溶液。在室温持续搅拌16小时，然后反应混合物用水(30毫升)及乙酸乙酯(60毫升)稀释。有机相经分离后，水相用乙酸乙酯(60毫升)洗涤。有机相合并，用水(30毫升)及盐水(30毫升)洗涤，然后在真空下蒸发溶剂前用硫酸镁干燥。残余物在乙酸乙酯/己烷混合物中再结晶，获得预期产物呈结晶态(5.8克，71.2％)，PF＝117.5°-118℃。Rf＝0.32，乙酸乙酯-石油醚3/1。
                                      1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δ，ppm：7.4-7.2(m，10H)；6.5(d，1H，NH)；5.1(s，2H)；4.9(m，1H，NH)；4.5(2d，AB，2H)；3.8(m，2H)；3.5(m，2H)；3.1(m，2H)；2.4(m，2H)；1.6-1.4(m，6H)；1.4-1.2(m，18H)；0.9(t，3H).13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm：172.24；156.49；138.06；136.53；128.46；128.04；127.87；76.76；71.39；66.60；65.44；51.54；41.43；40.65；33.76；31.87；29.61；29.30；28.01；26.47；25.05；22.65；14.09.
g.(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄基氧十四酰基氨基]戊-1-醇
在三颈瓶内，催化剂(150毫克20％钯/碳)添加到(2R)-5-(苄基氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄基氧十四酰基氨基]戊-1-醇(3.0克，5.27毫摩尔)在HPLC级乙醇(300毫升)/三乙胺(6毫升)混合物中。抽真空排放空气，然后往瓶内装入氢气。反应混合物在室温下氢化2小时，然后过滤去除催化剂，滤液经浓缩得到预定产物，呈均质白色固体。Rf＝0.2；
CH2Cl2/MeOH/Et3N 5/1/0.5.PF＝47-48℃.
1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δ，ppm：7.4-7.2(m，5H)；6.75(d，1H，NH)；4.5(2d，AB，2H)；3.9(m，2H)；3.5(m，2H)；2.3-2.6(m，7H)；1.7-1.2(m，24H)；0.9(t，3H).13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm：171.86；138.13；128.37；127.87；127.75；76.81；71.50；64.57；51.38；41.51；41.17；33.89；31.82；29.26；28.57；28.03；25.07；22.60；14.04.
1.1.3.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧-十四酰 基-氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-10- 醇
IIDQ(2-异丁氧基-1-异丁氧基羰基-1，2-二氢喹啉)(364克，1.2毫摩尔，1.2当量)添加到(2RS)-4-(二苯基氧磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]丁酸(850克，1.0毫摩尔，1当量)在无水二氯甲烷(20毫升)中的溶液，此添加步骤系在室温及在氩气流下进行。反应混合物搅拌15分钟后，加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄基氧十四酰基氨基]戊-1-醇(757克，1.0毫摩尔，1当量)在无水二氯甲烷(10毫升)中的溶液。搅拌4小时之后，溶液蒸发至干。用硅胶柱闪式色谱纯化(二氯甲烷/丙酮洗脱液，5/2)，能够回收磷酸化假肽(620毫克，53％)，呈无定形固体状(Rf＝0.49，在二氯甲烷-己醇-三乙胺，10/1/0.5中)。1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δ，ppm：7.40-7.15(m，15H)，7.00(m，1H)，6.90及6.80(2d，2diast，1H)，6.65(d，1H)(3×NH)，5.15(m，1H)，4.50(m，3H)，4.30(m，2H)，3.85(m，2H)，3.45(m，2H)，3.15(m，2H)，2.41-2.14(m，8H)，1.6-1.4(m，8H)，1.4-1.1(m，54H)，0.9(t，9H，3CH3).13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm：173.11，171.68，170.52(2diast.)，169.94(2diast.)，150.0(d，2JP，C＝7.2Hz)，138.20(2diast.)，129.58，127.99，127.49，127.26，125.24，119.73(t，3JP，C：5.0Hz)，76.48，71.12，70.71，65.86(élargi)，64.22，50.96，49.71(élargi)，41.46，41.05，39.07，34.13，34.00，32.70，31.61，29.34，29.06，28.87，27.98，25.2524.92，24.72，22.38，13.80.
实例1.2
N-[(R)-3-十四酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(＝OM-197-MC)(图2)
1.2.1N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，β-苄酯
往(R)-3-十二酰基氧十四酸(3.35克，7.85毫摩尔)在-15℃无水THF(25毫升)中的溶液，在氩气流下，相继加入N-甲基吗啉(0.86毫升，7.85毫摩尔，1当量)及氯甲酸异丁酯(1.02毫升，7.85毫摩尔，1当量)。可快速地观察到N-甲基吗啉盐酸盐沉淀。在-15℃搅拌30分钟后，加入市售的H-D-Asp(0Bn)-OH(Senn化学公司，CH-Dielsdolf)(175克，7.85毫摩尔，1当量)在CH3CN/H2O，3.5/1混合物(85毫升)中的溶液，该溶液含有三乙胺(3.7毫升)。然后反应混合物在室温下搅拌一夜。然后蒸去有机溶剂，水相冷却至0℃，用10％柠檬酸水溶液酸化至pH＝3，再用乙酸乙酯(2×)萃取。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。在硅胶柱闪式色谱纯化(2/1，石油醚/乙酸乙酯洗脱液，含2％乙酸)，接着共蒸发甲苯，能够回收N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸β-苯酯(4.00克，81％)，呈白色结晶固体状(Rf＝0.42，在1/1石油醚/乙酸乙酯中，含2％乙酸，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。PF＝67-69℃。
1.2.2N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄基氧十四酰基氨基]-戊基}酰胺β-苄酯 (ASM-1)
往如上所得的β-苄酯(363毫克，0.57毫摩尔)及(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇(1.1.2节)(250毫克，0.57毫毫摩尔，10当量)在无水二氯甲烷(6毫升)中的溶液，在0℃(冰/水浴)在氩气流下相继加入市售HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)(94毫克，0.69毫摩尔，1.2当量)，然后加入市售N，N’-二异丙基碳化二亚胺(109微升，0.69毫摩尔，1.2当量)。反应混合物在0℃搅拌1小时，随后在室温下搅拌一夜。反应介质随后用水、1N盐酸溶液及1饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再分离相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。经用硅胶柱闪式色谱纯化(二氯甲烷/丙酮洗脱液，3/1)，可以回收偶合反应产物(436毫克，72％)，呈白色结晶固体状(Rf＝0.27，在5/1二氯甲烷/丙酮中，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
                               PF＝106-108℃；13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ,ppm：173.66；172.09；171.73；170.33；170.12；138.23；135.28；128.53；128.37；128.13；127.81；127.71；125.81；76.71；71.40；71.16；66.77；65.01；51.36；49.39；41.66；39.25；34.40；33.98；31.85；29.58；29.47；29.29；29.11；28.00；25.57；25.17；25.08；24.94；22.62；14.05.
1.2.3.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基)酰胺(＝OM-197- MC)
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸β-苄酯，αN-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(417毫克，0.40毫摩尔)在1/1甲醇/乙酸乙酯混合物(36毫升)中的溶液，在10％钯/碳(20毫克)存在下，在室温及大气压氢气下氢化3小时。过滤去除催化剂，用4/1二氯甲烷/甲醇混合物(50毫升)洗涤，滤液用蒸发至干，再用叶轮泵抽干，获得游离酸(345毫克，100％)，呈白色结晶固体状(Rf＝0.30，在含0.5％乙酸的9/1二氯甲烷/甲醇中，磷钼酸化合物显色剂)。PF＝135-137℃。ES/MS：m/z868.7[M+H]+，890.7[M+Na]+，868.7[M+K]+，912.7[M-H+2Na]+(图3)。
1.2.4N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-L-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺
同样的反应顺序应用到市售H-L-Asp(0Bn)-OH(Fluka公司，Buchs，瑞士)，获得L-天冬氨酸系列的差向异构体产物。
实例1.3
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-二羟基磷酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(＝OM-197-MC-MP)(图2)
1.3.1N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-二苄氧基磷酰氧基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基} 酰胺-β苄酯
往如上所得的N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯(300毫克，0.29毫摩尔)及IH-四唑(60毫克，0.86毫摩尔)在无水THF(12毫升)中的溶液，在室温及在氩气流下加入85％二苄基二乙基亚氨基磷酸酯(231微升，0.66毫摩尔)。快速观察到在反应介质中形成白色晶体。在搅拌30分钟后，反应混合物冷却至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％，183毫克，1.06毫摩尔)在二氯甲烷(8毫升)的溶液。注意晶体消失。在室温下搅拌45分钟后，加入硫代硫酸钠饱和溶液，然后反应混合物再度搅拌10分钟。溶液用醚稀释，然后有机相经分离后，用饱和硫代硫酸钠溶液(5次)、饱和碳酸氢钠溶液(2次)及1M盐酸溶液(1次)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(5/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收磷酸三酯(294毫克，79％)，呈白色固体状(Rf＝0.27，在5/1二氯甲烷-丙酮中，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)
                                            13C-RMN(62，89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.26；171.37；171.01；170.60；170.03；138.22；135.50；135.40；135.28；128.40；128.33；128.16；128.08；127.94；127.82；127.76；127.53；127.41；76.43；71.03；70.90；69.28；66.47；49.09；48.37；41.62；41.35；41.24；39.02；38.88；25.05；24.94；24.82；22.48；13.90.
1.3.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-二羟基磷酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺 (＝OM-197-MC-MP)
如上述制备的磷酸二苄酯(249毫克，190毫升)在HPLC级乙醇(12毫升)中的溶液，在10％钯/碳(30毫克)存在下，在室温及氢的大气压力下氢化4小时。采用微孔过滤除去催化剂，滤液蒸发至干，然后残余物使用叶轮泵脱水获得粗制游离磷酸酯(180毫克，100％)。ES/MS：m/z 850.7[M+H-P(O)(OH)3 +]，948.5[M+H]+970.5[M+Na]+(图4)。
实例1.4
确定合成中间物的差向异构比率
采用原始氨基酸构型确定带有酰基胺基不对称中心的立体化学。但天冬氨酸或谷氨酸衍生物与由鸟氨酸或赖氨酸得到的氨基醇间进行的肽偶合，在某些条件下可能导致偶合反应的酸对偶在C-α出现差向异构现象。为了说明该反应的差向异构率，下述方法应用于由天冬氨酸得到的化合物。
试样(30微克)蒸发入微管内，然后再溶解在40微升6M盐酸中。接着在110℃在氩气下进行水解24小时。然后试样蒸发至干，随后再度溶解在100微升0.1M四硼酸盐缓冲液，pH9.2中。随后使用OPA-IBLC试剂(邻-苯二甲醛-N-异丁炔基-L-半胱氨酸)用下述比例进行预管柱(pré-colonne)衍生化：
5微升0.1M四硼酸钠缓冲液，pH9.2
2微升170mM OPA，260mM IBLC甲醇溶液
2微升欲分析溶液
用Hypersil ODS柱(250×4.6毫米，5微米Supelco)的HPLC分析，能够定量测定存在于起始试样中的来自L及D型天冬氨酸两种衍生物(Brückner等人，1995，J.Chromatogr.A 711，201-215)。HPLC操作条件如下：
柱：     Hypersil ODS(250×4.6，5微米，Supelco)
移动相： A：23mM乙酸钠，pH5.9
         B：甲醇-乙腈(12∶1)
注入：   5微升
流速：   1毫升/分钟
洗脱：   A∶B梯度：25分钟内96∶4至80∶20
探测：   紫外光：  338纳米
在这些色谱条件下，观察到L-及D-天冬氨酸衍生物的保留时间为16.1及17.2分钟。
第2系列实施例：带有官能化附属支链的假二肽的制备
实施例2.1
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基胺基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6，7-二羟基庚酸酯)(＝OM-197-FV6)(图5)
2.1.1.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰 基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-10-醇 (6-庚烯酸酯)
往1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-10-醇(图1.1)(875毫克，0.74毫摩尔)在无水二氯甲烷(25毫升)中的溶液，加入6-庚烯酸(141微升，1.04毫摩尔，1.4当量)。溶液冷却至0℃。然后加入EDCI(64毫克，0.33毫摩尔，1.4当量)及DMAP(41毫克，0.33毫摩尔，0.14当量)。反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌3小时。用二氯甲烷稀释后，有机相相继地用水，1N盐酸溶液及水洗涤。然后，有机相用硫酸镁干燥，在40℃真空下蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(1/1石油醚/乙酸乙酯洗脱液)，能够回收1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-10-醇6-庚烯酸酯(820毫克：85％)，呈白色发泡体状(Rf＝0.18，在1/1石油醚/乙酸乙酯中，磷钼酸显色剂)。13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.30；171.18；170.42；169.91；169.73；150.10；138.21；138.14；129.77；128.25；127.49；125.44；119.88；114.56；76.48；71.11；70.90；66.01；65.52；49.90；47.80；41.34；39.07；33.92；33.76；33.69；33.61；33.17；31.75；29.47；29.19；29.00；28.46；28.11；25.34；25.05；24.85；22.52；13.96.
2.1.2.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰 基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-10-醇 (6，7-二羟基庚烯酸酯)
往在叔丁醇/水混合物(5毫升/5毫升)中含K3Fe(CN)6(373毫克，1.13毫摩尔，3当量)，碳酸钾(157毫克，1.13毫摩尔，3当量)及1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)(10.7毫克，0.095毫摩尔，0.25当量)的溶液，加入如上所得化合物(486毫克，0.38毫摩尔)，然后加入四氧化锇在25％叔丁醇(48微升，4.75毫摩尔，0.0125当量)中的溶液。反应混合物在室温(27℃)强力搅拌16小时。加入硫代硫酸钠(Na2S2O5，60毫克)，连续搅拌近1小时直到介质颜色变成褐色，然后变成绿色或淡蓝色为止。反应混合物用醚稀释，分离有机相。水相用醚彻底洗涤，有机相合并，用硫酸镁干燥，然后在40℃真空下蒸发。如此获得预期的粗制二醇呈绿色油状。通过硅胶柱闪式色谱纯化(5/2二氯甲烷/丙酮洗脱)，能够回收纯的1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氧杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-10-醇6，7-二羟庚烯酸酯(198毫克，40％)，呈无定形固体状(Rf＝0.24，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷钼酸显色剂)。
                                      13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.46；173.33；171.34；170.58；170.02；150.13；138.23；129.80；128.26；127.87；127.54；125.50；120.01；119.80；71.79；71.23；70.97；66.63；66.03；65.54；49.93；47.90；41.46；39.17；33.98；33.79；32.86；32.45；31.77；29.49；29.21；29.03；28.51；25.50；25.07；24.87；24.77；24.66；22.54；13.99.HPLC(210nm)：TR＝32.535min.ES/MS：m/z1343.0(M+Na+)；1321.0(M+H+)；1071.0(M+H+磷酸单苯酯)。
2.1.3.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基 氨基1-4-氢代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-10-醇(6，7-二 羟基庚烯酸酯)
前面得到的二醇(198毫克，0.15毫摩尔)在HPLC级乙醇(20毫升)/乙酸乙酯(1.4毫升)混合物中的溶液，在10％钯/碳(70毫克)存在下，在室温及氢的大气压力下氢化2.5小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得粗制去苄基化产物(168毫克，91％)，呈无定形固体状。
                                                     13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.15；173.51；172.82；171.04；170.49；170.35；150.05；129.79；129.42；125.53；119.91；119.83；119.72；71.80；70.93；68.58；66.47；65.94；65.52；50.02；48.12；42.59；41.26；39.13；36.92；34.29；33.85；32.32；31.74；29.50；29.18；29.00；28.15；25.47；25.07；24.85；24.73；24.56；22.51；13.99.HPLC(210nm)：TR＝30.7min.ES/MS：m/z1253.0[M+Na]+；1231.0[M+H]+.
2.1.4.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧- 9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10- (6，7-二羟基庚烯酸酯)(＝OM-197-FV6)
往氧化铂PtO2(91毫克)(在氢气氛下预先活化10分钟获得铂黑)在HPLC级乙醇(1毫升)中的悬浮液，添加前面获得的三醇(168毫克，0.14毫摩尔)在HPLC级乙醇(8毫升)/乙酸乙酯混合物(8毫升)中的溶液。溶液在室温(27℃)在氢的大气压力下氢化24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得粗制磷酸酯产物(130毫克，88％)。HPLC(210nm)：TR＝23.6分钟。ES/MS：m/z1078.9[M+H]+，1100.8[M+Na]+，1116.8[M+K]+(图6)。
实施例2.2.
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-FV7)(图5)
2.2.1.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氧 代己酸酯)(＝OM-197-FV7)
将1.86毫升0.1M高碘酸钠(39.62毫克，20当量)加入在1∶1水/异丙醇混合物中的10毫升(9.28毫摩尔，1当量)上述制备的去保护三醇，进行高碘酸氧化反应。采用LC/UV跟踪反应，2小时后表明二醇官能团定量转化成醛。在高碘酸氧化步骤(图7)后对ES/MS光谱所观察的分子离子m/z1046.8证明了预期反应。基于这种光谱，m/z1068([M+Na]+)钠与m/z1084.8([M+K]+)钾的加合物清晰可见，以及对应于m/z948.8磷酰基损失的片段。加入1至2滴乙二醇结束该反应。产物纯化可用在C18载体上的SPE进行，产率90％(5毫克二醇比例)。
实施例2.3.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-0-(6，7-二羟基庚烯酸酯)(＝OM-197-FV5)(图8)
2.3.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α- N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}-酰胺-β- 苄酯，5-0-(6-庚酸酯)
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}-酰胺β-苄酯(1.2.2.节)(122毫克，0.116毫摩尔)在无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，加入6-庚烯酸(22微升，0.160毫摩尔，1.4当量)。溶液冷却到0℃。然后，加入EDC1(49.3毫克，025毫摩尔，2.1当量)及DMAP(5.6毫克，0.046毫摩尔，0.4当量)。反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温下搅拌6小时。在用二氯甲烷稀释后，有机相相继地使用水、1N盐酸(2×)、碳酸氢钠(2×)及水(2×)洗涤。如此获得纯的预期庚烯酸酯(119克，89％)，呈白色固体状(Rf＝0.62，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，显色剂：磷钼酸)。
                       13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.63；173.38；171.72；171.11；170.08；138.14；135.28；128.46；128.34；128.24；128.05；127.64；127.53；114.62；76.49；71.14；71.02；66.66；65.49；49.17；47.79；41.69；41.35；39.09；35.46；34.33；33.80；33.65；33.21；31.79；29.52；29.23；29.06；28.46；28.16；22.56；14.00.HPLC(210nm)：TR＝36.9min.ES/MS：m/z1159.0[M+H]+；1176.0[M+NH4]+.PF＝81.5-84℃.[α]D 20＝+7.3(CHCl3)：
2.3.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α -N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}-酰胺β- 苄酯，5-0-(6，7-二羟庚酸酯)
往如上所得庚烯酸酯(60毫克，0.052毫摩尔)在水/丙酮混合物(5/3毫升)的溶液中，加入N-甲基吗啉氧化物(9毫克，0.076毫摩尔，1.5当量)，随后滴加四氧化锇在2.5％叔丁醇中的溶液(123微升，0.012毫摩尔，0.23当量)。反应混合物在室温下搅拌24小时。Na2S2O5(20毫克)添加到反应混合物，随后在室温下搅拌1小时至2小时。然后溶液用醚萃取数次，有机相合并，用硫酸镁干燥及浓缩。用硅胶柱闪式色谱纯化(5/2二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收纯的预期二醇(35毫克，57％)，呈白色固体状(Rf＝0.15，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，显色剂，磷钼酸)。
                        13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.67；173.39；171.81；171.34；170.27；170.01；138.18；135.27；128.56；128.42；128.18；127.50；127.68；76.68；71.82；71.37；71.17；66.85；66.74；65.66；49.27；47.99；41.88；41.51；39.31；35.60；34.42；33.95；33.51；31.80；29.60；29.49；29.30；28.55；25.65；25.60；25.19；25.12；24.97；24.77；24.14；22.65；14.08.HPLC(210nm)：TR＝34.16min.ES/MS：m/z1193.0[M+H+]；1212.0[M+NH4]+.
2.3.3.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α -N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-0- (6，7-二羟基庚酸酯)(＝OM-197-MC-FV5)
如上所得二醇(35毫克，0.029毫摩尔)在HPLC级甲醇(2毫升)/乙酸乙酯(2毫升)混合物中的溶液，在室温与氢的大气压力下，在含10％钯的钯/碳(10毫克)存在下进行氢化2.5小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得粗制N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺5-0-(6，7-二羟基庚酸酯)(26毫克，88％)，呈白色固体状。HPLC(210nm)：TR＝26.90分钟。PF＝94-97℃。[α]D 20＝+11.1℃(CHCl3/MeOH＝1∶0.1)。ES/MS：m/z1012.7[M+H]+，1034.7[M+Na]+，1050.7[M+K]+(图9)。
实施例2.4.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-0-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)(图8)
2.4.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α- N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-0-(6- 氧代己酸酯)(＝OM-197-MC-FV6)
1.98毫升0.1M高碘酸钠(42.25毫克，20当量)添加到在1∶1异丙醇-水混合物中的10毫克(9.88微摩尔，1当量)如上制备的去保护三醇(2.3.3.节)。溶液在室温下搅拌2小时。通过加入1至2滴乙二醇中止反应。在这个高碘酸氧化步骤后，在ES/MS光谱(图10)上观察到m/z980.6[M+H]+分子离子，证明存在醛官能团。也可见到对应于m/z1002.8([M+Na]+)钠及m/z1018.6([M+K]+)钾的加合物峰。通过在C18载体上SPE纯化能够回收OM-197-MC-FV6产物，产率90％。
实施例2.5.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-0-(6-羟基己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)(图8)
2.5.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α -N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基)酰胺5-0-(6- 羟基己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)
往如上所得6-氧代己酸衍生物(4.5毫克，0.0043毫摩尔)在90％异丙醇(20毫升)中的溶液，加入硼氢化钠在甲醇溶液(1毫克/毫升)(0.2毫升)中的溶液。混合物在25℃搅拌3分钟，然后加入过量乙酸(0.2毫升)。采用C18柱制备HPLC纯化能够回收90％产物OM-197-MC-FV7(2.3毫克，51％)在异丙醇中的溶液。
实施例2.6.
(3RS，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇]1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-RS，R)(图11)
2.6.1.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二酰基氧十四酰基 氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-10-醇 (6-苄氧基羰基氨基己酸酯)
往1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基-十四酰基氨基]-癸-10-醇(图1)(230毫克；0.20毫摩尔)在无水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，添加6-苄氧基羰基氨基己酸(88毫克，0.33毫摩尔，1.65当量)。溶液冷却至0℃。接着加入EDC1(200毫克，1.04毫摩尔，5.2当量)及DMAP(13毫克，0.10毫摩尔，0.5当量)。反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌4小时。使用二氯甲烷稀释后，有机相经分离，相继地用水、1N盐酸和水洗涤。然后，有机相用硫酸镁干燥，在40℃真空下蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(7/1.2二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收纯酯(115毫克，41％)，呈无定形固体状(Rf＝0.77，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷钼酸显色剂)
                                                                13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.27；171.20；170.34；169.88；156.36；150.16；150.13；138.28；136.56；129.80；128.35；128.26；127.90；127.51；125.45；119.97；119.83；71.05；66.37；65.97；65.61；49.94；47.81；41.39；40.66；39.09；34.32；34.25；33.95；33.65；31.78；29.50；29.38；29.22；29.03；28.55；28.44；25.95；25.06；24.87；24.26；22.55；14.00.HPLC(210nm)：TR＝33.497min.ES/MS：m/z1424.0[M+H]+；1174.0[M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.6.2.1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二酰基氧十四酰基 氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基-十四酰基氨基]-癸-10-醇 10(6-氨基己酸酯)
如上所得产物(115毫克；0.81微摩尔)在HPLC级乙醇(15毫升)/冰醋酸(0.4毫升)混合物中的溶液，在钯(10％碳载钯)(80毫克)存在下，在室温及氢的大气压力下氢化4小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得去苄基化产物(90毫克，97％)，呈无定形固体状。HPLC(210nm)：TR＝29.185分钟。ES/MS：m/z1200.0[M+H]+；952.0[M+H-(PhO)2OPOH]+。
2.6.3.3-[(R)-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9- [(R)-3-羟基十四酰基氨基]-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己 酸酯)(＝OM-197-MP-AC)
往氧化铂PtO2(30毫克)在(HPLC级)乙醇(1毫升)(预先在氢气氛下活化10分钟获得铂黑)中的溶液，加入如上所得氨基醇(90毫克，75毫摩尔)在HPLC级乙醇(5毫升)/1N盐酸(0.1毫升)混合物中的溶液。溶液于室温在氢的大气压力下氢化24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物使用叶轮泵抽干，能够获得期望的氨基磷酸酯(60毫克，79％)。HPLC(210nm)：TR＝28.51分钟。ES/MS：m/z1047.5[M+H]+；1069.6(M+Na)+，949.6[M+H-(HO)2OPOH]+(图12)。
实施例2.7
(3R，9R)3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-R，R)(图13)
2.7.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(2-四氢吡喃基)氧-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基} 酰胺β-苄酯(ASM-1-0-THP)
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸β-苄酯，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基)酰胺(1.5克；1.43毫摩尔)在无水二氯甲烷(30毫升)中的溶液，在室温及氩气流下相继地加入3，4-二氢-2H-吡喃(DHP)(327微升，3.58毫摩尔)，然后加入对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS)(108毫克，429毫摩尔)。在室温下搅拌18小时后，再加入3，4-二氢-2H-吡喃(DHP)(130微升，1.43毫摩尔)。然后溶液又在室温下搅拌9小时，然后用二氯甲烷稀释，相继地使用5％碳酸氢钠溶液及水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(先6/1，然后7/1二氯甲烷/丙酮洗脱液洗脱)，能够回收N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-[(4R)-5-(2-四氢吡喃基)氧-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯(1.45克；90％)，呈白色结晶固体状(Rf＝0.57，在5/1二氯甲烷/丙酮中；磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.7.2N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(2-四氢吡喃基)氧-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基} 酰胺
如上制备的化合物(250毫克；0.22毫摩尔)在含三乙基胺(0.4毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳载钯(10毫克)存在下，在室温及氢的大气压力下氢化二小时。过滤去除催化剂，滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，回收呈三乙基铵盐形式的酸(250毫克)。
2.7.3.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-10-(2-四氢吡喃基)氧-癸-1-醇
往如上所制备的酸(约250毫克)在2/1二氯甲烷/无水THF混合物(3毫升)中的溶液，在0℃及氩气流下加入N-甲基吗啉(72微升；0.66毫摩尔；3当量)，然后加入氯甲酸异丁酯(86微升；0.66毫摩尔；3当量)。迅速观察形成的N-甲基吗啉盐酸盐沉淀。CCM监视反应的进行(Rf＝0.90，在2/1二氯甲烷/丙酮中)。在室温下搅拌30分钟后，反应混合物冷却至0℃，然后快速加入硼氢化钠(33毫克；0.88毫摩尔；4当量)在水(1毫升)中的溶液。一旦气体停止冒出(5分钟)，溶液用水(1毫升)及THF(1毫升)稀释，然后在室温下搅拌5分钟。溶液经浓缩，使用二氯甲烷及水稀释，接着分离各相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(2/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收醇(138毫克；61％二步骤)，呈白色结晶固体状。(Rf＝0.33，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.7.4.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-10-(2-四氢吡喃基)氧-癸-1-醇二 苄基磷酸酯
往上述制备的醇(120毫克；0.12毫摩尔)及1H-四唑(25毫克；0.35毫摩尔；3当量)在无水THF(5毫升)中的溶液，在室温及氩气流下，加入85％二苄基二乙基亚氨基磷酸酯(95微升；0.27毫摩尔；2.3当量)。可见在反应介质中快速形成白色晶体。搅拌30分钟后，反应混合物冷却至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％；75毫克；0.43毫摩尔；3.7当量)在二氯甲烷(3毫升)中的溶液。注意晶体消失。在室温下搅拌45分钟后，加入饱和Na2S2O3溶液(3毫升)，反应混合物搅拌10分钟。其次，溶液用醚稀释，有机相经分离后，用饱和硫代硫酸钠溶液(5x)及饱和碳酸氢钠溶液(2x)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(先4/1，然后2/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收磷酸二苄酯(126毫克；84％)，呈无定形固体状(Rf＝0.53，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.7.5.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-1，10-二醇1-(磷酸二苄酯)
往1％盐酸在甲醇(25毫升)中的溶液，在0℃添加如上制备的化合物(700毫克，0.54毫摩尔)在二氯甲烷(2.5毫升)中的溶液。在0℃搅拌45分钟后，反应介质用5％碳酸氢钠溶液中和，用二氯甲烷稀释，然后分离有机相。所得水相用二氯甲烷(3x)萃取，合并有机相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发，获得粗制醇(640毫克；98％)(Rf＝0.50，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.7.6.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-(磷酸二苄酯) 10-(6-苄氧基羰基氨基己酸酯)
往如上制备的化合物(640毫克，0.53毫摩尔)和6-(苄氧基羰基氨基)已酸(423毫克，1.60毫摩尔)在无水二氯甲烷(25毫升)中的溶液，在0℃及氢气流下相继地加入市售1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(306毫克，1.60毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(20毫克，160毫摩尔)。然后反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。然后反应介质用水，再用1N盐酸溶液洗涤，接着分离各相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。采用硅胶闪式色谱纯化(先4/1，然后2/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，可回收偶合反应产物(537毫克；71％)。
                                     13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.18；171.16；170.38；169.60；156.30；138.23；136.50；135.38；135.28；128.42；128.26；128.17；127.79；127.74；127.44；76.48；71.15；70.84；69.47；69.39；69.31；66.25；65.62；64.43；64.37；49.78；47.76；41.41；41.34；40.57；38.97；34.22；34.16；33.96；33.57；32.95；31.70；29.43；29.15；28.95；28.32；25.87；25.46；25.02；24.80；24.18；22.49；13.94.
2.7.7.3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂- 9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6- 胺基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-R，R)(图13)
如上制备的化合物(500毫克，0.35毫摩尔)在含乙酸(10毫升)的5/2二氯甲烷/乙醇混合物(70毫升)中的溶液，在10％碳载钯存在下，在室温及氢大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物使用叶轮泵抽干，获得3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(368毫克，定量产率)。ES/MS：m/z1047.9[M+H]+；1069.8(图14)。
实施例2.8.
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-S，R)
应用于N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺β-苄酯(1.2.4.节)，同样的反应顺序可得到实施例2.8的产物。
实施例2.9.
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-(6-羟己酸酯)(＝OM-197-FV8)(图15)
2.9.1.(2R)-5-(氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊- 1-醇苄氧基甲基醚
往(2R)-5-(苄氧基羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇(1.1.2.节)(2.05克；3.60毫摩尔)在无水二氯甲烷(40毫升)中的溶液，在室温及在氩气流下相继地加入BOMC1(苄基氯甲基醚)(工业级60％，1.25毫升；5.41毫摩尔；1.5当量)及二异丙基乙基胺(942微升；5.41毫摩尔；1.5当量)。然后，反应混合物在室温下搅拌一夜，随后蒸发至干。通过硅胶柱闪式色谱纯化(2/1石油醚/乙酸乙酯洗脱液)，回收O-苄氧甲基衍生物(2.28克；92％)，呈白色结晶固体状(Rf＝0.70，在1/3石油醚/乙酸乙酯混合物中，磷钼酸及紫外光显色剂)。PF＝97-100℃。此种产物(200克；2.90毫摩尔)在含三乙基胺(4毫升)的HPLC级乙醇(220毫升)中的溶液，在20％氢氧化钯/碳(200毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化3小时时间。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，能够获得游离胺(1.58克；98％)，呈无定形固体状。
                             [α]D-1°(C＝1.20；CHCl3)；1H-RMN(250MHz，CDCl3)，δ，ppm：7.45-7.21(m，10H，Ar)，6.52(d，1H，NH)，4.80-4.45(m，6H，2×CH2-ph，O-CH2-O)，4.10(m，1H，H-3＇)，3.83(m，1H，H-2)，3.62(dd，1H，H-1)，3.47(dd，1H，H-1)，2.65(t，2H，2×H-5)，2.40(m，2H，2×H-2’)，1.80-1.40(m，8H，2×H-4，2×H-3，2×H-4’，NH2)，1.40-1.20(m，18H，9×CH2)，0.88(t，3H，CH3)；13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm：170.78；138.24；137.63；128.38；128.32；127.66；127.62；94.82；76.70；71.26；69.63；69.44；48.48；41.82；41.47；33.83；31.84；29.88；29.58；29.56；29.51；29.27；29.04；25.11；22.62；14.06.
2.9.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-L-天冬氨酸，α -N-{(4R)-5-(苄氧基甲氧基)-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基} 酰胺β-苄酯
在IIDQ存在下，按照第1.2.2.节中描述的相同条件，如前述制备的胺与N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-L-天冬氨酸-β-苄酯(由L-天冬氨酸-β-苄酯制备，参见第1.2.1节)偶合。用硅胶纯化其产物(先2∶1然后1∶1石油醚/乙酸乙酯)能够获得相应的酰胺，65％产率。ES/MS：m/z1169.7([M+H]+)。
2.9.3.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二苄基 磷酸酯
如上所得偶合反应产物(1.05克；0.90毫摩尔)在含三乙基胺(1.5毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(65毫升)中的溶液，在10％碳载钯(50毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化1小时。过滤去除催化剂，滤液蒸发至干，然后用叶轮泵抽干。残余物溶解在1∶1异丙醇/二氯甲烷混合物(50毫升)中，在室温与Amberlite IR-120(H+)树脂(3毫升)共同搅拌10分钟。树脂过滤除去，滤液蒸发至干，获得游离酸(956毫克；99％)，呈白色结晶固体状。
往如上所得的酸(855毫克；0.79毫摩尔)在无水THF(5毫升)中的溶液在0℃及氩气流下，加入N-甲基吗啉(87微升；0.79毫摩尔；1当量)，然后加入氯甲酸异丁酯(103微升；0.79毫摩尔；1当量)。迅速观察到形成的N-甲基吗啉盐酸盐沉淀。在室温下搅拌30分钟后，反应混合物冷却至0℃，然后快速加入硼氢化钠(60毫克；1.58毫摩尔；2当量)在水(2毫升)中的溶液。一旦停止放出气体(5分钟)，溶液用水(2毫升)及THF(2毫升)稀释，然后在室温下搅拌5分钟。溶液经浓缩后，用二氯甲烷及水稀释。用1M盐酸溶液中和，接着分离各相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(4/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，可回收还原产物(387毫克；46％)，呈白色结晶固体状。
往此醇(313毫克；0.29毫摩尔)及1H-四唑(62毫克；0.88毫摩尔；3当量)在无水THF(12毫升)中的溶液，在室温及在氩气流下加入85％二苄基二乙基亚氨基磷酸酯(267微升；0.67毫摩尔；2.3当量)。迅速观察到在反应介质中生成白色晶体。搅拌30分钟后，反应混合物冷却至-20℃，然后加入mCPBA(57-85％；187毫克；1.08毫摩尔；3.7当量)在二氯甲烷(8毫升)中的溶液。观察到晶体消失。在室温下搅拌45分钟后，加入饱和Na2S2O3溶液(5毫升)，反应混合物搅拌10分钟。溶液再用醚稀释，然后有机相经分离，用饱和Na2S2O3溶液(5x)、饱和碳酸氢钠溶液(2x)及1M盐酸溶液(1x)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤与蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(先8/1，然后5/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，可以回收磷酸三酯(361毫克；93％)，呈无定形固体状。
这种产物在THF-HCl含水介质中进行水解反应，分裂去除苄氧基甲基缩醛，这样得到(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二苄基磷酸酯。
2.9.4.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代 -5-氯杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯 10-(6，7-二羟庚酸酯)
在二氯甲烷中，在0℃与在DMAP存在下，在EDCl存在下使用庚-6-烯酸使上述得到的产物在10位进行O-酰化反应(参见2.3.1.节)。然后庚烯酸酯在(催化量)四氧化锇及N-甲基吗啉氧化物存在下进行羟基化反应(参见2.2.2.节)，这样获得对应的二醇(6，7-二羟基庚酸酯)。此种产物在乙醇中，在氢的大气压力下，在钯/碳催化剂存在下通过氢解去保护(参见2.2.3.节)。
2.9.5.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯 10-(6-氧代己酸酯)
如上去保护的二醇在异丙醇-水混合物中进行高碘酸氧化反应(操作程序，参见2.2.1.节)。
2.9.6.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代 -5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯 10-(6-羟基己酸酯)(＝OM-197-FV8)
往如上所得的6-氧代己酸衍生物(4.5毫克，0.0043毫摩尔)在90％异丙醇(20毫升)中的溶液，加入硼氢化钠(0.2毫升)在甲醇(1毫克/毫升)中的溶液。混合物在25℃搅拌3分钟，然后加入过量乙酸(0.2毫升)。使用C18柱制备HPLC纯化，可回收90％产物OM-197-FV8(2毫克，44％)在异丙醇中的溶液。ES/MS：m/z1048.5[M+H]+；950.5[M+H-(HO)2OPOH]+(图16)。
实施例2.10.
2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟磷酰氧)-丁酸-{2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)氨基)戊酯(＝OM-144-FP9)(图17)
2.10.1.三氟甲烷磺酸庚-6-烯酯
三氟甲烷磺酸酐Tf2O((CF3·SO2)2O，11毫升；6.67毫摩尔)在-15℃滴加到庚-6-烯-1-醇(515毫克；4.51毫摩尔)和三乙胺(627微升；4.51毫摩尔)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，混合物在-15℃搅拌30-45分钟至无任何醇剩余为止。回到室温后，介质用二氯甲烷稀释，相继地用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤。如此得到的有机相用硫酸镁干燥，真空浓缩获得残余物，残余物溶解在(1/2)乙酸乙酯/石油醚混合物中，用硅胶过滤(去除反应期间形成的三乙胺盐)。蒸发滤液后，得到三氟甲烷磺酸盐，产率87％(956毫克)，未经进一步纯化可用于下面步骤。Rf＝0.8，在1/2乙酸乙酯/石油醚中。
                            1H-RMN(CDCl3，250MHz)；δ，ppm：5.7；5.0；4.45；2.0；1.8；1.4.13C-RMN(CDCl3，62.89MHz)；δ，ppm：138.21；114.95；77.68；33.40；29.13；28.10；24.53.
2.10.2.(2R)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-5-(庚-6-烯基) 氨基-戊-1-醇
将上述新制备的三氟甲烷磺酸盐(956毫克；3.88毫摩尔)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，滴加到(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇(1.1.2.节)(1.69克；3.88毫摩尔)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，混合物在室温在氩气流下搅拌4小时。用二氯甲烷稀释后，反应介质相继地用饱和碳酸氢钠水溶液及水洗涤。如此所得到的有机相用硫酸镁干燥，真空浓缩。用硅胶柱闪式色谱纯化(15/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，能够回收期望的仲胺(862毫克；43％)。Rf＝0.3(8/1二氯甲烷/甲醇)。
                                                                   ES/MS：m/z532.0[M+H]+.RMN1H(CDCl3，250MHz)；δ，ppm：7.2-7.4；7.1；5.8；5.0；4.6；3.95；3.5；2.9；2.5；2.1；1.9-1.5；1.5-1.2；0.9.RMN13C(CDCl3,62.89MHz)；δ，ppm：172.17；138.28；138.21；128.39；127.96；127.71；114.82；76.80；71.40；63.81；50.87；48.30；47.75；41.57；34.10；33.39；31.89；29.66；29.62；29.33；28.19；28.03；25.21；26.11；25.78；22.82；22.66；14.10.RMN1H(CDCl3，250MHz)；δ，ppm：7.2-7.4；6.75；5.8；5.0；4.5；3.9；3.5；2.5；2.0；2.1；1.7-1.2；0.9.RMN13C(CDCl3，62.89MHz)；δ，ppm：171.77；138.68；138.14；128.23；127.72；127.56；114.22；76.64；71.37；64.58；51.45；49.79；49.37；41.53；33.90；33.53；31.77；29.65；29.20；28.64；28.57；25.00；26.68；25.93；22.53；13.98(分别为铵盐及游离碱光谱)。
2.10.3.2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二苯氧基磷 酰氧基)丁酸-{2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-5-(庚-6-烯基)-氨 基}-戊酯
往上述得到的仲胺(163毫克；0.307毫摩尔；1当量)和4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]丁酸(1.1.1.节)(278毫克；0.368毫摩尔；1.2当量)在二氯甲烷(25毫升)中的熔液，加入N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)(54微升；1当量)。介质冷却至0℃，然后加入EDC1(71毫克；1.2当量)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(41毫克；1当量)。反应混合物在0℃搅拌2小时，随后在室温下搅拌90小时。然后，该溶液用水洗涤，有机相用硫酸镁干燥，随后在40℃真空下蒸发。采用硅胶柱闪式色谱纯化(15/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，能够回收O-酰化产物(126毫克；32％)。
2.10.4.2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二苯氧基磷 酰氧基)丁酸-{2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-5-(6，7-二羟基庚 基)-氨基}-戊酯
新制备的2.5％四氧化锇在吡啶(1.1毫升；1.9当量)中的溶液，在25℃滴加到如上制备的O-酰化反应产物(70毫克；0.055毫摩尔)在无水吡啶(5毫升)中的溶液。混合物在室温下搅拌24至48小时，然后加入Na2S2O5处理，最终用二氯甲烷稀释，相继地用水、1N盐酸水溶液和再次用水洗涤。所得有机相用硫酸镁干燥，过滤，蒸发，得到的残余物用硅胶柱闪式色谱纯化(15/1至10/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，这样能够回收期望的二醇(27毫克；38％)。HPLC(210nm)：TR＝37.25分钟。ES/MS：m/z1307.0[M+H]+。
2.10.5.2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟基磷酰 氧基)丁酸-{2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-5-(6，7-二羟基庚基)-氨 基}-戊酯(＝OM-144-FP8)
a.去苄基化反应
往前面得到的二醇(50毫克；0.038毫摩尔)在HPLC级甲醇/乙醇混合物(5/0.2毫升)中的溶液，加入催化剂(10％Pd/C)(10毫克)。反应混合物在氢气(大气压)中在室温下搅拌4小时。用微孔过滤器过滤去除催化剂，滤液蒸发得到去苄基化产物(46毫克；99％)，无需进一步纯化。HPLC(210nm)：TR＝35.13及35.51分钟(观测到两种非对映异构体)。ES/MS：m/z1217.0[M+H]+。
b.去苯基化反应：
催化剂(PtO2)(25毫克；3.8当量)在HPLC级乙醇(0.5毫升)中的悬浮液，在氢气下进行10分钟预活化。前面得到的去苄基化产物(35毫克，0.029毫摩尔)在HPLC级乙醇(2毫升)中的溶液(在氩气下预脱气)添加到催化剂悬浮液。然后，反应混合物在氢气下在室温搅拌2小时。催化剂用微孔过滤器过滤，滤液蒸发得到期望的磷酸酯(26毫克；87％)，无需进一步纯化。HPLC(210nm)：TR＝29.3及30.9分钟(观察到两种非对映异构体)。ES/MS：m/z1064.8[M+H]+，1086.8[M+Na]+，1108.8[M-H+2Na]+(图18)。
2.10.6.2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟基磷酰 氢基)-丁酸-{2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)-氨 基}-戊酯(＝OM-144-FP9)
1.87毫升0.1M高碘酸钠(40.17毫克，20当量)添加到在异丙醇水混合物(1∶1)中的10毫克(9.39毫摩尔，1当量)前面制备的去保护产物。溶液在室温下搅拌2小时。通过加入1至2滴乙二醇中止反应。TR＝30.0及31.5分钟。(观察到两种非对映异构体)。ES/MS：m/z1032.8[M+H]+，1054.8[M+Na]+。
实施例2.11.
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-壬-1，9二醇1-0-羧甲基醚9-0-(6-氧代己酸酯)(＝OM-112-FV7)(图19)
D-丝氨酸被保护成N-(对-甲氧基苄氧基羰基)衍生物形式[参见Chen及Wang，Synthesis(1989)：36-37]，然后，羟基官能团在氢化钠(2当量)存在下，使用溴乙酸苄酯进行烷基化。在二氯甲烷中用三氟乙酸处理释放出胺基官能团，然后在三乙基胺存在下，使用(R)-3-十二酰基氧十四烷酰氯进行酰化。如此所得的丝氨酸衍生物在IIDQ存在下与(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊-1-醇胺(参见4.1.1.节)偶合，获得(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-壬-1，9-二醇1-0-苄氧基羰基甲基醚。然后，该产物在EDC1存在下使用庚-6-烯酸进行酰化。附属酯的双键使用四氧化锇(催化量，在N-甲基吗啉N-氧化物存在下)进行羟基化，然后在乙醇溶液中，在钯/碳存在下通过氢解使二醇去保护。在异丙醇-水混合物中，通过高碘酸钠处理可得到OM-112-FV-7产物。C65H103N3O12。MM：1010.45。
实施例2.12.
(2R，8R)-1-(羧甲基)-硫-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基-十四酰基氨基]-壬-9-醇9-0-(7-氨基庚酸酯)(＝OM-212-AH1)(图20)
在THF-水介质中，在碳酸钠存在下，使用溴乙酸对-甲氧基苄酯使D-半胱胺酸进行S-烷基化。如此得到的S-苄氧基羰基甲基半胱胺酸使用(R)-3-十四酰氧十四烷酰氯进行N-酰化，然后在IIDQ存在下，S-烷基化-N-酰化的D-半胱胺酸衍生物与(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊-1-醇胺{由氢解(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊-1-醇获得(参见4.1.1.)}偶合。如此所得的产物选择性地在第一位置，使用由丁醇与7-(对-甲氧基苄氧基羰基氨基)庚酸得到的酯进行O-酰化。然后使用三氟乙酸水溶液处理该酯，可除去两个对-甲氧基苄基基团。C59H112N4O10S。MM：1069.64。
实施例2.13.
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-壬烷-1，9-二醇1-0-(2，2-二羧乙基)醚9-0-(6-氧代己酸酯)(＝OM-312-FV7)(图21)。
在氢化纳存在下，使用亚甲基丙二酸二苄酯使D-丝胺酸的N-(对-甲氧基苄氧基羰基)衍生物进行O-烷基化。在二氯甲烷中，通过三氟乙酸处理，释放胺官能，然后在三乙基胺存在下，使用(R)-3-十二酰基氧十四烷酰氯进行酰化。如此所得的丝氨酸衍生物在IIDQ存在下与(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊-1-醇胺(参见4.1.1.节)偶合，得到(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-苄氧基十四酰基胺基]-壬烷-1，9-二醇1-0-[2，2-双-(苄氧基羰基)乙基]醚。这种产物在EDC1存在下使用庚-6-烯酸进行O-酰化，然后庚烯酰酯使用四氧化锇进行羟基化。在乙醇中，在钯/碳存在下通过氢解除去苄基。在异丙醇-水混合物中，使用高碘酸钠处理去苄基化产物获得OM-312-FV-7产物。C58H105N3O14。MM：1068.49。
实施例2.14.
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6-溴乙酰氨基己酸酯)(＝OM-412-BA7)(图22)
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(参见4.2.3.3.节)，在水-DMF介质，在三乙胺存在下，使用溴乙酸丁二酰亚胺基氧基酯进行溴乙酰化反应。最后产物采用HPLC纯化。C57H108BrN4O13P。MM：1168.4。
实施例2.15.
(3R，9R)-3-[(R)-羟基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基)-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-O-(6-氧代己酸酯)(OM-512-FV7)(图23)
2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基)-4-二苯氧基-磷酰氧基-丁酸[制备方法如下：使用(R)-3-苄氧基十四酰氯使0-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸苄酯三氟乙酸盐进行N-酰化反应，然后在乙醇中，在三乙胺及钯/碳催化剂存在下，通过氢解分裂苄酯]，在IIDQ存在下偶合(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]戊-1-醇[制备方法如下：使用(R)-3-十二酰基氧十四酰氯使(2R)-5-(苄氧基羰基氨基)-2-氨基-戊-1-醇的三氟乙酸盐进行N-酰化反应，然后在乙醇中，在三乙基胺及钯/碳催化剂存在下，通过氢解将C5位的氨基去保护]。在EDC1存在下，使用6-庚烯酸，将如此生成的酰胺的游离态OH官能进行O-酰化，得到相应的酯。辅助酯的双键使用四氧化锇进行羟基化反应；然后使用钯/碳催化剂，通过氢解去除苄基，通过在铂黑氢解释放磷酸酯。二醇官能团进行高碘酸氧化反应，生成6-氧代己酰基衍生物OM-512-FV7。C55H104N3O13P。MM：1046.42。
实施例2.16.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺(＝OM-197-MC-AC)(图24)
2.16.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-苄氧基羰基氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基 氨基]戊基}酰胺β-苄酯
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯(400毫克，0.38毫摩尔)及6(苄氧基羰基氨基)己酸(220毫克，0.83毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)中的溶液，在0℃，在氩气流下相继地加入市售1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(162毫克，0.85毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(12毫克，98微摩尔)。然后，反应混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。反应介质用水及1N盐酸溶液洗涤，然后相分离。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(先9/1，然后4/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收偶合反应产物(395毫克；81％)，呈白色固体状。
                                    13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm 173.46；173.29；171.83；171.14；170.12；156.38；138.19；136.60；133.30；128.51；128.42；128.31；127.99；127.70；127.58；119.97；76.49；71.23；71.06；66.73；66.47；49.21；47.83；41.42；40.73；39.14；35.46；34.38；33.86；33.70；31.84；29.57；29.46；29.28；29.10；26.01；25.54；25.17；25.08；24.94；24.31；22.61；14.05.
2.16.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰 胺
上述制备的化合物(340毫克，0.26毫摩尔)在含乙酸(2毫升)的5/1二氯甲烷/乙醇混合物(24毫升)中的溶液，在10％碳载钯(40毫克)存在下，在室温与在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺(238毫克，定量产率)。C55H104N4O10：m/z/981.9([M+H]+)；(图25)。
实施例2.17.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)5-(6-丁二酰氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]}戊基]酰胺(＝OM-197-MC-AC-Succ)(图24)
往实施例2.16.的产物(2.16.2.节)(50毫克；0.051毫摩尔)在吡啶(3毫升)中的溶液，相继地加入丁二酐(11毫克，0.1毫摩尔)及4-N，N-二甲基胺基吡啶(7毫克；0.57毫摩尔)。在50℃在氩气下搅拌6小时后，加入甲醇(2毫升)，反应介质再在室温下搅拌15分钟。蒸去溶剂，产物采用硅胶柱闪式色谱纯化(先7∶1，然后5∶1二氯甲烷/甲醇洗脱液)；如此获得的产物呈白色固体状(42毫克；74％)。C59H108N4O13ES/MS：m/z1082([M+H]+)，Rf＝0.1(4∶1二氯甲烷/甲醇)。
实施例2.18.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(甘氨酸氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Gly)(图24)
2.18.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-苄氧羰基氨基乙酰氧基]-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基] 戊基}酰胺β-苄酯
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基)酰胺β-苄酯(300毫克，0.29毫摩尔)及市售N-苄氧基羰基甘氨酸(101毫克，0.49毫摩尔)在干燥二氯甲烷(10毫升)中的溶液，在0℃及氩气流下相继地加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(93毫克，0.48毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(6毫克，49微摩尔)。然后反应混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。反应介质再用水及1N盐酸溶液洗涤，接着相分离。有机相用硫酸镁干燥。过滤及蒸发。通过硅胶柱闪式色谱纯化(先8/1，然后6/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收偶合反应产物(313毫克；88％)，呈白色固体状。
                        13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm173.71；173.49；171.80；171.68；171.21；170.21；170.06；169.94；169.84；156.41；138.18；136.16；135.26；128.46；128.40；128.33；128.26；128.04；127.93；127.65；127.55；76.49；71.14；71.07；70.93；66.90；66.67；66∶38；66.26；49.21；49.03；47.72；47.66；42.58；41.83；41.68；41.32；39.02；35.58；35.39；34.34；33.84；31.80；29.52；29.24；29.06；28.31；28.13；25.34；25.12；25.03；24.89；22.57；14.01.
2.18.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(甘胺酸氧)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(＝OM- 197-MC-Gly)(图24)
上述制备的化合物(268毫克，0.22毫摩尔)在含乙酸(2毫升)的5/1二氯甲烷/乙醇混合物(12毫升)中的溶液，在10％碳载钯(30毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(甘氨酸氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(200毫克，定量产率)。C51H96N4O10：ES/MS；m/z925.7([M+H]+)，947.8[M+Na]+；(图26)。
实施例2.19.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(丁二酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Succ)(图27)
2.19.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(丁二酰氧基)-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺 β-苄酯
往丁二酐(25毫克，0.25毫摩尔)在无水二氯甲烷(2毫升)中的溶液，在三乙基胺(40微升，0.29毫摩尔)存在下，在0℃加入N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯(1.2.2.节)(150毫克，0.14毫摩尔)在二氯甲烷(5毫升)中的溶液。反应混合物在0℃搅拌10分钟，随后在室温下搅拌。然后反应介质用二氯甲烷稀释，用1N盐酸熔液洗涤，接着分离相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(9/1二氯甲烷/丙酮洗脱液，含2％乙酸)，能够回收酸产物(148毫克；90％)，呈白色固体状。
                                13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm175.03；173.55；173.35；171.92；171.72；171.36；170.97；170.60；170.46；170.41；138.05；135.24；128.85；128.76；128.41；128.27；128.20；128.03；127.59；76.48；71.31；70.77；66.67；65.08；49.20；48.11；41.48；41.31；39.02；35.80；34.26；34.13；33.84；31.77；29.50；29.21；29.03；25.05；24.99；24.83；22.54；13.98.
2.19.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-丁二酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺 (＝OM-197-MC-Succ)(图27)
上述制备的化合物(124毫克，0.11毫摩尔)的溶液溶解于含乙酸(1毫升)的热(HPLC级)乙醇(12毫升)中，然后在10％碳载钯(15毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化10小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物使用叶轮泵抽干，得到二酸产物(102毫克，97％)。C53H97N3O12：ES/MS；m/z968.6([M+H]+)，990.7([M+Na]+)；(图28)。
实施例2.20.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺(＝OM-197-AP)(图29)
2.20.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸-β-苄酯，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺(1.2.2.节)(2.53克；2.4毫摩尔)在含三乙基胺(4毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(150毫升)中的溶液，在10％碳载钯(120毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化2小时。过滤去除催化剂，滤液蒸发至干，然后用叶轮泵抽干。然后残余物溶解在1/1异丙醇/二氯甲烷混合物(100毫升)中，在室温与Amber1iteIR-120(H+)树脂(5毫升)共同搅拌10分钟。过滤去除树脂，滤液蒸发至干，获得游离酸(2.25克；97％)，呈白色结晶固体状。(Rf＝0.45，在含1％乙酸的9/1二氯甲烷/甲醇中，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。PF＝115-117℃。
2.20.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3- 苄氧基羰基氨基丙基)酰胺
将IIDQ(2-异丁氧基-1-异丁氧基羰基-1，2-二氢喹啉)(98克；0.32毫摩尔)在无水二氯甲烷(3毫升)中的溶液，在0℃及在氩气流下添加到前面制备的化合物(250毫克，0.26毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反应混合物在0℃搅拌15分钟，加入市售3-苄氧基羰基氨基-丙基胺盐酸盐(70毫克，0.29毫摩尔)在含三乙基胺(40微升，0.29毫摩尔)的无水二氯甲烷(7毫升)中的溶液。搅拌18小时后，溶液蒸发至干。采用硅胶柱闪式色谱纯化(20/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，可回收偶合反应产物(217毫克；78％)，呈白色固体状。
2.20.3.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-氨 基丙基)酰胺(＝OM-197-AP)
上述制备的化合物(50毫克，44毫摩尔)在含乙酸(1毫升)的1/1-氯甲烷/异丙醇混合物(8毫升)中的溶液，在10％碳载钯(10毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化6至8小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，残余物用叶轮泵抽干，获得N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺(32毫克，80％)。C52H101N5O8：ES/MS；m/z924.8([M+H]+)；1848.8([2M+H]+)；(图30)。
实施例2.21.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys)(图31)
2.21.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N- [(1S)-1-苄氧基羰基-5-苄氧基羰基氨基戊基]酰胺
在室温及在氩气流下，IIDQ(2-异丁氧-1-异丁氧羰基-1，2-二氢喹啉)(114毫克；0.38毫摩尔)在无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，加到N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺(2.20.1节)(330毫克，0.31毫摩尔)在无水二氯甲烷(20毫升)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后加入市售ε-N-苄氧基羰基-L-赖氨酸苄酯盐酸盐(140毫克，0.31毫摩尔)在含三乙基胺(48微升，0.34毫摩尔)的无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。搅拌18小时后，溶液蒸发至干。通过硅胶柱闪式色谱纯化(先30/1，然后20/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，可以回收偶合反应产物(317毫克；77％)，呈白色固体状。
                            13C-RMN(62，89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.68；172.35；171.92；170.74；170.62；170.54；156.75；156.52；138.31；136.54；135.12；128.54；28.40；128.28；128.21；127.96；127.577；127.59；76.67；71.40；71.18；67.20；67.09；66.48；64.67；52.30；51.19；41.64；40.34；39.24；37.58；34.40；34.10；31.83；29.58；29.27；29.09；25.16；25.11；24.93；22.60；14.04.
2.21.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N- [(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(OM-197-Lys)
上述制备的化合物(93毫克；71微摩尔)在含冰醋酸(0.5毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳载钯(17毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，残余物用叶轮泵抽干，获得N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基]酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(71毫克，定量产率)。C55H105N5O10：ES/MS：m/z996.9([M+H]+)；1018.9([M+Na]+)；(图32)。
实施例2.22.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys-AC)(图31)
2.22.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-苄氧基羰基氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基 氨基]戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1-苄氧基羰基-5-苄氧基羰基氨基戊 基]酰胺
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-苄氧基羰基-5-苄氧基羰基氨基戊基]酰胺(2.21.1.节)(317毫克，0.24毫摩尔)及6-(苄氧基羰基氨基)己酸(128毫克，0.48毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)中的溶液，在0℃及在氩气流下相继地加入市售的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(93毫克，0.48毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(12毫克，0.98毫摩尔)。反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。然后反应介质先用水，然后用1N盐酸溶液洗涤，接着分离相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱处理(2/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，可回收偶合反应产物(266毫克；71％)呈白色固体状。
2.22.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)-酰 胺-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys-AC)
如上制备的化合物(236毫克；151微摩尔)在含乙酸(1毫升)的1/1二氯甲烷/异丙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳载钯(100毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基已酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(140毫克，83％)。C61H116N6O11：ES/MS：m/z555.5([M+H]+2)；1110.0([M+H]+)；(图33)。
实施例2.23.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp)(图34)
2.23.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}-酰胺β-N- [(1S)-1，2-二(苄氧基羰基)乙基]酰胺
IIDQ(2-异丁氧-1-异丁氧羰基-12-二氢喹啉)(96克；0.32毫摩尔)在无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，在室温及在氩气流下添加到N-[(R)-3-十四酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}-酰胺(2.20.1节)(252毫克，0.26毫摩尔)在无水二氯甲烷(20毫升)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后加入市售的L-天冬氨酸二苄酯的对甲苯磺酸盐(141毫克，0.29毫摩尔)在含三乙基胺(40微升，0.29毫摩尔)的无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。搅拌18小时后，溶液蒸发至干。用硅胶柱闪式色谱纯化(20/1二氯甲烷/甲醇洗脱液)，可回收偶合反应产物(260毫克；78％)。
                                              13C-RMN(62,89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.68；171.92；171.17；170.60；170.46；170.37；170.18；170.06；138.31；138.19；135.20；135.12；134.87；128.48；128.26；128.18；127.75；127.63；127.56；76.66；71.40；71.19；70.98；68.79；67.59；66.85；65.14；64.73；51.25；50.17；48.78；48.67；41.70；39.37；39.21；37.50；35.94；34.48；34.38；34.10；31.81；29.54；29.25；29.08；27.93；25.56；25.14；25.09；24.91；22.58；14.02.
2.23.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}-酰胺β-N- [(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp)
上述制备的化合物(260毫克；207微摩尔)在1/1二氯甲烷/异丙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳载钯(50毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化4小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，残余物用叶轮泵抽干，获得二酸(108毫克，88％)。C53H98N4O12：ES/MS：m/z983.7([M+H]+)；1005.8([M+Na]+)；(图35)。
实施例2.24.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp-AC)(图34)
2.24.1.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-苄氧基羰基氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基 氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二(苄氧基羰基)乙基]酰胺
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二(苄氧基羰基)乙基]酰胺(2.23.1.节)(158毫克，0.13毫摩尔)以及6-(苄氧基羰基氨基)己酸(84毫克，0.32毫摩尔)在干燥二氯甲烷(6毫升)中的溶液，在0℃及氩气流下相继加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(61毫克，0.32毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(4毫克；33微摩尔)。然后，反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。然后，反应介质用水及1N盐酸溶液洗涤，接着分离相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收偶合反应产物(83毫克，44％)。
                                                  13C-RMN(62，89MHz，CDCl3)，δ，ppm：173.69，173.53，173.26，171.21，171.11，170.61，170.38，170.31，170.22，156.36，138.26，136.58，135.20，134.87，128.48，128.38，128.31，128.27，128.19，127.95，127.55，76.50，71.24，71.10，67.58，67.48，66.79，66.42，65.69，49.99，48.77，47.86，41.70，41.49，40.70，39.15，37.50，35.94，34.44，34.37，33.97，33.67，31.80，29.54，29.24，29.07，28.37，25.98，25.55，25.13，25.08，24.91，24.28，22.58，14.02.
2.24.2.N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N- {(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰 胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp-AC)
上述制备的化合物(80毫克；0.053毫摩尔)在含己酸(1毫升)的1/4二氯甲烷/乙醇混合物(10毫升)溶液，在10％碳载钯(50毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得二酸(61毫克，定量产率)。质谱(SM)：C59H109N5O13之计算值：1095.8；实测值m/z1097.0([M+H]+)(图36)。
实施例2.25.
N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(＝OM-197-N’C2-AC)(图37)
2.25.1.N-乙酰基-D-天冬氨酸，β-苄酯
往乙酸酐(85微升，0.90毫摩尔)在乙腈(1亳升)中的溶液，加入市售H-D-Asp(OBn)-OH(Senn化学公司，CH-Dielsdorf)(200毫克，0.90毫摩尔)在CH3CN/H2O/Et3N(3.5/1.0/0.4毫升)混合物中的溶液。反应混合物在室温下搅拌18小时。蒸发去除有机溶剂，剩余水相冷却至0℃，用10％柠檬酸水溶液酸化至pH＝3，再用乙酸乙酯(2×)萃取。有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。获得N-乙酰基-D-天冬氨酸苄酯，呈白色结晶固体状(192毫克，81％)，未经进一步纯化即可用在下面步骤(Rf＝0.30，在含2％乙酸的20/1二氯甲烷/甲醇中，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.25.2.N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)- 3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯
IIDQ(2-异丁氧-1-异丁氧羰基-1，2-二氢喹啉)(254毫克；0.84毫摩尔；1.2当量)在无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，在室温及在氩气流下，添加到上述制备的N-乙酰基-D-天冬氨酸-β-苄酯(185毫克，0.70毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反应混合物搅拌15分钟，随后加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇(1.1.2.节)(334毫克，0.77毫摩尔，1.1当量)在无水二氯甲烷(10毫升)中的溶液。搅拌3小时后，溶液蒸发至干。残余产物用硅胶柱闪式色谱纯化(5/3二氯甲烷/丙酮，然后纯丙酮洗脱液)，回收偶合反应产物(369毫克；78％)(Rf＝0.22，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
                                          13C-RMN(62，89MHz，CD3OD)，δ，ppm：171,92；171,23；171,07；170,61；170,35；138,11；135,24；128,40；128,24；128,02；127,69；127,59；71,25；67,57；64,56；51,03；49,41；41,51；39,21；35,90；33,88；31,73；29,46；29,17；28,32；28,02；25,35；25,24；24,97；22,83；22,51；13,97；SM：C39H59N3O7的计算值681,4；实测值：m/z682,5([M+H]+)，704,5([M+Na]+).
2.25.3.N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-苄氧基羰基 氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯
往N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-苄酯(200毫克；0.29毫摩尔)及6-(苄氧基羰基氨基)己酸(156毫克；0.59毫摩尔)在无水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，在0℃及氩气流下相继加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(112毫克，0.59毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(7毫克，59毫摩尔)。然后反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。然后反应介质相继用水及1N盐酸溶液洗涤，接着分离相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，回收偶合反应产物(200毫克；73％呈白色固体状。
        13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm173.65，171.71，171.26，170.30，156.41，138.16，136.60，135.33，128.57，128.46，128.38，128.20，128.04，127.76，127.62，71.21，66.80，66.53，65.72，65.63，49.36，47.80，41.36，40.76，39.22，39.13，35.79，33.75，31.88，29.61，29.31，28.58，28.52，26.04，25.48，25.11，24.36，23.13，22.64，14.09.
2.25.4N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧 基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)酰胺(＝OM-197-N’C2-AC)
上述制备的化合物(200毫克；0.22毫摩尔)在含乙酸(2毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳载钯(40毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂，滤液蒸发至干，然后用叶轮泵抽干，获得N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基已酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺(132毫克，定量产率)。SM：C31H58N4O8的计算值614.43；实测值：m/z615.5([M+H]+)；629.5([M+NH4]+)；637.5([M+Na]+)(图38)。
实施例2.26.
N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基)酰胺(＝OM-197-N’(C10-20C8)-AC)(图39)
2.26.1.2-羟基辛酸苄酯
往市售外消旋2-羟基辛酸(1.00克，6.2毫摩尔)在HPLC级乙酸乙酯(30毫升)中的溶液，相继加入苄基溴(2.22毫升；18.7毫摩尔)，三乙胺(2.6毫升，18.7毫摩尔)及四丁基碘化铵(1.15克；3.12毫摩尔)。溶液在室温下搅拌18小时，随后蒸去溶剂。残留物溶于醚中，然后有机相以饱和碳酸钠溶液及水(2×)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发，获得粗制2-羟基辛酸苄酯(Rf＝0.57，在3/1石油醚/乙酸乙酯混合物中；磷钼酸化合物及紫外光显色剂)。
2.26.2 2-癸酰氧基辛酸苄酯
上述制备的酯(780毫克；3.12毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)的溶液，在0℃中相继滴加吡啶(0.9毫升)及癸酰氯(654毫克；3.43毫摩尔)。混合物在室温下搅拌20小时，然后反应介质倒入含(5％)碳酸氢钠的冰冷水中。有机相经分离，相继用1N盐酸溶液与水(2×)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(30/1石油醚/乙酸乙酯洗脱液)，能够回收纯2-癸酰氧基辛酸苄酯。
2.26.3 2-癸酰氧基辛酸
如上制备的2-癸酰氧辛酸苄酯(515毫克；1.27毫摩尔)在HPLC级乙醇(40毫升)中的溶液，在10％碳载钯(100毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化2小时。在微孔膜上过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，然后残余物用叶轮泵抽干，获得2-癸酰氧基辛酸(定量产率)。
2.26.4.N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，β-苄酯
往2-癸酰氧基辛酸(317毫克；1.01毫摩尔)在无水THF(2毫升)中的溶液，在-15℃及氩气气流下，相继加入N-甲基吗啉(111微升；1.01毫摩尔；1当量)以及氯甲酸异丁酯(131微升；1.01毫摩尔；1当量)。迅速观察到生成的N-甲基吗啉盐酸盐沉淀。在-15℃搅拌30分钟后，加入市售H-D-Asp(OBn)-OH(CH-Dielsdorf，Senn化学公司)(225毫克；1.01毫摩尔；1当量)在含三乙胺(0.4毫升)的3.5/1乙腈/水混合物(9毫升)中的溶液。然后，反应混合物在室温下搅拌一夜。有机相蒸发，水相冷却至0℃，用10％柠檬酸水溶液酸化至pH＝3，用乙酸乙酯(2×)萃取。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(含2％乙酸的2/1石油醚/乙酸乙酯洗脱液)，接着与甲苯共蒸发，能够回收N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，β-苄酯(140毫克；27％)。
2.26.5.N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5- 羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺β-苄酯
在室温及氩气气流下，IIDQ(98毫克；0.32毫摩尔；1.2当量)添加到N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸β-苄酯(140克；0.27毫摩尔)在无水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反应混合物搅拌15分钟后，加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]戊-1-醇(1.1.2.节)(129毫克；0.30毫摩尔；1.1当量)在无水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。搅拌18小时后，溶液蒸发至干。用硅胶柱闪式色谱纯化(先5/1二氯甲烷/丙酮，后1/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收偶合反应产物(197毫克；78％)(Rf＝0.30，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，磷钼酸化合物以及紫外光显色剂)。
2.26.6.N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5- [6-(苄氧基羰基氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]- 戊基}酰胺β-苄酯
往N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸β-苄酯，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-苄氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(197毫克；0.21毫摩尔)以及6-(苄氧基羰基氨基)己酸(112毫克；0.42毫摩尔)在无水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，在0℃及氩气气流下，相继加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(81毫克，0.42毫摩尔)以及4-二甲基氨基吡啶(6毫克，42毫摩尔)。然后，反应混合物在0℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌一夜。然后，反应介质相继用水及1N盐酸溶液洗涤；接着分离各相。有机相用硫酸镁干燥，过滤及蒸发。用硅胶柱闪式色谱纯化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脱液)，能够回收偶合反应产物(170毫克；68％)。
2.26.7N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5- (6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺
上述制备的化合物(150毫克；0.13毫摩尔)在含乙酸(2毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳载钯(40毫克)存在下，在室温及在氢的大气压力下氢化12至24小时。过滤去除催化剂。滤液蒸发至干，残余物用叶轮泵抽干，获得N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基)-戊基}酰胺(110毫克，定量产率)；SM(质谱)C47H88N4O10的计算值868.65；实测值：m/z比870.0([M+H)+，884.0([M+NH4]+)，891.5([M+Na]+)(图40)。
实施例2.27.
本发明化合物的纯化及分析
合成产物与带有附属官能化支链的酰基化二肽溶于水-异丙醇混合物(1∶1体积/体积)中。然后添加必需量的2M碳酸氢铵，以达到50mM浓度。
2.27.1.纯化
在下述条件下，采用反相制备HPLC进行纯化：
柱：       Bondapack C18 PrepPak，40×200毫米，15-20微米，
           300埃，Waters公司
移动相：   A：异丙醇-水(9∶1体积/体积)，50m M碳酸氢铵
           B：异丙醇-水(2∶8体积/体积)，50mM碳酸氢铵
流速：     40毫升/分钟
洗脱：     在柱上恒溶剂组成吸附：40％B(60％A)，10分钟
           梯度A∶B：在10分钟内40-80％B
           恒溶剂组成洗脱：80％B，30分钟
           洗涤步骤：100％B，10分钟
检测：     紫外光，210毫微米
若观察有任何芳族产物(不完全脱保护步骤)，则须进行更精密的纯化步骤。这种补充纯化处理是根据下述条件进行的：
柱：       Kromasil C18，21×250毫米，5微米，100埃，
           Macherey-Nagel公司。
移动相：   A：异丙醇-水(9∶1体积/体积)，50mM碳酸氢铵
           B：异丙醇-水(2∶8体积/体积)，50mM碳酸氢铵
流速：     5毫升/分钟
洗脱：     柱上恒溶剂组成吸附：40％B(60％A)，10分钟
           恒溶剂组成洗脱：84％B，30分钟
           洗涤步骤：100％B，10分钟
           检测：紫外光，210毫微米
           系统：Waters2000
含有呈铵盐形式的相关化合物的洗脱部分合并，并通过在C18Bondapack相，15-20微米，300埃，waters公司吸附浓缩。然后反离子使用10克/升碱金属盐(例如氯化钠或氯化钾)在水-异丙醇混合物(9∶1体积/体积)中的水溶液洗涤交换。在柱通过5个水-异丙醇混合物(9∶1体积/体积)体积去除过量盐后，化合物用纯异丙醇洗脱。
2.27.2.纯化过程监视
在各个步骤后，洗脱部分可根据下述条件采用反相HPLC分析色谱进行分析：
柱：       Supelcosil C18.3微米，4.6×150毫米，100埃，
           Supelco公司
移动相：   A：水-乙腈(1∶1体积/体积)，5mMT BAP
           B：水-异丙醇(1∶9体积/体积)，5mM TBAP
           TBAP：四丁基磷酸铵
流速：     1毫升/分钟
洗脱步骤： A∶B梯度(75∶25至0∶100范围)，37.5分钟
检测：     紫外光，210纳米和254纳米
色谱：     对于这些分析，使用不同的HPLC色谱(HP1050 Ti系列，HP 1090系列M，LabChromshimadzu)。根据使用的系统可以改变保留时间，对于一定化合物可能有约1分钟。
2.27.3.最后产物的测定及纯度分析
在上述色谱条件下，采用HPLC/UV对所得产物进行测定和纯度的控制。根据这些分析结果，所得到产物的纯度是97至100％。为了证明含有在紫外光为无活性的杂质，进行LC/ES-MS分析(电喷洒型电离作用，正模式)。为了满足电离的条件，使用下列色谱分析：
柱：       VydacC 4.5微米，4.6×150毫米，300埃
移动相：   A：水-乙腈(1∶1，体积/体积)，0.05％TFA
           B：水-异丙醇(1∶9，体积/体积)，0.05％TFA
流速：     1毫升/分钟
洗脱：     A∶B梯度(80∶20-0∶100)，20分钟
温度：     40℃
2.27.4.光谱分析
质谱
采用不同型号的质谱仪(FinniganLCQ，离子阱；MicromassQuattro II，三阶段四极；MicromassZ-Bio-Q三阶段四极)测量ES/MS光谱(正与负模式)。还进行了MS/MS型的补充分析。
核磁共振
使用250.13及62.89MHzBrukerDPX型装置测量了1H-RMN及13C-RMN光谱。
第3系列实施例：缀合物(conjugués)的制备
实施例3.1
与FGFG肽的缀合物
如图5、8、15、17、19、21及23中列出的合成流程图所表明的，在带有烯烃型辅助支链的酰化假二肽化合物进行相邻二羟基化反应，导致生成稳定二醇官能团。然后进行定期氧化反应，在辅助支链上形成醛官能团。然后，通过还原性胺化反应，这种官能团能够例如偶合小尺寸肽，如FGGF(苯基丙氨酸-甘氨酸-苯基丙氨酸-甘氨酸，Sigma公司)。为了除去溶液中存在的盐，醛的纯化步骤是必不可少的。这种醛化合物纯化可根据下述程序用C18 Bondapack相(waters公司)15-20及微米，300埃进行：
-稀释在异丙醇-水混合物(1∶3)后吸收
-使用异丙醇-水混合物(1∶9)洗脱盐
-使用最小体积的异丙醇洗脱醛。
通过还原性胺化的偶合反应可在水溶液中进行，同时醛官能(酰化假二肽的辅助支链)与待偶合肽或蛋白质上可用胺官能团之间满足相等的化学计算量。
在GFGF肽实例中，2毫克纯化的OM-197-FV7(1.86微摩尔，1当量)添加到0.8毫克FGFG(1.86毫摩尔，1含量)溶于1毫升(1∶1)水-乙腈中的溶液。该溶液在室温下搅拌30分钟形成亚胺。随后，通过加入92微升1 M NaBH3CN(5.77毫克，50当量)进行还原步骤，形成高度稳定的碳-氮键(图41)。缀合物首先用VydacC4柱进行纯化，去除未反应肽，随后用Baondapack C18相(Waters公司)，获得钠盐(参见本发明化合物纯化与分析一节)。然后，缀合物溶解于含有0.01％三乙醇胺(TEoA)的无菌水中，以满足生物活性试验的需求。纯化后记录的ES/MS质谱显示在图43中，证明了在1457.4m/z的[M+H]+分子离子，表明其期望的偶合作用。通过MS/MS分析鉴定出m/z400与900间的可见离子为来自缀合肽分子峰的片段。未检测出对应于起始FGFC肽的离子(m/z 427.1[M+H]+，m/z853.0[2M+H]+，图42)。
实施例3.2.
与(NANP)6P2P30肽的缀合物
在图5中列出的合成流程图所得到的OM-197-FV7化合物例如可与药学感兴趣的肽偶合，例如(NANP)6P2P30[Valmori等人；1992，《J.Immunol.》149：717-721]，它具有下述的序列：
            (NANP)6QYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
(NANP)6P2P30肽具有四个可能的缀合位点(末端胺+三个赖氨酸)。5毫克纯化的OM-197-FV7(4.64微摩尔，4当量)添加到7.49毫克(NANP)6P2P30(1.16微摩尔，1当量)溶于1毫升(1∶1)水-异丙醇混合物中的溶液。该溶液在室温下搅拌30分钟，随后通过加入230微升1MNaBH3CN(14.43毫克，50当量)进行还原步骤。溶液在室温下搅拌2小时。然后，反应混合物对水渗析24小时(3.5Kd渗析盒，Slide-A-Lyzer，Pierce公司)。反应混合物进行LC/ES-MS分析证明存在有三种类型的分子，如图44的色谱图所表明的：对应于游离的肽(峰A)、单缀合的肽(峰B)以及双缀合肽(峰C)的峰清楚可见。每个峰所记录的离子云示于图45、46及47，证明单缀合物和双缀合物分别是与一个或二个OM-197-FV分子共价缀合。
图45：肽(NANP)6P2P30(游离肽)。PM：6451。
在m/z1076.2(A6)，1291.2(A5)，1613.7(A4)的离子
图46：单缀合物OM-197-FV7-(NANP)6P2P30。PM：7481。
在m/z1247.8(B6)，1497.4(B5)，1871.2(B4)的离子
图47：双缀合物(OM-197-FV)2-(NANP)6P2P30。PM：8511。
在m/z/1496.6(C6)，1703.3(C5)，2129.1(C4)离子
采用SDS-PAGE分析OM-197-PV7-(NANP)6P2P30缀合物能够证明有不同的独立带，它们分别对应于未反应的肽、单缀合物及双缀合物。在使用的电泳条件下(10-20％聚丙烯酰胺梯度，tris-tricin缓冲液，Bio-Rad公司，#161-1108)，现在的标准能评价相关带间的差为1000uma，证明了OM-197-FV的一个或二个分子偶合在肽上。
实施例3.3.
与P2P30肽的缀合物
其它肽也可通过还原性胺化反应与带有醛型辅助支链的化合物偶合。例如OM-197-FV与P2O30肽偶合。后者对应于破伤风类毒素的T抗原决定簇部分，且具如下序列：
                KQYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
P2O30肽具有5个可能的缀合位点(末端胺+4个赖氨酸)，质量4200uma。因此使用5当量OM-197-FV7。应用上述的反应条件。在对水渗析(3.5Kd渗析盒Slide-A-lyZer，Pierce公司)后，所得缀合物的质谱采用LC/ES-MS技术测量，且对游离肽P2O30记录光谱比较，后者是多电荷离子，m/z840.9(A5)1050.9(A4)及1401.0(A3)，它构成了分子量4200uma肽的离子云(图48)。OM-197-FV-P2P30单缀合物的ES/MS谱是多电荷离子的，m/z872.8(A6)，1047.1(A5)，1308.6(A4)及1744.4(A3)(图49)，它构成了分子量5230uma缀合物的离子云，其对应于通过还原性胺化反应OM-197-FV分子接技在P2P30肽分子上。
同理，所得到的(OM-197-FV)2-P2P30双缀合物质谱证明每个肽单位有二个OM-197-FV分子。由离子m/z1044.5(A6)，1253.1(A5)，1566.3(A4)及2088.4(A3)(图50)构成的离子云，通过转换分析后证明双缀合物的预期分子量(6261uma)。
实施例3.4.
与(NANP)3CS.T3肽的缀合物
对具有下述序列的(NANP)3CS.T3肽(TNO，PM：3527uma)进行类似偶合：
          NANPNANPNANPDIEKKIAKMEKASSVFNWNS
在对水渗析后，从ES/MS谱所观察的离子表明分子量4557及5587uma，它们对应于单缀合物及双缀合物的预期值。
实施例3.5.
MR99B肽缀合物
采用图8的合成流程图所得OM-197-MC-FV6化合物，例如与药物有利的肽如PyCS 245-253偶合。对应于尤氏疟原虫(Plasmodiumyoelli)的T抗原决定簇(épitope)部分的肽[Franke，E.D.等人，1997，J.Immunol.159，3432-3433]具下述序列：
                          SYVPSAEQI(PyCS245-253)
为了不在偶合期间修饰T抗原决定簇部分，添加SER氨基酸，形成称做为MR99B具如下序列的肽：
                        SERSYVPSAEQI(MR99B)
因该序列不含赖氨酸，故MR99B肽具独特的还原性胺化缀合位点(在末端胺)。因此，2毫克纯化的OM-197-MC-FV6(2.04微摩尔，1.4当量)添加到2毫克MR99B(1.47微摩尔，1当量)溶于1毫升1∶1水-异丙醇混合物中的溶液。溶液在室温下搅拌30分钟，然后通过加入29.4微升1MNaBH3CN(29.4微摩尔，20当量)进行还原步骤。溶液在室温下搅拌2小时。反应混合物进行LC/ES-MS分析，证明形成了具有预期分子量(2330.4uma，图51)的OM-197-MC-FV-MR99B，如同证明图52(离子云)及53(转化光谱)具有的谱。
OM-197-MC-FV-MR99B缀合物纯化是根据下述条件采用C4相的半制备性液相色谱进行的：
柱：         Vydac C4 250×10毫米，5微米，300埃(Vydac)
移动相：     A：(9∶1体积/体积)水-乙腈，0.05％TFA
           B：(9∶1体积/体积)异丙醇-水，0.05％TFA
流速：     2.5毫升/分钟
洗脱：     恒溶剂组成洗脱：65％B，20分钟
           洗涤：100％B，10分钟
检测：     紫外光，210纳米
系统：     HPLC 1050
为了验证肽抗原簇未被缀合改变，进行了OM-197-MC-FV-MR99B的胰蛋白酶消化。0.5毫克缀合物与83微克胰蛋白酶(Roche，#109819)(基质-酶比(6∶1)在1毫升50mMTris-HCl缓冲液，2mM氯化钙，pH8中在25℃培养24小时。
在图54列出反应后LC/ES-MS分析结果，能够证明在图55及56示出的ES-MS光谱的二片段。第一片段具有在m/z比993.5([M+H]+)及1015.6([M+Na]+)的离子，对应于CSPy245-253肽(图55)。第二片段具有在m/z比678.1([M+H]+)及1355.0([M+H]+)的离子，表明有OM-197-MC-FV-SER型结构存在(图56)。也可观察到第三个峰。该峰对应于SYVPS及AEQI两个片段(在这些色谱条件下共洗脱液)。当MR99B单独消化时也观察到这种反应。
这些结果证明缀合未改变MR99B肽的T抗原决定簇部分，如图51流程图所示。
实施例3.6.
与MR99A肽的缀合物
为了提高肽的OM-197-MR-FV的缀合程度，以及提高佐剂/抗原比，还不改变T-抗原决定簇部分，KGG型序列可接枝在欲缀合的肽上。因此，KGGKGGK序列例如可接枝在MR99B肽上而获得下述MR99A肽：
               KGGKGGKSERSYVPSAEQ           MR99A
这时，该肽有四个可能的缀合位点用于还原性胺化反应(三个赖氨酸与末端胺)。因此，12毫克经纯化的OM-197-MC-FV6(12.2微摩尔，12当量)添加到2毫克MR99A(1.01微摩尔，1当量)溶解于1毫升1∶1水-异丙醇中的溶液。该溶液在室温下搅拌30分钟，然后加入242微升1MNaBH3CN(244微摩尔，242当量)进行还原步骤。溶液在室温下搅拌2小时。反应混合物的LC/ES-MS分析结果证明不同峰，它们对应于OM-197-MC-FV分子与MR99A肽缀合的不同程度。对应于(OM-197-MC-FV)3-MR99A三缀合物(4870amu)的质谱示于图57(离子云)及58(转化光谱)，而图59(离子云)及60(转化光谱)的谱证明形成了四缀合物(OM-197-MC-FV)4-MR99A(5834 uma)。同等观察到对应于五缀合物形式的离子。这个结果证明在某些反应条件下(过量OM-197-MC-FV)，赖氨酸并非是唯一能通过还原性胺化反应进行反应的氨基酸。
三-及四-缀合物(OM-197-MC-FV)3-4-MR99A的纯化可根据下述条件采用C4相半制备性液相色谱术进行：
柱：          Vydac C4，250×10毫米，5微米，300埃(Vydac)
移动相：      A：(9∶1，体积/体积)水-MeCN，0.05％TFA
              B：(9∶1，体积/体积)异丙醇-水，0.05％TFA
流速：        2.5毫升/分钟
洗脱：        恒溶剂组成洗脱：85％B，20分钟
              洗涤：100％B，10分钟
检测：        紫外光，210纳米
系统：        HPLC 1050
如同OM-197-MC-FV-MR99B单缀合物的情况，(OM-197-MC-FV)n-MR99A多缀合物进行胰蛋白消化，以决定抗原簇(CSPy 245-253)是否受缀合影响。1毫克多缀合物与166微克胰蛋白酶(Roche，109819号)(基质-酶比：(6∶1))在1毫升50mM Tris HCl缓冲液，2mM氯化钙，pH8中在25℃共同培育24小时。
反应后进行的LC/ES-MS分析能够证明许多片段，它们相应于MR99A肽各个位点分裂产物。此这些产物中，揭示了具有在m/z993.5([M+H]+)及1015.6([M+H]+)的离子，并相应于CSPy245-253肽的片段。该肽的存在证明了即使在多重缀合反应后，肽的T抗原决定簇部分的完整性。通过m/z1621.4([M+H]3+)及1942.8([M+H]3+)的三倍电荷离子所观察的二个片段是特别令人感兴趣的。实际上，这种片段分别对应于片段(OM-197-MC-FV)4-KGGKGGKSER及(OM-197-MC-FV)5-KGGKGGKSER。观察这些片段表明，不同的OM-197-MC-FV分子有效地接枝在添加到CSPy245-253的序列上，即使在还原性胺化反应步骤时，除赖氨酸以外的氨基酸也进行反应。还应该强调指出，在肽上存在若干立体重要性的OM-197-MC-FV分子不影响蛋白酶的活性，如胰蛋白酶。例如在可分裂键选择性分裂后能释放出活性成分的prodrogue缀合的情况下，这些结果此时显得特别重要。
实施例3.7.
与Ag85c肽的缀合物
带有辅助甲酰基戊酰基型支链的结构可以与多种药学上有益的肽缀合。例如，我们提出例如OM-197-MC-FV分子通过还原性胺化反应接枝在合成肽末端胺上，其肽序列衍生自结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的抗原蛋白的序列。最初使用肽如下：
        MR100YLQVPSASMGR                                1208.4uma
        MR101         MVQIPRLVANNTRIWVYC                2176.6uma
        LR72          PYAASLSGFLNPSEGWWPTLIGLAM         2676.1uma
在与OM-197-MC-FV反应后，通过LC/ES-MS分析观察到下列缀合物：例如OM-197-FV-MR100，其分子量2171.0uma(图61及62)。另外也获得OM-197-MC-FV-MR101(3140.0uma)及OM-197-MC-FV-LR72(3643.0uma)。
实施例3.8.
具有OM-197型结构的二聚物
还原性胺化反应也可以应用于合成OM-197型结构的二聚物。
例如，使用两种带有官能化辅助支链的化合物，例如OM-197-MC-FV及OM-197-MC-AC可以生成二聚物。因此，1毫克经纯化后的OM-197-MC-FV6(0.98微摩尔，1当量)添加到1毫克OM-197-MC-AC(0.98微摩尔，1当量)溶于1毫升(1∶9)水-异丙醇中的溶液中。溶液在室温下搅拌1小时，然后通过加入19.6微升1 M NaBH3CN(19.6微摩尔，20当量)进行还原步骤。随后，溶液在室温下搅拌12小时，反应介质进行LC/ES-MS分析能够证明形成具有预期分子量(1945.5uma)的OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC二聚物，如图63所示的谱证明。因此，这种分子在带酰基链的主链末端有两个羧酸官能。
在图63所示的结构中，例如，在用OM-197-MP-FV或OM-197-MP-AC型化合物进行前述合成时，可用磷酰基置换其中一个羧基。通过与前述带有官能辅助支链的两种化合物(OM-197-MP-FV及OM-197-MC-AC)间的还原性胺化反应进行类似反应，可获得OM-197-MP-FV-OM-197-MC-AC二聚物。图64的ES/MS谱证明这种化合物的预期分子质量(2011.9uma)
实施例3.9.
带有氨基型附属支链化合物的缀合
带有氨基型附属支链化合物也可通过还原性胺化反应接合至肽抗原。事实上有可能利用待接合肽序列中存在的末端丝氨酸。在第一个步骤，肽进行高碘酸氧化反应，结果形成高度反应性的乙醛酰基(-CO-CHO)。然后，这种基团通过还原性胺化反应与OM-197型化合物官能化辅助支链上的伯胺反应。
例如，合成的肽MR99B可接合(缀合)到OM-197-MC-AC化合物，如图65的合成流程图所示。为此目的，147微升0.1M高碘酸纳(14.6微摩尔，20当量)添加到1毫克MR99B肽(0.73微摩尔，1当量)溶于1毫升水的溶液中。溶液在室温下搅拌2小时。因此，如此得到的醛用C18相纯化，回收在1毫升(1∶1)异丙醇-水混合物中。然后，加入0.72毫克OM-197-MC-AC化合物(0.73微摩尔，1当量)，以及1毫升0.2M硼酸盐缓冲液，pH9.2。在室温下搅拌30分钟后，加入14.6微升1MNaBH3CN(14.6微摩尔，20当量)进行还原步骤。溶液在室温下搅拌24小时。
反应混合物的LC/ES-MS分析证明了形成具有预期分子量(2299.1uma，图65)的OM-197-MC-AC-MR99B缀合物，如图66(离子云)以及67(转化光谱)所示谱证明。
带有氨基型辅助支链的其它化合物也可以类似方式接合。例如可列举OM-197-MC-AP、OM-197-MP-AC、OM-212-AH1、OM-197-MC-Gly、OM-197-MC-Lys、OM-197-Lys-AC或OM-197-Asp-AC。
实施例3.10.
与卵白蛋白的缀合物
蛋白质，例如像卵白蛋白，特别适合于采用还原性胺化反应进行偶合。对于带有官能化辅助支链与醛官能的假二肽，其序列中有大量的赖氨酸(卵白蛋白有20个赖氨酸)是同样的可能缀合位点。通过改变还原性胺化反应的化学计算量(酰基化假二肽/蛋白质的比)，可达到不同的接合程度。
1毫克经纯化后的OM-197-FV7(0.928微摩尔，10当量)添加到4毫克卵白蛋白(0.09微摩尔，1当量)溶于5毫升水中的溶液。该溶液在室温下搅拌30分钟，随后，通过加入46微升1 M NaBH3CN(2.89毫克，50当量)进行还原步骤。溶液在室温下搅拌2小时。反应混合物随后对水渗析24小时(3.5Kd渗析盒，Slide-A-Lyzer，Pierce公司)。
根据卵白蛋白的大小以及特有的非同源特性，卵白蛋白构成大量分析问题。因此，通过质谱法表征OM-197-FV-卵白蛋白缀合物极为困难。为了证明发生接合(缀合)反应，对不同批次的OM-197-FV-卵白蛋白缀合物进行SDS-PAGE分析。如图68(B)(4-20％聚丙烯酰胺梯度)表明其凝胶，观察到，OM-197-FV-卵白蛋白缀合物(线3、4及5)的质量超过初始卵白蛋白质量达约3000uma(线2)。这种质量差提示了每个卵白蛋白分子有许多OM-197-FV分子。采用C4相进行的LC/UV分析证实这种结果。实际上，在这些条件下，初始卵白蛋白清楚地出现在RT＝11.3分钟，而在接合反应后，对应于初始的卵白蛋白峰完全消失，这个事实证明了卵白蛋白的定量反应。相反地，OM-197-FV-卵白蛋白缀合物未被洗脱出。这种色谱性能还表明在卵白蛋白上还存在多个OM-197-FV分子，因此妨碍了缀合物在这种条件下洗脱。
实施例3.11.
H1N1血液凝集素缀合物
H1N1血液凝集素蛋白也提供说明OM-197型分子与蛋白质抗原间偶合的选择范例。
1毫克经纯化的OM-197-FV7(0.928微摩尔，15当量)添加到5毫克H1N1(血液凝集素A/Beijig 262/95，Solvay Duphar公司，Weesp，NL)(0.06微摩尔，1当量)溶于8毫升水中的溶液。溶液在室温下搅拌30分钟，然后通过加入46微升1 M NaBH3CN(2.89毫克，50当量)进行还原反应步骤。溶液在室温下搅拌2小时，然后，反应混合物对水渗析24小时(3.5Kd渗析盒)。
在OM-197-FV-卵白蛋白缀合物(4-20％骤丙烯酰胺梯度)使用的相同条件下，采用SDS-PAGE分析了OM-197-FV-H1N1缀合物。图68(C)上有起始蛋白质(线6)和电泳前后的缀合物(分别为线8及7)所得的电泳图。H1N1蛋白质出现三个带，其中二个带对应于在参考文献中描述的HA1及HA2亚单位(Swiss-Prot，瑞士生物电脑科学会，日内瓦)。在OM-197-FV-H1N1缀合物的情况下，观察到各带的质量差，证明OM-197-FV分子与H1N1蛋白质的偶合。
实施例3.12.
与AZT的缀合物(图69)
往AZT(200毫克；0.749毫摩尔)在吡啶(4毫升)中的溶液相继加入丁二酸酐(150毫克；0.5毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(50毫克；0.41毫摩尔)。任其在50℃放置12小时后，加入甲醇(2毫升)，反应介质又在室温下搅拌15分钟。然后，反应介质经浓缩，产物用硅胶柱闪式色谱用如下洗脱液纯化：5/1二氯甲烷/甲醇。这时得到产物呈白色固体状(266毫克；97％)。C14H17N5O7(M＝367克/摩尔)；Rf＝0.25(4/1二氯甲烷/甲醇)。
在0℃及氩气气流下，往如此得到的丁二酰基-AZT衍生物(60毫克；0.163毫摩尔)在THF(3毫升)中的溶液，相继加入三乙胺(24微升；0.172毫摩尔)及氯甲酸乙酯(14微升；0.172毫摩尔)。迅速观察到形成三乙胺盐酸盐沉淀。搅拌40分钟后，加入氨基己酰基衍生物(实施例2.16.)(160毫克；0.163毫摩尔)在含三乙胺(24微升；0.172毫摩尔)的9/1DMF：水混合物(10毫升)中的溶液。然后，反应混合物在0℃搅拌拌15分钟，随后在室温下搅拌一夜，然后在减压下蒸发。粗产物溶于二氯甲烷(15毫升)及水(5毫升)中。有机相分离。水相用10％柠檬酸水溶液酸化，然后用二氯甲烷萃取(两次)。这时，有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤及浓缩。用硅胶柱闪式色谱，用洗脱液(先9/1，后7/1二氯甲烷/甲醇)纯化。回收AZT-缀合物(123毫克；57％)，呈白色固体状。Rf＝0.2(4/1二氯甲烷/甲醇)；C69H119N9O16(M＝1329克/摩尔)；实测值：m/z1330.9([M+H]+)。
分析HPLC：保留时间Tr＝24.437分钟，C18Supelcosil柱(15厘米×4.6毫米，3微米，100埃)；溶剂A＝50％MeCN5mM TBAP：溶剂B＝90％2-丙醇，5mM TBAP。梯度：25-100％B，37.5分钟，在210毫微米紫外光检测。
制备HPLC：C18Kromasil柱(25厘米×21毫米，5微米，100埃)，溶剂A＝-50％ MeCN，5mM TBAP；溶剂B＝90％2-丙醇，5mMTBAP。
产物使用80％B洗脱。
终相：通过SPE以Na+盐通过，C18 Bondapack相15微米，用90％2-丙醇洗脱。
与d4T的缀合物(图69)
往d4T(200毫克；0.89毫摩尔)在吡啶(4毫升)中的溶液，相继加入丁二酸酐(179毫克；0.786毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(109毫克、0.89毫摩尔)。在室温下搅拌12小时后，加入甲醇(2毫升)，反应介质又在室温下搅拌15分钟，然后蒸发。然后，粗产物用硅胶柱闪式色谱。如下洗脱液(5/1二氯甲烷/甲醇)纯化。获得产物呈白色固体状(280毫克；97％)。C14H16N2O7(M＝324克/摩尔)；Rf＝0.25(4/1二氯甲烷/甲醇)。
往如此得到的d4T的丁二酰基衍生物(60毫克；0.185毫摩尔)在THF(3毫升)中的溶液，在0℃及氩气气流中，相继加入三乙胺(27微升；0.194毫摩尔)及氯甲酸乙酯(16微升；0.194毫摩尔)。迅速观察到形成的三乙胺盐酸盐沉淀。搅拌40分钟后，在0℃加入氨基己酰基衍生物(实施例2.16.)(181毫克；0.185毫摩尔)在含三乙胺(27微升；0.194毫摩尔)的9/1MDF/水混合物(10毫升)中的溶液。然后反应混合物在0℃搅拌15分钟，随后在室温下搅拌一夜，然后在减压下蒸发。这时，粗产物溶于二氯甲烷(15毫升)及水(5毫升)中。有机相分离。水相用10％柠檬酸水溶液酸化，然后用二氯甲烷(2x)萃取。有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤及浓缩。用硅胶柱闪式色谱，用洗脱液(9/1然后7/1二氯甲烷/甲醇)进行纯化，回升d4T-缀合化合物(107毫克；45％)呈白色固体状。Rf＝0.2(4/1二氯甲烷/甲醇)；C69H118N6O16(M＝1329克/摩尔)；实测值：m/z1288.9(MH+)；1310(Na)。
分析HPLC：保留时间Tr＝24.455分钟，C18 Supelcosil柱(15厘米×46毫米，3微米，100埃)；溶剂A＝50％MeCN，5MmTBAP：溶剂B＝90％2-丙醇，5mMTBAP。梯度：25-100％B，37.5分钟，在210毫微米做紫外光监测。
制备HPLC：C18 Kromasil柱(25厘米×21毫米，5微米，100埃)，熔剂A＝50％MeCN，5mN TBAP；溶剂B＝90％2-丙醇，5mM TBAP。
产物使用80％B洗脱。
终相：用SPE Na+盐通过，C18 Bondapack相15微米，用90％2-丙醇洗脱。
第4系列实施例：本发明化合物的药理研究(试管试验)
实施例4.1.
内毒性测定分析
采用动力学产色石蕊阿米巴细胞溶解产物试验(Charles RiverEndosafe，产品R1708K，批号EK2251E)测定内毒性。
这个LAL试验用于本发明化合物的低内毒性。
本试验的生物学原理是基于通过细菌内毒素引发石蕊阿米巴细胞溶解产物(LAL)中存在的酶原，该酶活化丝氨酸-蛋白酶的串联(cascade)。在无色基质(与对硝基苯胺偶合的S-2834肽)存在下，产色基团分裂导致释放出对硝基苯胺(pNA)，出现黄色，可在405纳米使用分光光度计监视。
             内毒素
1.酶原--------------------→酶
             酶
2.基质---------------------→肽+对-硝基苯胺
这种动力学产色试验是基于内毒性的量与达到光密度(D.0.)0.2所需要的时间成反比。浓度是以0.005-50EU/毫升范围的标准曲线相比测定的。
使用0.1毫克/毫升产物溶液的稀释溶液(5-，10-，50-，100-，500-或1000-倍)进行产物试验。LAL结果对应于不再抑制LPS过载回收的最低稀释度。
结果是相对于国际标准试样溶液(EC-6)以EU(内毒性单位)表示的。对于本系列测定，1EU表示0.08纳克(ng)大肠杆菌(E.coli.)055：B5LPS。
带有符合通式I官能化辅助支链的不同酰基化假二肽所得LAL结 果：
 
产物 稀释 EU/毫克产物 每毫克产物纳克当量LPS
OM-197-MC 50 88.6 7.4
OM-197-MC-MP 50 210.5 16.8
OM-197-FV6 50 540 43
OM-197-FV8 50 1820 145.6
OM-197-MC-FV5 50 49.3 3.9
OM-197-MC-FV7 10 <0.05 <0.004
OM-197-MP-AC(R/S，R) 25 0.14 0.011
OM-197-MP-AC(R，R) 25 0.15 0.012
OM-197-MP-AC(S，R) 25 <0.125 <0.01
OM-197-MC-AC 25 6.0 0.48
OM-197-N’C2-MC-AC 10 <0.5 <0.04
OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC 10 <0.5 <0.04
OM-197-MC-Succ 25 5.3 0.42
OM-197-Lys 25 3.0 0.24
OM-197-AP 10 <0.5 <0.04
OM-197-Asp 50 <2.5 <0.2
OM-197-Asp-AC 50 2307 184.6
OM-197-Lys-AC 50 <2.5 <0.2
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 10 1.34 0.11
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 10 1.05 0.08
OM-197-MC-AC-Succ 10 <0.05 <0.004
全部受测试的假二肽都具有低内毒性。对于多种产物，这种内毒性甚至低于试验检测限。内毒性的定量测定由于需要稀释恢复过载的试样而受限制。即使在这个LAL试验中最活性化合物的内毒性活性也比LPS低5000倍。
本发明的假二肽因其低的内毒性和生物学活性而备受关注。
表
使用与卵白蛋白缀合产物进行免疫实验的不同产物的LAL结果
 
试验化合物或混合物 EU/毫克 每毫克产物的纳克当量LPS
卵白蛋白 <0.8 <0.064
卵白蛋白+OM-197-MP 5.8 0.48
OM-197-FV-卵白蛋白 99 8.21
相信与卵白蛋白偶合的OM-197-FV可导致检测的LAL活性升高。这种升高可归因在有OM-197-FV分子的方式中的变化。其它卵白蛋白系列产物皆具有相等的LAL活性。LAL结果变化很大，各组间差3倍至4倍是不说明问题的。最大的LAL活性是对于偶合产物每次注射2.4纳克当量LPS(25微克/注射)，至于其它组，最大LAL活性是每次注射0.012纳克当量LPS。
表
使用与H1N1血液凝集素缀合产物的免疫实验的不同产物的LAL结果
 
试验化合物或混合物 EU/毫克 每毫克产物的纳克当量LPS
H1N1 2 0.17
H1N1+OM-197-MP 20 1.67
OM-197-FV-H1N1 15.6 1.30
H1NI系列产物都具有相同的LAL活性。LAL结果变化很大，各组间差3倍至4倍是不说明问题的。偶合对LAL活性无影响。最大的LAL活性是每次注射0.008纳克当量LPS(5微克/注射)。
表
使用与(NANP)6P2P30肽缀合产物进行免疫实验的不同产物的LAL结果
 
试验化合物或混合物 EU/毫克 每毫克产物的纳克当量LPS
(NANP)6P2P30 16 1.33
(NANP)6P2P30+1FA n.d.* n.d.*
(NANP)6P2P30+OM-197-FV6 13 1
(NANP)6P2P30+OM-197-MC 12 1
(OM-197-FV)1，2，3-(NANP)6P2P30 2 0.17
OM-197-FV-(NANP)6P2P30 9.4 0.78
OM-197-FV-(NANP)6P2P30+OM-197-MP 17.4 1.45
本试验不适合乳液样品，故未测定LAL
(NANP)6P2P30系列产物皆具有相同的LAL活性。LAL结果变化很大，各组间差3倍至4倍是不说明问题的。偶合对LAL活性无影响。最大LAL活性是每次注射0.03纳克当量LPS(20微克/注射)。
实施例4.2.
使用本发明化合物刺激的小鼠骨髓干细胞增殖的测定
4.2.1.增殖实验
6-周龄雄性C57/BL6小鼠通过吸入二氧化碳而死亡。去除臀、股、胫及后腿骨。通过切开的端部注入杜别可氏(Dulbecco’s)改性Eagle(伊格尔)培养基(DH培养基)，从骨室中抽取出骨髓。干细胞经洗涤，再次悬浮于补充20％胎牛血清(SVF)的DH培养基中。细胞浓度调整至500000细胞/毫升。
产物在补充20％SVF、氨基酸及抗生素的DH培养基中的溶液直接按系列稀释在微量培养板中。产物重复三次测试，各微量培养板含有由只是培养基组成的负对照物。每个孔的最后容积为100微升。
将100微升细胞悬浮液添加到产物稀释溶液，细胞在37℃培育器内，在8％二氧化碳及饱和湿度环境下培育7天。通过测量在活细胞线粒体中产色基质XTT(2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-羧苯胺(caboxanilide))氧化作用测定细胞的增殖。
培养结束时，50微升XTT基质溶液(1毫克/毫升XTT+0.008毫克/毫升芬纳井(phenazine)甲基硫酸盐)添加到各孔。在饱和湿度培育器内，在37℃与8％二氧化碳下培养8小时后，使用分光光度计，与参比试样在690纳米相比，在490纳米读取微量培养板。
结果以平均值±标准差表示，得到剂量-反应曲线。由DH介质组成的负对照值(平均±标准差)也以图形表示。
由剂量反应曲线，计算出曲线的3个特定点：
Max：最大曲线幅度及其对应的浓度
EC50：对应于50％最大幅度的浓度
Min：最低浓度诱导显著的增殖，它对应于空白±3×标准差值。
对应于EC50及Min的浓度值是用连接曲线不同点的直线线段决定的。
如果曲线没有最大值，但曲线在最高试验浓度还继续上升，则在Max及EC50值的前标出[>]记号。
如果曲线还未降低低于空白±3×标准差的限度，则最低浓度给出[<]最低试验浓度。
4.2.2.结果的表示
由带有官能化辅助支链的酰化假二肽诱生的骨髓干细胞的增殖
图70显示不同酰化假二肽的活性，表明官能化辅助支链对在小鼠体内骨髓干细胞增殖的影响。
某些酰化假二肽可诱发的增殖高于由大肠杆菌LPS组成的正对照组。可诱发显著增殖的最低产物浓度高于正对照组施用的浓度。这种最低产物浓度大大受辅助支链官能度的影响。
图71显示与一种药物偶合的酰化假二肽偶合的活性。这种活性证明了，尽管偶合，这些化合物仍保持其一部份活性。还无法区别固有的活性与通过胞内酯酶由偶合酯键所得到的活性。这些产物的抗病毒活性倾向于表明酯键至少进行部分分裂。无论机理如何，保持生物活性证明这种抗病毒活性与产物活性组合的十分重要的意义。
表
通过带有满足通式I的官能化辅助支链的酰化假二肽所诱发的骨髓干细胞增殖结果
 
产物 最大幅度/浓度/光密度/微克/毫升 EC50幅度/浓度/光密度/微克/毫升 最小幅度/浓度/光密度/微克/毫升
DH培养基(负对照) 0.67±0.04
大肠杆菌LPS(正对照) 1.72/16 1.19/1.2 0.80/0.06
OM-197-MC 1.75/64 1.21/19.4 0.80/1.25
OM-197-MC-MP >1.60/>160 >1.13/>6.5 0.80/0.77
OM-197-FV6 1.52/50 1.10/5.7 0.80/1.60
OM-197-FV8 1.07/25 0.87/1.8 0.80/1.24
OM-197-MC-FV5 1.75/50 1.21/32.0 0.80/8.20
OM-197-MC-FV7 >1.83/>100 >1.25/>33.1 0.80/6.58
OM-197-MP-AC(R/S，R) 2.12/25 1.39/3.1 0.80/0.71
OM-197-MP-AC(S，R) 1.22/6.25 0.94/2.62 0.80/1.17
OM-197-MC-AC 1.62/50 1.15/31.0 0.80/0.92
OM-197-N’C2-MC-AC 0.75/1.56 0.71/nd 0.80/nd
OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC 0.75/6.25 0.71/nd 0.80/nd
OM-197-MC-Succ 2.16/50 1.41/24.7 0.80/2.95
OM-197-Lys 1.56/25 1.11/3.3 <0.86/<0.39
OM-197-AP 1.49/25 1.08/2.2 0.80/0.41
OM-197-Asp 1.22/25 0.94/5.0 0.80/1.89
OM-197-Asp-AC 1.33/50 0.10/2.8 0.80/1.27
OM-197-Lys-AC >2.02/>50 >1.34/>14.6 0.80/0.90
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 1.08/12.5 0.87/3.3 0.80/2.11
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 1.40/50 1.03/25.2 0.80/2.81
OM-197-MC-AC-Succ >1.65/>100 >1.16/33.7 0.80/2.04
nd＝未测定
除带有短链的化合物外，本发明所有酰化假二肽都可诱发显著的骨髓干细胞增殖。
实施例4.3.
通过使用本发明产物刺激鼠巨噬细胞产生氧化氮的测定
4.3.1.产生氧化氮的实验
6周龄C57/BL6雄性小鼠通过吸入二氧化碳而死亡。去除臀、股、胫及后附属骨。由切开的端部通过注入杜别可氏改性伊格尔培养基(DH培养基)，从骨室中萃取出骨髓。干细胞洗涤后，并再次悬浮于补充20％马血清(SH)及30％L929细胞上清液的DH培养基(细胞浓度约4000细胞/毫升)中。L929为鼠纤维母细胞系，其上清液富含巨噬细胞生长因子(H-CSF)。细胞培养液分配在培养皿里，它饱和湿度的培育器中，在37℃与8％二氧化碳下培育8天。
8天后，干细胞分化成为成熟巨噬细胞。通过冷却刮下巨噬细胞，经洗涤，再悬浮于补充5％胎牛血清(FCS)、氨基酸及抗生素的DH培养基中。细胞浓度调整为700000细胞/毫升。
在补充5％SVF、氨基酸及抗生素的DH培养基的产物溶液系列地直接稀释在微量培养板中。产物重复三次试验，每个微量培养板含有由只是培养基组成的负对照物。每个孔的最后体积为100微升。
100微升细胞悬浮液添加到产物稀释溶液，细胞在饱和湿度的培育器中，在37℃与在8％二氧化碳下培育22小时。在有产物的培育结束后，抽取出100微升升上清液，通过格利斯(Griess)反应测定亚硝酸盐浓度。在2.5％磷酸水溶液中100微升格利斯试剂(5毫克/毫升对氨基苯磺酰胺+0.5毫克/毫升N-(1-萘基亚乙基二胺盐酸盐)添加到每个孔。使用分光光度计，相对在690纳米的参考试样，在562纳米读取微量培养板。亚硝酸盐浓度与产生的氧化氮浓度成比例。亚硝酸盐浓度是与标准曲线比较测定的。
结果以平均值±标准差表示，得到剂量-反应曲线。
由剂量反应曲线，计算出曲线的3个特定点：
Max：最大曲线幅度及其对应的浓度
EC50：对应于50％最大幅度的浓度
Min：最低浓度诱导显著的增殖，它对应于空白±3×标准差值。
对应于EC50及Min的浓度值是用连接曲线不同点的直线线段决定的。
如果曲线没有最大值，但曲线在最高试验浓度还继续上升，则在Max及EC50值的前标出[>]记号。
如果曲线还未降低低于空白±3×标准差限，则最低浓度给出[<]最低试验浓度。
4.3.2.结果表示
通过带有官能化辅助支链的酰化假二肽诱发鼠巨噬细胞产生氧化 氮
图72显示不同的酰化假二肽的活性，证明官能化辅助支链对诱发鼠骨髓干细胞增殖的能力的影响。
OM-197-MP-AC(R/S，R)能够诱发增殖高于由大肠杆菌LPS组成的正对照物所诱发的增殖。能够诱发显著增殖的最低产物浓度远低于正对照物的浓度。使用酰化假二肽刺激的鼠巨噬细胞产生的氧化氮大大受辅助支链的影响。
图73显示与药物偶合的酰化假二肽的活性。这种活性证明了，尽管偶合，这些化合物仍保持其一部份活性。无法区别固有活性与通过胞内酯酶偶合酯键所得到的活性。这些产物的抗病毒活性倾向于表明酯键至少进行部分分裂。无论机理如何，保持生物活性证明这种抗病毒活性与产物活性组合的十分重要的意义。
表
使用符合通式I的带有官能化辅助支链酰化假二肽诱发小鼠巨噬细胞产生氧化氮的结果
 
产物 最大幅度/浓度/μM亚硝酸盐/微克/毫升 EC50幅度/浓度/μM亚硝酸盐/微克/毫升 最小幅度/浓度/μM亚硝酸盐/微克/毫升
DH培养基(负对照) 0.29±0.09
大肠杆菌LPS(正对照) >10.37/>50 >5.33/>0.01 <1.41/<0.001
OM-197-MC 7.16/51 3.73/1.23 0.57/0.15
OM-197-MC-MP 7.94/51 4.12/1.18 0.57/0.11
OM-197-FV6 7.48/25.6 3.89/1.49 0.57/0.20
OM-197-FV8 8.00/51 4.15/7.89 0.57/1.45
OM-197-MC-FV5 5.64/16 2.97/2.56 0.57/0.67
OM-197-MC-FV7 6.17/>25.6 3.23/>3.70 0.57/0.36
OM-197-MP-AC(R/S，R) >14.09/>100 >7.19/>10.69 0.57/1.04
OM-197-MP-AC(S，R) 7.56/40 3.93/3.28 0.57/0.59
OM-197-MP-AC(R，R) >8.31/>100 >4.3/>15.32 0.57/3.35
OM-197-MC-AC 7.08/25 3.69/4.91 0.57/0.91
OM-197-N’C2-MC-AC >0.24/200 nd nd
OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC >0.96/>100 0.63/61.05 0.57/54.3
OM-197-MC-Succ 5.84/16 3.07/0.89 0.57/0.22
OM-197-Lys 5.50/40 2.90/2.23 0.57/<0.47
OM-197-AP >9.64/>100 >4.97/>13.69 0.57/1.87
OM-197-Asp 8.26/51 4.28/0.95 0.57/0.086
OM-197-Asp-AC >7.97/>100 >4.13/>7.04 0.57/2.00
OM-197-Lys-AC >7.04/>50 >3.67/>11.06 0.57/1.46
OM-197-MC-AC-Succ-AZT >2.53/>100 >1.41/>74.89 0.57/55.98
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 4.17/12.5 2.23/1.15 0.57/0.56
OM-197-MC-AC-Succ 6.17/>16 3.23/0.72 0.57/0.28
nd-未测定
除了含短链化合物(OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC小量产生)外，全部本发明的酰基假二肽都可诱发鼠巨噬细胞大量产生氧化氮。
实施例4.4.
树状细胞分化试验
评估本发明产物诱发前树状细胞成熟成为树状细胞的能力。测量下列参数：葡聚糖(Dextran)-FITC的加入以及CD83，CD86表面分子的表达。
4.4.1.实验程序
周围血液单核细胞是由健康捐赠者的“血块黄层(buffy coats)”分离出来的。通过粘着纯化的单核细胞在含10％胎牛血清(SVF)、GM-CSF及IL-4(10纳克/毫升)的RPMI-1640培养基中制成悬浮液，其浓度为1×106细胞/毫升。细胞分配在培养皿(每个培养皿10×106细胞)，培养6天，3天后更换培养基。这样所得的细胞称作前树状细胞(DC-6)。使用稀释产物溶液或LPS(正对照)再培育3天(参见产物一节)，可将前树状细胞培养成熟为成熟的树状细胞。第9天(DC-9)，收获细胞，分析树状细胞成熟的不同表示性参数：评估CD83、CD86表面分子的表达及掺入葡聚糖-FITC的能力。所有这些参数都采用FACEEPICS-XL-MCL(库特(Coulter)免疫公司，芬兰海雷)分析。
表面分子的表达是以用LPS活化细胞(正对照)的平均萤光百分数表示；葡聚糖-FITC掺入率是以保持在培养基中的细胞掺入率计算的，且以百分比表示。
产物：在添加0.1％三乙胺的0.9％氯化钠/水中，制备0.5毫克/毫升OM-197-MC，OM-197-FV6及OM-197-MP-AC(R/S，R)的备用溶液。溶液在37℃培养20分钟，进行激烈搅拌3分钟，然后在RPMI-1640培养基中稀释至100微克/毫升，且以10微克/毫升至0.03微克/毫升的浓度范围稀释使用。
参比产物：大肠杆菌脂多醣(LPS，DIFCO，美国密苏里州底特律)，5毫克/毫升在PBS中备用溶液，100微克/毫升中间物溶液是用RPMI1640培养基制备的。试验浓度是1微克/毫升至0.03微克/毫升的稀溶液。
另一系列实验中，全部酰化假二肽都经过冷冻干燥，再直接溶于非致热原的水中。不同产物及LPS对照在10微克/毫升浓度进行了试验。对于葡聚糖细胞吞噬作用或CD86表面标记表达，这些结果以树状细胞百分数和平均萤光值表示。这些结果是这些产物的2至6次实验的平均值。
4.4.2.结果分析
通过GM-CSF与IL-4缀合作用由单核细胞分化所得的未成熟树状细胞(DC-6)是能够掺合葡聚糖-FITC的。在成熟过程中，细胞丧失其掺合葡聚糖-FITC的能力。到达DC-9分化阶段时进行这些分析。
这些结果(图74)是在仅用培养基培养的未刺激的细胞中以所观察的葡聚糖-FITC掺合百分数表示。这些使用LPS或OM-197-MP-AC(R/S，R)处理的细胞分别仅保持15％及22％吞噬能力。应该注意至少需要1微克/毫升OM-197-MP-AC(R/S，R)，才诱发最大降低掺合葡聚糖，而0.1微克/毫升LPS则可诱发同样的降低。需要10微克/毫升OM-197-MC，可诱发降低22％细胞吞噬。此外，浓度低于3微克/毫升，OM-197-MC对吞噬没有任何作用。OM-197-FV6对树状细胞的成熟显然没有什么影响。
共刺激表面分子的表达是DC成熟的另一个标准。曾试验CD83和CD86(分别为图75&76)表达增加。这些结果是以LPS-诱发这些标记表达为基的以平均萤光的百分数表示。这些结果全然符合由细胞吞噬研究所得到的结果。OM-197-MP-AC(R/S，R)从0.1微克/毫升开始表面分子的表达增加，而OM-197-MC应该至少需要1微克/毫升才能诱使增加CD83及CD86的表达。OM-197-FV6对树状细胞特征性表面分子表达没有什么影响。
这些结果表明，酰化假二肽随其附属支链而其性能有显著的差异。OM-197-MP-AC(R/S，R)表明，从0.1微克/毫升起就具有诱发DC-6细胞分化成为DC-9细胞的绝佳能力，而OM-197-MC的浓度高于1微克毫升才开始诱发这种分化，OM-197-FV6全然没有这种活性。
通过符合通式I的带官能化辅助支链的酰化假二肽刺激前树状细 胞(CD6)后，荧光素标记葡聚糖细胞吞噬作用和CD86的表达前树状细 胞分化成成熟树状细胞
 
产物 葡聚糖％CD/荧光 CD86％CD/荧光
37℃ 18.3/0.9 33.5/2.9
LPS大肠杆菌 100/7.3 100/7.3
OM-197-FV6 84.5/6.3 62.9/4.9
OM-197-MC-FV5 86.5/6.4 74.5/5.6
OM-197-MP-AC(R/S，R) 84.6/6.3 80.0/6.0
OM-197-MC-AC 68.3/5.2 67.4/5.2
OM-197-MC-Succ 35.5/3.0 34.9/3.0
OM-197-Lys 12.1/0.5 21.2/2.1
OM-197-AP 56.1/4.4 62.0/4.8
OM-197-Asp 26.4/2.4 29.0/2.6
OM-197-Asp-AC 22.0/22.1 26.7/2.4
OM-197-Lys-AC 92.2/6.8 93.5/6.9
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 62.2/4.8 81.4/6.1
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 11.6/0.5 25.9/2.4
在10微克/毫升浓度，许多酰化假二肽可诱发前树状细胞分化成为树状细胞。附属支链所带的官能可调节这种活化前树状细胞的能力。
与药物偶合的酰化假二肽OM-197-MC-AC-Succ-AZT具有显著诱发分化成为树状细胞的能力。酰化假二肽配方作用对其诱发前树状细胞分化成为树状细胞的能力是特别重要的。某些产物的活性依据它们在有或无0.1％TEOA存在下溶解情况而有极大的差别。
实施例4.5.
在树状细胞中诱发MxA蛋白质的分析
曾评价本发明的产物通过前树状细胞诱发产生抗病毒蛋白质MxA的能力。由这些细胞产生的MxA在电泳分离SDS-PAGE后采用蛋白印迹法(western blotting)。
4.5.1.实验程序
如上述制备得到的DC-6阶段树状细胞，使用或没有使用α-IFN(500单位/毫升)，LPS(1微克/毫升)，TRANCE(100纳克/毫升)，CD40L(1微克/毫升)，OM-197-MC-AC(1微克/毫升)或OM-197-FV6(1微克/毫升)活化48小时。蛋白质的提取及分析进行如下：收集细胞，然后使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤3次，再使用100mM Tris-HCl缓冲液，150mM氯化钠，5mM EDTA，1％崔顿(Triton)-100，其中含有1 mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)及1微克/毫升抑胃肽(pepstatin)作为蛋白酶抑制剂进行分解。按照每100微升(5x)缓冲液106细胞进行分解，缓冲液含有60mM Tris-HCl(pH6.8)，10％甘油，2％SDS，14.4mM 2-巯基乙醇及0.1％溴酚。试样在密封伊本朵夫(Ependorf)试管内加热至95℃达5分钟。使用与相同细胞数等效的试样量，在10厘米×10厘米12％丙烯酰胺迷你凝胶(minigel)上进行电泳。使用下述缓冲液进行迁移：25 mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3。
转移到膜上：蛋白质由SDS-PAGE凝胶转移到硝基纤维素膜(转移缓冲液：25 mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)
与抗体培养：使用庞索红(Ponceau Red)染色证明膜转移。用5％在TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)中的脱脂乳保护膜上无特定的位点，在室温放置1小时。膜在稀释于TBS-乳(1∶100，体积/体积)中的抗-MxA单克隆抗体(克隆143)溶液中进行培养。使用TBS-0.1％吐温(Tween)20洗3次。膜与稀释千倍(体积/体积)的与过氧化酶偶合的第二种抗小鼠抗体(HRP，Sigma公司)共同培育。膜用TBS-吐温洗3次。膜与化学发光剂(ECL，阿莫杉法玛西亚公司(Amersham Pharmacia))共同培养后，使含MxA的条带显色。在本系统中，HRP催化基于卢迷诺(luminol)的化学发光反应，可在胶片上检测这种反应。
4.5.2.结果
按照如下活化DC-6细胞达0、2小时、4小时、24小时(图77)或48小时(图78)：
Figure S00819149219950321D000971
图77及78中的蛋白印迹法说明随时间推移产生MxA：在24小时后(图77)以及48小时后(图78)，通过产物OM-197-AC5及OM-197-FV6分别诱发MxA蛋白质显著升高。这种MxA的产量与通过LLPS正对照或α-TNF诱发的产量是相当的；这种产量高于分别通过负对照、通过TRANCE(α-TNF组细胞分裂素，它也诱发树状细胞成熟)或通过CD40L(另一种可促进树状细胞成熟的化学剂)诱发的产量。
本发明化合物OM-197-MP-AC及OM-197-FV6证明了：因其诱发MxA蛋白质的能力而具有抗病毒的性质。
实施例4.6.
测定本发明化合物通过人类周围血液单核细胞活化产生α-TNF的能力
4.6.1.程序
周围血液单核细胞系由健康捐赠者的“血块黄层”分离的。“血块黄层”细胞再悬浮，在菲可巴克(Ficoll-Paque)梯度(阿莫杉法玛西亚公司)离心分离单核细胞。纯化后的单核细胞再悬浮于补充10％SFV、抗生素、巯基乙醇及L-谷氨酸的RPMI-1640培养基中。细胞浓度调整至2×106活细胞/毫升。
100微升各个带有官能化辅助支链的酰化假二肽在RPMI1640培养基中的溶液，该溶液稀释到100、10或1微克/毫升，它们分配在微量培养板。试样重复3次试验，各个微量培养板含有仅由培养基组成的负对照组。大肠杆菌LPS的稀释液(1至0.00001微克/毫升的范围)用作为正对照。
100微升细胞悬浮液添加到含产物稀溶液或对照的各孔中。这些细胞与产物在37℃、5％二氧化碳及饱和湿度的培育器(恒温箱)中培养18小时。
培养结束后，微量培养板经离心，收集上清液，以等分试样在-80℃冷冻，直到ELISA测定。
由单核细胞产生的α-TNF浓度采用化学发光ELISA(广堤果(QuantiGlo)#QTA00 R&D套件组)测定。稀释4倍的上清液分配到至微量培养板各孔，其中连接人的抗α-TNF抗体。微量培养板在室温培养4小时。洗涤后加入与过氧化酶缀合的人的抗-αTNF抗体。培养2小时并彻底洗涤后，加入化学发光基质，20分钟后读取发光。上清液中含有的α-TNF浓度是与7000至0.7微微克(pg)/毫升标准曲线相比测定的。
结果以产生的α-TNF微微克/毫升表示。列出的这些结果是从酰化假二肽活性的代表性实验得到的。
4.6.2.结果
由通式I带一个官能化辅助支链的酰化假二肽在周围血液单核细胞诱发α-TNF的产量。
 
产物 100微克/毫升 10微克/毫升 1微克/毫升
OM-197-MC 12 0 0
OM-197-MC-MP 72 0 0
OM-197-FV6 88 104 0
OM-197-FV8 252 100 12
OM-197-MC-FV5 116 104 0
OM-197-MC-FV7 76 80 0
OM-197-MP-AC(R/S，R) 160 156 244
OM-197-MP-AC(R，R) 84 88 0
OM-197-MP-AC(S，R) 80 124 488
OM-197-MC-AC 144 140 12
OM-197-N’C2-MC-AC 0 0 0
OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC 0 0 0
OM-197-MC-Succ 176 96 0
OM-197-Lys 20 164 284
OM-197-AP 84 116 428
OM-197-Asp 80 28 0
OM-197-Asp-AC 132 172 20
OM-197-Lys-AC 256 184 232
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 64 224 108
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 52 40 0
OM-197-MC-AC-Succ 40 32 0
负对照是由诱发基本的α-TNF产量在检测限0.7微微克/毫升以下的RPMI培养基组成的。
通过大肠杆菌LPS在周围血液单核细胞诱发α-TNF的产量。
由大肠杆菌LPS组成的正对照，即使在最低的试验浓度也诱发出α-TNF的高产量。
最大部份酰化假二肽诱发很高的α-TNF产量，即使这个产量低于由正对照诱发的这个产量。为了诱发大量产生α-TNF，这些浓度也应该比LPS的浓度高。
某些化合物，OM-197-MC和OM-197-MC-MP唯有在100微克/毫升浓度才诱发很高的产量。
胺官能度对诱发产生α-TNF特别受到关注，一方面提高诱发大量反应所必需的幅度，以及降低诱发大量反应所必需的最低产物浓度。
短链酰化假二肽OM-197-N’C2-MC-AC及OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC即使在100微克/毫升浓度也未诱发出产生任何的α-TNF。
实施例4.7.
测定本发明化合物抑制由大肠杆菌脂多醣(LPS)诱发的由人类周围血液单核细胞产生的α-TNF的能力
4.7.1.程序
周围血液单核细胞是从健康捐赠者的“血块黄层”分离出来的。“血块黄层”细胞制悬浮液，采用菲可巴克(Ficoll-Paque)梯度(阿莫杉法玛西亚公司)离心分离单核细胞。纯化的单核细胞再悬浮在补充10％SFV、抗生素、巯基乙醇及L-谷氨酸的RPMI-1640培养基中。细胞浓度调整至2×106活细胞/毫升。
通过产物与单核细胞预先培养，1小时后加入系列诱发产生α-TNF的LPS稀溶液，测定这些产物所起的抑制作用。不同的带官能化辅助支链的酰化假二肽的抑制浓度是10微克/毫升。大肠杆菌的LPS系列稀释(10倍稀释)1至0.00001微克/毫升。
50微升用RPMI 1640培养基稀释到10微克/毫升的产物溶液分配在微量培养板中。每个条件(10微克/毫升产物+稀释的大肠杆菌LPS)试验重复三次，每个微量培养板包括由只是培养基组成的负对照样。添加用RPMI培养基稀释大肠杆菌LPS的稀释液时，可测定由只是LPS(无抑制作用)诱发产生的α-TNF。
100微升细胞悬浮液添加到装有产物稀释液或对照物的每个孔中。细胞与产物在37℃，在5％二氧化碳及湿度饱和的恒温箱中培养1小时。
前培养期结束时，加入50微升系列大肠杆菌LPS稀释液。单核细胞与产物及LPS接着培养18小时。细胞活化期结束时，离心微量培养板，收集上清液，以等分试样在-80℃冷冻，直到采用ELISA测定。
单核细胞分泌的α-TNF浓度可采用化学发光的ELISA(广堤果#QTA00R&D套件组)测定。稀释4倍上清液放到微量培养板的每个孔中，该孔内结合人的抗α-TNF抗体。微量培养板在室温培养4小时。洗涤后加入与过氧化酶缀合的人的抗α-TNF抗体。2小时培养及彻底洗涤后，加入化学发光基质，20分钟后读取发光。上清液含有的α-TNF浓度可相对于7000至0.7微微克/毫升的标准曲线进行测定。
与仅用RPMI培育的对照物相比，使用大肠杆菌LPS与这些产物共同培养诱发产生50％α-TNF的LPS浓度来表征抑制作用。这种浓度增加得越高，产物抑制活性越高。使用α-TNF产量抑制值＝100-(该产物和LPS诱发的α-TNF产量)/(只是LPS诱发的α-TNF产量)×100可计算出这个浓度。用这些抑制数据，将在50％抑制效果附近的两个LPS稀释液的线段可外推出这个浓度。
产物诱发抑制LPS产生α-TNF的能力也可用最大抑制作用表征。对应于这个最大抑制作用(抑制>95％)的LPS也表示了产物的抑制能力。这些结果可用有全部产物的代表性实验计算得到。
4.7.2.结果
通过符合通式I的带官能化辅助支链的酰化假二肽抑制在人类单核细胞上由LPS诱发产生的α-TNF
 
产物 抑制50％LPS，微克/毫升 最大抑制(％) 最大抑制LPS，微克/毫升
OM-197-MC 1 100 0.0043
OM-197-MC-MP 0.19 100 0.001
OM-197-FV6 >1 100 0.014
OM-197-FV8 >1 100 0.0033
OM-197-MC-FV5 >1 100 0.016
OM-197-MC-FV7 >1 100 0.00035
OM-197-MP-AC(R/S，R) >1 100 0.00002
OM-197-MP-AC(R，R) 0.68 100 0.0013
OM-197-MP-AC(S，R) >1 100 0.00002
OM-197-MC-AC 0.88 100 0.00003
OM-197-N’C2-MC-AC 0.0003 100 0.00001
OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC 0.0009 85 <0.00001
OM-197-MC-Succ 1 100 0.018
OM-197-Lys 0.70 100 0.0055
OM-197-AP >1 100 0.016
OM-197-Asp >1 100 0.00036
OM-197-Asp-AC 0.29 100 0.0058
OM-197-Lys-AC >1 100 0.001
OM-197-MC-AC-Succ-AZT 0.45 100 0.0005
OM-197-MC-AC-Succ-d4T 0.64 100 0.00016
OM-197-MC-AC-Succ >1 100 0.044
由RPMI培养基组成的负对照物可诱发产生基本的α-TNF低于0.7毫克/毫升检测限。
所有酰化假二肽都能诱发抑制大肠杆菌LPS诱发的α-TNF。达到这种抑制效果需要的产物浓度是随辅助支链官能度以及脂肪酸链长度而改变的。甚至通过酯键与药物偶合的酰化假二肽也能诱发这种抑制作用。
实施例4.8.
本发明化合物对抗K562细胞系靶细胞的NK细胞毒性活化能力的测定
4.8.1.程序
PBMC是根据前面实施例4.6所述程序从“血块黄层”分离出来的。简言之，在菲可(Ficoll)离心及3次洗涤后，PBMC按照在3毫升含10％FCS的RPMI培养基中3×106细胞/毫升分配在6孔板中，或只是用培养基培养，或使用γ-IFN(1000单位(U)/毫升)，LPS(1微克/毫升)，OM-197-AC5(1微克/毫升)或OM-197-FV6(1微克/毫升)刺激培育。细胞在这种条件下培养24小时。K562细胞(人类白血病细胞系，ATCC#CCL243，20110-2209玛奈萨(维吉尼亚州)美国)使用含10％FCS的RPMI培养基保持培养，且每周进行两次传代培养。
为了测量细胞毒性，PBMC及K562细胞用HBSS洗涤两次，并再悬浮于含5％FCS的不含酚红的RPMI培养基。PBMC分配在圆底96孔平板中，达到在50微升容积中PBMC/靶比为20/1、10/1及5/1。每个孔添加在50微升不含酚红的RPMI中5000个K562细胞(靶细胞)。最后容积为100微升。平板经过离心促进接触，然后在37℃培育4小时。
根据供应商的方案，使用基于测量细胞溶解期间释放LPH的非放射性塞托拓(CytoTox)96工具套盒(盒号#G1780，批号#124100，波米加(Promega)公司，威斯康辛州马理森)测定细胞毒性。
细胞毒性的百分数系根据下式计算：
4.8.2.结果
化合物OM-197-AC5及OM-197-FV6诱发NK活性，与由在相同浓度(1微克/毫升)下试验LPS诱发的活性相近或略微低差。
Figure S00819149219950321D001041
实施例4.9.
测定本发明化合物诱发小鼠淋巴细胞增殖的能力
4.9.1.实验描述
汇集得自一组4只纯CBA小鼠的脾细胞，在没有或有OM-197-MP-AC佐剂(0.1至10微克/毫升)下培养四次。培养1或2天后，通过测量氚标记胸腺核苷(3H-TdR)掺合评价这些细胞的增殖反应。表中报告值表示4次培养的算术平均值±标准差。
佐剂：OM-197-MP-AC母液是用0.9毫克/毫升在加0.1％三乙醇胺的注射用水制备的。
结果
OM-197-MP-AC产物刺激体外试验的脾细胞增殖。这种作用在培养1天后最大，这种作用在1微克/毫升浓度时胸腺核苷掺合提高5倍，而在10微克/毫升浓度时胸腺核苷掺合提高12倍。培养1天后，1微克/毫升的OM-197-MP-AC产物具有很强的有丝分裂效果，与5微克/毫升伴刀豆球蛋白A相当(参见表1)。
表1
鼠脾细胞对OM-197-MP-AC佐剂的增殖性反应的测定
上表列出的值表示4次培育掺合测量的平均值±标准偏差。使用(5微克/毫升)伴刀豆球蛋白A作为正对照，在培育1天后获得胸腺核苷掺合为37.5±6.2×103CPM的值。
实施例4.10.
本发明化合物与AZT及d4T缀合物作为前药的抗病毒活性的测定。
4.10.1.程序
用HTLV(一种引起白血病形态的病毒)感染不死的(永生化)TMT-4淋巴细胞，可用来试验分别与AZT-及d4T-缀合的本发明化合物抗病毒活性(抗VIH(HIV，英文))。这种细胞具有受到VIH感染后无法存活的性质。试验基于保护该产物(如AZT)不会受到这种病毒性毁灭效果。
这些产物是在96孔平板用一系列稀释溶液进行的。微量培养板的上半部中，试验了各种浓度的产物与细胞及病毒(重复3次)，这样能够测定保护细胞免受病毒毁灭性作用的产物浓度。我们观察到活细胞数减少50％时的浓度是产物的IC50。存活细胞计数是使用MTT进行的，MTT是一种黄色四唑鎓化合物，它可以酶还原(在存活细胞的粒线体中)成为紫色甲???化合物。含活细胞的孔为紫色，细胞死亡则持续为黄色。测量光密度(O.D.)可定量这种作用。
在平板的下半部以同样方式评价产物的细胞毒性，在平板下半部用产物与无病毒细胞共同培养的稀释液进行了试验，这样能够测定产物对细胞的毒性作用。其毒性以CC50表示，CC50表示50％细胞因产物毒性死亡的浓度。产物的选择性(选择性指标，SI)定义为CC50/IC50。这个参数是重要的，好的产物具有很高的选择性指标。
4.10.2.结果
与AZT(OM-197-LC-Succ-AZT)或d4T缀合的本发明产物具有抗HIVIIIIB及HIV2ROD的抗病毒活性。对MT-4细胞进行两次实验(重复三次)结果列举如下：
 
产物 VIH种系 IC50(μM) CC50(μM)
AZT VIH-1IIIB 0.0029 187
OM-197-MC-Succ-AZT VIH-1IIIB 0.0519 >94
D4T VIH-1IIIB 0.107 321
OM-197-MC-Succ-d4T VIH-1IIIB 0.963 +/-97
AZT VIH-2ROD 0.0018 187
OM-197-MC-Succ-AZT VIH-2ROD 0.061 >94
D4T VIH-2ROD 0.22 321
OM-197-MC-Succ-d4T VIH-2ROD 0.51 +/-97
与AZT或d4T-缀合的本发明化合物表明在这种MT-4细胞模式中抗病毒活性。这些前药的其中一个优点在于缀合物的脂质性质，这种性质一方面使得该化合物对感染细胞的靶向作用，同时释放抗病毒物质至病毒储存位点，另一方面，能够调节靶细胞的免疫活性。
实施例4.11.
本发明化合物将前树状细胞活化成熟成为树状细胞能力的测定
4.11.1.程序
树状细胞的获得：从(C57BI/6，6至8周龄)小鼠的股骨及胫骨抽骨髓。骨髓悬浮液经70微米细胞筛过筛而获得单一细胞悬浮液。骨髓细胞再悬浮于补充10％热失活胎牛血清(SVFi)和抗生素的伊斯科(Iscove)改性杜别可(Dulbecco)培养基(IMDM)中。细胞在37℃、二氧化碳下及饱和湿度6孔微量培养板中培养。第二天(第0天)收集及洗涤未粘着的细胞。采用崔邦蓝(blue de trypan)染料排除法补充存活细胞。细胞浓度在含有20纳克/毫升鼠重组GM-CSF(rmGM-CDF)和20纳克/毫升鼠重组IL-4(rmIL-4)的IMDM中调整到2×105细胞/毫升，进一步培养。在第3天添加浓度10纳克/毫升的新rmGM-CSF及rmIL-4。在第6天收集未附着的细胞，经洗涤，并采用崔邦蓝(bleudetrypan)染料排除法补充。细胞浓度在含10纳克/毫升rmGM-CSF及rmIL-4的IMDM中调整到2×105细胞/毫升，再进行培养。第8天收集由成熟及未成熟树状细胞(CD-DM)组成的非粘着细胞，且用于与产物共同培养实验。
与本发明产物一起培养：浓度5×105细胞/毫升的CD-DM在24孔微量培养板中在如下活化剂存在下进行培养：100纳克/毫升大肠杆菌0111：B4的LPS正对照，IMDM负对照；以及2种本发明化合物：OM-197-MC-FV5及OM-197-MP-AC浓度分别为0.1、1及10微克/毫升。经48小时培养后，收集细胞，储存供流量细胞计分析之用。
使用流量细胞计分析：CD-DM使用含2％SVFi和0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS洗涤。然后细胞在冰上与最佳浓度的抗CD86、抗CD40、与FITC缀合的抗MHCII及与过氧化酶缀合的抗CD80一起培养30分钟。然后细胞洗涤3次，细胞在冰上与过氧化酶缀合的鼠的免疫球蛋白共同培养30分钟，标记抗CD86和抗CD40。培养后，细胞洗涤，再悬浮于FACS缓冲液中。采用FACScanTM流量细胞计测量萤光。每个试样分析15000脉冲。曾经只是与缀合物培养的细胞用作为负对照。
4.11.2.结果
细胞表达
Figure S00819149219950321D001081
MFI：平均萤光强度
本发明产物能诱发前树状细胞成熟成为树状细胞。这些体外得到的结果与小鼠活体试验所得的结果是一致的。
在活体试验中，每只小鼠静脉及皮下用药20微克和5微克OM-197-MP-AC，诱发树状细胞成熟且迁移入脾脏内，由边缘区段(位于红髓与白髓间)迁移至T细胞出现的白髓。使用本发明产物处理的动物脾脏组织切片的免疫染色，揭示了成熟树状细胞与T细胞同局限于白髓，如用LPS处理一样；而未处理动物则未观察到迁移及成熟。
第5系列实施例：本发明化合物的药理研究(活体试验)
实施例5.1.
在鼠的免疫模式中，与(NANP)6P2P30混合或偶合的带官能化辅助支链的假二肽性质的评价。
5.1.1.实验程序
抗原：(NANP)6P2P30肽包含恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的重复序列(NANP)和两个破伤风毒素序列(P2：830-843及P30：947-967)。该肽已知是T辅助细胞的抗原决定簇，显示其在常见的佐剂存在下诱发高而长期的免疫反应。根据参考文献(Valmori等人，1992年，《免疫学杂志》，149：717-721)中描述的方法通过合成可以获得这种肽。0.4毫克/毫升抗原母液是用pH8.0的0.9％氯化钠水溶液制备的。
佐剂：1毫克/毫升酰化的假二肽(OM-197-MP，OM-197-FV6及OM-197-MC)母液是用添加0.1％三乙醇胺的0.9％氯化钠水溶液制备的。正对照由不完全弗隆氏(Freund)佐剂(IFA得自迪弗可(Difco)公司，美国密苏里州底特律)组成，负对照为0.9％氯化钠/水溶液。
整个实验过程中，抗原及佐剂配制成如前述的混合物或缀合物形式。试验了二种类型的缀合物(OM-197-FV)n-(NANP)6P2P30。相应于不同缀合程度的缀合物，每个肽分子有1、2或3个OM-197-FV分子(分别为单-、二-及三缀合物混合物，n＝1、2及3)，亦即每一个肽分子有一分子OM-197-FV(单缀合物，n＝1)。
免疫作用：使6周龄BALB/c雌性小鼠(每组6只小鼠)免疫两次，含0.1毫升皮下注射在尾底部。用药量是第一次注射时为20微克抗原和50微克佐剂，第二次注射为10微克抗原和50微克佐剂。在缀合物的情况下，计算注射剂量时，抗原部分是决定性的。
实验组表：
免疫与取样方案：
 
周数 0 3 5
免疫(N°) ↑(1) ↑(2)
特异性抗原反应 ↑ ↑
采血样：
血清制备：于第0及第5周采血样。让血液于37℃放置60分钟然后于4℃维持一夜。随后于-80℃冷冻血清，直到测量抗体。
5.1.2.抗(NANP) 6 P 2 P 30 IgG抗体的测定
对(NANP)6P2P30抗原特异性的IgG抗体的测定是采用ELISA进行的。固定抗原是在96孔微量培养板(Maxisorp F96，Nunc公司，丹麦)进行的，在潮湿的室内于4℃培养一夜，每个孔有0.1毫升PBS(磷酸盐缓冲盐水)，其中含有0.001毫克/毫升(NANP)6P2P30抗原。微量培养板使用含1％牛血清白蛋白(BSA，福陆卡公司，瑞士)的PBS饱和。这些平板使用含0.05％吐温20的PBS(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)洗涤。在5周时抽取的血清用稀释缓冲液(含2.5％脱脂乳粉和0.05％吐温20的PBS)进行一系列稀释，然后移至微量培养板，让其于室温(TA)下放置1小时。然后平板用PBS洗涤。含有与碱性磷酸酶缀合的小鼠抗免疫球蛋白G多克隆抗体的稀释溶液(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)分配到平板上，且在室温(TA)下培育1小时。然后，平板用PBS洗涤，通过与碱性磷酸酶基质，对硝基苯基磷酸酯(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)的比色反应，证明特异性的抗体。使用微量培养板读取器(Dynatech 25000 ELISA读取器，亚煦弗得(Ashford)公司，英国米多赛斯)，读取在405毫微米的吸光率。每个条件重复测量两次。列出的这些结果是每组小鼠所得到于405纳米测量的吸光率平均值。
5.1.3.结果：特异性反应
用图形表示了接受两次免疫的小鼠，采用ELISA测定的特异性产生的抗-(NANP)6P2P30IgG抗体(图79)。
两次注射抗原+佐剂混合物(OM-197-FV6或OM-197-MC)，诱发生血清反应，比单独注射抗原时所观察的高得多。使用OM-197-FV-(NANP)6P2P30单共轭物(缀合物)免疫诱发IgG反应略高于抗原+OM-197-FV6混合物所得反应。(OM-197-FV)1，2，3-(NANP)6P2P30较高共轭度(缀合度)并未改善对这种抗原的血清反应。OM-197-MP佐剂和OM-197-FV-(NANP)6P2P30单缀合物的混合物显著增加了对这种抗原的血清反应，超过了由(NANP)6P2P30+IFA混合物组成的正对照物所达到的反应。
当使用(NANP)6P2P30NA肽作为抗原，采用ELISA捕获抗体时，可得到类似的结果(图80)。
实例5.2.
卵白蛋白免疫组：在皮下用药一次和二次后，测定在小鼠上产生的特异性抗体
5.2.1.实验的描述
本研究的目的是比较注射佐剂+抗原混合物(OM-197-MP+卵白蛋白)诱发的血清反应与使用有这种相同抗原的缀合物(OM-197-FV-卵白蛋白)引出的血清反应。为此，30只BALB/c小鼠(雌性，开始处理时为8周龄)分为下述三组：
 
组别 佐剂-抗原25微克蛋白质/动物/注射 佐剂(未结合)50微克/动物/注射 注射体积微升
A 卵白蛋白 - 200
B 卵白蛋白 OM-197-MP 200
C OM-197-FV-卵白蛋白 - 200
溶液：
A组：制备仅有抗原的母液(卵白蛋白，Fluka AG，瑞士巴克)，该溶液浓度为在水+0.01％硫柳汞中125微克/毫升。
B组：抗原+佐剂混合物母液(卵白蛋白+OM-197-MP)含有在水+0.01硫柳汞中125微克/毫升卵白蛋白和250微克/毫升OM-197-MP。
C组：OM-197-FV-卵白蛋白缀合物的母液浓度是在水+0.01％硫柳汞中125微克/毫升蛋白质。
注射液的准备：每个母液于37℃培育15分钟，然后在每种情况下，往每种溶液添加适量的氯化钠(14％)，以获得等渗溶液(0.9％氯化钠)。整体混合物涡旋3分钟。
免疫作用：于第0天及第14天注射。这些溶液采用皮下用药(两个不同部位各100微升，每只动物共接受200微升)。于第14天和第28天采血样(后眼眶穿刺)。
抗卵白蛋白免疫球蛋白测定：采用ELISA重复两次测定下述卵白蛋白的血清免疫球蛋白：IgGI、IgG2a及IgM。简言之，微量培养板(NUNC免疫平板，罗斯克莱(Roskilde)公司，丹麦)使用100微升卵白蛋白(0.5微克)在碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中于4℃培育(涂布一夜)。使用0.5％吐温-20(默克侯朗(Merck Hohenbrunn)公司，丹麦)洗涤后，血清稀释50、200及800倍[稀释液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)+0.02％吐温-20]。每个100微升稀血清试样添加到各孔中。于37℃培养45分钟。
在第二次洗涤后，卵白蛋白特效的IgGl、IgG2a及IgM与100微升与过氧化酶缀合抗-IgGl抗体(抗小鼠的大鼠抗体)(希洛泰克(Serotec)公司，英国牛津)、与过氧化酶缀合IgG2a的抗体(法明哲(Pharmingen)公司，美国加州圣地牙哥)及与生物素缀合IgM的抗体(法明哲公司，美国加州圣地牙哥)，它们预先稀释在PBS/BSA/吐温缓冲液(分别稀释250、1000、500倍)，于37℃培养30分钟。对于IgM，补充洗涤后，需要用1∶100与过氧化酶结合的链丝菌抗生素(达寇(Dako)公司，丹麦万罗雀普)溶液进行第三次培养(37℃，30分钟)。
洗涤后，添加100微升1，2-亚苯基二胺溶液(OPD，默克公司，丹史达特，D)，检测与抗IgG1二次抗体结合的过氧化酶，而对于IgG2a及IgM，使用的试剂是3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB，希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)。在室温培育20分钟后，通过加入100微升2N硫酸中止反应。使用Bio Rad 3550模式平板读取器于490纳米读取吸光值。
5.2.2.结果
每次在490纳米读取的结果是以每毫升的任意单位(u.a.)表示的。这就有可能将每个样品与使用来自A组(单独注射卵白蛋白动物)第28天所采集血样的不同稀释液制备的参比样品进行比较。根据定义，稀释50倍的样品浓度为1000u.a./毫升。然后，各个结果根据相应的稀释因数(50、200或800倍)进行校正，这些结果示于图81、82及83。空心圆是对应于14天的平均值，黑圈是对应于28天的平均值；Ova表示卵白蛋白的缩写。
这些结果表明，OM-197-FV-卵白蛋白缀合物在研究模式中是特别的免疫原，因为在第二次注射后可显著提高小鼠产生的对卵白蛋白的特异性抗体，而与接受分析的免疫球蛋白类别(IgG1、IgG2a及IgM)无关。特别地，应该揭示抗卵白蛋白IgG2a惊人的增高(图84)，提示一种优选地朝向TH1的免疫性。卵白蛋白+OM-197-MP非共价混合物产生比缀合物更低的IgG2a反应。
实例5.3.
H1N1血液凝集素免疫组：小鼠在皮下用药1次和2次后产生的特异性抗体的测定
5.3.1.实验描述
这个研究的目的是佐剂+抗原混合物(OM-197+H1N1)所诱发的血清反应，与使用具有相同抗原缀合物(OM-197-FV-H1N1)所产生的血清反应加以比较。为此，30只BALB/C小鼠(雌性，处理开始时为8周龄)分为下述三组：
 
组别 佐剂-抗原H1N1 2.5微克/动物/注射 佐剂(未结合)50微克/动物/注射 注射体积微升
A H1N1 - 100
B H1N1 OM-197-MP(50微克) 100
C OM-197-FV-H1N1 - 100
5.3.2.注射液的准备
A组：H1N1母液(A/北京262/95血液凝集素，苏维杜佛(SolvayDuphar)，威斯普，NL)制成在水中浓度25微克/毫升。
B组：H1N1+OM-197-MP母液含有在水中25微克/毫升H1N1和500微克/毫升OM-197-MP。
C组：OM-197-FV-H1N1(H1N1共价结合OM-197-FV)母液为25微克/毫升在水中的浓度。
每种母液于37℃培养15分钟。然后往每种溶液各2毫升添加135微升(14％)氯化钠。整体混合物涡旋3分钟。
5.3.3.抗H1N1免疫球蛋白的注射与测定：
在第0天及第14天安排注射。溶液经皮下用药(50微升用于两个不同部位，每只动物共100微升)。在第14天采血样(后眼眶穿刺)。
采用ELISA重复测定对H1N1特异性的IgM。简言之，微量培养板(NUNC免疫平板，丹麦罗斯克莱公司)与100微升H1N1(0.5微克)在碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中在4℃培养(涂布一夜)。使用0.5％吐温-20(默克侯朗公司，丹麦)洗涤后，血清稀释50、200及800倍[稀释液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)+0.02％吐温-2]。各100微升稀释血清样品加到各个孔中。于37℃培养45分钟。
经第二次洗涤后，对H1N1特异性的IgM在37℃与预先稀释在吐温缓冲液(稀释500倍)中的100微升抗IgG1抗体(抗大鼠的小鼠抗体)-生物素缀合物(法明哲公司，美国加州圣地牙哥)共同培养。在补充洗涤后，与1∶100过氧化酶缀合的链丝菌抗生物素(达寇公司，丹麦葛罗雀普)稀释溶液进行第三次培养(于37℃，30分钟)。
经洗涤后，100微升3’，3’，5’，9-四甲基联苯胺溶液(TMB，希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)添加到与抗IgM二次抗体缀合的过氧化酶。在室温培养20分钟后，通过加入100微升2N硫酸中止反应。使用Bio Rad 3550模式平板读取器读取于490毫微米的吸光率。
5.3.4.结果
每次测量的在490毫微米的结果是以每毫升任意单位(U.A.)表示的。这就有可能将每个样品与使用由A组(单独注射H1N1动物)于28天收集血清样品的各种稀释液制备的对比样品加以比较。根据定义，稀释50倍的样品浓度为1000U.A./毫升。然后，各个结果可根据对应的稀释因数(50、200或800倍)进行校正，且示于图84：实心圆对应28天的平均值。
使用OM-197-FV-H1N1缀合物的免疫小鼠显示出，抗-H1N1IgM抗体效价高于由只是H1N1抗原构成的对照样品的效价，以及高于OM-197-MP+H1N1混合物组成的对照样品的效价。
实例5.4.
在皮下使用利什曼原虫(Leishmania)LmCPb抗原的小鼠免疫模式中，OM-197-MP-AC佐剂性质的评价
5.4.1.实验描述
CBA小鼠经尾部单次皮下注射(100微升)利什曼原虫寄生虫LmCPb抗原(每小鼠3微克)±佐剂。形成两组，每组6只小鼠，接受下述的处理：仅抗原(对照组)和抗原+50微克OM-197-MP-AC。
注射后11天，鼠腹股沟及主动脉周围淋巴节细胞(2组，每组各3只小鼠)在纯化的LmCPb抗原或寄生虫(无鞭毛体)全部提取物存在下重复3次培养。在第4天取出上清液样品，储存于-20℃，以便测定IL-4及γ-IFN。最后，将氚化胸腺核(3H-TdR)添加到培养物，以测量其增殖。
采用夹层-ELISA测定细胞分裂素(γ-IFN及IL-4的OptEIA盒，BD，法明哲公司，瑞士贝梭)，通过测量胸腺核苷的掺合(3H-TdR)评价增殖反应。用算术平均值±标准差以CPM表示的3H-TdR掺合测量结果(8个组各3只小鼠)，以及以微微克/毫升表示的IL-4浓度，对于每组各3只小鼠各自以两次测量值的算术平均值给出的(测定细胞分裂素)。
抗原：制备在PBS中浓度150微克/毫升的LmCPb母液
佐剂：制备在水中浓度0.9毫克/毫升的OM-294-MP-母液，用于附加注射0.1％三乙醇胺。
抗原-佐剂混合物：在就要注射前，在无菌PBS中预先调节到适当最后浓度的佐剂制剂(4个体积)与抗原母液(1个体积)混合。
5.4.2.结果
使用利什曼原虫LmCPb抗原免疫的CBA小鼠，单次剂量50微克OM-197-MP-AC，足以诱发提高淋巴节细胞增殖(2至6倍)，这种增殖是根据对纯化抗原(0.6至15微克/毫升)的反应或对寄生虫无鞭毛体阶段的全部提取物(2至50×10-6/毫升范围)离体测量的。这些结果列于表1。此外，用OM-197-MC-AC处理表明使用寄生虫抗原刺激的淋巴节细胞培养上清液内出现相当量的IL-4(参考表2)，而未检测到产生γ-IFN(<100微微克/毫升)。
表1用LmCPb免疫的CBA小鼠离体试验的淋巴节淋巴细胞增殖反 应：仅OM-197-MC-AC佐剂或与CpG-DNA结合使用的效果
Figure S00819149219950321D001161
该1表列出的值是用两组淋巴节(每组3只小鼠；每组重复培养三次)进行掺合测量的算术平均±标准差。
表2体外使用由LmCPb免疫的CBA小鼠淋巴细胞产生的IL-4：仅 OM-197-MP-AC佐剂或与CpG-DNA结合使用的影响
Figure S00819149219950321D001162
该表列出的值是对三次重复培养的两组淋巴节细胞上清液(a和b；每组3只小鼠)中两次细胞分裂素测量的算术平均。
结论
在使用LmCPb(在利什曼原虫寄生虫的无鞭毛体阶段有丰富的蛋白酶)免疫的CBA小鼠内，OM-294-MP-AC产物可增强，通过测量淋巴细胞增殖离体评价的特异性T反应。此外，这种佐剂可促进分泌相当量IL-4的抗LmCPb淋巴细胞的发育。
实例5.5.
与尤氏疟原虫环境子孢子(circumsporozoite)蛋白质的合成肽(PyCs-252-260)偶合或混合的，带官能化辅助支链酰化假二肽性质在鼠免疫模式中的评价
该实验目的是评价与尤氏疟原虫环境子孢子蛋白质的合成肽(PyCs-252-260)接枝或混合的，带辅助支链的酰化假二肽诱发特异性细胞和体液免疫反应的能力。
5.5.1.实验程序
抗原与佐剂的配制：对应于尤氏疟原虫环境子孢子蛋白质T细胞抗原决定簇的合成肽PyCS-252-260具有SYVPSAEQI序列(表1)。肽2MR99B(SERSYVPSAEQI)是往N端增加SER氨基酸得到的，肽1MR99A(KGGKGGKSERSYVPSAEQI)是通过添加与MR99B肽的N端连接的赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸氨基酸得到的。这些肽是使用购自巴肯芬卡兰(Bachem Feinchemikallien)公司(瑞士巴登朵夫)、诺瓦拜肯(Novabiochem)公司(瑞士洛芙芬津)以及福陆卡公司(瑞士巴克)的试剂及溶剂，根据Merrifield及Atherton合成方法(Atherton等人，Bioorg Chem，8：350-351，1979)，通过固相合成(F-moc)得到的。这些肽通过反相HPLC进行纯化。
如实施例3.6([OM-197-MC-FV]n-肽1)和实施例3.5(OM-197-MC-FV-肽2)中所描述的，可得到肽与带辅助支链的酰化假二肽(OM-197-MC-FV)4的单和多缀合物。最终缀合肽无菌溶液进行冷冻干燥。
小鼠免疫作用：抗原剂量相当于每只小鼠每次注射20微克肽2(表2)。注射前，冷冻干燥制剂溶解于0.9％氯化钠，搅拌3分钟，在50℃下超音波处理10分钟。一个体积的抗原(在PBS中14.5微克肽PyCS252-260加50微克P30(通用T细胞抗原决定簇))与一个体积的佐剂混合制备得到有IFA的配方。
4周龄BALB/c小鼠(哈兰(Harlan)，吉斯特，NL)于尾部末端皮下注射。使用23号针注射最后体积50微升。动物于第5周开始接受第二次抗原剂量注射，第9周接受第三次注射。
表1.抗原
表2.实验组，免疫及采样表
采用肽免疫
淋巴器官及血液采样：
血清采样：于7及11周后全部小鼠都采血样。血液放置在37℃达6分钟，然后于4℃维持一夜。随后，血清于-80℃冷冻直到测定抗体。
鼠腹股沟淋巴节及脾脏的回收：每组两只动物分别于7周及11周后杀死。采用外科手术取出鼠腹股沟淋巴节及脾脏，细胞经培养而采用ELISPOT评价CTL活性(γ-干扰素反应)。
抗肽1抗体效价的测定：
采用ELISA测定特别对肽1(KGGKGGKSERSYVPSAEQI)的特异性抗体。抗原固定方式是在96孔微量培养板(麦希索普F96，弄克，丹麦)于潮湿室内在4℃培育一夜，每个孔有0.05毫升含0.001毫克肽1的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。平板用PBS-0.05％吐温20(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)(PBS-T)洗涤，在室温下使用5％脱脂乳于PBS-T中饱和平板1小时。在第9周及第11周抽取小鼠的单个血清样品(A，B，C，D，E，F，G)用稀释缓冲液(含2.5％脱脂乳粉及0.05％吐温20的PBS)进行一系列稀释，然后移转至微量培养板，任其在室温下放置1小时。平板再用PBS洗涤，含有与碱性磷酸酶缀合的山羊杭小鼠免疫球蛋白多克隆抗体(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)的稀释溶液添加到平板且，在室温下培育1小时。平板用PBS洗涤，通过与碱性磷酸酶基质、对硝基苯基磷酸酯(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)比色反应证明这些特异性抗体。使用微量培养板读取器(Dynatech25000ELISA读取器，亚煦弗得公司，英国米多赛斯)，读取于405毫微米的吸光率，两次重复测量血清样品。列出的这些结果是所得到的每组小鼠测量值的平均值。抗体效价是用最后诱导高的正反应的稀释液决定的，即光密度高于附加背景噪音值±3标准偏差。
v-干扰素-ELISPOT测定：
在潮湿室内，于ELISPOT微量培养板中，其孔底覆盖硝基纤维素(密里波尔(Millipore)，法国摩尔森)，50微克/毫升抗体溶液在4℃培养一夜，固定鼠的抗-γ-干扰素的特异性抗体(01E703B2)。添加含10％胎牛血清(FCS，法科拉(Fakola)，瑞士)的DMEM(生命技术公司，美国纽约州大岛)于37℃放置2小时实施饱和步骤。由淋巴器官(鼠腹股沟淋巴节及脾脏)得到的细胞以200000或400000细胞/孔在微量培养板培养，然后在37℃与100000抗原呈现细胞[事先使用PyCS 252-260肽于37℃处理1小时，照射(10Krad)以及洗涤3次)共同培养24小时或于(伴)刀豆球蛋白A存在下培养作为对照。培育后，取出细胞，洗涤后，在2小时内加入第二种生物素化的小鼠抗-γ-IFN抗体(ANI，2微克/毫升，在PBS中，含1％BSA)。加入稀释1000倍的与碱性磷酸酶结合的链丝菌抗生物素(百灵佳曼汉公司，德国曼汉)，于37℃培养1小时，随后使用含0.05％吐温20的PBS洗涤三次，接着使用PBS洗涤三次。抗-γ-IFN免疫复合物的存在可通过加入BCIP/NBT基质(希格玛公司，美国蒙大拿州圣路易)加以证明。可用流水洗涤停止该反应。这时可用Biosys GmbH自动读取器(德国卡本)计数γ-IFN的正斑点。特异性斑点数相应于在有肽的脉冲式细胞存在下计算的点数与无肽存在下计算点数的差。这些结果以每组小鼠得到值的平均值表示。以每百万培养细胞的点数表示。
结果
在图85(第2次注射后2周)与图86(第3次注射后2周)示出体液反应。两次免疫后，第5组(动物使用通过具有4单位酰化假二肽的辅助支链结合的肽1已进行免疫)7只中有5只观察得阳性反应。本组中，由于小鼠B及D显示有意义但低的抗体效价，故在注射第3针后有反应的小鼠百分比提高了。使用与相同佐剂混合的相同肽免疫的第三组没有显示任何有意义的抗体效价。(使用游离态OM-197佐剂补充肽2单缀合的)第7组在3次免疫后观察到出现反应。其它各组接受短肽或没有接受任何肽，没有显示出任何抗体反应。
结果，OM-197-肽2四缀合物在全部接受免疫的小鼠中皆诱发低效价至中效价的抗体反应。
通过CTL的频率，它分泌对PyCS 252-260抗原决定簇特效的γ干扰素，可测定细胞活性。这些结果记录于表3中。正对照用第2组表示，负对照单用佐剂表示(第1及8组)。用伴刀豆球蛋白A刺激细胞的对照组对全部小鼠皆呈阳性。
第5组(四缀合物)以及第7组(单缀合物+佐剂)显示阳性CTL反应。
结果，与4个酰化假二肽分子接合的肽(OM-197-肽1)是有效的，而单缀合物(OM-197-肽2)未诱发CTL反应。相反地，用游离OM-197补充的单缀合物诱发CTL反应，而未诱发产生任何抗体，该项事实的原因可能在于肽2尺寸小(12个氨基酸)。
表3：对PyCS 252-260肽的CTL反应
实例5.6.
在兔模式中酰化假二肽热原性的评价
这个实验的目的是确定不会诱发静脉注射兔体发烧的带接枝辅助支链的酰化假二肽最高浓度。
程序：
15只新西兰白兔分成下列各组：
第1组：1.0毫克/千克
第2组：0.1毫克/千克
第3组：0.01毫克/千克
第4组：0.001毫克/千克
第5组：注射水
试验当天，兔子称重，并在为此目的的备用箱中进行免疫。温度探头插入直肠。
探头插入后1小时记录体温(注射前)达90分钟，求出平均温度。
然后，每个兔通过边缘(外侧)耳静脉静脉注射产品或对照物(无菌水，0.9％氯化钠)。每30分钟测量一次温度，测量3小时。计算出出注射前平均体温与最高体温的差，且报告。
每组取3只兔，若3次反应的和不超过1.15℃，则认为试验产品不是致热原的，若其和超过2.65℃，则认为该产品是致热原的。若所得结果介于两者之间，则另外使用3只兔重复试验。
结果：
OM-197-MC-MP及OM-197-MC-Asp化合物的致热性试验结果列于后：
 
OM-197-MC-MP剂量 反应，℃平均(个别值) 结果
1毫克/千克 3.40(1.50，0.60，1.30) 致热原
0.1毫克/千克 2.00(1.45，0.05，0.50) 非致热原(1个高值)
0.01毫克/千克 0.65(0.00，0.45，0.20) 非致热原
0.001毫克/千克 0.35(0.10，0.05，0.20) 非致热原
对照 0.20(0.20，0.00，0.00) 非致热原
 
OM-197-MC-Asp剂量 反应，℃平均(个别值) 结果
1毫克/千克 3.25(1.25，1.45，0.55) 致热原
0.1毫克/千克 2.85(1.10，1.20，0.55) 致热原
0.01毫克/千克 0.35(0.20，0.15，0.00) 非致热原
0.001毫克/千克 0.25(0.00，0.10，0.15) 非致热原
对照 0.40(0.25，0.05，0.10) 非致热原
本发明化合物与低于0.1毫克/千克剂量时非热原性。

Claims (5)

1.化合物，它选自：
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-二羟基磷酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-戊基}酰胺
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯-10-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6-羟基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(3RS，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(3R，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-羟基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其与无机碱或有机碱的加成盐
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-壬-1，9-二醇1-O-羧甲基醚9-O-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(2S，8R)-1-(羧甲基)-硫代-2-[(R)-3-十四酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-壬-9-醇9-O-(7-氨基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-3-氧代-4-氮杂-8-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-壬-1，9-二醇1-O-(2，2-二羧基乙基)醚9-O-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯10-(6-溴乙酰氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(3RS，9R)-3-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯10-O-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-丁二酰基氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-甘氨酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-(2-癸酰基氧辛酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，它选自：
N-[[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氢磷酸酯-10-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羟基庚酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羟基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
(3RS，9R)，(3R，9R)及(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-氨基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
3-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氢磷酸酯-10-(6-羟基己酸酯)及其与无机碱或有机碱的加成盐
2-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-(二羟基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羟基氧十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-[(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基)}酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐
N-{(R)-3-十二酰基氧十四酰基]-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其与无机碱或有机碱的加成盐。
3.药物组合物，该组合物含有至少一种根据权利要求1所述的化合物作为活性成分，该化合物呈与药学上可接受的，无毒性的，惰性载体或赋形剂结合或混合的形式。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，该组合物含有至少一种根据权利要求1所述的化合物与治疗上相容的无机或有机碱的盐作为活性成分。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，该组合物是基于与药用载体或赋形剂结合或混合的，呈纯的非对映异构体形式的根据权利要求1所述的化合物。
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