EP1242365A1 - Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise - Google Patents

Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Info

Publication number
EP1242365A1
EP1242365A1 EP00993510A EP00993510A EP1242365A1 EP 1242365 A1 EP1242365 A1 EP 1242365A1 EP 00993510 A EP00993510 A EP 00993510A EP 00993510 A EP00993510 A EP 00993510A EP 1242365 A1 EP1242365 A1 EP 1242365A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
general formula
amino
group
function
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00993510A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Bauer
Olivier Richard Martin
Sylvain Rodriguez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OM Pharma SA
Original Assignee
OM Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OM Pharma SA filed Critical OM Pharma SA
Publication of EP1242365A1 publication Critical patent/EP1242365A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the field of chemistry, and more particularly to that of peptide chemistry. More specifically, it relates to acylated pseudodipeptides carrying a functionalized auxiliary arm, which may or may not be grafted in the form of conjugates and the auxiliary arm of which gives the molecule original properties in terms of biological activities and in physical- chemical.
  • the chemical nature of the auxiliary arm gives an additional dimension to the acylated pseudodipeptide by finely modulating its original properties and giving it new ones.
  • These molecules carrying a functionalized auxiliary arm can be conjugated to a phamacophore, to an antigen or to a vector molecule.
  • Bioconjugation involves the coupling of two or more chemical entities to form a new molecular complex with properties different from those of its individual components. Natural or synthetic products with their own pharmacological properties can thus be combined with one another to create new entities with original or improved physico-chemical and pharmacological properties compared to the starting compounds.
  • the applications of bioconjugation affect all areas of human, veterinary medicine and diagnostic methods.
  • a hapten-adjuvant conjugate could prove to be very effective as a vaccination adjuvant.
  • Ikeda et al. [(1999) Chem. Pharm. Bull., 47 (4), 563-568] have presented a synthesis between a structural analogue of Lipid A and a tumor antigen of peptide nature and demonstrated in vitro mitogenic activity.
  • a more specific subject of the invention is pseudodipeptides derived from functionalized amino acids, the free amino functions of which are amidified by fatty acids and one of the ends of the pseudodipeptide carrying a functionalized auxiliary arm.
  • N-acylated pseudodipeptides carrying an acid group in neutral form or charged at one end of the pseudodipeptide and carrying at the other end of a functionalized auxiliary arm, corresponding to general formula I.
  • R ⁇ ⁇ and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from hydroxyl, alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio descriptors m, n take a value varying from 0 to 10 descriptors p, q take a varying value from 1 to 10 Y represents O or NH,
  • X and Z represent a functionalized auxiliary arm or an acid group in neutral or charged form chosen from the following groups:
  • auxiliary group in X or Z corresponds to the general formula (II)
  • A is O, S or NH
  • the descriptor r takes a value of 0 or 1
  • the descriptor s takes a value varying from 1 to 10 W is chosen from the groups: -formyl -acetyl cyano
  • the invention relates more particularly to new N-acylated pseudodipeptides carrying an acid group in neutral or charged form, at one end of the pseudodipeptide and carrying at the other end of a functionalized auxiliary arm, corresponding to the formula general I.
  • X and Z represent an acid group in neutral or charged form or a functionalized auxiliary arm, with the limitation that at least one of the substituents X or Z represents a functionalized auxiliary arm,
  • Y represents O or NH
  • the acid group X or Z is preferably chosen from the groups:
  • the substituents X or Z represent an acid group in neutral form, it is the carboxylic, sulphonic, phosphonic or free phosphoric form.
  • it is an acid group in charged form it is the carboxylic, sulfonic, phosphonic or phosphoric form salified, in particular by addition of an inorganic or organic base, preferably therapeutically compatible.
  • the bases are not therapeutically compatible, they can be used as a means of identification, purification or duplication.
  • alkaline bases such as sodium, potassium and lithium hydroxides, ammonium salts
  • alkaline earth bases such as hydroxides of calcium or strontium, magnesium salts, ferrous metal salts and the like
  • organic bases such as those derived from primary, secondary or tertiary amines, basic amino acids such as lysine or ornithine or amino sugars.
  • Bases which cannot be used therapeutically are, for example, brucine, strychnine, N-methylglucosamine or N-methylmorpholine. As indicated above the salts resulting therefrom will serve as a means of separation or of identification or of purification.
  • the molecule derives in particular from serine or from aspartic acid.
  • the molecule derives in particular from homoserine or glutamic acid
  • W will preferably be chosen from groups:
  • the compounds of general formula IV are particularly preferred as currently preferred compounds: X- (CH 2 ) m -CH- (CH 2 ) n -CO-NH- (CH 2 ) p -CH- (CH 2 ) q -Z
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio the descriptors m, n take a value varying from 0 to 10 the descriptors p, q take a value varying from 1 to 10 and in which one of the substituents X or Z is a carboxyl or a dihydroxyphosphoryloxy radical or a carboxy [(C 1 -C 5 ) alkoxy] or carboxy [(C 1 -C 5 ) alkylthio] group or a [carboxy (CrC 5 ) alkyl] aminocarbonyl group or a [dicarboxy (CrC 5
  • Ri and R 2 includes acyl derivatives with a chain of variable length ranging from 2 to 24 carbon atoms, identical or different, branched or in a straight chain, saturated or unsaturated, which can carry one or more substituents chosen from the group formed by an alkyl, amino, acylamino, hydroxyl, alkoxy, acyloxy, acylthio and alkylthio.
  • substituents chosen from the group formed by an alkyl, amino, acylamino, hydroxyl, alkoxy, acyloxy, acylthio and alkylthio.
  • acyl groups concerned those derived from lauric acid, 2-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxymyristic acid, 2-decanoyloxyoctanoic acid, 3-lauryloxymyristic acid, acid 3-myristyloxymyristic and 3-palmityloxymyristic acid are those currently preferred.
  • the invention relates in particular as preferred compounds to the pseudodipeptides
  • These compounds are distinguished by interesting and original pharmacological properties, in particular immunomodulatory. They are of particular interest in the preparation of vaccine compositions in formulations by admixture or as covalently conjugated with antigens of polypeptide or polysaccharide nature or on compounds consisting of polypeptides conjugated to polysaccharides. They can be used in particular in the prevention of infections of viral, microbial and protozoal origin or in the therapy of certain autoimmune diseases. They also find use as a vector of a molecule of therapeutic interest by their properties of non-covalent association according to the more or less hydrophilic or hydrophobic character of their auxiliary arm. Their chemical properties which allow them to be coupled with molecules of therapeutic interest, just as their amphiphilic character favors the formulations and the transport of the molecules which are associated to them towards the membrane receptors, as well as towards the cell walls and the cytoplasm.
  • They can be used alone or in combination, covalent or not, with a molecule of therapeutic interest by extratemporary ex vivo incubation with blood cells in order to render the cells immunocompetent before re-inoculating them in vivo by the parenteral route.
  • the molecules show similar properties, as adjuvants of the immune system used for example for, vaccination, in covalent association or not with the appropriate antigens, against diseases of viral, parasitic, microbial and fungal origin. These molecules, conjugated or not, can also be used in the therapy of certain autoimmune diseases.
  • some of the compounds according to the invention after covalent association or not, show different properties in their capacity to induce the production of cytokines or the maturation of the immunocompetent stem cells coming from the hematopoietic and lymphoid organs.
  • Some of the compounds according to the invention are capable of promoting the maturation and the differentiation of monocytes into functional dentritic cells, in the presence or in the absence of the appropriate antigen and thus contribute to strengthening humoral and cellular immunity.
  • Some of the compounds promote the differentiation of cells of the hematopoietic system, in particular of the bone marrow, and make it possible to improve or correct certain dysfunctions of the immune system. They show in particular antiviral properties.
  • the compounds according to the invention are particularly advantageous because of their low toxicity. They are used in covalent association or not with antigens in the prevention or therapy of infectious diseases in humans and in animals at doses which vary from 0.005 mg to 100 mg per unit dose and from 0.005 to 200 mg per day according to the indications and according to the weight of the subjects.
  • the present invention also relates to a process for obtaining N-acylated pseudodipeptides carrying an acid group in neutral form or charged at one end of the pseudodipeptide and carrying at the other end a functionalized auxiliary, corresponding to the general formula I, which consists in blocking the amino functions in position (q + 1) and YH in position ⁇ of an amino acid ⁇ -functionalized by orthogonal blocking reagents, in that we submit the carboxylic function remaining free to the action of a reducing agent to form the corresponding alcohol, in that the amino function is released in position (q + 1) which is acylated using a derivative functional of a carboxylic acid of formula R 2 OH in which R 2 is defined as above, then releases the terminal function to obtain the functionalized amino alcohol of general formula V
  • R 2 represents the acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above, p and q each represent an integer varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent, with a ⁇ -functionalized amino acid derivative of general formula VI
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • m and n are an integer varying from 0 to 10
  • X is an acid group defined as above which can be in esterified form, to form the pseudodipeptide of general formula VII
  • A- (CO) r (CH 2 ) sW (VIII) A can be a leaving group, an OH, SH or NH 2 function the descriptor r is preferably 1, but also takes the value of 0 the descriptor s preferably varies from 2 to 6, but generally takes a value varying from 1 to 10,
  • W is preferably chosen from one of the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, - alkylthio, -hydroxyl, -1, 2-dihydroxyethyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or present in the form of ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, - azido, -thiocyano or their precursors, if necessary in the presence of a coupling agent, and subjecting it to catalytic hydrogenation or to another deprotection process so as to obtain the derivative of general formula I
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphopseudodipeptides of general formula IV
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C1-C24 alkyl) thio descriptors m, p and q take a value varying from 1 to 10 descriptor n takes a value ranging from 0 to 10 X and Z each represent an acid group in neutral or charged form or a functionalized auxiliary arm, characterized in that the amino functions are blocked in position (q + 1) and in ⁇ of a diamine acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q-1 COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function remaining free to the action of a
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a number integer varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent with a ⁇ -hydroxylated amino acid derivative of general formula VI X- (CH 2 ) m -CH- (CH 2 ) n -COOH (VI)
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents
  • m is an integer varying from 1 to 10
  • n is a number integer varying from 0 to 10
  • X is a dialkyloxy- or diaryloxy-phosphoryloxy group of formula (RO) 2 P-0 i O to form the pseudodipeptide of general formula X
  • R 1, R 2 and the descriptors m, n, p and q are defined as above, and R is a labile radical by hydrogenolysis, which it is possible, if desired, to substitute, alkylate or acylate the free terminal alcohol function with a substitution, alkylation or acylation reagent of general formula VIII,
  • A can be a leaving group, an OH, SH or NH 2 function, the descriptor r preferably being 1, but which can also take a value of O the descriptor s preferably being between 2 and 6, but which can take a value varying from 1 to 10
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo- or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, -alkylthio ,, -hydroxyl, -1, 2 -dihydroxyethyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or in the form of an ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, - thiocyano or their precursors, if necessary in the presence of a coupling agent, and to subject it to catalytic hydrogenation or to another deprotection process so as to obtain the derivative of general formula XI
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphopseudodipeptides of general formula XII
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio the descriptors m, p and q take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n takes a value ranging from 0 to 10 and in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary arm which consists in blocking the amino functions in position (q + 1) and in ⁇ , of a diamine acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q-1 COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function remaining free to the action of a
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a whole number varying from 1 to 10 the descriptor s preferably being between 2 and 7, but takes a value varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a condensing agent in an inert solvent with an amino acid derivative ⁇ -hydroxy of general formula VI
  • R ⁇ is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents m is an integer varying from 1 to 10 n is a whole number varying from 0 to 10 and X is a dialkyloxy- or diaryloxy-phosphoryloxy group of formula (RO) 2 PO o to form the pseudodipeptide of general formula XIV
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyl, - ethynyl, -carboxyl free or in the form of ester , mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, -thiocyano or their precursors.
  • the invention also relates to a method for obtaining the carboxypseudodipeptides of general formula IV X- (CH 2 ) m -CH- (CH 2 ) n -CO-NH- (CH 2 ) p-CH- (CH 2 ) q - Z (IV)
  • R and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (alkyl in the descriptors m, p and q take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n takes a value ranging from 0 to 10 and in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary arm which consists in blocking the amine functions in position (q + 1) and in ⁇ of a diamino acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q- ⁇ COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function which remains free to the action of a reducing agent to
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a whole number varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent with a functional derivative of carb-carboxy amino acid of general formula VI
  • R 1 is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents m is an integer varying from 1 to 10 n is an integer varying from 0 to 10 and X is a radical RO-CO- to form the pseudodipeptide of general formula XVI
  • R is a labile group by hydrogenolysis, such as for example the benzyl group, which may, if desired, be substituted, alkylated or acylate the free terminal alcohol function with a substitution, alkylation or acylation reagent of general formula VIII,
  • A is a leaving group, an OH, SH or NH 2 function, the descriptor r preferably being 1, but which can also take a value of O the descriptor s preferably being between 2 and 6, but which can take a value varying from 1 at 10
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, - alkylthio, -hydroxyl, -1, 2-dihydroxyethyl , -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or in the form of ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, - thiocyano or their precursors, if necessary in the presence of an agent coupling, and subjecting it to catalytic hydrogenation or to a deprotection process, so as to obtain the derivative of general formula XVII
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphodipeptides of general formula IV
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (CC 24 alkyl) thio the descriptors m, p and q take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n takes a value going from 0 to 10 and in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary arm
  • R is a labile group by hydrogenolysis such as for example the benzyl group
  • A may be a leaving group, an OH, SH or NH 2 function the descriptor r is preferably 1, but also takes a value of 0 the descriptor s preferably varies from 2 to 6, but generally takes a value varying from 1 at 10
  • W being preferably chosen from one of the groups, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, -alkylthio, -hydroxyle, -1 , 2-dihydroxyethyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or present as an ester or other derivative
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphodipeptides of general formula IV
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (dC 24 alkyl) thio the descriptors m, p and q take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n takes a value going from 0 to 10 and in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary arm
  • A can be a leaving group, an OH, SH or NH 2 function
  • the descriptor r is preferably 1, but also takes a value of 0
  • the descriptor s preferably varies from 2 to 6, but generally takes a value varying from 1 to 10
  • W being preferably chosen from one of the groups, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, -alkylthio, -hydroxyle, -1 , 2-dihydroxyethyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or present as an ester or other derivative
  • R 3 represents an aminoalkyl, carboxyalkyl, dicarboxyalkyl or aminocarboxyalkyl group.
  • the stereochemistry of the centers carrying acylamino groups is determined by the configuration of the starting amino acids and that of the acylamino groups by the configuration of the starting fatty acids. It is possible to start from an acid diamino of configuration L or D or racemic. It is possible to start from a hydroxyl amino acid of L, D or racemic configuration. All the enantiomers or diastereoisomers of the compounds of general formula I or IV or XII or XVI form part of the invention.
  • the compounds of the invention are prepared by coupling between the acid function of an ⁇ -functionalized N-acylated amino acid and the amine function of an amino alcohol resulting from the reduction of the carboxyl of a mono diamine acid.
  • -N- acylated then O-acylation or -alkylation of the alcohol function remained free in order to introduce a functionalized auxiliary arm, which can be optionally modified after hanging in order to release a reactive function. Deprotection of the final product releases an acid function.
  • the ⁇ -functionalized amino acid is an ⁇ -amino ⁇ -hydroxylated acid such as serine or homoserine, which is subjected to a sequence of N-protection reactions (for example in the form of t-butoxycarbonyl derivative), formation of a benzyl ester by O-alkylation of the carboxylate and phosphorylation of the OH function in order to introduce a protected phosphate group.
  • N-protection reactions for example in the form of t-butoxycarbonyl derivative
  • Typical protecting groups for phosphates can be phenyl, benzyl or o-xylyl. Phenyl is the currently preferred group.
  • the amine function is then released by elimination of the protective group (for example by treatment of the t-butoxycarbonyl derivative with trifluoroacetic acid), then acylated with an activated derivative of a fatty acid, preferably a derivative of 3- hydroxytetradecanoic such as 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid.
  • the activated form can be an acyl chloride, an activated ester, a mixed anhydride or any other chemical form allowing the formation of the amide bond.
  • the benzyl ester optionally present is then removed by selective hydrogenolysis to give a carboxylic acid carrying an acylamido group in the ⁇ position and a (RO) 2 P (0) 0- group in the ⁇ position.
  • the partner of the peptide coupling reaction is preferably obtained from an ⁇ , ⁇ -diamino acid such as ornithine or lysine by a sequence of reactions for selective protection of the amine function in position ⁇ , for example under the form of benzyloxycarbonyl derivative, via a copper complex according to a method described in Organic Preparations [Organic Preparations and Procedures International (1992), 23, 191-194], elimination of the copper complex and protection of the amine function in the ⁇ position, for example in the form of a t-butoxycarbonyl derivative.
  • Other protecting groups can be used.
  • the free carboxylic function is reduced to primary alcohol by using for example the borane dimethyl sulfide complex or by the treatment of a mixed anhydride preformed with sodium borohydride, according to the method described in [Tetrahedron Letters (1991), 32, 923 -92].
  • the amine function in the ⁇ position is released in an acid medium (for example by treatment with trifluoroacetic acid), then N-acylated with an activated derivative of a fatty acid, preferably a derivative of 3-hydroxytetradecanoic acid such as acid 3- benzyloxytetradecanoic. If necessary, the free OH function is protected at this stage, for example in the form of benzyloxymethyl ether.
  • the ⁇ -amino function is released by treatment with a reagent inert with respect to the other protective groups present, such as for example by selective hydrogenolysis in a hydroxylic solvent containing triethylamine if the protective group is a benzyloxycarbonyl.
  • the amine thus obtained is coupled with the ⁇ -acylamine ⁇ -phosphorylated carboxylic acid prepared as described above in the presence of IIDQ or another peptide coupling reagent, to give a phosphorylated pseudodipeptide protected.
  • This product is O-acylated on the hydroxyl function which has remained free with a ⁇ -functionalized acid such as 6-heptenoic acid in the presence of EDCI or another esterifying agent. ( Figure 5).
  • the alkenyl function of this ester is subjected to a dihydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide in catalytic or stoichiometric quantity, then the groups protecting the phosphate and the hydroxyl function optionally present in the form of benzyl ether, are eliminated by hydrogenolysis in the presence of an appropriate catalyst (Ex. 2.1).
  • the vicinal diol is subjected to oxidation such as for example by periodic acid to give rise to a reactive aldehyde function (Ex. 2.2).
  • the reduction of the aldehyde function to primary alcohol leads to the derivative carrying a ⁇ -hydroxyacyl group (Ex. 2.9).
  • the peptide coupling product is O-acylated by a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid, such as 6-benzyloxycarbonylaminohexanoic acid ( Figure 11).
  • a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid such as 6-benzyloxycarbonylaminohexanoic acid
  • the product thus obtained is subjected to a complete deprotection reaction by hydrogenolysis in the presence of a catalyst, which provides a pseudodipeptide carrying an aminoalkanoyl auxiliary arm (Ex. 2.6).
  • the acid partner of the peptide coupling reaction is derived from D or L-aspartic acid or, where appropriate, from D or L-glutamic acid ( Figure 2).
  • the aspartic acid derivative is obtained by N-acylation of the amine function of the ⁇ -benzyl ester of this amino acid with a fatty acid, preferably a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an acylating agent .
  • This product is coupled with an amino alcohol of the type described above, then the pseudodipeptide thus obtained is subjected to a hydrogenolysis reaction in the presence of a catalyst such as palladium on carbon or platinum on a support, to produce the pseudodipeptide carrying an acid function.
  • a catalyst such as palladium on carbon or platinum on a support
  • carboxylic Ex. 1.2
  • a phosphorylation reaction for example by the phosphoramidite method
  • a hydrogenolysis reaction to give the pseudodipeptide carrying a carboxylic function and a phosphoric function (Ex. 1.3).
  • the hydroxyl function of the pseudodipeptide obtained previously is acylated with a ⁇ -functionalized acid.
  • the ⁇ -functionalized acid is a ⁇ -alkenoic acid or a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the O-heptenoyl derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection (Ex 2.3) and periodic oxidation ( Ex.
  • the intermediate pseudodipeptide described in FIG. 2 is subjected to a reaction for protecting the free hydroxyl function, preferably in the form of a tetrahydropyranyl ether, then the carboxyl function present in the form of the ester is deprotected by hydrogenolysis or by another deprotection method, then reduced, preferably after activation in the form of mixed anhydride, with a reducing agent such as sodium borohydride; the hydroxyl function thus formed is subjected to a phosphorylation reaction, preferably by the phosphoramidite method, then the ether of.
  • a reaction for protecting the free hydroxyl function preferably in the form of a tetrahydropyranyl ether
  • the carboxyl function present in the form of the ester is deprotected by hydrogenolysis or by another deprotection method, then reduced, preferably after activation in the form of mixed anhydride, with a reducing agent such as sodium borohydride
  • the hydroxyl function thus formed is
  • tetrahydropyranyl is hydrolyzed in an acid medium and the hydroxyl function thus regenerated subjected to an acylation reaction with a ⁇ - functionalized carboxylic acid.
  • the ⁇ -functionalized acid is a ⁇ -alkenoic acid or a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the protected O-aminoacylated derivative which is then subjected to a hydrogenolysis reaction (Ex. 2.7, Ex 2.8).
  • the monophosphorylated intermediate of the preceding paragraph can be obtained ( Figure 15) by peptide coupling of an N-acylated derivative of the ⁇ -benzyl ester of aspartic acid ( Figure 2) with a protected form, for example in the form benzyloxymethyl ether, tetrahydropyranyl, or silyl of the amino alcohol derived from ornithine (FIG. 1), followed by the release of the acid function present in the form of benzyl ester, of its reduction into primary alcohol, phosphorylation of this function and deprotection of the protected alcohol function in the form of benzyloxymethyl ether, tetrahydropyranyl, or silyl.
  • a protected form for example in the form benzyloxymethyl ether, tetrahydropyranyl, or silyl of the amino alcohol derived from ornithine (FIG. 1)
  • the intermediate pseudodipeptide described in FIG. 2 is subjected to an O-acylation reaction (FIG. 27) with a derivative of a dicarboxylic acid, preferably succinic anhydride, in the presence of a base or of 'a coupling agent, then the new ester thus formed is subjected to a deprotection reaction by hydrogenolysis (Ex. 2.19).
  • a deprotection reaction by hydrogenolysis Example. 2.19
  • Treatment of deprotected O-aminoacyl derivatives with succinic anhydride gives pseudodipeptides carrying a succinylaminoacyl group (Ex. 2.17).
  • the amino alcohol obtained from ornithine or lysine as described above is alkylated with an ⁇ -alkenyl triflate, such as hept-6-enyl triflate ( Figure 17) .
  • an ⁇ -alkenyl triflate such as hept-6-enyl triflate
  • the alkenyl group is then subjected to a dihydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide, then the protective groups are removed by hydrogenolysis in the presence of suitable catalysts, and the vicinal diol function is oxidized by sodium periodate to produce an aldehyde function reactive (Ex. 2.10).
  • the N-protected derivative of serine for example the p-methoxybenzyloxycarbonyl derivative prepared according to a method described in Synthesis (1989), 36-37, is O-alkylated with benzyl bromoacetate .
  • the protecting group for the amine function is removed, for example by treatment with trifluoroacetic acid in dichloromethane, and the amine function is N-acylated, preferably with a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as the acid. 3- dodecanoyloxytetradecanoic, in the presence of an acylating agent or using acid chloride or any other activated form of fatty acid.
  • the O-alkylated N-acylated derivative of the serine thus obtained is coupled with the amino alcohol described above (FIG.
  • the free OH function is acylated with a ⁇ -functionalized alkanoic acid in the presence of an activating reagent such as a carbodiimide.
  • this functionalized acid is a ⁇ -alkenoic acid or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the O- ( ⁇ -heptenoyl) derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection by hydrogenolysis and oxidation periodic (Ex. 2.11)
  • the starting amino acid is cysteine or homocysteine ( Figure 20).
  • cysteine is S-alkylated with p-methoxybenzyl bromoacetate, then N-acylated, preferably with a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as 3-tetradecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an agent acylation or using an acid halide or other activated form of the fatty acid.
  • the S-alkylated and N-acylated derivative of cysteine thus obtained is coupled with 5-amino-2 - [(R) -3-hydroxytétradécanoylamino] pentan-1-ol in the presence of IIDQ or a peptide coupling agent .
  • the primary OH free function is then O-acylated with a ⁇ -functionalized alkanoic acid, used in the form of an activated ester such as an O-benzotriazolyl ester.
  • this acid is a ⁇ -aminoalkanoic acid such as 7- (p-methoxybenzyloxycarbonylamino) heptanoic acid.
  • the product thus obtained is subjected to a complete deprotection reaction in aqueous acid medium, which provides a pseudodipeptide carrying an auxiliary 7-aminoheptanoyl arm (Ex. 2.12).
  • aqueous acid medium which provides a pseudodipeptide carrying an auxiliary 7-aminoheptanoyl arm (Ex. 2.12).
  • Figure 21 the Np-methoxybenzyloxycarbonylated derivative of serine is O-alkylated with the dibenzyl methylenemalonate in an alkaline medium.
  • the protective group of the amine is removed by treatment with an acid, then the amine function thus released is N-acylated, preferably by a derivative of a 3-acyl-hydroxylated fatty acid such as 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an acylating agent or using a functional fatty acid derivative such as acid chloride or any other activated form of the fatty acid.
  • the O-alkylated N-acylated derivative of the serine thus obtained is coupled with the amino alcohol described above ( Figure 1) in the presence of IIDQ or any other peptide coupling agent.
  • the pseudodipeptide is then O-acylated on the free OH function with a ⁇ -functionalized alkanoic acid.
  • this acid is a ⁇ -alkenoic acid or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid, for example, hept-6-enoic acid, and thus the pseudodipeptide leads to the 0- (6-heptenoyl) derivative which is subjected successively to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection by hydrogenolysis and periodic oxidation, to lead to the derivative carrying an auxiliary arm 6-oxohexanoyl and a malonyl group (Ex. 2.13).
  • the 6-aminohexanoyl derivative described above (FIG. 11) is N-acylated with a bromoacetamido group by using for example the ester O-succinimidyl of bromoacetic acid as agent. acylation.
  • This reaction provides a derivative carrying an auxiliary arm 6- (bromoacetamido) hexanoyl (Ex. 2.14).
  • the benzyl ester of O-phosphorylated homoserine (see Figure 1) is N-acylated with 3-benzyloxytetradecanoic acid, preferably using the mixed anhydride prepared from 3-benzyloxytetradecanoic acid and isobutyl chloroformate. The benzyl ester is then selectively hydrogenolized as described above.
  • the ⁇ -N- benzyloxycarbonyl derivative of the diamino alcohol derived from ornithine is N ⁇ - acylated with 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of a coupling agent or by using an activated ester or another activated form of the fatty acid, and the ⁇ -amino function is released by selective hydrogenolysis.
  • This amine is coupled with the N- (3-benzyloxytetradecanoyl) O- (diphenyl-oxyphosphoryl) derivative of homoserine in the presence of IIDQ or another peptide coupling agent.
  • the pseudodipeptide thus obtained is O-acylated with a ⁇ -functionalized alkanoic acid, for example in the presence of a carbodiimide.
  • this acid is an acid ⁇ -alkenoic or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the derivative 0- (6-heptenoyl) which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection by hydrogenolysis in the presence of catalysts suitable and periodic oxidation, to lead to the derivative carrying a 6-oxohexanoyl auxiliary (Ex. 2.15).
  • the intermediate pseudodipeptide described in FIG. 2 is subjected to a deprotection reaction of the carboxyl function present in the form of an ester, then this carboxyl function is coupled with a functionalized aminoalkane. , in the presence of a coupling agent.
  • the functionalized aminoalkane is a derivative of an ⁇ , ⁇ -diaminoalkane or of an amino acid.
  • the coupling product is then subjected to a hydrogenolysis reaction (Ex. 2.20).
  • the coupling product is either subjected to a deprotection reaction, to preferably by hydrogenolysis (Ex. 2.21 and 2.23), or subjected to an O-acylation reaction with a ⁇ - functionalized alkanoic acid, preferably the N-benzyloxycarbonyl derivative of 6-aminohexanoic acid.
  • the ester thus formed is then deprotected by hydrogenolysis or another deprotection method (Ex. 2 .22 and 2 .24).
  • the invention also relates to the intermediate products of general formula V, VI, IX, XIII, XVI in enantiomerically and / or stereoisomerically pure form or in the form of a mixture of stereoisomers.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions containing, as active principle, at least one compound of general formula I, in neutral or charged form, in combination or in mixture with an inert, non-toxic, pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the invention relates more particularly to pharmaceutical compositions containing, as active principle, at least one salt of a compound of general formula I, with a therapeutically compatible mineral or organic base.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions based on a compound of general formula I, in enantiomerically pure form or in the form of a mixture of stereoisomers, in combination or in mixture with a pharmaceutical excipient or vehicle.
  • the compounds according to the invention can be grafted on an antigen to modulate the immune response or be also grafted on a pharmacophore to improve its therapeutic action or its targeting and be preferably used by the injectable route in the form of conjugates in the form of aqueous solutions or suspensions, optionally neutralized with an amine or hydroxyalkylamine.
  • an antigen to modulate the immune response
  • a pharmacophore to improve its therapeutic action or its targeting
  • the injectable route in the form of conjugates in the form of aqueous solutions or suspensions optionally neutralized with an amine or hydroxyalkylamine.
  • H1 N1 antigen the nonapeptide SYVPSAEQI antigen of Plasmodium and pharmacophores such as AZT, d4T, as well as antibiotics such as macrolides and substances having an action on the CNS.
  • N-methylmorpholine (1,108 ml; 10.07 mmol; 1 eq) and isobutyl chloroformate (1.31 ml; 10.07 mmol; 1 eq).
  • the reaction mixture is stirred for 30 minutes at -15 ° C.
  • Is then added a solution of benzyl O- (diphenyloxyphosphoryl) - DL-homoserinate (5.724 g, 10.07 mmol; 1 eq) in a THF / Et 3 N mixture (30 ml / 5 ml). After stirring for 18 hours at room temperature, the solvent is evaporated in vacuo.
  • N - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoyll-D-aspartic acid, ⁇ -benzyl ester To a solution of (R) -3-dodecanoyloxytetradecanoic acid (3.35 g; 7.85 mmol) in anhydrous THF (25 ml) to - 15 ° C and under argon are successively added ⁇ / -methylmorpholine (0.86 ml; 7.85 mmol; 1 eq) and isobutyl chloroformate (1.02 ml; 7.85 mmol; 1 eq). A precipitate of N-methylmorpholine hydrochloride is rapidly observed.
  • reaction medium is then washed with water, a 1N HCl solution, a saturated NaHCO 3 solution and then the phases are separated.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and evaporated.
  • Nr (R) -3-dodecanoyloxytetradecanov ⁇ -D-aspartic acid, ⁇ -Nf (4R) -5- hvdroxy-4 - [(R) -3-hvdroxytétradecanoylaminol pentvDamide ( OM-197-MC)
  • a solution of ⁇ -benzyl ester of N - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoyl] -D- aspartic acid, ⁇ -N - ⁇ (4R) -5-hydroxy-4 - [(R) -3-benzyloxytetradecanoylamino] pentyl ⁇ amide (417 mg; 0.40 mmol) in a 1/1 MeOH / EtOAc mixture (36 ml) is hydrogenated in the presence of 10% Pd on carbon (20 mg) at room temperature and under atmospheric hydrogen pressure for 3 hours.
  • HPLC separation on a Hypersil ODS column (250 x 4.6 mm, 5 ⁇ m, Supelco) makes it possible to quantify the two derivatives originating from the L- and D- forms of aspartic acid present in the starting sample (Br ⁇ ckner et al. 1995 , J. Chromatogr. A 711, 201-215).
  • the HPLC conditions used are as follows:
  • the product can be purified by SPE on C18 support with a yield of 90%
  • N - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoylamino] -D-aspartic acid, -N - ⁇ (4R) -5- hydroxy-4 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylaminoJpentyl ⁇ amide 5-0- (6-hydroxyhexanoate) ( OM-197-MC-FV7) ( Figure 8) 2.5.1. N - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoylaminol-D-aspartic acid, ⁇ -N-
  • EDCI 200 mg, 1.04 mmol, 5.2 eq
  • DMAP 13 mg; 0.10 mmol; 0.5 eq
  • the reaction mixture is stirred for 30 minutes at 0 ° C., then 4 hours at room temperature.
  • the organic phase is separated and washed successively with H 2 0, 1 N HCl, H 2 0.
  • the organic phase is then dried over MgSO, then evaporated at 40 ° C under vacuum.
  • EtOH / EtOAc 1/1 (16 ml) containing Et 3 N (0.4 ml) is hydrogenated in the presence of 10% Pd on carbon (10 mg) at room temperature and under atmospheric pressure of hydrogen for 2 hours.
  • the catalyst is removed by filtration and the filtrate evaporated to dryness then dried with a vane pump to give the acid in the form of triethylammonium salt (250 mg).
  • reaction mixture is then stirred for 30 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature.
  • the reaction medium is then washed with water and then a 1N HCl solution and then the separate phases.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. Purification by Flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / acetone 4/1 then 2/1) allows the coupling product to be collected (537 mg; 71%).
  • a solution of the compound prepared above (500 mg, 0.35 mmol) in a CH 2 CI 2 / ethanol 5/2 mixture (70 ml) containing acetic acid (10 ml) is hydrogenated in the presence of Pd on carbon to 10% at room temperature and under atmospheric hydrogen pressure for 12 to 24 hours.
  • the catalyst is removed by filtration.
  • the solution is diluted with H 2 0 (2 ml) and THF (2 ml) then stirred for 5 minutes at room temperature.
  • the solution is concentrated, diluted with CH 2 CI 2 and H 2 0, neutralized with a 1M HCl solution and then the separated phases.
  • the organic phase is dried over MgSO, filtered and evaporated. Purification by Flash Chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / Acetone 4/1) makes it possible to collect the reduction product (387 mg; 46%) in the form of a white crystalline solid.
  • This product is subjected to a hydrolysis reaction of the benzyloxymethyl acetal in an aqueous THF-HCl medium, which provides the (3S, 9R) -3 - [(R) -3-dodecanoyl-oxytetradecanoylamino] -4-oxo-5. -aza-9 - [(R) -3-benzyloxytétradécanoylamino] -décane- 1, 10-diol 1-dibenzylphosphate.
  • the product obtained above is O-acylated in position 10 with hept-6-enoic acid in the presence of EDCI in dichloromethane at 0 ° C. in the presence of DMAP (see section 2.3.1).
  • This heptenoic ester is then subjected to a hydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide (catalytic) and of N-methylmorpholine oxide (see section 2.3.2), which provides the corresponding diol (ester 6,7- dihydroxyheptanoique).
  • This product is deprotected by hydrogenolysis in ethanol under atmospheric pressure of hydrogen in the presence of palladium carbon (see section 2.3.3). 2.9.5.
  • Triflic anhydride Tf 2 0 ((CF 3 ' S0 2 ) 2 0.11 ml; 6.76 mmol) is added dropwise at -15 ° C to a solution of hept-6-en-1-ol (515 mg ; 4.51 mmol) and Et 3 N (627 ⁇ l; 4.51 mmol) in CH 2 CI 2 (10 ml) and the mixture is stirred for 30-45 minutes at -15 ° C until the alcohol disappears. After returning to ambient temperature, the medium is diluted with CH 2 CI 2 and washed successively with H 2 0, with a saturated aqueous solution of NaHCO 3, a saturated aqueous solution of NaCl.
  • the medium is cooled to 0 ° C. and then EDCI (71 mg; 1.2 eq) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) (41 mg; 1 eq) are added.
  • the reaction mixture is stirred for 2 hours at 0 ° C. and then 90 hours at room temperature.
  • the solution is then washed with H 2 0 and the organic phase is dried over MgSO 4 and then evaporated under vacuum at 40 ° C. Purification by flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / MeOH 15/1) makes it possible to collect the O-acylation product (126 mg; 32%).
  • D-serine is protected in the form of an N- derivative (p-methoxybenzyloxycarbonyl) [Ref: Chen and Wang, Synthesis (1989), 36-37], then the OH function alkylated with benzyl bromoacetate in the presence of NaH (2 equiv.).
  • the amine function is released by treatment with trifluoroacetic acid in dichloromethane, then acylated with (R) -3-dodecanoyloxytetradecanoic acid chloride in the presence of triethylamine.
  • the double bond of the auxiliary ester is hydroxylated with osmium tetroxide (catalytic, in the presence of N-methylmorpholine N-oxide), then the diol deprotected by hydrogenolysis in the presence of palladium on carbon in ethanol.
  • the product OM-112-FV-7 is obtained by treatment with sodium periodate in an isopropanol-water mixture. C 65 H ⁇ 03 N 3 O ⁇ 2 . MM: 1010.45.
  • D-cysteine is S-alkylated with p-methoxybenzyl bromoacetate in the presence of sodium carbonate in THF-water medium.
  • the S-benzyloxycarbonylmethyl cysteine thus obtained is N-acylated with (R) -3-tetradecanoyloxy-tetradecanoic acid chloride, then the S-alkylated N-acylated derivative of D-cysteine is coupled with the amine (2R ) -5-amino-2 - [(R) -3-hydroxytétradécanoylamino] pentan-1-ol ⁇ obtained by hydrogenolysis of (2R) -5-amino-2 - [(R) -3-benzyloxytétradécanoylamino] pentan-1 - ol, see 4.1.1 ⁇ in the presence of IIDQ.
  • the product thus obtained is O-acylated selectively in the primary position with the ester derived from HOBt and from 7- (p-methoxybenzyloxy-carbonylamino) heptanoic acid.
  • the two p-methoxybenzyl groups are then removed by treatment of the ester with aqueous trifluoroacetic acid.
  • the amine function is released by treatment with trifluoroacetic acid in dichloromethane, then acylated with chloride of (R) -3-dodeca-noyloxytetradecanoic acid in the presence of triethylamine.
  • the serine derivative thus obtained is coupled with the amine (2R) -5- amino-2 - [(R) -3-benzyloxytétradécanoylamino] pentan-1-ol (see 4.1.1) in the presence of IIDQ to give the (2R, 8R) -2 - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoylamino] -3-oxo-4- aza-8 - [(R) -3-benzyloxytetradecanoylamino] nonane-1, 9-diol 1 -0- [2 , 2-bis- (benzyloxycarbonyl) ethyl] ether.
  • This product is O-acylated with hept-6-enoic acid in the presence of EDCI, then the heptenoyl ester subjected to hydroxylation with osmium tetroxide.
  • the benzyl groups are removed by hydrogenolysis in the presence of palladium on carbon in ethanol.
  • the product OM-312-FV-7 is obtained by treatment of the debenzylated product with sodium periodate in an isopropanol-water mixture.
  • the amide thus formed is O-acylated on the free OH function with 6-heptenoic acid in the presence of EDCI to give the corresponding ester.
  • the double bond of the auxiliary ester is subjected to a hydroxylation reaction with osmium tetroxide; the benzyl group is then removed by hydrogenolysis on palladium carbon and the phosphate released by hydrogenolysis on platinum black.
  • the diol function is subjected to a periodic oxidation reaction to generate the 6-oxohexanoyl derivative OM-512-FV7. C 55 H 1 o 4 N 3 0 13 P. MM: 1046.42.
  • reaction mixture is then stirred for 30 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature.
  • the reaction medium is then washed with water and then a 1N HCl solution and then the separate phases.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and evaporated.
  • Purification by Flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / acetone 8/1 then 6/1) makes it possible to collect the coupling product (313 mg; 88%) in the form of a white solid.
  • the catalyst is removed by filtration and the filtrate evaporated to dryness and then dried with a vane pump.
  • the residue is then dissolved in a / -PrOH / CH 2 CI 2 1/1 mixture (100 ml) and stirred for 10 minutes at room temperature with an Amberlite IR-120 (H + ) resin (5 ml).
  • the resin is removed by filtration and the filtrate evaporated to dryness to give the free acid (2.25 g; 97%) in the form of a white crystalline solid.
  • Rf 0.45 in CH 2 CI 2 / MeOH 9/1 containing 1% acetic acid; UV and phosphomolybdic developer).
  • Mp 115-117 ° C.
  • reaction mixture is stirred for 15 minutes at room temperature and then a solution of the paratoluenesulfonate salt of commercial L-aspartic acid dibenzyl ester (141 mg, 0.29 mmol) in anhydrous CH 2 CI 2 (5 ml) containing triethylamine (40 ⁇ l, 0.29 mmol) is added. After 18 hours of stirring, the solution is evaporated to dryness. Purification by Flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / MeOH 20/1) allows the coupling product to be collected (260 mg; 78%).
  • reaction mixture is then stirred for 30 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature.
  • the reaction medium is then washed with water and then a 1N HCl solution; the phases are then separated.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. Purification by Flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / acetone 6/1) allows the coupling product to be collected (83 mg; 44%).
  • the benzyl 2-decanoyloxyoctanoate obtained above (515 mg; 1.27 mmol) in EtOH of HPLC quality (40 ml) is hydrogenated in the presence of Pd on carbon at 10%) (100 mg) at room temperature and under atmospheric hydrogen pressure for 2 hours.
  • the catalyst is removed by filtration on a millipore membrane. The filtrate is evaporated to dryness then the residue is dried with a vane pump to obtain 2-decanoyloxyoctanoic acid (quantitative yield).
  • N- (2-decanoyloxyoctanoyl) -D-aspartic acid, ⁇ -benzyl ester To a solution of 2-decanoyloxyoctanoic acid (317 mg; 1.01 mmol) in anhydrous THF (2 ml) at -15 ° C and under argon are successively added N-methylmorpholine (111 ⁇ l; 1.01 mmol; 1 eq) and isobutyl chloroformate (131 ⁇ l; 1.01 mmol; 1 eq). A precipitate of N-methylmorpholine hydrochloride is rapidly observed.
  • the synthetic products and acylated pseudodipeptides carrying a functionalized auxiliary arm are dissolved in a water - isopropanol mixture (1: 1 v / v).
  • the required amount of 2M ammonium bicarbonate is then added to reach a concentration of 50 mM.
  • Mobile phase A: isopropanol - water (9: 1, v / v), 50mM ammonium bicarbonate
  • B isopropanol - water (2: 8, v / v), 50mM ammonium bicarbonate
  • the fractions containing the compounds of interest in the form of ammonium salt are combined and concentrated by adsorption on phase C18 Bondapack, 15-20 ⁇ m, 300 A, Waters.
  • the counter ion can then be exchanged by washing with an aqueous solution of an alkali metal salt (such as NaCI or KCI, for example) at 10 g / L in water - isopropanol (9: 1, v / v). After removing the excess salt by passing 5 volumes of a water-isopropanol mixture (9: 1, v / v) over the column, the compound is eluted with pure isopropanol.
  • an alkali metal salt such as NaCI or KCI, for example
  • TBAP tetrabutylammonium phosphate
  • ES / MS spectra (positive and negative modes) were measured on mass spectrometers of different types (Finnigan LCQ, ion trap; Micromass Quattro II, triple stage quadrupole; Micromass Z-Bio-Q, triple stage quadrupole). Additional MS / MS type analyzes were also carried out.
  • the coupling reaction by reductive amination is carried out in aqueous solution while respecting an equal stoichiometry between the aldehyde functions (auxiliary arm of the acylated pseudodipeptide) and the amino functions available on the peptide or protein to be coupled.
  • the conjugate is purified first on a Vydac C 4 column to remove the unreacted peptide, then on phase Bondapack C18 (Waters) to obtain the sodium salt (see paragraph: purification and analysis of the compounds according to the invention).
  • the conjugate is then resolubilized in sterile H 2 0 0.01% triethanolamine (TEoA) to satisfy the conditions for biological activity tests.
  • TEoA triethanolamine
  • the visible ions between m / z 400 and 900 were identified by MS / MS analyzes as being fragments originating from the molecular peak of the conjugated peptide.
  • the ions corresponding to the initial FGFG peptide (m / z 427 A [M + H] + , m / z 853.0 [2M + H] + , Figure 42) were not detected.
  • the peptide (NANP) 6p 2 P 3 o has four possible conjugation sites (terminal amine + three lysines). 5 mg of purified OM-197-FV7 (4.64 ⁇ mol, 4 eq) were added to a solution of 7.49 mg of (NANP) 6 P2P 3 o (1 16 ⁇ mol, 1 eq) dissolved in 1 ml H2O-isopropanol ( 1: 1) The solution is stirred for 30 minutes at room temperature, then the reduction step is carried out by adding 230 ⁇ l of 1 M NaBH3CN (14.43 mg, 50 eq). ) The solution is stirred for two hours at room temperature.
  • reaction mixture is then dialyzed against H 2 0 for 24 hours (3.5Kd dialysis cassette, Slide-A-Lyzer, Pierce).
  • LC / ES-MS analysis of the reaction mixture shows the presence of three types of molecules, as shown by the chromatograms presented in Figure 44: the peaks corresponding to the free peptide (pic A), to the monoconjugate peptide (pic B) and to the biconjugate peptide (peak C) are clearly visible.
  • the ionic envelopes recorded for each they are presented in Figures 45, 46 and 47 and attest to a covalent conjugation to one or two molecules of OM-197-FV for the monoconjugate and the biconjugate, respectively.
  • peptides can also be coupled by reductive amination to the compounds carrying an aldehyde-type auxiliary arm.
  • OM-197-FV7 to the peptide P 2 P 3 o-
  • the latter corresponds to the T epitope part of the toxin tenanus toxoid and has the following sequence:
  • the peptide P 2 P 3 o has five possible conjugation sites (terminal amine + four lysines) and a mass of 4200 uma. Five equivalents of OM-197-FV7 were therefore engaged. The reaction conditions described above were applied. After dialysis against H 2 0 (3.5Kd dialysis cassette, Slide-A-Lyzer, Pierce), the mass spectra of the conjugates obtained were measured by LC / ES-MS and compared with those recorded for the free peptide P 2 P3o which has multiply charged ions m / z 840.9 (A5), 1050.9 (A4) and 1401.0 (A3) which constitute the ionic envelope (Figure 48) of a peptide with a molecular mass of 4200 uma.
  • NANPNANPNANPDIE KIAKMEKASSVFNWNS
  • the compound OM-197-MC-FV6, obtained by the synthetic scheme presented in Figure 8, can be coupled, for example, to a peptide of pharmaceutical interest such than PyCS 245-253.
  • This peptide corresponding to the T epitope part of Plasmodium yoelii [Franke, ED et al., 1997, J. Immunol. 159, 3424-3433], presents the following sequence:
  • the MR99B peptide Due to its lysine-free sequence, the MR99B peptide has a unique site of conjugation by reductive amination (on the terminal amine).
  • 2 mg of purified OM-197-MC-FV6 (2.04 ⁇ mol, 1.4 eq.) are added to a solution of 2 mg of MR99B (1.47 ⁇ mol, 1 eq.) Dissolved in 1 ml H 2 O-isopropanol ( 1: 1)
  • the solution is stirred for 30 minutes at room temperature, then the reduction step is carried out by adding 29.4 ⁇ l of 1M NaBH 3 CN (29.4 ⁇ mol, 20 eq.).
  • the solution is stirred for two hours at room temperature.
  • a trypsin digestion of the conjugate OM-197-MC-FV-MR99B is carried out.
  • 0.5 mg of conjugate are incubated for 24 hours at 25 ° C with 83 ⁇ g of trypsin (Roche, # 109819) (substrate-enzyme ratio (6: 1)) in 1 ml of 50mM Tris HCI buffer, 2 mM CaCI 2 , pH 8 .
  • the LC / ES-MS analysis after the reaction is presented in Figure 54 and makes it possible to highlight two fragments whose ES-MS spectra are presented in Figures 55 and 56.
  • the first fragment exhibits ions at m / z 993.5 ( [M + H] + ) and 1015.6 ([M + Na) and corresponds to the peptide CSPy 245-253 ( Figure 55).
  • the second fragment presents ions at m / z 678.1 ([M + H] +2 ) and 1355.0 ([M + H] + ), indicating the presence of a structure of type OM-197-MC-FV-SER ( Figure 56).
  • a third peak is also observed. It corresponds to the two fragments SYVPS and AEQI (coeluents under these chromatographic conditions). This reaction is also observed during the digestion of MR99B alone.
  • KGG type sequences can be grafted to the peptide to conjugate.
  • a KGGKGGK sequence can, for example, be grafted to the peptide MR99B, to give the following peptide MR99A:
  • a trypsin digestion is carried out on the polyconjugates (OM-197-MC-FV) n -MR99A in order to determine whether the antigenic part (CSPy 245-253 ) is not affected by the conjugation.
  • 1 mg of polyconjugate is incubated for 24 hours at 25 ° C with 166 ⁇ g of trypsin (Roche, # 109819) (substrate-enzyme ratio (6: 1)) in 1 ml of 50mM Tris HCI buffer, 2 mM CaCI 2 , pH 8 .
  • auxiliary arm of the formylevaleryl type can be conjugated to numerous peptides of pharmaceutical interest.
  • grafting by reductive amination of OM-197-MC-FV molecules on the terminal amine of synthetic peptides whose sequences derive from that of an antigenic protein of Mycobacterium tuberculosis The initial peptides are as follows:
  • the reductive amination technique can also be applied for the synthesis of dimer of OM-197 type structures.
  • a dimer can be formed with two compounds carrying a functionalized auxiliary arm such as OM-197-MC-FV and OM-197-MC-AC.
  • OM-197-MC-FV6 1 mg
  • 1 mg of purified OM-197-MC-FV6 1 mg
  • 1 mg of OM-197-MC-AC 0.98 ⁇ mol, 1 eq.
  • the solution is stirred for 1 hour at room temperature, then the reduction step is carried out by adding 19.6 ⁇ l of 1 M NaBH 3 CN (19.6 ⁇ mol, 20 eq.).
  • the solution is stirred for 12 hours at room temperature.
  • one of the carboxylic groups can be replaced, for example, by a phosphorylated group by carrying out this synthesis from a compound of type OM-197-MP-AC or OM-197-MP-FV
  • a reductive amination reaction similar to that described above between two compounds carrying a functionalized auxiliary arm OM-197-MP-FV and OM-197-MC-AC
  • a dimer OM-197-MP-FV-OM-197-MC-AC could be obtained.
  • the ES / MS spectrum presented in Figure 64 attests to the molecular weight expected for this compound (2011.9 uma).
  • Compounds carrying an amino-type auxiliary arm can also be conjugated to peptide antigens by a reductive amination reaction. It is indeed possible to exploit, for example, the presence of a terminal serine in the sequence of the peptides to be conjugated. Firstly, periodic oxidation is carried out on the peptide, leading to the formation of a very reactive glyoxylyl group (-CO-CHO). The latter can then react by reductive amination with a primary amine present on the functionalized auxiliary arm of the OM-197 type compounds.
  • the synthetic peptide MR99B can for example be conjugated to the compound OM-197-MC-AC, as shown in the synthetic diagram in Figure 65.
  • 147 ⁇ l of 0.1 M Nal0 4 (14.6 ⁇ mol, 20 eq.) are added to a solution 1 mg of peptide MR99B (0.73 ⁇ mol, 1 eq.) dissolved in 1 ml of water.
  • the solution is stirred for two hours at room temperature.
  • the aldehyde thus obtained is purified on phase C18 and collected in 1 ml isopropanol-water (1: 1).
  • LC / ES-MS analysis of the reaction mixture makes it possible to demonstrate the formation of an OM-197-MC-AC-MR99B conjugate of expected molecular mass (2299.1 uma, Figure 65), as shown by the spectra presented in Figures 66 (ionic envelope) and 67 (transformed spectrum).
  • Other compounds carrying an amino-type auxiliary arm can be similarly conjugated. Examples include OM-197-MC-AP, OM-197-MP-AC, OM-212-AH1, OM-197-MC-Gly, OM-197-MC-Lys, OM-197-Lys-AC or OM-197-Asp-AC.
  • Proteins such as ovalbumin for example, lend themselves particularly well to coupling by reductive amination.
  • the numerous lysines present in the sequence (20 lysines for ovalbumin) are all possible congestion sites for pseupeptidolipids carrying an auxiliary arm functionalized with an aldehyde group.
  • acylated pseudodipeptide / protein ratio By varying the stoichiometry of the reductive amination reaction (acylated pseudodipeptide / protein ratio), different degrees of conjugation can be obtained.
  • the hemagglutinin protein H1 N1 is also an example of choice to illustrate the coupling between molecules of type OM-197 and a protein type antigen.
  • the OM-197-FV-H1 N1 conjugate was analyzed by SDS-PAGE under the conditions used for the OM-197-FV-ovalbumin conjugate (4-20% polyacrylamide gradient).
  • the electrophoretic profiles obtained for the initial protein (line 6) and the conjugate before and after dialysis (lines 8 and 7, respectively) are presented in Figure 68 (C).
  • the H1 N1 protein appears in the form of three bands, two of which correspond to the HA1 and HA2 subunits described in the literature (Swiss-Prot, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva).
  • a mass difference is observed for each of the bands, thus demonstrating the coupling of OM-197-FV molecules on the H1 N1 protein.
  • the reaction mixture is then stirred for 15 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature before being evaporated under reduced pressure.
  • the crude product is then taken up with dichloromethane (15 ml) and water (5 ml).
  • the organic phase is separated.
  • the aqueous phase is acidified with a 10% aqueous citric acid solution and then extracted with dichloromethane (2 x).
  • the organic phases are then combined, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated. Purification by chromatography on silica gel with the following eluent (CH 2 CI 2 / MeOH: 9/1 then 7/1) makes it possible to collect the compound conjugated with AZT (123 mg; 57%) in the form of a solid white.
  • the reaction mixture is then stirred for 15 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature before being evaporated under reduced pressure.
  • the crude product is then taken up with dichloromethane (15 ml) and water (5 ml).
  • the organic phase is separated.
  • the aqueous phase is acidified with a 10% aqueous citric acid solution and then extracted with dichloromethane (2 x).
  • the organic phases are then combined, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated. Purification by chromatography on silica gel with the following eluent: (CH 2 CI 2 / MeOH: 9/1 then 7/1) allows the conjugated compound to be collected with d4T (107 mg; 45%) as a white solid.
  • Endotoxicity test Endotoxicity was determined by the Limulus Amoebocyte Kinetic Chromogenic Lysate test (Charles River ' Endosafe product R1708K lot EK2251 E). This LAL test was used to demonstrate the low endotoxicity of the compounds of the invention.
  • the biological principle of this test is based on the initiation by bacterial endotoxins of a proenzyme present in the lysate of Limulus amoebocytes (LAL) which activates a cascade of serine proteases.
  • LAL Limulus amoebocytes
  • a colorless substrate S-2834 peptide coupled to p-nitroaniline
  • pNA p-nitroaniline
  • the chromogenic kinetic test is based on the fact that the amount of endotoxin is inversely proportional to the time necessary to reach an optical density
  • the products are tested from dilution (5 x, 10 x, 50 x, 100 x, 500 x or 1000 x) of the product solution at 0.1 mg / ml.
  • the LAL result corresponds to the first dilution which is no longer inhibitory for the recovery of an LPS overload.
  • the H1 N1 series products all have equivalent LAL activities.
  • the LAL results are very variable and differences between the groups of 3 to 4 x are not significant. Coupling has no effect on LAL activity.
  • the maximum LAL activity is 0.008 ng LPS equivalent per injection (5 ⁇ g / injection).
  • the 6 P 2 P 3 o (NANP) series products all have equivalent LAL activities.
  • the LAL results are very variable and differences between the groups of 3 to 4 x are not significant. Coupling has no effect on LAL activity.
  • the maximum LAL activity is 0.03 ng LPS equivalent per injection (20 ⁇ g / injection).
  • mice 6 week old male C57 / BL6 mice are sacrificed by inhalation of CO 2 .
  • the bones of the hind limbs, the hip, the tibia and the femur are removed.
  • the marrow is extracted from the bone lumen by injection of Eagle medium modified by Dulbecco (DH medium) through the ends which have been previously cut.
  • the stem cells are washed and resuspended in DH medium supplemented with 20% fetal calf serum (SVF). The cell concentration is adjusted to 500,000 cells / ml.
  • DH medium Eagle medium modified by Dulbecco
  • SVF fetal calf serum
  • the products in solution in the DH medium supplemented with 20% FCS, amino acids and antibiotics, are diluted in series directly in the microplate. Products are tested in triplicate and each microplate comprises a negative control composed of medium alone. The final volume in each well is 100 ⁇ l. 100 ⁇ l of cell suspension are added to the product dilutions and the cells are incubated for 7 days in an oven at 37 ° C., under 8% C0 2 , saturated with humidity. Proliferation is determined by measuring the oxidation of an XTT chromogenic substrate (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-caboxanilide) in the mitochondria of cells alive.
  • an XTT chromogenic substrate (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-caboxanilide
  • XTT substrate solution (1 mg / ml of XTT + phenazine methosulfate at 0.008 mg / ml) are added to each well.
  • the microplates are read with a spectrophotometer at 492 nm against a reference at 690 nm.
  • results are expressed as an average + standard deviation in the form of a dose-response curve.
  • values of the negative control composed of DH medium (mean ⁇ standard deviation) are also indicated in graphical form.
  • Max maximum amplitude of the curve and its corresponding concentration
  • EC50 concentration corresponding to 50% of the maximum amplitude
  • Min first concentration inducing a significant proliferation corresponding to the white + 3 x standard deviation
  • concentrations corresponding to I ⁇ C50 and to the min are determined from the line segments connecting the different points of the curve.
  • Figure 70 presents the activity of different acylated pseudodipeptides and shows the influence of the functionalized auxiliary arm on the capacity to induce the proliferation of stem cells mouse marrow.
  • acylated pseudodipeptides are capable of inducing a proliferation greater than that induced by the positive control, composed of LPS from E. coli.
  • the minimum concentration of product capable of inducing significant proliferation is greater than that of the positive control.
  • This minimum concentration of product is strongly influenced by the functionality of the auxiliary arm.
  • Figure 71 shows the activity of acylated pseudodipeptides coupled to a drug. This activity demonstrates that, despite the coupling, the compounds retain part of their activity. It was not possible to distinguish between an intrinsic activity or an activity resulting from the coupling of the ester bond by intracellular esterases. The antiviral activity of these products would tend to demonstrate that at least part of the ester bonds have been cleaved. Whatever the mechanism, the conservation of a biological activity demonstrates all the interest of this association -> antiviral activity + activity of the product.
  • the stem cells After 8 days the stem cells have differentiated into mature macrophages.
  • the macrophages are detached by cold passage, washed and resuspended in DH medium supplemented with 5% fetal calf serum (SFV), amino acids and antibiotics.
  • the cell concentration is adjusted to 700,000 cells per ml.
  • the products in solution in the DH medium supplemented with 5% of FCS, amino acids and antibiotics, are diluted in series directly in the microplate.
  • the products are tested in triplicate and each microplate comprises a negative control composed of medium alone.
  • the final volume in each well is 100 ⁇ l.
  • 100 ⁇ l of cell suspension are added to the product dilutions and the cells are incubated for 22 hours in an oven at 37 ° C., under 8% C0 2 , saturated with humidity. At the end of the incubation with the products, 100 ⁇ l of supernatant are removed and the nitrite concentration is determined by the Griess reaction.
  • Min first concentration inducing a significant proliferation corresponding to the blank + 3 * standard deviation
  • concentrations corresponding to I ⁇ C50 and to the min are determined from the line segments connecting the different points of the curve.
  • FIG. 72 presents the activity of different acylated pseudodipeptides and shows the influence of the functionalized auxiliary arm on the capacity to induce proliferation of mouse marrow stem cells.
  • OM-197-MP-AC R / S.R
  • the minimum concentration of product capable of inducing significant proliferation is nevertheless much greater than that of the positive control.
  • the production of NO by murine macrophages stimulated by acylated pseudodipeptides is strongly influenced by the functionality of the auxiliary arm.
  • Figure 73 shows the activity of acylated pseudodipeptides coupled to a drug. This activity demonstrates that, despite the coupling, the compounds retain part of their activity. It was not possible to distinguish between an intrinsic activity or an activity resulting from the coupling of the ester bond by intracellular esterases. The antiviral activity of these products would tend to demonstrate that at least part of the ester bonds have been cleaved. Whatever the mechanism, the conservation of a biological activity demonstrates all the interest of this association -> antiviral activity + activity of the product.
  • acylated pseudodipeptides of the invention except the compounds with shortened chains (marginal production for OM-197-N '(C10-2OC8) -MC-AC) are capable of inducing significant production of nitric oxide by murine macrophages.
  • the capacity of the products of the invention to induce the maturation of pre-dendritic cells into dendritic cells was evaluated. The following parameters were measured: the incorporation of Dextran-FITC and the expression of the surface molecules CD83, CD86.
  • Peripheral blood mononuclear cells are isolated from "buff coats" of healthy donors.
  • the adhesively purified monocytes are resuspended in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum (SVF), GM-CSF and IL-4 at 10 ng / ml at a rate of 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the cells are distributed in petri dishes at a rate of 10 ⁇ 10 6 cells per dish and cultured for 6 days with a change of medium after 3 days. The cells thus obtained are called predendritic cells (DC-6).
  • DC-6 predendritic cells
  • the maturation of predendritic cells into mature dendritic cells is carried out by incubation with dilutions of products or LPS (positive control) for 3 additional days (see by-products).
  • DC-9 the cells are harvested, and the various parameters indicative of the maturation of the dendritic cells: the expression of the surface molecules CD83, CD86 as well as the capacity to incorporate Dextran-FITC are evaluated. All these parameters are analyzed by FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Finland).
  • the expression of surface molecules is expressed as a% of the average fluorescence of cells stimulated by LPS (positive control); the incorporation of Dextran is calculated relative to that of the cells maintained in the medium and is expressed in%>.
  • Immature dendritic cells resulting from the differentiation of monocytes, by the combined effect of GM-CSF and IL-4, are capable of incorporating Dextran-FITC.
  • cells lose the ability to incorporate Dextran-FITC.
  • the analyzes are carried out at the DC-9 differentiation stage.
  • the results ( Figure 74) are expressed as a% of the incorporation of Dextran-FITC observed in unstimulated cells incubated with the medium alone.
  • Cells treated with LPS or OM-197-MP-AC (R / S, R) retain only 15% and 22% of phagocytosis respectively, at least 1 ⁇ g / ml of OM-197- MP-AC (R / SR) to induce a maximum decrease in the incorporation of Dextran while 0.1 ⁇ g / ml of LPS induce an equivalent decrease. 10 ⁇ g / ml of OM-197-MC are necessary to induce a 22% reduction in phagocytosis.
  • OM-197-MP-AC (R / S, R) induces an increase in the expression of surface molecules from 0.1 ⁇ g / ml, whereas it takes at least 1 ⁇ g / ml for OM- 197-MC begins to increase the expression of CD83 and CD86.
  • LOM-197-FV6 has no effect on the expression of surface molecules characteristic of dendritic cells.
  • OM-197-MP-AC shows an exceptional ability to induce differentiation of DC-6 cells into DC-9 already from 0.1 ⁇ g / ml, when concentrations greater than 1 are required ⁇ g / ml so that the OM-197-MC begins to induce this differentiation, and that IOM-197-FV6 is totally devoid of this type of activity.
  • a concentration of 10 ⁇ g / ml many acylated pseudodipeptides are capable of inducing the differentiation of predendritic cells into dendritic cells.
  • the functionality carried by the auxiliary arm modulates this ability to activate predendritic cells.
  • the acylated pseudodipeptide OM-197-MC-AC-Succ-AZT coupled to a drug has a significant capacity to induce differentiation into dendritic cells.
  • the effect of the formulation of acylated pseudodipeptides is particularly important on the ability to induce the differentiation of predendritic cells into dendritic cells. Certain products exhibit very different activities depending on whether they have been dissolved in the presence or absence of 0.1% TEOA.
  • MxA production by the cells was measured after SDS-PAGE electrophoretic separation by western blotting.
  • the DC-6 dendritic cells obtained as described above were stimulated or not with IFN- (500 U / ml), LPS (1 ⁇ g / ml), TRANCE (100 ng / ml),
  • CD40L (1 ⁇ g / ml), OM-197-MP-AC (1 ⁇ g / ml) or OM-197-FV6 (1 ⁇ g / ml) for 48 h.
  • Protein extraction and analysis was carried out as follows: the cells are recovered, then washed 3 times with PBS (phosphate buffered saline) and lysed in a 100 mM Tris-HCl buffer, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA , 1% Triton-100 containing 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and 1 ⁇ g / ml pepstatin as protease inhibitors. The lysis is carried out at the rate of 10 6 cells for
  • Transfer to membrane the proteins are transferred from the SDS-PAGE gel to a nitrocellulose membrane.
  • transfer buffer 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8.3.
  • Incubation with antibodies the transfer is verified by staining the membrane with Ponceau red. Non-specific sites on the membrane are blocked with 5% skimmed milk in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) for 1 h at room temperature. The membrane is incubated in a solution of the anti-MxA monoclonal antibody (clone 143) diluted 1: 100, (v / v) in TBS-milk. The membrane is washed 3 times with TBS-0.1% Tween 20. The membrane is incubated with a second anti-mouse antibody coupled to peroxidase (HRP, Sigma) diluted 1: 1000, (v / v).
  • HRP peroxidase
  • the membrane is washed 3 times with TBS-Tween.
  • the bands containing MxA are revealed after incubation of the membrane with chemiluminescence reagents (ECL, Amersham Pharmacia).
  • HRP catalyzes a chemoluminescence reaction based on the luminol that can be detected on a film.
  • MxA over time: a significant increase in the MxA protein is induced by the products OM-197-AC5 and OM-197-FV6 after 24 hours (Fig 77) and respectively after 48 hours (Fig 78). This production of MxA is equivalent to that induced by the positive control LPS or IFN ⁇ . This production is greater than that induced respectively by the negative control, TRANCE (a cytokine of the TNF- ⁇ family which also induces the maturation of dendritic cells) or CD40L (another agent maturing dendritic cells)
  • OM-197-MP-AC and OM-197-FV6 show antiviral properties by their capacity to induce the protein MxA.
  • Peripheral blood mononuclear cells are isolated from "buffy coats" of healthy donors.
  • the cells of the "buffy coats” are resuspended and the mononuclear cells separated by centrifugation on a Ficoll-Paque gradient (Amersham Pharmacia).
  • the purified mononuclear cells are resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% SFV, antibiotics, mercaptoethanol and L-glutamine. The cell concentration is adjusted to 2 ⁇ 10 6 living cells per ml.
  • each of the acylated pseudodipeptide solutions carrying a functionalized auxiliary arm 100 ⁇ l of each of the acylated pseudodipeptide solutions carrying a functionalized auxiliary arm, diluted to 100, 10 or 1 ⁇ g / ml in RPMI 1640 medium, are deposited in the microplate.
  • the conditions are tested in triplicate, and each microplate comprises a negative control composed of medium alone.
  • the dilutions of LPS from E. coli (1 to 0.00001 ⁇ g / ml) serve as a positive control.
  • the microplate is incubated for 4 hours at room temperature. After washing, the human anti-TNF ⁇ antibody conjugated to peroxidase is added. After a 2 hour incubation and intensive washing, the chemiluminescent substrate is added and the luminescence is read after 20 minutes. The concentration of TNF- ⁇ contained in the supernatants is determined relative to a standard curve ranging from 7000 to 0.7 pg / ml.
  • results are expressed in pg / ml of TNF- ⁇ produced.
  • results presented are drawn from an experience representative of the activity of acylated pseudodipeptides.
  • the negative control composed of RPMI medium induces a production of basic TNF- ⁇ below the detection limit of 0.7 pg / ml. Production of TNF- ⁇ induced by LPS E. coli by peripheral blood mononuclear cells.
  • the positive control composed of LPS from E. coli induces a high production of TNF- ⁇ even for the lowest concentrations tested.
  • acylated pseudodipeptides induce a significant production of TNF- ⁇ , even if this production remains lower than that induced by the positive control. It also requires higher concentrations than that of LPS to induce significant production of TNF- ⁇ .
  • OM-197-MC and OM-197-MC-MP induce significant production only at the concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the amine functionality is particularly advantageous for inducing the production of TNF- ⁇ , on the one hand by increasing amplitude and by decreasing the minimum concentration of product necessary to induce a significant response.
  • the acylated pseudodipeptides with shortened chains OM197-N'C2-MC-AC and OM-197-N '(C10-2OC8) -MC-AC do not induce TNF- ⁇ production at all even at the concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • Peripheral blood mononuclear cells are isolated from "buffy coats" from healthy donors. The cells of the "buffy coats” are resuspended and the mononuclear cells separated by centrifugation on a Ficoll-Paque gradient (Amersham Pharmacia). The purified mononuclear cells are resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% SFV, antibiotics, mercaptoethanol and L-glutamine. The cell concentration is adjusted to 2 ⁇ 10 6 living cells per ml.
  • the inhibition by the products is determined by preincubation of the products with the mononuclear cells, and the addition, after 1 hour, of serial dilutions of LPS inducing the production of TNF- ⁇ .
  • the inhibitory concentration of the various acylated pseudodipeptides carrying a functionalized auxiliary arm is 10 ⁇ g / ml.
  • the LPS of E. coli is serially diluted from 1 to 0.00001 ⁇ g / ml (factor of 10 x). 50 ⁇ l of products diluted to 10 ⁇ g / ml in RPMI 1640 medium are deposited in the microplate. Each condition (product at 10 ⁇ g / ml + LPS of diluted E.
  • each microplate comprises a negative control composed of medium alone.
  • the determination of the production of TNF- ⁇ induced by LPS alone (without inhibition) is obtained by adding the dilutions of LPS of E. coli to RPMI medium. 100 ⁇ l of the cell suspension are added to each well containing the product dilutions or controls. The cells are incubated with the products for 1 hour in an oven at 37 ° C., saturated with humidity under 5% of CO 2 .
  • the concentration of TNF- ⁇ produced by mononuclear cells is determined by chemiluminescent ELISA (R&D kit QuantiGIo # QTA00).
  • the 4 x diluted supernatants are deposited in each well of the microplate in which the anti-human TNF- ⁇ antibody is linked.
  • the microplate is incubated for 4 hours at room temperature. After washing, the human anti-TNF ⁇ antibody conjugated to peroxidase is added. After a 2 hour incubation and intensive washing, the chemiluminescent substrate is added and the luminescence is read after 20 minutes.
  • the concentration of TNF- ⁇ contained in the supernatants is determined relative to a standard curve ranging from 7000 to 0.7 pg / ml.
  • the capacity of the products to induce the inhibition of the production of TNF- ⁇ by the LPS is also characterized by the maximum inhibition.
  • the concentration of LPS corresponding to this maximum inhibition is also representative of the inhibitory power of the products.
  • the results are calculated from a representative experiment containing all the products.
  • acylated pseudodipeptides carrying a functionalized auxiliary arm corresponding to general formula I of the production of TNF- ⁇ induced on human mononuclear cells by LPS The negative control composed of RPMI medium induces a production of basic TNF- ⁇ below the detection limit of 0.7 pg / ml.
  • acylated pseudodipeptides are capable of inducing an inhibition of the production of TNF- ⁇ induced by the LPS of E. coli.
  • concentration of product necessary for this inhibition depends on the functionality of the auxiliary arm and the length of the fatty acid chains. Even acylated pseudodipeptides coupled to a drug by an ester bond are capable of inducing this inhibition.
  • the PBMCs were isolated from buffy coats according to the protocol described previously in example 4.6. Briefly, after centrifugation on Ficoll and 3 washes, the PBMCs were distributed in a 6-well plate at the rate of 3 ⁇ 10 6 cells / ml in 3 ml of RPMI medium containing 10% o FCS and incubated either with the medium alone or stimulated with IFN- ⁇ (1000 U / ml), LPS (1 ⁇ g / ml), OM-197-AC5 (1 ⁇ g / ml), or OM-197-FV6 (1 ⁇ g / ml). The cells were thus incubated for 24 hours.
  • K562 cells (leukemic human cell line, ATCC #CCL 243, 20110-2209 Manassas (VA), USA) are maintained in culture in RPMI medium containing 10% FCS with 2 passages per week.
  • the PBMCs and the K562 cells are washed twice with HBSS and resuspended in RPMI medium without phenol red containing 5% FCS.
  • the PBMCs are distributed in a 96-well plate with a round bottom so as to obtain the PBMC: target ratios of 20: 1, 10: 1, 5: 1 in a volume of 50 ⁇ l.
  • 5000 K562 cells (targets) are then added per well in 50 ⁇ l of RPMI without phenol red.
  • the final volume is 100 ⁇ l.
  • the plate is centrifuged to promote contact and then incubated at 37 ° C for 4 h.
  • Cytotoxicity is determined with the non-radioactive CytoTox 96 kit based on the measurement of LDH released during cell lysis (kit # G1780, lot # 124100, Promega, Madison, Wl) according to the supplier's protocol. The percentage of cytotoxicity is calculated according to the formula below:
  • the spleen cells of a group of 4 naive CBA mice are pooled, cultured in quadriplicate in the absence or in the presence of the adjuvant OM-197-MP-AC
  • Adjuvant the OM-197-MP-AC stock solution is prepared at 0.9 mg / ml in water for injection supplemented with 0.1% triethanolamine.
  • the product OM-197-MP-AC stimulates the proliferation of spleen cells in vitro. This effect, maximum after one day of culture, increases the incorporation of thymidine by a factor of 5 at the concentration of 1 ⁇ g / ml and by 12 at the concentration of 10 ⁇ g / ml. After one day of culture, the product OM-197-MP-AC, at a concentration of 1 ⁇ g / ml, exerts a mitogenic effect as powerful as Concanavalin A at 5 ⁇ g / ml (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of the proliferative response of murine spleen cells to the adjuvant OM-197-MP-AC The values given in the table represent the arithmetic mean ⁇ the standard deviation of the measurements of incorporation of cultures in quadruplicate. Concanavalin A (5 ⁇ g / ml), used as a positive control, gives a thymidine incorporation value of 37.5 ⁇ 6.2 x 10 3 CPM after one day of culture.
  • the products are tested by serial dilution of the product in a 96-well plate.
  • the products tested In the upper part of the microplate, the products tested at different concentrations with cells and the virus (in triplicate), which makes it possible to determine the concentration of product which protects the cells from the devastating effect of the virus.
  • the concentration at which we observe a 50% reduction in the number of living cells is the IC50 of the product.
  • Quantification of living cells is done with MTT, a yellow tetrazolium compound which is reduced enzymatically (in the mitochondria of living cells) to a formazan which is purple.
  • Wells containing cells in good condition have a purple color, if the cells are dead a yellow color persists. Measuring the optical density (OD) quantifies this effect.
  • the cytotoxicity of a product is evaluated in the same way in the lower part of the plate where the test is carried out by dilution of the products incubated on the cells without virus, which makes it possible to determine the toxic effect of the products on the cells. It is reported as CC50, the concentration at which 50% of cells die from the toxic effect of the product.
  • the selectivity (selectivity index, SI) of a product is defined as CC50 / IC50. This parameter is important, a good product has a high selectivity index.
  • the compounds according to the invention conjugated with AZT or d4T show antiviral activities in this model of MT-4 cells.
  • One of the advantages of these prodrugs lies in the lipid nature of the conjugates which allows on the one hand the targeting of the compounds towards the infected cells by releasing the antiviral compounds in the virus reservoirs and on the other hand to modulate the immunological activity target cells.
  • Obtaining dendritic cells the femurs and the tibias of the mice (C57BI / 6, age 8 to 10 weeks) were emptied of their marrow.
  • the marrow suspension was passed through a 70 ⁇ m cell sieve so as to obtain a suspension unicellular.
  • the marrow cells were resuspended in Dulbecco medium modified by Iscove (IMDM) supplemented with 10% fetal calf serum (SVFi) inactivated by heat and antibiotics.
  • IMDM Dulbecco medium modified by Iscove
  • SVFi fetal calf serum
  • the cells were incubated overnight at 37 ° C., under CO 2 in a humidity-saturated oven, in 6-well microplates. The next day (day 0) the non-adherent cells were collected and washed.
  • Living cells were counted by excluding trypan blue.
  • the cell concentration was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / ml in IMDM containing 20 ng / ml of recombinant murine GM-CSF (rmGM-CSF) and 20 ng / ml of recombinant murine IL-4 (rmlL-4) and the incubation was continued.
  • the 6th day the nonadherent cells were collected, washed, and counted by trypan blue exclusion.
  • the cell concentration was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / ml in IMDM containing rmGM-CSF and rmlL-4 10 ng / ml, and the incubation was continued. 8 ee day, non-adherent cells consist of dendritic immature and mature cells (CD-DM) were collected and used for incubation with the products.
  • CD-DM dendritic immature and mature cells
  • the CD-DMs were incubated at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml in 24-well microplates in the presence of the following activators: the positive LPS control of Esche chia coli 0111: B4 at 100 ng / ml; the IMDM negative control; as well as 2 compounds according to the invention OM-197-MC-FV5 and OM-197-MP-AC at concentrations of 0.1, 1 and 10 ⁇ g / ml. After 48 hours of incubation, the cells were collected and stored for analyzes by flow cytometry.
  • the CD-DMs were washed in PBS containing 2% SVFi and 0.01% sodium azide (FACS buffer). Then they were incubated on ice for 30 minutes with optimal concentrations of anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII conjugated to FITC, and anti-CD80 conjugated to peroxidase. Then the cells were washed 3 times.
  • the labeling of anti-CD86 and anti-CD40 was carried out by incubating the cells on ice for 30 minutes with donkey antibodies anti-lg of rat conjugated to peroxidase. After incubation, the cells were washed and resuspended in FACS buffer. Fluorescence was measured on a FACScan TM flow cytometer. 15,000 events were analyzed by sample. Cells which were incubated with conjugate alone served as a negative control.
  • the products according to the invention are capable of inducing the maturation of predendritic cells into dendritic cells. These results obtained in vitro are in agreement with the observations made in vivo in mice. In vivo, iv and sc treatments of OM-197-MP-AC, 20 ⁇ g and 5 ⁇ g respectively by mouse, induce the maturation and migration of dendritic cells in the spleen, from the marginal zone (located between the red pulps and white) to the white pulp, where the T cells are located.
  • the peptide (NANP) 6 P 2 P 3 o comprises the repeated sequence (NANP) of Plasmodium falciparum and two sequences of the tetanus toxin (P 2 : 830-843 and P 30 : 947-967)
  • This peptide is known as being a T-helper epitope and has demonstrated its ability to induce a long-lasting high immune response in the presence of conventional adjuvants.
  • the peptide was obtained by synthesis according to the method described in the literature (Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721).
  • the stock solution of the antigen is prepared at 0.4 mg / ml in 0.9% NaCl / water at pH 8.0.
  • Adjuvants stock solutions of acylated pseudodipeptides (OM-197-MP, OM-197-FV6 and OM-197-MC) are prepared at 1 mg / ml in 0.9% NaCl / water, added with 0.1% triethanolamine.
  • the positive control is constituted by the incomplete Freund's adjuvant (IFA from Difco, Detroit, Ml, U.S.A.) and the negative control is a 0.9% NaCl / water solution.
  • the adjuvant and the antigen are formulated in the form of a mixture or of conjugates described above.
  • mice 6-week-old female BALB / c mice (6 mice per group) are immunized twice, by subcutaneous injection at the base of the tail of 0.1 ml.
  • the amounts administered are 20 ⁇ g of antigen and 50 ⁇ g of adjuvant during the first injection and 10 ⁇ g of antigen and 50 ⁇ g of adjuvant during the second.
  • the antigen part is decisive for the calculation of the injected dose.
  • the assay of IgG antibodies directed specifically against the antigen (NANP) ⁇ P 2 P 3 o is carried out by ELISA.
  • the antigen is fixed in a 96-well microplate (Maxisorp F 96, Nunc, DK) by overnight incubation in a humid chamber at 4 ° C with in each well 0.1 ml of PBS (phosphate buffered saline) containing 0.001 mg / ml of antigen (NANP ⁇ P ⁇ o-
  • PBS phosphate buffered saline
  • the saturation of the microplate is carried out with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA, Fluka, CH).
  • the plates are washed with PBS containing 0.05%) of Twe ' in 20 (Sigma, Saint-Louis, MO, USA).
  • the sera collected at 5 weeks are diluted in series with the dilution buffer (PBS containing 2.5% defatted milk powder and 0.05% o of Tween 20), then transferred to the microplate and left for 1 h at room temperature (RT). The plates are then washed with PBS.
  • the dilution solution containing the mouse anti-immunoglobulin G polyclonal antibody conjugated with alkaline phosphatase (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) is added to the plates and incubated for 1 h at RT.
  • the plates are washed with PBS and the specific antibodies demonstrated by colorimetric reaction with the substrate of alkaline phosphatase, p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, USA.).
  • the absorbance at 405 nm is measured with a microplate reader (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), each condition is determined in duplicate. The results presented are the average of the absorbances measured at 405 nm obtained for the mice of each group.
  • NANP 6 anti-P2G3 IgG antibodies 6 determined by ELISA is presented graphically for the mice having received two immunizations (FIG. 79).
  • OM-197-FV6 or OM-197-MC Two injections of an antigen + adjuvant mixture (OM-197-FV6 or OM-197-MC) induce a serological response far superior to that observed during the injection of the antigen alone.
  • 3 - (NANP) 6 P2P30 does not improve the serological response against this antigen.
  • the mixture of the adjuvant OM-197-MP and the monoconjugate OM-197-FV- (NANP) 6 P 2 P 3 o significantly increases the serological response to this antigen and exceeds the values obtained with the positive control consisting of mixture (NANP) 6 P2p3o + IFA.
  • Ovalbumin immunization group determination of specific antibodies generated in mice after 1 and 2 subcutaneous administrations.
  • the aim of this study is to compare the serological response induced by the injection of an adjuvant + antigen (OM-197-MP + ovalbumin) mixture with that elicited by a conjugate with this same antigen (OM-197-FV-ovalbumin ).
  • an adjuvant + antigen OM-197-MP + ovalbumin
  • OM-197-FV-ovalbumin an adjuvant + antigen
  • Group A the mother solution of antigen alone (ovalbumin, Fluka AG, Buchs, Switzerland) was prepared at a concentration of 125 ⁇ g / ml in H 2 0 + 0.01% thiomersal.
  • Group B the stock solution of the antigen + adjuvant mixture (ovalbumin + OM-197- MP) contains 125 ⁇ g / ml of ovalbumin and 250 ⁇ g / ml of OM-197-MP in H 2 0 + 0.01%) thiomersal.
  • Group C the mother solution of the OM-197-FV-ovalbumin conjugate is at the concentration of 125 ⁇ g / ml of protein in H 2 0+ 0.01% thiomersal.
  • each stock solution is incubated for 15 minutes at 37 ° C, then in each case an adequate volume of NaCl (14%) is added to each solution to obtain an isotonic solution (0.9% NaCl). The whole is vortexed for 3 minutes.
  • Immunizations the injections took place on days 0 and 14. The solutions are administered subcutaneously (100 ⁇ l at 2 different sites, in total 200 ⁇ l per animal). The blood samples were taken on days 14 and 28 (retro-orbital puncture).
  • the specific lgG1, lgG2a and IgM for ovalbumin are incubated for 30 minutes at 37 ° C with 100 ⁇ l of antibodies (anti-mouse rat) anti-lgG1 conjugated with peroxidase (Serotec, Oxford, UK), conjugated lgG2a with peroxidase (Pharmingen, San Diego, CA, USA) and IgM conjugated with biotin (Pharmingen, San Diego, CA, USA), previously diluted in PBS / BSA / Tween buffer (dilutions: 250, 1000, and 500 times respectively).
  • a 3 rd incubation was required (30 min at 37 ° C) with a 1/100 solution of streptavidin conjugated to peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
  • Hemagglutinin H1N1 immunization group determination of specific antibodies generated in mice after 1 and 2 administrations subcutaneously.
  • the aim of this study is to compare the serological response induced by the injection of an adjuvant + antigen (OM-197-MP + H1N1) mixture with that elicited by a conjugate with this same antigen (OM-197-FV-H1 N1).
  • OM-197-MP + H1N1 an adjuvant + antigen
  • OM-197-FV-H1 N1 an adjuvant + antigen
  • H1 N1 hemagglutinin A / Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL
  • H 2 the mother solution of H1 N1 (hemagglutinin A / Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) was prepared at the concentration of 25 ⁇ g / ml in H 2 0.
  • Group B the mother solution H1 N1 + OM-197-MP contains 25 ⁇ g / ml of H1 N1 and 500 ⁇ g / ml of OM-197-MP in H 2 0.
  • Group C the OM-197-FV-H1 N1 stock solution (H1 N1 covalently linked to OM-197-FV) is at the concentration of 25 ⁇ g / ml in H 2 0).
  • the injections took place on days 0 and 14.
  • the solutions are administered subcutaneously (50 ⁇ l at 2 different sites, in total 100 ⁇ l per animal).
  • the blood samples were taken on day 14 (retro-orbital puncture).
  • the specific IgMs for H1 N1 were determined in duplicates by ELISA.
  • microwell plates NUNC Immunoplate, Roskilde, DK
  • 100 ⁇ l of H1 N1 0.5 ⁇ g
  • a bicarbonate buffer pH 9.6
  • Tween-20 0.5% Tween-20
  • the sera were diluted 50, 200 and 800 times (dilution solution: phosphate buffered saline (PBS) + 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02% Tween- 20)).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the specific IgMs for H1N1 are incubated for 30 minutes at 37 ° C. with 100 ⁇ l of anti-mouse IgG antibodies (anti-mouse rat) conjugated with biotin (Pharmingen, San Diego, CA, USA), diluted beforehand in Tween buffer (dilution: 500 times). After an additional wash, a third incubation (30 min at 37 ° C) was carried out with a 1/100 solution of streptavidin conjugated to peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
  • TMB 3 ', 3', 5 ', 5'-tetramethylbenzidine solution
  • the results of each measurement at 490 nm are expressed in Arbitrary Units (AU) per ml. This was possible by comparing each sample with a reference prepared from dilutions of a pool of samples at 28 days from group A (animals injected with H1 N1 alone). By definition, the sample pool diluted 50 times is at the concentration of 1000 AU / ml. The individual results were then corrected according to the corresponding dilution factor (50, 200, or 800 times) and are presented in Figure 84: the solid circles correspond to the 28-day average.
  • mice immunized with the OM-197-FV-H1 N1 conjugate show an anti-H1 N1 IgM antibody titer greater than that of the control constituted by the H1N1 antigen alone, as well as that of the OM-197-MP mixture + H1 N1.
  • CBA mice receive a single subcutaneous injection (100 ⁇ l) of the Leishmania LmCPb parasite antigen (3 ⁇ g per mouse) ⁇ adjuvant in the tail.
  • Two groups of 6 mice are formed which receive the following treatments: antigen alone (control group) and respectively antigen + 50 ⁇ g of OM-197-MP-AC Eleven days after the injection, the cells of the inguinal and periaortic lymph nodes ( 2 groups of 3 mice) are cultured in triplicate in the presence of the purified LmCPb antigen or the total extract of the parasite (amastigote).
  • supernatant is removed and stored at -20 ° C for the assay of IL-4 and IFN- ⁇ .
  • tritiated thymidine 3 H-TdR is added to the cultures for the measurement of proliferation.
  • the cytokines are assayed by sandwich-ELISA (OptEIA TM IFN- ⁇ and IL-4 kits, BD PharMingen, Basel, Switzerland) and the proliferative response is evaluated by measuring the incorporation of thymidine ( 3 H-TdR).
  • 3 H-TdR thymidine
  • the measurement of the incorporation of 3 H-TdR expressed in CPM as an arithmetic mean (standard deviation 82 pools of 3 mice) and the IL-4 concentration in pg / ml is given individually for each pool of 3 mice under form of arithmetic mean of two measurements (assay of cytokines).
  • Antigen the LmCPb stock solution is prepared at a concentration of 150 ⁇ g / ml in PBS.
  • Adjuvants the OM-197-MP-AC stock solution is prepared at 0.9 mg / ml in water for injection added with 0.1% triethanolamine
  • Antigen-adjuvant mixture The preparation of adjuvant (4 volumes), previously adjusted to the appropriate final concentration in sterile PBS is mixed just before injection with the stock solution of antigen (1 volume).
  • mice with OM-197-MP-AC show in the supernatant of the ganglion cultures stimulated by the parasite antigen significant amounts of IL-4 (see Table 2), while the production of 'IFN- ⁇ is not detected ( ⁇ 100 pg / ml).
  • Table 2 Production of IL-4 in vitro by lymphocytes of CBA mice immunized with LmCPb: Effect of the adjuvant OM-197-MP-AC alone or in combination with CpG-DNA
  • the OM-197-MP-AC product potentiates in CBA mice immunized with LmCPb (a protease abundant in the amastigote phase of the Leishmania parasite) a specific T response evaluated in vitro by measuring lymphocyte proliferation.
  • LmCPb a protease abundant in the amastigote phase of the Leishmania parasite
  • this adjuvant promotes the development of anti-LmCPb lymphocytes secreting large amounts of IL-4
  • the aim of this experiment is to evaluate the ability of the acylated pseudodipeptide carrying an auxiliary arm grafted or mixed on a synthetic peptide PyCS 252-260 of the circumsporozoite protein of Plasmodium yoelii, to induce a specific cellular and humoral immune response against the peptide. 5.5.1. Experimental protocol
  • mice immunizations the dose of antigen corresponds to 20 ⁇ g of peptide 2 per mouse and per injection (Table 2). Before the injection, the lyophilized preparations are taken up with 0.9% NaCl, vortexed for 3 min and subjected to a 10 min ringing at 50 ° C.
  • the formulations with IFA are prepared by mixing a volume of antigen (14.5 ⁇ g peptide PyCS 252-260 plus 50 ⁇ g of P30 (universal T epitope) in PBS) and a volume of adjuvant.
  • mice 4 week old BALB / c mice (Harlan, Zeist, NL) are injected subcutaneously at the base of the tail. The injection of the formulations is carried out with 23 "needles in a final volume of 50 ⁇ l. The animals receive a second dose of antigen at the start of the 5 th week and a third injection during the 9 th week.
  • Blood and lymphoid organ samples Obtaining serum: blood samples are taken from all mice after 7 and 11 weeks. The blood is left to stand for 60 min at 37 ° C., then placed overnight at 4 ° C. The serum is then frozen at -80 ° C until the antibody dosage.
  • the assay of the antibody titer directed specifically against peptide 1 is carried out by ELISA.
  • the antigen is fixed in a 96-well microplate (Maxisorp F 96, Nunc, DK) by overnight incubation in a humid chamber at 4 ° C with in each well 0.05 ml of PBS (phosphate buffered saline) containing 0.001 mg of peptide 1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the plates are washed with PBS-0.05% Tween 20 (Sigma, St-Louis, MO, .SA) (PBS-T) and the saturation of the microplate is carried out with 5%> of lean milk in PBS -T for 1 hour at room temperature.
  • mice taken at times 9 and 11 weeks are diluted in series with the dilution buffer (PBS containing 2.5% of defatted milk powder and 0.05% of Tween 20), then transferred to the microplate and left for 1 h at room temperature (RT). The plates are then washed with PBS and the dilution solution containing the polyclonal goat anti-mouse immunoglobulin antibody conjugated with alkaline phosphatase (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) is added to the plates and incubated for 1 h. YOUR.
  • PBS containing 2.5% of defatted milk powder and 0.05% of Tween 20
  • the plates are washed with PBS and the specific antibodies detected by colorimetric reaction with the substrate of alkaline phosphatase, p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.).
  • the absorbance at 405 nm is measured with a microplate reader (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), each serum is determined in duplicate.
  • the results presented are the average of the values obtained for the mice of each group.
  • the antibody titer is determined by the last dilution inducing a significant positive response, that is to say with an optical density value greater than the value of the background noise plus 3 standard deviations.
  • the specific anti-mouse interferon- ⁇ antibodies (O1 E703B2) are fixed by overnight incubation at 4 ° C. in a humid chamber, of an antibody solution at 50 ⁇ g / ml in an ELISPOT microplate, the bottom of the wells is covered with nitrocellulose (Millipore, Molsheim, F) ,.
  • the saturation step is carried out by adding DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) containing 10% fetal calf serum (FCS, Fakola, CH) for 2 hours at 37 ° C.
  • the cells obtained at from the lymphoid organs are cultured in microplates at 200O00 or 400O00 cells per well, then co-cultured for 24 h at 37 ° C with 10000 antigen presenting cells (previously pulsed with the peptide PyCS 252 -260 at 37 ° C for 1 hour and irradiated (10 K rads) and washed 3 times) or in the presence of Concanavalin A as a control. After incubation, the cells are eliminated and after washing, a second anti-IFN- ⁇ antibody from biotinylated mice (ANI, 2 ⁇ g / ml in PBS with 1% BSA) is added for 2 h.
  • ANI biotinylated mice
  • Streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA) diluted 1: 1000 is added and incubated for 1 hour at 37 ° C., 3 washes are carried out with PBS containing 0.05%) of Tween 20, followed by 3 washes with PBS.
  • the presence of anti-IFN- ⁇ immune complexes is demonstrated by the addition of the BCIP / NBT substrate (Sigma, St-Louis, MO, USA). The reaction is stopped by washing with running water. IFN- ⁇ positive spots are then counted using a Biosys GmbH automatic reader (Karben, Germany).
  • the specific spots correspond to the difference between the number of spots counted in the presence of cells pulsed with the peptide and the number of spots counted in the absence of peptide.
  • the results represent are the average of the values obtained for the mice of each group. They are expressed in number of spots per million cells cultured. Results
  • the humoral response is presented in Figure 85 (2 weeks after the second injection) and Figure 86 (2 weeks after 3rd injection).
  • the positive responses are observed in 5 out of the 7 animals in group 5 (animals having been immunized with peptide 1 conjugated by an auxiliary arm to 4 units of acylated pseudodipeptide).
  • the percentage of responder mice increases with the 3rd injection since mice B and D show a titer of antibody significant but low.
  • Group 3 immunized with the same peptide mixed with the same adjuvant does not produce a significant antibody titer.
  • An emerging response is observed after 3 immunizations in group 7 (monoconjugate with peptide 2 supplemented by the free adjuvant OM-197).
  • the tetraconjugate OM-197-peptide 2 is capable of inducing an antibody response in all mice immunized with a medium to low titer.
  • the evaluation of cell activity is determined by the frequency of CTLs, secreting interferon- ⁇ , specific to the PyCS 252-260 epitope. The results are presented in Table 3.
  • the positive control is represented by group 2 and the negative control represented by the adjuvants alone (group 1 and 8).
  • the control of cell stimulation by Concanavalin A is positive for all the mice.
  • Groups 5 (tetra-conjugate) and 7 (monoconjugate + adjuvant) show positive CTL responses.
  • the aim of this experiment is to determine the highest concentration of acylated pseudodipeptide carrying a grafted auxiliary arm which does not induce fever in an injected rabbit i.v ..
  • Group 1 1.0 mg / kg
  • Group 2 0.1 mg / kg
  • the rabbits are weighed and immobilized in boxes provided for this purpose. Temperature probes are introduced into their rectum.
  • Each rabbit then receives an i.v. injection of product or control (sterile water to
  • the compounds according to the invention are not pyrogenic at doses lower than 0.1 mg / kg.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

L'objet de l'invention concerne spécifiquement des pseudodipeptides qui dérivent d'acides aminés fonctionnalisés, comportant des chaînes d'acides gras fixées sous forme d'amide sur les fonctions amine du pseudodipeptide et dont l'une des extrémités est porteuse d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, l'autre extrémité étant un groupement acide sous forme neutre ou chargée. Les composés de la présente invention possédent des propriétés immunomodulatrices comme adjuvants. Les composés de l'invention peuvent en outre être greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire ou être également greffés sur un pharmacophore pour améliorer son action thérapeutique ou son ciblage. Les composés de l'invention trouvent de ce fait une utilisation en médecine humaine et vétérinaire comme agents immunisants et comme outil de diagnostic.

Description

PSEUDODIPEPTIDES ACYLES PORTEURS D'UN BRAS AUXILIAIRE FONCTIONNALISE INTRODUCTION
La présente invention se rapporte au domaine de la chimie, et plus particulièrement à celui de la chimie des peptides. Elle a plus précisément pour objet des pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, pouvant être greffés ou non sous la forme de conjugués et dont le bras auxiliaire confère à la molécule des propriétés originales en termes d'activités biologiques et en termes physico-chimiques. La nature chimique du bras auxiliaire confère une dimension supplémentaire au pseudodipeptide acylé en modulant finement ses propriétés originales et en lui donnant de nouvelles. Ces molécules porteuses d'un bras auxiliaire fonctionnalisé peuvent être conjuguées à un phamacophore, à un antigène ou à une molécule vecteur. La bioconjugaison implique le couplage de deux ou plusieurs entités chimiques pour former un nouveau complexe moléculaire possédant des propriétés différentes de celles de ses composants individuels. Des produits naturels ou synthétiques, dotés de propriétés pharmacologiques propres, peuvent ainsi être combinés entre eux pour créer de nouvelles entités aux propriétés physico-chimiques et pharmacologiques originales ou améliorées par rapport aux composés de départ. Les applications de la bioconjugaison touchent tous les domaines de la médecine humaine, vétérinaire et les méthodes de diagnostic.
De nombreux agents de couplage de type homo- ou hétérobifonctionnels ont déjà été décrits et peuvent être appliqués à la conjugaison de molécules aussi diverses que des acides aminés, des peptides, des protéines, des sucres, des oligosaccharides, des polysaccharides, des acides nucléiques, des oligonucléotides, des polynucléotides, des lipides, et à pratiquement toute molécule porteuse d'un groupe fonctionnel susceptible de former une liaison. Un effort considérable a été consacré ces dernières années à la synthèse de constructions antigéniques composées de deux molécules porteuses de messages différents. Good et al. [(1987), Science 235, 1059-1062], ont par exemple synthétisé un peptide contenant des épitopes reconnus à la fois par les lymphocytes T auxiliaires et par les lymphocytes. B. Bessler et Jung [(1992) Res. Immunol. 5, 548-553] ont décrit des conjugués composés d'un peptide et d'un immunostimulant. Hoffmann et al. [(1997) FEMS Immunol. Med. Microbiol. Microbiology 17, 225-234] ont décrit des conjugués entre un lipopeptide et un peptide synthétique de la melittine. Ulrich et yers [(1995) Vaccine Design, Plénum Press, New York, 495-524], ont observé que la réponse immunitaire n'était efficace que si l'haptène et l'adjuvant MPL (Monophosphoryl Lipid A) se trouvaient dans le même liposome. Ils ont discuté de la possibilité d'une liaison covalente entre l'adjuvant MPL et l'haptène. En effet un conjugué haptène-adjuvant pourrait s'avérer très efficace comme adjuvant de vaccination. Ikeda et al. [(1999) Chem. Pharm. Bull., 47(4), 563-568] ont présenté une synthèse entre un analogue structurel du Lipid A et un antigène tumoral de nature peptidique et démontré in vitro une activité mitogénique.
Ce concept de conjugaison pourrait être valable aussi pour des protéines ou même des couples protéines-polysaccharides. En effet, il est connu que des polysaccharides utilisés seuls comme vaccin, n'induisent qu'une réponse immunologique faible chez les enfants de moins de 5 ans, parce que la réponse ne dépend pas des cellules T [Gotschlich et al., (1977) ; Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Peltola et al., (1977), Pediatrics 60, 730-737]. Au contraire, des polysaccharides liés aux protéines vecteurs (carrier) donnent une réponse immunologique beaucoup plus forte. Ce phénomène a été découvert en 1931 par Avery et Goebel [(1931), J. Exp. Med. 54, 437-447]. Divers vaccins développés ces dernières années témoignent du progrès dans ce domaine. On mentionnera en particulier les vaccins contre Haemophilus influenzae et divers sérotypes de Streptococcus pneumoniae [Powell et Newman, (1995), Vaccine Design Plénum Press, New York]. Pour ces derniers, un vaccin multivalent a été développé [Sood et Fattom, (1998), Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (3), 333-347].
Des perspectives nouvelles s'ouvrent avec un complexe composé d'un adjuvant lié à l'unité polysaccharide-protéine. La technologie de synthèse chimique de bioconjugués est bien développée et permet aujourd'hui de réaliser une multitude de projets inconcevables il y a quelques années, en utilisant les nombreux réactifs homo- ou hétérobifonctionnels disponibles et les procédures de conjugaison décrites dans une vaste littérature [Hermanson, (1996), Bioconjugate Techniques, Académie Press, New York].
Par exemple on pourrait citer la méthode de l'amination réductrice [Roy et al., (1984), Canad. J. Biochem. Cell. Biol. 62, 270-279; Hermanson, (1995), p.472] permettant la conjugaison d'une molécule porteuse d'une fonction aldéhyde, avec une aminé primaire présente sur un peptide ou une protéine, avec un conjugué protéine-polysaccharide ou avec un pharmacophore. Cette réaction conduit à la formation d' une dialkylamine très stable.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'invention a plus précisément pour objet des pseudodipeptides dérivés d'acides aminés fonctionnalisés, dont les fonctions aminé libres sont amidifiées par des acides gras et dont l'une des extrémités du pseudodipeptide est porteuse d'un bras auxiliaire fonctionnalisé.
Elle a spécifiquement pour objet des pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I l d) NHRT NHR2 dans laquelle R<\ et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10 Y représente O ou NH,
X et Z représentent un bras auxiliaire fonctionnalisé ou un groupe acide sous forme neutre ou chargée choisi parmi les groupements suivants :
-carboxyle -carboxy [(Cι-C5)alkoxy]
-carboxy [(Cι-C5)alkylthio]
-phosphono [(CrC5)alkoxy]
-phosphono [(Cι-C5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-Cs)alkoxy] -dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-C5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy
-hydroxysulfonyloxy
-hydroxysulfonyl [(C^CsJalkoxy]
-hydroxysulfonyl [(C1-C5)alkylthio] -hydoxysulfonyloxy [(Cι-C5)alkoxy]
-hydoxysulfonyloxy [(Cι-C5)alkylthio]
-[carboxy(Cι-C5)alkyl]aminocarbonyle
-[dicarboxy(Cι-C5)alkyl]aminocarbonyle
-[ammonio(Cι-C5)alkyl]aminocarbonyle -{carboxy[amino(Cι-C5)alkyl]}aminocarbonyle avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé.
Le groupe auxiliaire en X ou Z répond à la formule générale (II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II)
A est O, S ou NH le descripteur r prend une valeur de 0 ou de 1 le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10 W est choisi parmi les groupements : -formyle -acétyle -cyano
-halogéno
-amino
-bromo ou iodo-acétamido -acylamido
.-diacylimido
-sulfhydryle
-alkylthio
-hydroxyle -1 ,2-dihydroxyéthyle
-alkoxy
-acyloxy
-vinyle
-éthynyle -carboxyle libre
- carboxyle sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide
-azido
-thiocyano
L'invention concerne tout particulièrement de nouveaux pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée, à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I d)
NHRi NHR2 dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10
X et Z représentent un groupe acide sous forme neutre ou chargée ou un bras auxiliaire fonctionnalisé, avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé,
Y représente O ou NH,
Le groupe acide X ou Z est choisi de préférence parmi les groupements :
-carboxyle
-carboxy [(C1-Cs)alkoxy] -carboxy [(Cι-C5)alkylthio]
-phosphono [(Cι-C5)alkoxy]
-phosphono [(Cι-C5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy [(CrC5)alkoxy]
-dihydroxyphosphoryloxy -hydroxysulfonyloxy
-hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkoxy]
-hydroxysulfonyl [(d-C5)alkylthio]
-hydoxysulfonyloxy [(Cι-Cs)alkoxy]
-hydoxysulfonyloxy [(CrC5)alkyIthio] et le groupe auxiliaire en X ou en Z répond à la formule générale II à l'exception du radical dihydroxyéthyle.
Lorsque les substituants X ou Z représentent un groupe acide sous forme neutre, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique libre. Lorsqu'il s'agit d'un groupe acide sous forme chargée il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique salifiée, notamment par addition d'une base minérale ou organique, de préférence thérapeutiquement compatible. Lorsque les bases ne sont pas thérapeutiquement compatibles, elles peuvent servir de moyen d'identification, de purification ou de dédoublement.
Parmi les bases salifiantes thérapeutiquement compatibles on citera notamment les bases alcalines comme les hydroxydes de sodium, de potassium, de lithium, les sels d'ammonium ; les bases alcalino-terreuses comme les hydroxydes de calcium ou de strontium, les sels de magnésium, les sels de métaux ferreux et similaires, les bases organiques comme celles dérivées d'aminés primaires, secondaires ou tertiaires, des aminoacides à réaction basique comme la lysine ou l'ornithine ou des sucres aminés.
Des bases non utilisables thérapeutiquement sont par exemple la brucine, la strychnine, la N-méthylglucosamine ou la N-méthylmorpholine. Comme indiqué ci- dessus les sels en découlant serviront comme moyen de séparation ou d'identification ou de purification.
Lorsque m est égal à 1 et n est égal à 0, la molécule dérive notamment de la serine ou de l'acide aspartique. Lorsque m est égal à 2 et n est égal à 0, la molécule dérive notamment de l'homosérine ou de l'acide glutamique
Lorsque Y = NH, p est égal à 3 et q est égal à 1 , il peut s'agir d'un dérivé de la citrulline, de l'ornithine ou de l'arginine.
Lorsque p est égal à 4 et q est égal à 1 , il s'agit notamment d'un dérivé de l'homoarginine ou de la lysine
Lorsque le substituant X ou Z représente le groupe auxiliaire de formule générale
(III) 0-CO-(CH2)s-W (III) le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10, mais plus particulièrement 4, 5 ou 6
W sera choisi de préférence parmi les groupements :
- formyle - amino
- hydroxyle
-1 ,2-dihydroxyéthyle -carboxyle
Parmi les pseudodipeptides objet de l'invention, on retiendra particulièrement comme composés actuellement préférés les composés de formule générale IV: X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I (iv)
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10 et dans laquelle un des substituants X ou Z est un carboxyle ou un radical dihydroxyphosphoryloxy ou un groupe carboxy [(Cι-C5)alkoxy] ou carboxy [(C-i- C5)alkylthio] ou un groupe [carboxy(CrC5)alkyl]aminocarbonyle ou un groupe [dicarboxy(CrC5)alkyl]aminocarbonyle ou {carboxy[amino(Cι-C5)alkyl]}amino- carbonyle et dans laquelle l'autre substituant est un radical acyloxy choisi parmi les groupes 6-aminohexanoyloxy, 6-oxohexanoyloxy, 6-hydroxyhexanoyloxy, 6,7- dihydroxyheptanoyloxy ou 3-carboxypropanoyloxy.
La définition de Ri et R2 englobe des dérivés acylés à chaîne de longueur variable allant de 2 à 24 atomes de carbone, identiques ou différents, ramifiés ou en chaîne droite, saturés ou insaturés, pouvant porter un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé par un alkyle, amino, acylamino, hydroxyle, alkoxy, acyloxy, acylthio et alkylthio. Parmi les groupements acyle concernés, ceux dérivés de l'acide laurique, de l'acide 2-hydroxyoctanoique, de l'acide 3-hydroxymyristique, de l'acide 2-décanoyloxyoctanoique, de l'acide 3-lauryloxymyristique, de l'acide 3-myristyloxymyristique et de l'acide 3-palmityloxymyristique sont ceux actuellement préférés. L'invention concerne en particulier à titre de composés préférés les pseudodipeptides présentés dans le Tableau suivant: L'invention concerne en particulier à titre de composés actuellement préférés :
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 1.2)
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol-1-dihydrogénophosphate 10-(6,7- dihydroxyheptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.1)
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogénophosphate 10-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.2)
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, -N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide 5-0-(6, 7-dihydroxy- heptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.3)
l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyl}amide 5-0-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.4)
- les (3RS, 9R), (3R, 9R) et (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4- oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno- phosphate 10-(6-aminohexanoate) et leurs sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.6, 2.7 et 2.8)
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6-hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.9) le 2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentyle et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.10)
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α~N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyl}amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.16)
l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- succinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.19)
l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N-[(1 S)-1 - carboxy-5-aminopentyrjamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex.2.22)
l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyl}amide β-N-[(1 S)- 1,2-dicarboxyethyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique (Ex. 2.24)
Ces composés se distinguent par des propriétés pharmacologiques intéressantes et originales, notamment immunomodulatrices. Ils trouvent un intérêt particulier dans la préparation de compositions vaccinales dans des formulations par mélange ou en tant que conjugués de manière covalente avec des antigènes de nature polypeptidique ou polysaccharidique ou sur des composés constitués de polypeptides conjugués à des polysaccharides. Ils peuvent être utilisés notamment dans la prévention des infections d'origine virale, microbienne et protozoaire ou dans la thérapie de certaines maladies autoimmunes. Ils trouvent également une utilisation comme vecteur de molécule d'intérêt thérapeutique par leurs propriétés d'association non-covalente selon le caractère plus ou moins hydrophile ou hydrophobe de leur bras auxiliaire. Leurs propriétés chimiques qui permettent de les coupler avec des molécules d'intérêt thérapeutique, de même que leur caractère amphiphile favorise les formulations et le transport des molécules qui leur sont associées vers les récepteurs membranaires, ainsi que vers les parois et le cytoplasme cellulaires.
Ils peuvent être utilisés également seuls ou en association, covalente ou non, avec une molécule d'intérêt thérapeutique par voie orale, parentérale, rectale, topique, percutanée ou permuqueuse.
Ils peuvent être utilisés seuls ou en association, covalente ou non, avec une molécule d'intérêt thérapeutique par incubation extratemporanément ex vivo avec des cellules sanguines afin de rendre les cellules immunocompétentes avant de les réinoculer in vivo par voie parentérale.
Les molécules montrent des propriétés semblables, en tant qu'adjuvants du système immunitaire utilisés par exemple pour, la vaccination, en association covalente ou non avec les antigènes appropriés, contre des maladies d'origine virale, parasitaire, microbienne et fongique. Ces molécules, conjuguées ou non, peuvent être en outre utilisées dans la thérapie de certaines maladies autoimmunes.
Par contre, certains des composés selon l'invention, après association covalente ou non, montrent des propriétés différentes dans leur capacité à induire la production de cytokines ou la maturation des cellules souches immunocompétentes provenant des organes hématopoiétiques et lymphoides. Certains des composés selon l'invention sont susceptibles de favoriser la maturation et la différenciation des monocytes en cellules dentritiques fonctionnelles, en présence ou en absence de l'antigène approprié et contribuent ainsi à renforcer l'immunité humorale et cellulaire. Certains des composés favorisent la différenciation des cellules du système hématopoïétique notamment de la moelle osseuse et permettent d'améliorer ou de corriger certains disfonctionnements du système immunitaire. Ils montrent en particulier des propriétés antivirales.
Les composés selon l'invention sont particulièrement intéressants du fait de leur faible toxicité. Ils sont utilisés en association covalente ou non avec des antigènes dans la prévention ou la thérapie de maladies infectieuses chez l'homme et chez l'animal à des doses qui varient de 0.005 mg à 100 mg par prise unitaire et de 0.005 à 200 mg par jour selon les indications et en fonction du poids des sujets. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I, qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et YH en position ω d'un acide aminé ω-fonctionnalisé par des réactifs de blocage orthogonaux, en ce qu'on soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, en ce qu'on libère la fonction aminé en position (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction terminale pour obtenir l' amino alcool fonctionnalisé de formule générale V
Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (V)
I NHR2
dans laquelle Y représente HO ou de préférence NH2,
R2 représente le groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent chacun un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte, avec un dérivé d'acide aminé ω-fonctionnalisé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I
NHRi
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme précédemment, m et n sont un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe acide défini comme précédemment qui peut être sous forme estérifiée, pour former le pseudodipeptide de formule générale VII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH(CH2)q-OH
I I (VII)
dans laquelle les substituants R^ R2, et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est de préférence 1 , mais prend également la valeur de 0 le descripteur s varie de préférence de 2 à 6, mais prend en général une valeur variant de 1 à 10,
W est choisi de préférence parmi l'un des groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, - azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale I
X-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I)
I I
NH Ri NHR2
dans laquelle les substituants X, Y, Z, Ri, R2, n, m, p et q ont les significations fournies antérieurement, L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C1-C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur variant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 X et Z représentent chacun un groupement acide sous forme neutre ou chargée ou un bras auxiliaire fonctionnalisé, caractérisé en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction aminé en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction aminé terminale par hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
NHR2 dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I
NHRT
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0 i O pour former le pseudodipeptide de formule générale X
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X) i I I
O NHRi NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r étant de préférence 1 , mais pouvant prendre également une valeur de O le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 6, mais pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, -alkylthio,, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, - thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XI
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W
I I I
O NHR! NHR2 (XI)
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale XII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII)
I I
NHR! NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et en ω, d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction aminé en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, libère la fonction aminé terminale par hydrogénolyse puis alkyle la fonction aminé avec un ester réactif d' alkyle ω-fonctionnalisé comme un triflate pour obtenir l'amino alcool de formule générale XIII
W-(CH2)sNH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XIII)
NHR,
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 7, mais prend une valeur variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle R^ est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-O o pour former le pseudodipeptide de formule générale XIV
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)sW (XIV) i I I O NHR! NHR2
dans laquelle les substituants R-i, R2 et les descripteurs m, n, p, q et s sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, puis en ce qu'on le soumette à une hydrogénation catalytique ou à un processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XV
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W i I I (xv)
O NH Ri NHR2
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, et s ont les significations fournies antérieurement.
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyle, - ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des carboxypseudodipeptides de formule générale IV X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NHRi NHR2
dans laquelle R et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé fonctionnel d'ω-carboxy amino acide de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle R-i est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un radical RO-CO- pour former le pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
dans laquelle les substituants R-i, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse, comme par exemple le groupe benzyle, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)
A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r étant de préférence 1 , mais pouvant prendre également une valeur de O le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 6, mais pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, - thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un processus de déprotection, de façon à obtenir le dérivé de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W
I I
NH R^ NHR2 (XVII) dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des phosphodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
NHR! NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé
qui consiste en ce que l'on bloque la fonction hydroxyle libre d'un pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I NHRi NHR2
dans laquelle les substituants R , R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse comme par exemple le groupe benzyle,
avec un groupe protecteur labile par acidolyse, libère la fonction carboxyle présente sous forme d'ester, soumet cette fonction carboxylique éventuellement sous forme activée à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool primaire correspondant, convertit cette fonction alcool en ester phosphorique par traitement avec un agent de phosphorylation ; la fonction hydroxyle protégée est libérée par traitement avec un acide, puis soumise à une réaction de substitution, d'acylation ou d'alkylation avec un réactif de formule générale VIII
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est de préférence 1 , mais prend également une valeur de 0 le descripteur s varie de préférence de 2 à 6, mais prend en général une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi l'un des groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -1,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester ou d'un autre dérivé
si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et le produit ainsi formé est déprotégé, par exemple par hydrogénolyse, de façon à obtenir le produit de formule générale XI
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r(CH2)s-W I I
O NH R1 NHR2 (XI)
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention de phosphodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV) dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en d-C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé
qui consiste en ce que l'on déprotège la fonction carboxyle présente sous forme d'ester dans un pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse comme pa'r exemple le groupe benzyle, puis soumet l'acide ainsi formé à une réaction de couplage peptidique avec un diamino alcane ou un acide aminé partiellement protégés tel que, par exemple, le 3-benzyloxycarbonylamino-1-aminopropane, le L-aspartate de dibenzyle ou l'ester benzylique de la ε-N-benzyloxycarbonyl-L-lysine, en présence d'un agent de couplage peptidique, puis soumet, si désiré, le produit de couplage a une réaction de substitution, d'acylation ou d'alkylation avec un réactif de formule générale VIII
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est de préférence 1 , mais prend également une valeur de 0 le descripteur s varie de préférence de 2 à 6, mais prend en général une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi l'un des groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester ou d'un autre dérivé
si nécessaire en présence d'un agent d'activation, et le produit ainsi formé est déprotégé, par exemple par hydrogénolyse, de façon à obtenir le produit de formule générale XVIII
R3-NH -CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r-(CH2)s-W
I I
NH Ri NHR2 (XVIII)
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement et le groupe R3 représente un groupe aminoalkyle, carboxyalkyle, dicarboxyalkyle ou aminocarboxyalkyle.
La stéréochimie des centres porteurs de groupes acylamino est déterminée par la configuration des acides aminés de départ et celle des groupes acylamino par la configuration des acides gras de départ. On peut partir d'un diamino acide de configuration L ou D ou racemique. On peut partir d'un acide aminé hydroxyle de configuration L, D ou racemique. Tous les énantiomeres ou diastéréoisomères des composés de formule générale I ou IV ou XII ou XVI, font partie de l'invention.
De façon générale, les composés de l'invention sont préparés par couplage entre la fonction acide d'un acide aminé N-acylé ω-fonctionnalisé et la fonction amine d'un amino alcool résultant de la réduction du carboxyle d'un acide diaminé mono-N- acylé, puis de la O-acylation ou -alkylation de la fonction alcool restée libre afin d'introduire un bras auxiliaire fonctionnalisé, qui peut être éventuellement modifié après accrochage afin de libérer une fonction réactive. La déprotection du produit final libère une fonction acide.
Dans une méthode actuellement préférée pour préparer les composés de l'invention (Figure 1), l'acide aminé ω-fonctionnalisé est un acide α-aminé ω-hydroxylé tel que la serine ou l'homosérine, qui est soumis à une séquence de réactions de N-protection (par exemple sous la forme de dérivé t-butoxycarbonyle), formation d'un ester benzylique par O-alkylation du carboxylate et phosphorylation de la fonction OH afin d'introduire un groupe phosphate protégé. Les groupes protecteurs typiques des phosphates peuvent être des groupes phényle, benzyle ou o-xylyle. Le phényle est le groupe actuellement préféré. La fonction amine est ensuite libérée par élimination du groupe protecteur (par exemple par traitement du dérivé t-butoxycarbonyle avec l'acide trifluoroacétique), puis acylée avec un dérivé activé d'un acide gras, de préférence un dérivé de l'acide 3-hydroxytétradécanoique tel que l'acide 3- dodécanoyloxytétradécanoique. La forme activée peut être un chlorure d' acyle, un ester activé, un anhydride mixte ou toute autre forme chimique permettant la formation de la liaison amide. L'ester benzylique éventuellement présent est ensuite éliminé par hydrogénolyse sélective pour donner un acide carboxylique portant un groupe acylamido en position α et un groupe (RO)2P(0)0- en position ω.
Le partenaire de la réaction de couplage peptidique est obtenu de préférence à partir d'un α,ω-diaminoacide tel que l'ornithine ou la lysine par une séquence de réactions de protection sélective de la fonction amine en position ω, par exemple sous la forme de dérivé benzyloxycarbonyle, par l'intermédaire d'un complexe de cuivre selon une méthode décrite dans Organic Préparations [Organic Préparations and Procédures International (1992), 23, 191-194], élimination du complexe de cuivre et protection de la fonction amine en position α, par exemple sous forme de dérivé t-butoxycarbonyle. D'autres groupes protecteurs peuvent être utilisés. La fonction carboxylique libre est réduite en alcool primaire en utilisant par exemple le complexe borane sulfure de dimethyl ou par le traitement d'un anhydride mixte préformé par le borohydrure de sodium, selon la méthode décrite dans [Tetrahedron Letters (1991), 32, 923-92]. La fonction amine en position α est libérée en milieu acide (par exemple par traitement avec l'acide trifluoroacétique), puis N-acylée avec un dérivé activé d'un acide gras, de préférence un dérivé de l'acide 3-hydroxytétradécanoique tel que l'acide 3- benzyloxytétradécanoique. Si nécessaire, la fonction OH libre est protégée à ce stade, par exemple sous forme d'éther de benzyloxyméthyle. La fonction ω-amino est libérée par traitement avec un réactif inerte vis à vis des autres groupes protecteurs présents, comme par exemple par hydrogénolyse sélective dans un solvant hydroxylique contenant de la triéthylamine si le groupe protecteur est un benzyloxycarbonyle.
Dans la méthode de synthèse actuellement préférée, l'aminé ainsi obtenue est couplée avec l'acide carboxylique α-acylaminé ω-phosphorylé préparé comme décrit plus haut en présence de IIDQ ou d'un autre réactif de couplage peptidique, pour donner un pseudodipeptide phosphorylé protégé. Ce produit est O-acylé sur la fonction hydroxyle restée libre avec un acide ω-fonctionnalisé tel que l'acide 6- hepténoique en présence de EDCI ou d'un autre agent d'esterification. (Figure 5). La fonction alcènyle de cet ester est soumise à une réaction de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium en quantité catalytique ou stoechiométrique, puis les groupes protecteurs du phosphate et de la fonction hydroxyle éventuellement présente sous forme d'éther de benzyle, sont éliminés par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur approprié (Ex. 2.1). Dans une dernière étape, le diol vicinal est soumis à une oxydation comme par exemple par l'acide périodique pour donner naissance à une fonction aldéhyde réactive (Ex. 2.2). La réduction de la fonction aldéhyde en alcool primaire conduit au dérivé porteur d'un groupe ω-hydroxyacyle (Ex. 2.9).
Dans une variante du procédé, le produit de couplage peptidique est O-acylé par un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique, tel que l'acide 6- benzyloxycarbonylaminohexanoique (Figure 11). Le produit ainsi obtenu est soumis à une réaction de déprotection complète par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur ce qui fournit un pseudodipeptide portant un bras auxiliaire aminoalkanoyle (Ex. 2.6).
Dans une seconde méthode préférée, le partenaire acide de la réaction de couplage peptidique est dérivé de l'acide D ou L-aspartique ou le cas échéant de l'acide D ou L-glutamique (Figure 2). Le dérivé de l'acide aspartique est obtenu par N-acylation de la fonction amine de l'ester β-benzylique de cet acide aminé avec un acide gras, de préférence un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3- dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation. Ce produit est couplé avec un amino alcool du type décrit ci-dessus, puis le pseudodipeptide ainsi obtenu est soumis à une réaction d' hydrogénolyse en présence de catalyseur tel le charbon palladié ou le platine sur support, pour produire le pseudodipeptide portant une fonction acide carboxylique (Ex. 1.2), ou à une réaction de phosphorylation, par exemple par la méthode au phosphoramidite, suivie d'une réaction d' hydrogénolyse pour donner le pseudodipeptide portant une fonction carboxylique et une fonction phosphorique (Ex. 1.3).
Dans une variante, la fonction hydroxyle du pseudodipeptide obtenu précédemment (Figure 2) est acylée avec un acide ω-fonctionnalisé. De préférence, l'acide ω- fonctionnalisé est un acide ω-alcénoique ou un acide ω-aminoalkanoique. Dans le cas de l'acide hepténoique (Figure 8), le pseudodipeptide conduit au dérivé O-hepténoyle qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection (Ex 2.3) et d'oxidation périodique (Ex. 2.4) ; la réduction de la fonction aldéhyde ainsi formée avec un agent réducteur comme par exemple le borohydrure de sodium donne le pseudodipeptide porteur d'une fonction ω-hydroxyalkanoyle (Ex. 2.5). Dans le cas d'un acide ω- aminoalkanoïque comme le dérivé N-benzyloxycarbonyle de l'acide 6- aminohexanoïque ou de la glycine (Figure 24), l'acylation du pseudodipeptide conduit aux dérivés O-aminoacylés protégés qui sont ensuite soumis à une réaction de déprotection par hydrogénolyse (Ex. 2.16 et 2.18).
Dans une deuxième variante (Figure 13), le pseudodipeptide intermédiaire décrit dans la Figure 2 est soumis à une réaction de protection de la fonction hydroxyle libre, de préférence sous la forme d'un éther de tétrahydropyranyle, puis la fonction carboxyle présente sous forme d'ester est déprotégée par hydrogénolyse ou par une autre méthode de déprotection, puis réduite, de préférence après activation sous forme d'anhydride mixte, avec un agent de réduction comme le borohydrure de sodium ; la fonction hydroxyle ainsi formée est soumise à une réaction de phosphorylation, de préférence par la méthode au phosphoramidite, puis l' éther de tétrahydropyranyle est hydrolyse en milieu acide et la fonction hydroxyle ainsi régénérée soumise à une réaction d'acylation avec un acide carboxylique ω- fonctionnalisé . De préférence, l'acide ω-fonctionnalisé est un acide ω-alcénoique ou un acide ω-aminoalkanoique. Dans le cas de l'acide 6-benzyloxycarbonyl- aminohexanoïque, le pseudodipeptide conduit au dérivé O-aminoacylé protégé qui est ensuite soumis à une réaction d' hydrogénolyse (Ex. 2.7, Ex 2.8). Alternativement, l'intermédiaire monophosphorylé du paragraphe précédent peut être obtenu (Figure 15) par le couplage peptidique d'un dérivé N-acylé du β-benzyl ester de l'acide aspartique (Figure 2) avec une forme protégée, par exemple sous forme d'éther de benzyloxyméthyle, de tétrahydropyranyle, ou de silyle de l'aminoalcool dérivé de l'ornithine (Figure 1), suivi de la libération de la fonction acide présente sous forme d'ester de benzyle, de sa réduction en alcool primaire, de la phosphorylation de cette fonction et de la déprotection de la fonction alcool protégée sous forme d'éther de benzyloxyméthyle, de tétrahydropyranyle, ou de silyle.
Dans une troisième variante, le pseudodipeptide intermédiaire décrit dans la Figure 2 est soumis à une réaction d'O-acylation (Figure 27) avec un dérivé d'un acide dicarboxylique, préférablement l'anhydride succinique, en présence d'une base ou d'un agent de couplage, puis le nouvel ester ainsi formé est soumis à une réaction de déprotection par hydrogénolyse (Ex. 2. 19). Le traitement des dérivés O- aminoacyle déprotégés avec l'anhydride succinique donne des pseudodipeptides porteurs d'un groupe succinylaminoacyle (Ex . 2.17).
Dans une troisième méthode préférée, l'amino alcool obtenu à partir de l'ornithine ou de la lysine comme décrit plus haut, est alkyle avec un triflate d'ω-alcényle, comme le triflate de hept-6-ényle (Figure 17). Le couplage de cet amino alcool portant une amine secondaire, avec l'acide α-acylaminé ω-phosphorylé décrit plus haut, en présence de EDCI ou d'un autre agent d'acylation, fournit un ester. Le groupe alcényle est ensuite soumis à une réaction de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis les groupes protecteurs sont éliminés par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés, et la fonction diol vicinal est oxydée par le periodate de sodium pour produire une fonction aldéhyde réactive (Ex. 2.10). Dans une quatrième méthode préférée (Figure 19), le dérivé N-protégé de la serine, par exemple le dérivé p-methoxybenzyloxycarbonyle préparé selon une méthode décrite dans Synthesis (1989), 36-37, est O-alkylé avec le bromoacetate de benzyle. Le groupe protecteur de la fonction amine est éliminé, par exemple par traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, et la fonction amine est N- acylée, préférablement avec un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3- dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant le chlorure d'acide ou toute autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé N-acylé O-alkylé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amino alcool décrit plus haut (Figure 1) en présence d'un agent de couplage peptidique tel que le IIDQ, puis la fonction OH libre est acylée avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé en présence d'un réactif d' activation comme un carbodiimide. De préférence, cet acide fonctionnalisé est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω- aminoalkanoique. Par exemple, avec l'acide hept-6-énoique, le pseudodipeptide conduit au dérivé O-(δ-hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection par hydrogénolyse et d'oxydation périodique (Ex. 2.11)
Dans une cinquième méthode actuellement préférée, l'acide aminé de départ est la cystéine ou l'homocystéine (Figure 20). Par exemple, la cystéine est S-alkylée avec le bromoacetate de p-méthoxybenzyle, puis N-acylée, de préférence avec un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3-tetradécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant un halogénure d'acide ou une autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé S-alkylé et N-acylé de la cystéine ainsi obtenu est couplé avec le 5-amino-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentan-1-ol en présence de IIDQ ou d'un agent de couplage peptidique. La fonction libre OH primaire est ensuite O-acylée avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé, utilisé sous la forme d'un ester activé comme un ester O-benzotriazolyle. De préférence, cet acide est un acide ω-aminoalkanoique tel que l'acide 7-(p- methoxybenzyloxycarbonylamino)heptanoique. Le produit ainsi obtenu est soumis à une réaction de déprotection complète en milieu acide aqueux ce qui fournit un pseudodipeptide portant un bras auxiliaire 7-aminoheptanoyle (Ex. 2.12). Dans une autre méthode préférée (Figure 21), le dérivé N-p-méthoxybenzyloxycarbonylé de la serine est O-alkylé avec le méthylènemalonate de dibenzyle en milieu alcalin. Le groupe protecteur de l'aminé est éliminé par traitement avec un acide, puis la fonction amine ainsi libérée est N-acylée, de préférence par un dérivé d'un acide gras 3-acyl-hydroxylé tel que l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant un dérivé fonctionnel d'acide gras tel que le chlorure d'acide ou toute autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé N-acylé O-alkylé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amino alcool décrit plus haut (Figure 1) en présence de IIDQ ou de tout autre agent de couplage peptidique. Le pseudodipeptide est ensuite O-acylé sur la fonction OH libre avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé. De préférence, cet acide est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique, par exemple, l'acide hept-6-énoique, et ainsi le pseudodipeptide conduit au dérivé 0-(6- hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection par hydrogénolyse et d'oxydation périodique, pour conduire au dérivé portant un bras auxiliaire 6- oxohexanoyle et un groupe malonyle (Ex. 2.13).
Dans une méthode alternative également préférée (Figure 22), le dérivé 6- aminohexanoyle décrit plus haut (Figure 11) est N-acylé avec un groupe bromoacétamido en utilisant par exemple l'ester O-succinimidyl de l'acide bromoacétique comme agent d'acylation. Cette réaction fournit un dérivé portant un bras auxiliaire 6-(bromoacétamido)hexanoyle (Ex. 2.14).
Dans une huitième méthode préférée (Figure 23), l'ester benzylique de l'homosérine O-phosphorylée (voir Figure 1) est N-acylé avec l'acide 3-benzyloxytétradécanoique, de préférence en utilisant l'anhydride mixte préparé à partir de l'acide 3- benzyloxytétradécanoique et du chloroformiate d'isobutyle. L'ester de benzyle est ensuite hydrogénolyse de façon sélective comme décrit plus haut. Le dérivé ω-N- benzyloxycarbonyle du diamino alcool dérivé de l'ornithine (voir Figure 1) est Nα- acylé avec l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent de couplage ou en utilisant un ester activé ou une autre forme activée de l'acide gras, et la fonction ω-amino est libérée par hydrogénolyse sélective. Cette amine est couplée avec le dérivé N-(3-benzyloxytétradécanoyl) O-(diphényl-oxyphosphoryl) de l'homosérine en présence de IIDQ ou d'un autre agent de couplage peptidique. Le pseudodipeptide ainsi obtenu est O-acylé avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé par exemple en présence d'un carbodiimide. De préférence, cet acide est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique. Par exemple, avec l'acide hept-6-énoique, le pseudodipeptide conduit au dérivé 0-(6-hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés et d'oxydation périodique, pour conduire au dérivé portant un auxiliaire 6- oxohexanoyle (Ex. 2.15).
Dans une neuvième méthode préférée (Figures 29, 31 et 34), le pseudodipeptide intermédiaire décrit dans la Figure 2 est soumis à une réaction de déprotection de la fonction carboxyle présente sous forme d'ester, puis cette fonction carboxyle est couplée avec un aminoalcane fonctionnalisé, en présence d'un agent de couplage. De préférence l'aminoalcane fonctionnalisé est un dérivé d'un α,ω-diaminoalcane ou d'un acide aminé. Dans le cas du 1-amino-3-benzyloxycarbonylaminopropane (Figure 29), le produit de couplage est ensuite soumis à une réaction d' hydrogénolyse (Ex. 2.20). Dans le cas de l'ester benzylique de la Nε-Z-lysine (Figure 31) et de l'aspartate de α,β-dibenzyle (Figure 34), le produit de couplage est soit soumis à une réaction de déprotection, de préférence par hydrogénolyse (Ex. 2.21 et 2.23), soit soumis à une réaction de O-acylation avec un acide alcanoïque ω- fonctionnalisé, de préférence le dérivé N-benzyloxycarbonylé de l'acide 6- aminohexanoïque. L'ester ainsi formé est ensuite déprotégé par hydrogénolyse ou une autre méthode de déprotection (Ex . 2 .22 et 2 .24).
L'invention concerne encore les produits intermédiaires de formule générale V, VI, IX, XIII, XVI sous forme énantiomériquement et/ou stéréoisomériquement pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères.
L'invention concerne encore les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I, sous forme neutre ou chargée, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne plus particulièrement les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un sel d'un composé de formule générale I, avec une base minérale ou organique thérapeutiquement compatible. L'invention concerne encore les compositions pharmaceutiques à base d'un composé de formule générale I, sous forme énantiomériquement pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule pharmaceutique.
Parmi les formes pharmaceutiques envisagées on pourra citer celles qui conviennent pour la voie digestive, parentérale, par inhalation, topique, transdermique ou permuqueuse comme par exemple les comprimés, les dragées, les gélules, les solutés ou suspensions injectables, les aérosols, les gels, les emplâtres ou les solutés pénétrants.
De préférence les composés selon l'invention peuvent être greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire ou être également greffés sur un pharmacophore pour améliorer son action thérapeutique ou son ciblage et être utilisés de préférence par la voie injectable sous forme de conjugués sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses, éventuellement neutralisées par une amine ou une hydroxyalkylamine. A titre d'exemple on pourra citer l'antigène H1 N1 , l'antigène nonapeptide SYVPSAEQI de Plasmodium et les pharmacophores tels que l'AZT, le d4T, ainsi que des antibiotiques comme les macrolides et les substances possédant une action sur le SNC.
Les exemples suivants, présentés dans les Figures 1 à 86, illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLES
1ere série d'exemples: préparation des intermédiaires de synthèse
EXEMPLE 1.1.
1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra-décanoylamino]-4~ oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-décan-10-ol (Figure 1).
1.1.1. Acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-f(R)3-dodécanoyloxytétra- décanoylaminol butanoïque a. N - TerbutvIoxycarbonvI-DL-homosérine A une solution de bromohydrate d'homosérine (2 g ; 16.78 mmol) dans H20 (20 ml) sont additionnés une solution de NaOH 1 M (16.78 ml) puis du carbonate de césium (3.01 mg ; 9.23 mmol). Après 5 minutes d'agitation, la solution est refroidie dans un bain d'eau et de glace. Sont alors ajoutés du dioxane (60 ml) et du pyrocarbonate de terbutyle. Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation dans un bain d'eau glacée pendant 1 heure puis à température ambiante pendant 5 heures. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu sec est employé directement pour l'étape suivante.
b. N - Terbutyloxycarbonyl-DL-homosérinate de benzyle Au résidu obtenu ci-dessus est ajouté diméthylformamide (20 ml) et on effectue une évaporation à siccité. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel du diméthylformamide (60 ml) et du bromure de benzyle (4.5 ml ; 20.13 mmol). Il se forme alors un précipité blanc. Le mélange est maintenu sous agitation pendant 16 heures. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est épuisé avec de l'acétate d'éthyle (2x20 ml). La phase organique est lavée avec H20 (20 ml) puis avec une solution saline (20 ml). Après séchage sur MgS0 , le solvant est évaporé et le résidu est utilisé tel quel pour l'étape suivante.
c. N -Terbutyloxycarbonyl-0-(diphényloxyphosphorvD-DL-homosérinate de benzyle A une solution du résidu sec de l'étape précédente dans CH2CI2 (60 ml) est ajouté le
4-(N,N-Diméthylamino)pyridine (DMAP) (4.11 g ; 33.56 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes. Sont alors ajoutés la pyridine (12 ml) et le chlorophosphate de diphényle (6.95 ml ; 33.56 mmol). La solution est agitée à température ambiante pendant 18 heures, puis lavée avec HCI 1 N (5 x 20 ml), H20 (30 ml) puis avec une solution saline (30 ml). La phase organique est séchée sur MgS0 , le solvant est évaporé sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution hexane/acétate d'éthyle 4/1) permet de recueillir le produit phosphorylé (7.49 g ; 82.4%) sous forme d'un solide cristallin. PF: 63.5- 64.0 °C.
d. 0-(Diphényloxyphosphoryl)-DL-homosérinate de benzyle, sel trifluoroacétique. Une solution du produit phosphorylé de l'étape précédente (7.88 g ; 15.4 mmol) dans l'acide trifluoroacétique (15 ml) est agitée à température ambiante pendant 2.5 heures. Le solvant est évaporé sous vide poussé et une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution MeOH/CH2CI2 10/1) permet de recueillir le sel trifluoroacétique de l'aminé déprotégée (7.17 g ; 88.9%) sous forme d'un solide cristallin. PF = 73.0-73.5°C.
e. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-(diphényloxyphosphoryloxy)- butanoate de benzyle Une solution de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoïque (4.284 g ; 10.07 mmol ; 1éq) obtenu selon la méthode décrite dans [Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205- 2214], dans du THF (30 ml) est préparée et est refroidie jusqu'à -15°C . Sont alors ajoutés la N-méthylmorpholine (1.108 ml ; 10.07 mmol ; 1éq) et le chloroformiate d'isobutyle (1.31 ml ; 10.07 mmol ; 1éq). Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes à -15°C. Est ensuite ajoutée une solution de O-(diphényloxyphosphoryl)- DL-homosérinate de benzyle (5.724 g, 10.07 mmol ; 1éq) dans un mélange THF/Et3N (30 ml/5 ml). Après agitation pendant 18 heures à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est dilué avec H20 (20 ml) et est extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 30 ml). Les phases organiques sont combinées, lavées successivement avec de l'eau (20 ml) et avec de la saumure (20 ml), puis séchées sur MgS0 avant d'être évaporées. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution hexane/acétate d'éthyle 2/1) permet de recueillir l'ester benzylique attendu (7.455 g ; 87%) sous forme d'un solide cristallin. PF = 31.0° - 32.1 °C. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7,1 (m, 15H) ; 6.90 (2d, 1 H, 3J = 7.6 Hz, NH) ; 5.3-5.1 (m, 3H) ; 4.7 (m, 1 H) ; 4.35 (m, 2H) ; 2.45 (m, 2H) ; 2.4-2.1 (m, 4H) ; 1.6 (m, 4H) ; 1.4-1.1 (m, 34H) ; 0.9 (t, 6H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm : 173.01 ; 171.08 ; 169.66 ; 150.18 (d, 2JP,c=7.1 Hz) ; 135.01 129.60 ; 128.33 ; 128.14 ; 127.96 ; 125.21 ; 119.80 (d, 3JP,C=5.0 Hz) ; 70.69 ; 67.05 65.19 (d, 2JP,c=5.6 Hz) ; 49.13 ; 40.97 ; 40.77 (2 diast.) ; 34.20 ; 33.98 ; 33.82 31.70 ; 29.42 ; 29.34 ; 29.14 ; 28.94 ; 25.01 ; 24.77 ; 22.47 ; 13.91.
f. Acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl amino] butanoïque
Une solution de l'ester benzylique obtenu précédemment (2.23 g ; 2.6 mmol) dans du MeOH qualité HPLC (300 ml), dans un ballon à trois tubulures, est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (1 g) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 1 heure. Le catalyseur est éliminé par filtration, et le filtrat est évaporé pour fournir un sirop incolore. Celui-ci est homogène en chromatographie sur couche mince et en RMN, et a été utilisé directement sans purification supplémentaire pour l'étape de couplage; Rf = 0.75 (CH2CI2/MeOH/Et3N 10/1/0.5). 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7.1 (m, 10H) ; 6.85 (d, 1 H, NH) ; 5.15 (m, 1 H) ; 4.6 (m, 1H) ; 4.35 (m, 2H) ; 2.45 (m, 2H) ; 2.4-2.15 (m, 4H) ; 1.6 (m, 4H) ; 1.4-1.1 (m, 34H) ; 0.9 (t, 6H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm 173.35 ; 173.30 (2 diast) ; 172.75 ; 170.37 ; 150.0 (d, 2JP,C=7.5 Hz) ; 129.55 125.28 ; 119.71 (d, 3JP,C=4.4 Hz) ; 70.78 ; 65.65 (d, 2JP,C=5.9 Hz) ; 49.00 ; 40.77 40.63 (2 diast.) ; 34.13 ; 33.86 ; 33.76 ; 31.59 ; 29.31 ; 29.25 ; 29.03 ; 28.82 ; 24.88 24.68 ; 22.36 ; 13.76.
1.1.2. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1-pentan-1-ol
a. Sel de cuiyre de la D-omithine
A une solution de D-ornithine (5,25 g ;30 mmol) dans du NaOH 1 N (30 ml), est ajoutée une solution de sulfate cuivrique pentahydraté (3.814 g ; 15.3 mmol) dans
H20 (50 ml). Après 2 heures d'agitation à température ambiante, le solvant est évaporé à siccité. Du méthanol (60 ml) est alors additionné au résidu pour former un solide de couleur pourpre qui est séparé, puis lavé successivement au dioxane et au méthanol pour être utilisé directement dans l'étape1 suivante
b. (2R)-2-Amino-5-(benzyloxycarbonylamino)-pentanoate de cuiyre Le solide pourpre est dissout dans un mélange de NaOH 1 N (40 ml) et de dioxane (70 ml). Le mélange réactionnel est refroidie dans un bain d'eau glacée et on ajoute ensuite le chloroformiate de benzyle (5.14 ml ; 36 mmol). Après 3 heures d'agitation dans un bain d'eau glacée, puis 15 heures à température ambiante, le précipité pourpre est récupéré par filtration puis lavé successivement avec EtOH à 95 % (40 ml), H20 (50 ml) et EtOH (60 ml). Le précipité est séché à l'étuve (T< 45° C, sous vide); le rendement en deux étapes est de 8.27 g, soit 93 % par rapport à la théorie (Référence : Organic Préparations and procédures international 23 (1992) 191-194).
c. Acide (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino -2-(terbutyloxycarbonylamino)pentanoïque Le sel de cuivre obtenu précédemment est dissout dans une solution de HCI 2N (400 ml), puis est ajouté l'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) (8.15 g ; 27.8 mmol). Après 2.5 heures d'agitation, le pH est neutralisé à 7 en ajoutant du NaOH 5N (environ 160 ml). Il se forme un précipité blanc. Le mélange est alors agité pendant 2 heures 30 dans un bain d'eau glacée. Le précipité est filtré, lavé à l'eau froide jusqu'à ce que l'effluant soit incolore, puis séché à l'étuve en dessous de 60°. Ce solide est dissout dans du NaOH 1 (156 ml) et la solution refroidie au bain d'eau glacée. Est ensuite ajouté à cette solution du pyrocarbonate de terbutyle (7.7g ; 35.2 mmol) dans le dioxane (160 ml). Le mélange réactionnel est agité à 0° C pendant 45 minutes puis pendant 16 heures à température ambiante. Le solvant organique est évaporé et le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (70 ml). La phase aqueuse est ensuite acidifiée par addition d'HCI 2N jusqu'à pH ~3, lavée avec AcOEt (100 ml). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H20 (30 ml) et avec une solution saline (30 ml), pgis évaporées sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 20/1) permet de recueillir le produit attendu sous forme d'une huile incolore (Rdt : 8.42g en deux étapes soit 76.7 % de la théorie) (Rf = 0.19 CH2CI2/MeOH 20/1). d. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-(terbutyloxycarbonylamino)pentan-1-ol
A une solution froide (-15° C) du dérivé de l'acide diamino pentanoïque obtenu ci- dessus, (5.45 g ; 14.8 mmol) dans du THF (60 ml), sont ajoutés la N- méthylmorpholine (1.65 ml ; 14.8 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (9.6ml ;14.8 mmol). Le mélange réactionnel est agité à -15°C pendant 1 minute puis est ajoutée une solution de borohydrure de sodium (5.1 g ; 44.6 mmol) dans 10 ml d'eau. Après une agitation à -15° C pendant 10 minutes H20 (400 ml) est additionnée au mélange pour arrêter la réaction. La solution est ensuite lavée avec AcOEt (100 ml X 2). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H20 (50 ml), une solution saline (60 ml), puis séchées sur MgS0 . Le solvant est évaporé et le résidu est cristallisé dans un mélange AcOEt/hexane pour conduire au produit cristallin attendu (4.94 g ; 94.9 %). PF = 47.5 - 48° C.
e. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-amino-pentan-1-ol, sel trifluoroacétique Une solution du (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-(terbutyloxycarbonylamino)- pentan-1-ol obtenu ci-dessus (6.32 g ; 18 mmol) dans l'acide trifluoroacétique (25 ml) est préparée puis agitée pendant 2.5 heures à température ambiante. Le solvant est ensuite évaporé et une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution MeOH/CH2CI2 10/1) permet de recueillir le sel trifluoroacétique sous forme d'une huile (5.45 g ; 82.7 %). Le chlorhydrate fond à 133.0 - 134.3° C (recristallisation du méthanol).
f. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylaminolpentan- 1-ol A une solution refroidie à -15° C d'acide (R)-3-benzyloxytétradécanoïque (5.27 g ; 15.8 mmol) [Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204] dans le THF (30 ml), sont ajoutés la N-méthylmorpholine (1.89 ml ; 15.8 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (2.21 ml ; 15.8 mmol). Après agitation à -15° C pendant 30 minutes, est additionnée une solution du sel trifluoroacétique obtenu précédemment (15.25 g ; 14.4 mmol) dans un mélange THF/Et3N (30 ml/1.44 ml). L'agitation est poursuivie à température ambiante pendant 16 heures puis le mélange réactionnel est dilué avec H20 (30 ml) et AcOEt (60 ml). La phase organique est séparée et la phase aqueuse lavée avec AcOEt (60 ml). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H20 (30 ml) et avec une solution saline (30 ml) puis séchées sur MgS0 avant d'être évaporées sous vide Le résidu est recristallisé dans un mélange AcOEt/hexane pour fournir le produit attendu sous forme cristalline (5.8 g ; 71.2 %). PF = 117.5°- 118° C. Rf = 0.32, AcOEt/éther de pétrole 3/1. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7.2 (m, 10H) ; 6.5 (d, 1 H, NH) ; 5.1 (s, 2H) ; 4.9 (m, 1 H, NH) ; 4.5 (2d, AB, 2H) ; 3.8 (m, 2H) ; 3.5 (m, 2H) ; 3.1 (m, 2H) ; 2.4 (m, 2H) ; 1.6-1.4 (m, 6H) ; 1.4-1.2 (m, 18H) ; 0.9 (t, 3H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm : 172.24 ; 156.49 ; 138.06 ; 136.53 ; 128.46 ; 128.04 ; 127.87 ; 76.76 ; 71.39 ; 66.60 ; 65.44 ; 51.54 ; 41.43 ; 40.65 ; 33.76 ; 31.87 ; 29.61 ; 29.30 ; 28.01 ; 26.47 ; 25.05 ; 22.65 ; 14.09.
g. (2R)-5-Amino-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino]pentan-1-ol Dans un ballon à trois tubulures, le catalyseur (Pd/C 20 %, 150 mg) est ajouté à la solution de (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxy-tétradécanoyl- amino] pentan-1-ol (3.0 g ; 5.27 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC/Et3N (300 ml/6 ml). On a chassé l'air par mise sous vide puis le ballon a été chargé d'hydrogène. Le mélange réactionnel est ainsi hydrogéné pendant 2 heures à température ambiante. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat est concentré pour fournir le produit attendu sous forme d'un solide blanc. Rf = 0.2 ; CH2CI2/MeOH/Et3N 5/1/0.5. PF = 47 - 48°C. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm: 7.4-7.2 (m, 5H) ; 6.75 (d, 1H, NH) ; 4.5 (2d, AB, 2H) ; 3.9 (m, 2H) ; 3.5 (m, 2H) ; 2.3 - 2.6 (m, 7H) ; 1.7-1.2 (m, 24H) ; 0.9 (t, 3H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm: 171.86 ; 138.13 ; 128.37 ; 127.87 ; 127.75 ; 76.81 ; 71.50 ; 64.57 ; 51.38 ; 41.51 ; 41.17 ; 33.89 ; 31.82 ; 29.26 ; 28.57 ; 28.03 ; 25.07 ; 22.60 ; 14.04.
1.1.3. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétra-décanoylamino1-décan-10-ol IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (364 mg ; 1.2 mmol ; 1.2éq) est additionné à une solution d'acide (2RS)-4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2- [(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]butanoïque (850 mg; 1.0 mmol ; 1 éq) dans du CH2CI2 anhydre (20 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis une solution de (2R)-5-amino-2-[(R)-3- benzyloxy-tétradécanoylamino]pentan-1-ol (757 mg ; 1.0 mmol, 1éq) dans du CH2CI2 anhydre (10 ml) est additionnée. Après 4 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ Acétone 5/2) permet de recueillir le pseudopeptide phosphorylé (620 mg ; 53%) sous forme d'un solide amorphe (Rf = 0.49, dans CH2CI2/MeOH/Et3N 10/1/0.5). 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm: 7.40-7.15 (m, 15H), 7.00 (m, 1H), 6.90 et 6.80 (2d, 2 diast, 1H), 6.65 (d, 1 H) (3 x NH), 5.15 (m, 1H), 4.50 (m, 3H), 4.30 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.41-2.14 (m, 8H), 1.6-1.4 (m, 8H), 1.4-1.1 (m, 54H), 0.9 (t, 9H, 3CH3). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm: 173.11 , 171.68, 170.52 (2 diast), 169.94 (2 diast), 150.0 (d, 2JP,C=7.2 Hz), 138.20 (2diast), 129.58, 127.99, 127.49, 127.26, 125.24, 119.73 (t, 3JP,C: 5.0 Hz), 76.48, 71.12, 70.71 , 65.86 (élargi), 64.22, 50.96, 49.71 (élargi), 41.46, 41.05, 39.07, 34.13, 34.00, 32.70, 31.61 , 29.34, 29.06, 28.87, 27.98, 25.25 24.92, 24.72, 22.38, 13.80.
EXEMPLE 1.2.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N~{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylaminoJpentyl}amide (- OM-197-MC) (Figure 2)
1.2.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyll-D-aspartique, β-benzyl ester A une solution d'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoïque (3.35 g ; 7.85 mmol) dans du THF anhydre (25 ml) à -15°C et sous argon sont ajoutés successivement la Λ/-méthylmorpholine (0.86 ml ; 7.85 mmol ; 1éq) et l'isobutyl chloroformate (1.02 ml ; 7.85 mmol ; 1éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de N- méthylmorpholine. Après 30 minutes d'agitation à -15°C, une solution de H-D- Asp(OBn)-OH commercial (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf) (1.75g ; 7.85 mmol ; 1éq) dans un mélange CH3CN/H20 3.5/1 (85 ml) contenant Et3N (3.7 ml) est alors ajoutée. Le mélange réactionnel est ensuite agité une nuit à température ambiante. Le solvant organique est ensuite évaporé puis la phase aqueuse refroidie à 0°C, acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% jusqu'à pH=3 et extraite avec AcOEt (2x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/AcOEt 2/1 contenant 2% d'acide acétique) suivi d'une coévaporation au toluène permet de recueillir le β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyl- oxytétradécanoylamino]-D-aspartique,. (4.00g ; 81 %) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.42 dans éther de pétrole/EtOAc 1/1 contenant 2% d'acide acétique ; révélateurs U.V. et phosphomolybdique). PF= 67-69°C.
1.2.2. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl1-D-aspartique, α-N-((4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino1 pentyl}amide β-benzyl ester (ASM-1)
A une solution du β-benzyl ester obtenu ci-dessus (363 mg ; 0.57 mmol) et de (2R)-
5-amino-2-[(R)-3-benzyloxy-tétradécanoylamino]pentan-1-ol (Section 1.1.2) (250 mg ; 0.57 mmol ; 1.0 éq) dans du CH2CI2 anhydre (6 ml) à 0°C (bain eau-glace) et sous argon sont successivement ajoutés HOAt commercial (1-hydroxy-7- azabenzotriazole) (94 mg, 0.69 mmol, 1.2 éq) puis le N,N'-diisopropylcarbodiimide commercial (109 μl, 0.69 mmol, 1.2 éq). Le mélange réactionnel est agité 1 heure à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau, une solution HCI 1 N, une solution de NaHC03 saturée puis les phases sont séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 3:1) permet de recueillir le produit de couplage (436 mg ; 72%) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.27 dans CH2CI2/acétone 5:1 ; révélateurs U.V. et phosphomolybdique). PF = 106-108°C; 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.66 ; 172.09 ; 171.73 ; 170.33 ; 170.12 ; 138.23 ; 135.28 ; 128.53 ; 128.37 128.13 ; 127.81 ; 127.71 ; 125.81 ; 76.71 ; 71.40 ; 71.16 ; 66.77 ; 65.01 ; 51.36 49.39 ; 41.66 ; 39.25 ; 34.40 ; 33.98 ; 31.85 ; 29.58 ; 29.47 ; 29.29 ; 29.11 ; 28.00 25.57 ; 25.17 ; 25.08 ; 24.94 ; 22.62 ; 14.05.
1.2.3. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovπ-D-aspartique, α-N-f(4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradecanoylaminol pentvDamide (= OM-197-MC) Une solution du β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D- aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino] pentyl} amide (417 mg ; 0.40 mmol) dans un mélange MeOH/EtOAc 1/1 (36 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (20 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration, lavé avec un mélange CH2CI2/MeOH 4/1 (50 ml) et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes pour donner l'acide libre (345 mg ; 100%) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.30 dans CH2CI2/ MeOH 9/1 contenant 0.5% d'acide acétique; révélateur phosphomolybdique). PF = 135-137°C. ES/MS: m/z 868.7 [M+H]+, 890.7 [M+Na , 868.7 [M+K]+, 912.7 [M-H+2Na]+ (Figure 3).
1.2.4 Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovn-L-aspartique, α-N-{(4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradecanoylaminol pentvDamide La même séquence de réactions appliquée au H-L-Asp(OBn)-OH commercial (Fluka, Buchs, Suisse) conduit au produit épimère en série L-aspartique.
EXEMPLE 1.3.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5- dihydroxyphosphoryloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoyl-amino]pentyl}amide (= OM-197-MC-MP) (Figure 2)
1.3.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl|-D-aspartique, α-N-f(4R)-5- dibenzyloxyphosphoryloxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino] pentvDamide β-benzyl ester
A une solution de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino] pentyl}amide β-benzyl ester obtenu précédemment (300 mg ; 0.29 mmol) et de 1H-tétrazole (60 mg ; 0.86 mmol) dans du THF anhydre (12 ml) à température ambiante et sous argon est additionné le dibenzyl-diéthyl phosphoramidite à 85% (231 μl ; 0.66 mmol). On observe rapidement la formation de cristaux blancs dans le milieu réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le mélange réactionnel est porté à -20°C puis une solution de mCPBA (57-86% ; 183 mg ; 1.06 mmol) dans du CH2CI2 (8 ml) est additionnée. On observe la disparition des cristaux. Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de Na2S203 saturée est ajoutée puis le mélange réactionnel est agité 10 minutes. La solution est ensuite diluée à l'éther, puis la phase organique est séparée et lavée avec une solution de Na2S203 saturée (5x), une solution de NaHC03 saturée (2x) et une solution de HCI 1M (1x). La phase organique est séchée sur MgS0 , filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 5/1) permet de recueillir le phosphotriester (294 mg ; 79%) sous forme d'un solide blanc. (Rf=0.27 dans CH2CI2/acétone 5/1 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique) ; 13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ en ppm :173.26 ; 171.37 ; 171.01 ; 170.60 ; 170.03 ; 138.22 ; 135.50 ; 135.40 ; 135.28 128.40 ; 128.33 ; 128.16 ; 128.08 ; 127.94 ; 127.82 ; 127.76 ; 127.53 ; 127.41 76.43 ; 71.03 ; 70.90 ; 69.28 ; 66.47 ; 49.09 ; 48.37 ; 41.62 ; 41.35 ; 41.24 ; 39.02 38.88 ; 25.05 ; 24.94 ; 24.82 ; 22.48 ; 13.90.
1.3.2. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovπ-D-aspartique1 α-N-((4R)- 5- dihvdroxyphosphoryloxy-4-r(R)-3-hvdroxytétradecanoylaminolpentyl) amide (= OM-197-MC-MP) Une solution du dibenzylphosphate préparé ci-dessus (249 mg ; 190 μmol) dans EtOH de qualité HPLC (12 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (30 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 4 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration sur millipore. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le phosphate libre brut (180 mg ; 100%). ES/MS: m/z 850.7 [M+H-P(O-)(OH)3]+, 948.5 [M+H]+, 970.5 [M+Na]+ (Figure 4).
EXEMPLE 1.4.
Détermination du degré d'épimérisation des intermédiaires de synthèse. La steréochimie de centres porteurs de groupes acylamino est déterminée par la configuration des acides aminés de départ. Cependant, le couplage peptidique réalisé entre le dérivé de l'acide aspartique ou glutamique et l' amino alcool obtenu à partir de l'ornithine ou la lysine peut conduire, sous certaines conditions, à un phénomère d'épimérisation en C-alpha du partenaire acide de la réaction de couplage. Afin de montrer de degré d'épimérisation de cette réaction, la méthode suivante a été appliquée pour les composés dérivant de l'acide aspartique. L'échantillon (30 μg) est évaporé dans un microvial, puis resolubilisé dans 40 μl de HCI 6M. L'hydrolyse est poursuivie pendant 24 heures à 110°C sous argon. L'échantillon est ensuite évaporé à sec, puis redissout dans 100 ml de tampon tétraborate 0.1 M, pH 9.2. Une derivatisation pré-colonne est ensuite réalisée avec le réactif OPA-IBLC (o-phtaldialdéhyde - N-isobutyryl-L-cysteine) dans les proportions suivantes:
5 μl d'une solution tampon tétraborate de sodium 0.1 M, pH 9.2 2 μl d'une solution méthanolique 170 mM OPA, 260 mM IBLC 2 μl de la solution à analyser
Une séparation HPLC sur colonne Hypersil ODS (250 x 4.6 mm, 5 μm, Supelco) permet de quantifier les deux dérivé provenant des formes L- et D- de l'acide aspartique présent dans l'échantillon de départ (Brϋckner et al. 1995, J. Chromatogr. A 711 , 201-215). Les conditions HPLC utilisées sont les suivantes:
Colonne: Hypersil ODS (250 x 4.6 mm, 5 μm, Supelco)
Phase mobile: A: 23 mM acétate de sodium, pH 5.9
B: méthanol - acétonitrile (12:1)
Injection: 5 μl
Débit: 1 ml/min
Elution: Gradient A:B : 96:4 à 80:20 en 25 minutes
Détection: UV : 338 nm
Dans ces conditions chromatographiques, des temps de rétention de 16.1 et 17.2 minutes sont observés pour les dérivés des acides L- et D-aspartique, respectivement. 2ere série d'exemples: Préparation des pseudodipeptides porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé
EXEMPLE 2.1. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1, 10-dîol-1-dihydrogénophosphate 10-(6, 7- dihydroxyheptanoate) (=OM-197-FV6) (Figure 5)
2.1.1. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1- décan-10-ol (6-hepténoate)
A une solution de 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino] -10-ol (Ex. 1.1) (875 mg ; 0.74 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (25 ml), est ajouté l'acide 6- heptènoïque (141 μl ; 1.04 mmol ; 1.4éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (64 mg ; 0.33 mmol ; 1.4éq) et la DMAP (41 mg ; 0.33 mmol ; 0.14 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 3 heures à température ambiante. Après une dilution au CH2CI2, la phase organique est lavée successivement avec H20, une solution de HCI 1 N et H20. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis évaporée à 40°C sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/AcOEt 1/1) permet de recueillir le 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-ol 6-hepténoate (820 mg, 85%) sous forme d'une mousse blanche (Rf= 0.18 dans éther de pétrole/AcOEt 1/1 ; révélateur acide phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.30 ; 171.18 ; 170.42 ; 169.91 ; 169.73 ; 150.10 ; 138.21 ; 138.14 ; 129.77 128.25 ; 127.49 ; 125.44 ; 119.88 ; 114.56 ; 76.48 ; 71.11 ; 70.90 ; 66.01 ; 65.52 49.90 ; 47.80 ; 41.34 ; 39.07 ; 33.92 ; 33.76 ; 33.69 ; 33.61 ; 33.17 ; 31.75 ; 29.47 29.19 ; 29.00 ; 28.46 ; 28.11 ; 25.34 ; 25.05 ; 24.85 ; 22.52 ; 13.96. 2.1.2. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1-10-ol (6,7-dihydroxyheptanoate)
A une solution contenant K3Fe(CN)6 (373 mg ; 1.13 mmol ;3 éq), K2C03 (157 mg ; 1.13 mmol ;3 éq), et 1 ,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) (10.7 mg ; 0.095 mmol ; 0.25éq) dans un mélange t-butanol/eau (5 ml/5 ml) est ajoutée le composé obtenu ci-dessus (486 mg, 0.38 mmol), puis le tétroxyde d'osmium en solution dans le t- butanol à 2.5% (48 μl ; 4.75 μmol ; 0.0125 éq). Le milieu réactionnel est vigoureusement agité pendant 16 heures à température ambiante (27°C). Du Na2S205 (60 mg) est additionné et l'agitation est poursuivie pendant environ 1 heure jusqu'à ce que le milieu devienne brun puis vert ou bleuâtre. Le mélange réactionnel est dilué à l'éther et la phase organique est séparée. La phase aqueuse est abondamment lavée à l'éther et les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS0 , puis évaporées à 40°C sous vide. Le diol attendu brut est ainsi obtenu sous forme d'une huile verte. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2C!2/Acétone 5/2) permet de recueillir le 1-(diphényl- oxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)- 3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-ol 6,7- dihydroxyheptanoate pur (198 mg ; 40%) sous forme d'un solide amorphe (Rf= 0.24 dans CH2CI2/Acétone 5/2 ; révélateur acide phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.46 173.33 ; 171.34 ; 170.58 ; 170.02 ; 150.13 ; 138.23 ; 129.80 ; 128.26 ; 127.87 127.54 ; 125.50 ; 120.01 ; 119.80 ; 71.79 ; 71.23 ; 70.97 ; 66.63 ; 66.03 ; 65.54 49.93 ; 47.90 ; 41.46 ; 39.17 ; 33.98 ; 33.79 ; 32.86 ; 32.45 ; 31.77 ; 29.49 ; 29.21 29.03 ; 28.51 ; 25.50 ; 25.07 ; 24.87 ; 24.77 ; 24.66 ; 22.54 ; 13.99. HPLC (210 nm) TR = 32.535 min. ES/MS: m/z 1343.0 (M+Na+) ; 1321.0 (M+H+) ; 1071.0 (M+H+ monophényl phosphate).
2.1.3. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-iïR)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-iïR)-3-hvdroxytétradécanoylamino]-10-ol (6,7-dihvdroxyheptanoate)
Une solution du diol obtenu ci-dessus (198 mg ; 0.15 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (20 ml) / AcOEt (1.4 ml) est hydrogénée en présence de 10%o Pd sur charbon (70 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2.5 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le produit débenzylé brut (168 mg ; 91%) sous forme d'un solide amorphe. 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.15 ; 173.51 ; 172.82 ; 171.04 ; 170.49 ; 170.35 150.05 ; 129.79 ;129.42 ; 125.53 ; 119.91 ; 119.83 ; 119.72 ; 71.80 ; 70.93 ; 68.58 66.47 ; 65.94 ; 65.52 ; 50.02 ; 48.12 ; 42.59 ; 41.26 ; 39.13 ; 36.92 ; 34.29 ; 33.85 32.32 ; 31.74 ; 29.50 ; 29.18 ; 29.00 ; 28.15 ; 25.47 ; 25.07 ; 24.85 ; 24.73 ; 24.56 22.51 ; 13.99. HPLC (210 nm) : TR = 30.7 min. ES/MS: m/z 1253.0 [M+Na]+ ; 1231.0 [M+H]+.
2.1.4. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hvdroxytétradécanoylaminol-décan-1 , 10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10- (6,7-dihvdroxyheptanoate) (=OM-197-FV6) A une suspension d'oxyde de platine Pt02 (91 mg) dans l'éthanol (qualité HPLC) (1 ml) (préalablement activé en noir de platine sous atmosphère d'hydrogène pendant 10 minutes) est additionnée une solution du triol obtenu ci-dessus (168 mg ; 0,14 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (8 ml) / AcOEt (8 ml). La solution est hydrogénée à température ambiante (27°C), sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le phosphate brut (130 mg, 88%). HPLC (210 nm): TR = 23.6 min. ES/MS: m/z 1078.9 [M+H]+, 1100.8 [M+Naf , 1116.8 [M+K]+ (Figure 6).
EXEMPLE 2.2.
3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- oxohexanoate) (=OM-197-FV7) (Figure 5) 2.2.1. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 , 1 Q-diol 1 -dihvdroqénophosphate 10-
(6-oxohexanoate) (=OM-197-FV7)
Une réaction d'oxydation périodique est réalisée avec en ajoutant 1.86 ml Nal0
0.1 M (39.62 mg , 20 éq.) à 10 mg (9.28 μmol, 1 éq.) du triol déprotégé préparé ci- dessus dans un mélange isopropanol-eau (1:1). La réaction est suivie par LC/UV et montre une conversion quantitative de la fonction diol en aldéhyde, après deux heures. L'ion moléculaire m/z 1046.8 observé sur le spectre ES/MS après l'étape d'oxydation périodique (Figure 7) atteste de la réaction attendue. Sur ce spectre, des adducts de sodium à m/z 1068.8 ([M+Na]+) et de potassium à m/z 1084.8 ([M+K]+) sont visibles, ainsi qu'un fragment correspondant à la perte du groupe phosphorylé à m/z 948.8. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol.
Le produit peut être purifié par SPE sur support C18 avec une rendement de 90%
(échelle 5 mg de diol).
EXEMPLE 2.3.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide 5-0-(6, 7- dihydroxyheptanoate) (≈OM-197-MC-FV5) (Figure 8)
2.3.1. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylaminol-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl)amide-β- benzyl ester, 5-Q-(6-heptènoate)
A une solution de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-benzyl ester (Section 1.2.2) (122 mg ; 0.116 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (5ml), est ajouté l'acide 6-heptènoïque (22 μl ; 0.160 mmol ; 1.4 éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (49.3 mg ; 0.25 mmol ; 2.1 éq) et la DMAP (5.6 mg ; 0.046 mmol ; 0.4 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 6 heures à température ambiante. Après une dilution au CH CI2, la phase organique est lavée successivement avec H20, HCI 1 N (2x), NaHC03 (2x) et H 0 (2x). L'ester hepténoïque attendu est ainsi obtenu pur (119 mg ; 89%>) sous forme d'un solide blanc (Rf = 0.62 dans CH2CI2/Acétone 5/1 ; révélateur acide phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.63 ; 173.38 171.72 ; 171.11 ; 170.08 ; 138.14 ; 135.28 ; 128.46 ; 128.34 ; 128.24 ; 128.05 127.64 ; 127.53 ; 114.62 ; 76.49 ; 71.14 ; 71.02 ; 66.66 ; 65.49 ; 49.17 ; 47.79 41.69 ; 41.35 ; 39.09 ; 35.46 ; 34.33 ; 33.80 ; 33.65 ; 33.21 ; 31.79 ; 29.52 ; 29.23 29.06 ; 28.46 ; 28.16 ; 22.56 ; 14.00. HPLC (210 nm): TR = 36.9 min. ES/MS: m/z 1159.0 [M+H]+ ; 1176.0 [M+NH4]+. PF = 81.5 - 84°C. [ ]D 20 = +7.3 ( CHCI3).
2.3.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylaminol-D-aspartique, α-N- ((4R)-5-hydroxy-4-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl)amide β- benzyl ester δ-O-fθJ-dihvdroxyheptanoate) A une solution de l'ester hepténoïque obtenu ci-dessus (60 mg ; 0.052 mmol) dans un mélange H20/Acétone (5/3 ml) sont ajoutés l'oxide de N-méthylmorpholine (9 mg ; 0.076 mmol ; 1.5 éq), puis la solution d'Os0 dans le t-butanol à 2.5% (123 μl ; 0.012 mmol ; 0.23 éq) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à température ambiante. Du Na2S205 (20 mg) est ajouté à la réaction qui est alors agitée pendant 1h à 2h à température ambiante. La solution est alors extraite à l'éther plusieurs fois, puis les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04 et concentrées. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 5/2) permet de recueillir le diol attendu pur (35 mg ; 57%) sous forme d'un solide blanc (Rf= 0.15 dans CH2CI2/Acétone 5/1 ; révélateur acide phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.67 ; 173.39 171.81 ; 171.34 ; 170.27 ; 170.01 ; 138.18 ; 135.27 ; 128.56 ; 128.42 ; 128.18 127.50 ; 127.68 ; 76.68 ; 71.82 ; 71.37 ; 71.17 ; 66.85 ; 66.74 ; 65.66 ; 49.27 ; 47.99 41.88 ; 41.51 ; 39.31 ; 35.60 ; 34.42 ; 33.95 ; 33.51 ; 31.80 ; 29.60 ; 29.49 ; 29.30 28.55 ; 25.65 ; 25.60 ; 25.19 ; 25.12 ; 24.97 ; 24.77 ; 24.14 ; 22.65 ; 14.08. HPLC (210 nm) : TR = 34.16 min. ES/MS: m/z 1193.0 [M+H+] ; 1212.0 [M+NH4]+. 2.3.3. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino1-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylaminolpentyl}amide 5-0- (6.7-dihvdroxyheptanoate) (=0M-197-MC-FV5) Une solution du diol obtenu ci-dessus (35 mg ; 0,029 mmol) dans un mélange MeOH qualité HPLC (2 ml) / AcOEt (2 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (10 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2,5 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'acide N- [(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)- 3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoate) brut (26 mg ; 88%) sous forme d'un solide blanc. HPLC (210 nm) : TR = 26.90 minPF = 94- 97°C. [α]D 20 = +11.1 (CHCI3/MeOH = 1 :0.1). ES/MS: m/z 1012.7 [M+H]+ ; 1034.7 [M+Na]+, 1050.7 [M+K]+ (Figure 9).
EXEMPLE 2.4.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5- hydroxy-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide 5-0-(6- oxohexanoate) (=OM-197-MC-FV6) (Figure 8)
2.4.1. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique1 α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1 pentvDamide 5-0-
(6-oxohexanoate) (=OM-197-MC-FV6) 1.98 ml Nal04 0.1 M (42.25 mg , 20 éq.) sont ajoutés à 10 mg (9.88 μmol, 1 éq.) du triol déprotégé préparé ci-dessus (Section 2.3.3) dans un mélange isopropanol-eau (1 :1). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol. Après cette étape d'oxydation périodique, un ion moléculaire [M+H]+ à m/z 980.6 est observé sur le spectre ES/MS (Figure 10), attestant de la présence d'une fonction aldéhyde. Les pics correspondants aux adducts de sodium à m/z 1002.8 ([M+Na]+) et de potassium à m/z 1018.6 ([M+K]+) sont également visibles. La purification par SPE sur support C18 permet de recueillir le produit OM-197-MC-FV6 avec un rendement de 90%. EXEMPLE 2.5.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, -N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide 5-0-(6- hydroxyhexanoate) (=OM-197-MC-FV7) (Figure 8) 2.5.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylaminol-D-aspartique, α-N-
{(4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-hvdroxytétradécanoylaminol pentyl}amide 5-0- (6-hvdroxyhexanoate) (=0M-197-MC-FV7) A une solution du dérivé 6-oxohexanoique obtenu ci-dessus (4.5 mg, 0.0043 mmol) dans de l'isopropanol à 90% (20 ml) est ajouté une solution (0.2 ml) de NaBH4 dans du méthanol (1 mg/ml). Le mélange est agité pendant 3 min à 25°C, puis un excès d'acide acétique (0.2 ml) est ajouté. La purification par HPLC préparative sur colonne C18 permet de recueillir le produit OM-197-MC-FV7 (2.3 mg, 51%), en solution dans de l'isopropanol à 90%.
EXEMPLE 2.6.
(3RS,9R)-3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1, 10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- aminohexanoate) (≈OM-197-MP-AC-RS,R) (Figure 11)
2.6.1. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino1-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-décan-10-ol
(6-benzyloxycarbonylaminohexanoate) A une solution de 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-décan-10-ol (Figure 1) (230 mg ; 0.20 mmol) dans le CH2CI2 anhydre (8 ml), est ajouté l'acide 6- benzyloxycarbonylaminohexanoïque (88 mg ; 0.33 mmol ; 1.65éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (200 mg, 1.04 mmol, 5.2 éq) et la DMAP (13 mg ; 0.10 mmol ; 0.5 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 4 heures à température ambiante. Après une dilution au CH2CI2, la phase organique est séparée et lavée successivement avec H20, HCI 1 N, H20. La phase organique est ensuite séchée sur MgS0 , puis évaporée à 40°C sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 7/1.2 permet de recueillir l'ester pur (115 mg ; 41 %) sous forme d'un solide amorphe (Rf = 0.77 dans CH2CI2/Acétone 5/2 ; révélateur acide phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.27 ; 171.20 ; 170.34 ; 169.88 ; 156.36 ; 150.16 150.13 ; 138.28 ; 136.56 ; 129.80 ; 128.35 ; 128.26 ; 127.90 ; 127.51 ; 125.45 119.97 ; 119.83 ; 71.05 ; 66.37 ; 65.97 ; 65.61 ; 49.94 ; 47.81 ; 41.39 ; 40.66 ; 39.09 34.32 ; 34.25 ; 33.95 ; 33.65 ; 31.78 ; 29.50 ; 29.38 ; 29.22 ; 29.03 ; 28.55 ; 28.44 25.95 ; 25.06 ; 24.87 ; 24.26 ; 22.55 ; 14.00. HPLC (210 nm) : TR = 33.497 min. ES/MS : m/z 1424.0 [M+H]+ ; 1174.0 [M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.6.2. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino|-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3-hydroxytétradécanoylamino1-décan- 10-QI 10-(6-aminohexanoate) Une solution du produit obtenu ci-dessus (115 mg ; 81 μmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (15 ml)/acide acétique glacial (0,4 ml) est hydrogénée en présence de palladium (10% sur charbon) (80 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 4 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le produit débenzylé (90 mg ; 97%) sous forme d'un solide amorphe. HPLC (210 nm) : TR = 29.185 min. ES/MS : m/z 1200.0 [M+H]+ ; 952.0 [M+H- (PhO)2OPOH]+.
2.6.3. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hvdroxytétradécanoylamino]-1 ,10-diol-1-dihydrogénophosphate 10-(6- aminohexanoate).(=OM-197-MP-AC) A une solution d'oxyde de platine Pt02 (30 mg) dans l'éthanol (qualité HPLC) (1 ml) (préalablement activé en noir de platine sous atmosphère d'hydrogène pendant 10 minutes) est additionnée une solution de l'amino-alcool obtenu ci-dessus (90 mg, 75 μmol) dans un mélange mélange EtOH qualité HPLC (5 ml)/HCI 1 N (0.1 ml). La solution est hydrogénée à température ambiante, sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'amino phosphate attendu (60 mg ; 79%). HPLC (210 nm): TR = 28.51 min. ES/MS: m/z 1047.5 [M+H]+; 1069.6 (M+Na+), 949.6 [M+H-(HO)2OPOH] + (Figure 12). EXEMPLE 2.7.
(3R,9R)-3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1, 10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- aminohexanoate) (=OM-197-MP-AC-R,R) (Figure 13)
2.7.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovn-D-aspartique, α-N-((4R)-5-(2- tetrahvdropyranyl)oxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylaminolpentyl)amide β-benzyl ester (ASM-1-0-THP) A une solution du β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D- aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino]pentyl}amide (1.5 g ; 1.43 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (30 ml) à température ambiante et sous argon sont ajoutés successivement le 3,4-Dihydro-2 H-pyran (DHP) (327 μl, 3.58 mmol) puis le pyridinium p-toluenesulfonate (PPTS) (108 mg, 429 μmol). Après 18 heures d'agitation à température ambiante, on ajoute de nouveau du 3,4-Dihydro-2 H-pyran (DHP) (130 μl, 1.43 mmol). La solution est ensuite agitée 9 heures supplémentaires à température ambiante puis diluée avec du CH2CI2, lavée avec une solution de NaHC03 à 5% puis H20. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2 / Acétone 7/1 puis 6/1) permet de recueillir l'acide N-[(R)-3- dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-[ (R)-3-benzyIoxytétradecanoylamino] pentyljamide β-benzyl ester (1.45 g ; 90%) sous forme d'un solide cristallin blanc. (Rf=0.57 dans CH2CI2 / Acétone 5/1; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.7.2. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyll-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(2- tetrahvdropyranyl)oxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino1 pentyl) amide
Une solution du composé préparé ci-dessus (250 mg ; 0.22 mmol) dans un mélange
EtOH/EtOAc 1/1 (16 ml) contenant Et3N (0.4 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (10 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes pour donner l'acide sous forme de sel de triéthylammonium (250 mg).
2.7.3. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3- benzyloxytétradécanoylamino]-10-(2-tetrahvdropyranyl)oxy-décan-1-ol
A une solution de l'acide préparé ci-dessus (-250 mg) dans un mélange CH2CI2/THF anhydre 2/1 (3 ml) à 0°C et sous argon sont additionnés la Λ/-méthylmorpholine (72 μl ; 0.66 mmol ; 3 éq) puis l'isobutyl chloroformate (86 μl ; 0.66 mmol ; 3 éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de Λ/-méthylmorpholine. Suivi CCM (Rf=0.90 dans CH2CI2/ Acétone 2/1). Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est porté à 0°C puis une solution de NaBH (33 mg ; 0.88 mmol ; 4 éq) dans H20 (1 ml) est rapidement additionnée. Dès la fin du dégagement gazeux (5 minutes), la solution est diluée avec H20 (1 ml) et du THF (1 ml) puis agitée 5 minutes à température ambiante. La solution est partiellement concentrée, puis diluée avec du CH2CI2 et H20. Les phases sont ensuite séparées, la phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ Acétone 2/1) permet de recueillir l'alcool (138 mg ; 61% sur 2 étapes) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.33 dans CH2CI2/ Acétone 3/1 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.7.4. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylaminol-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- benzyloxytétradécanoylamino]-10-(2-tetrahvdropyranyl)oxy-décan-1-ol dibenzyl phosphate
A une solution de l'alcool préparé ci-dessus (120 mg ; 0.12 mmol) et de 1H-tétrazole (25 mg ; 0.35 mmol ; 3 éq) dans du THF anhydre (5 ml) à température ambiante et sous argon est additionné le dibenzyl-diéthyl phosphoramidite à 85% (95 μl ; 0.27 mmol ; 2.3 éq). On observe rapidement la formation de cristaux blancs dans le milieu réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le mélange réactionnel est porté à -20°C puis une solution de mCPBA (57-86% ; 75 mg ; 0.43 mmol ; 3,7 éq) dans du CH2CI2 (3 ml) est additionnée. On observe la disparition des cristaux. Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de Na2S203 saturée (3 ml) est ajoutée puis le mélange réactionnel est agité 10 minutes. La solution est ensuite diluée à l'éther, puis la phase organique est séparée et lavée avec une solution de Na2S203 saturée (5x), et avec une solution de NaHC03 saturée (2x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ acétone 4/1 puis 2/1) permet de recueillir le dibenzylphosphate (126 mg ; 84%) sous forme d'un solide amorphe. (Rf=0.53 dans CH2CI2/ Acétone 3/1 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.7.5. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- benzyloxytétradécanoylaminol- décan-1 ,10-diol 1-(dibenzyl phosphate)
A une solution de HCI 1% dans du méthanol (25 ml) à 0°C est ajoutée une solution du composé préparé ci-dessus (700 mg, 0.54 mmol) dans du CH2CI2 (2.5 ml). Après 45 minutes d'agitation à 0°C, le milieu réactionnel est neutralisé avec une solution de NaHC03 à 5%>, dilué avec du CH2CI2 puis la phase organique est séparée. La phase aqueuse résultante est ensuite extraite avec du CH2CI2 (3χ) puis les phases organiques regroupées. La phase organique est séchée sur MgS0 , filtrée et évaporée pour donner l'alcool brut (640 mg ; 98%). (Rf=0.50 dans CH2CI2/ Acétone 3/1 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.7.6. 3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- benzyloxytétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -(dibenzyl phosphate) 10-(6-benzyloxycarbonylaminohexanoate) A une solution du composé préparé ci-dessus (640 mg, 0.53 mmol) et d'acide 6- (benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (423 mg, 1.60 mmol) dans du CH2CI2 sec (25 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3- diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (306 mg, 1.60 mmol) et la 4- diméthylaminopyridine (20 mg, 160 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1N puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 4/1 puis 2/1) permet de recueillir le produit de couplage (537 mg ; 71 %). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm: 173.18; 171.16; 170.38; 169.60; 156.30; 138.23; 136.50; 135.38; 135.28; 128.42; 128.26; 128.17; 127.79; 127.74; 127.44; 76.48; 71.15; 70.84; 69.47; 69.39 69.31 ; 66.25; 65.62; 64.43; 64.37; 49.78; 47.76; 41.41 ; 41.34; 40.57; 38.97; 34.22 34.16; 33.96; 33.57; 32.95; 31.70; 29.43; 29.15; 28.95; 28.32; 25.87; 25.46; 25.02 24.80; 24.18; 22.49; 13.94.
2.7.7. 3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3- hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogénophosphate
10-(6-aminohexanoate) (=OM-197-MP-AC-R,R) (Figure 13)
Une solution du composé préparé ci-dessus (500 mg, 0.35 mmol) dans un mélange CH2CI2/éthanol 5/2 (70 ml) contenant de l'acide acétique (10 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner le 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogénophosphate 10-(6- aminohexanoate) (368 mg, rendement quantitatif). ES/MS: t77/z 1047.9 [M+H]+;
1069.8 (M+Na+) (Figure 14).
EXEMPLE 2.8.
(3S,9R)-3-[(R)~3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5~aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- amînohexanoate) (=OM-197-MP-AC-S,R)
Appliquée au β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-L- aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyl}amide (Section 1.2.4), la même séquence de réaction conduit au produit de l'exemple 2.8. EXEMPLE 2.9.
3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1, 10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- hydroxyhexanoate) (=OM-197-FV8) (Figure 15) 2.9.1. (2R)-5-(Amino)-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylaminol-pentan-1-ol benzyloxymethyl ether A une solution de (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxy- tétradécanoylamino]pentan-1-ol (Section 1.1.2) (2.05 g ; 3.60 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (40 ml) à température ambiante et sous argon sont ajoutés successivement BOMCI (benzyl chlorométhyl éther) (qualité technique 60%, 1.25 ml ; 5.41 mmol ; 1.5éq) et la diisopropyléthylamine (942 μl ; 5.41 mmol ; 1.5 éq). Le mélange réactionnel est ensuite agité une nuit à température ambiante puis évaporé à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/ EtOAc 2/1) permet de recueillir le dérivé O-benzyloxyméthyl (2.28 g ; 92%) sous forme d'un solide cristallin blanc. (Rf=0.70 dans éther de pétrole/EtOAc 1/3; révélateur U.V. et acide phosphomolybdique). PF= 97-100°C. Une solution de ce produit (2.00 g ; 2.90 mmol) dans EtOH de qualité HPLC (220 ml) contenant Et3N (4 ml) est hydrogénée en présence de 20% Pd(OH)2 sur charbon (200 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'aminé libre (1.58 g ; 98%) sous forme d'un solide amorphe. [α]D -1° (C=1.20 ; CHCI3) ; 1H-RMN (250 MHz, CDCI3), δ en ppm : 7.45-7.21 (m, 101-1, Ar), 6.52 (d, 1 H, NH), 4.80-4.45 (m, 6H, 2 x CH2-ph, O- CH2-0), 4.10 (m, 1 H, H-3'), 3.83 (m, 1 H, H-2), 3.62 (dd, 1 H, H-1), 3.47 (dd, 1 H, H-1), 2.65 (t, 2H, 2 x H-5), 2.40 (m, 2H, 2 x H-2'), 1.80-1.40 (m, 8H, 2 x H-4, 2 x H-3, 2 x H-4', NH2), 1.40-1.20 (m, 18H, 9 x CH2), 0.88 (t, 3H, CH3) ; 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 170.78 ; 138.24 ; 137.63 ; 128.38 ; 128.32 ; 127.66 ; 127.62 ; 94.82 ; 76.70 ; 71.26 ; 69.63 ; 69.44 ; 48.48 ; 41.82 ; 41.47 ; 33.83 ; 31.84 ; 29.88 ; 29.58 ; 29.56 ; 29.51 ; 29.27 ; 29.04 ; 25.11 ; 22.62 ; 14.06. 2.9.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-L-aspartique, α-N-
{(4R)- 5-(benzyloxymethoxy)-4-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino]- pentvDamide β-benzyl ester L'aminé préparée comme décrit ci-dessus est couplée avec le β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-L-aspartique (préparé à partir du β-benzyl ester de l'acide L-aspartique, voir section 1.2.1) en présence de IIDQ dans les mêmes conditions que celles décrites dans la section 1.2.2. La purification du produit sur gel de silice (éther de pétrole/EtOAc 2:1 puis 1 :1) permet de recueillir l'amide correspondante avec un rendement de 65%. ES/SM: m/z 1169.7 ([M+H]+).
2.9.3 (3S. 9R)-3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-
S-benzyloxytétradécanoylaminol-décane-I .I O-diol 1-dibenzylphosphate Une solution du produit de couplage obtenu ci-dessus (1.05 g ; 0.90 mmol) dans un mélange EtOH/EtOAc 1/1 (65 ml) contenant Et3N (1.5 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (50 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 1 heure. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes. Le résidu est ensuite mis en solution dans un mélange /-PrOH/CH2CI2 1/1 (50 ml) et agité pendant 10 minutes à température ambiante avec une résine Amberlite IR-120 (H+) (3 ml). La résine est éliminée par filtration et le filtrat évaporé à sec pour donner l'acide libre (956 mg ; 99%) sous forme d'un solide cristallin blanc.
A une solution de l'acide obtenu ci-dessus (855 mg ; 0.79 mmol) dans du THF anhydre (5 ml) à 0°C et sous argon sont additionnés la Λ/-méthylmorpholine (87 μl ; 0.79 mmol ; 1 éq) puis l'isobutyl chloroformate (103 μl ; 0.79 mmol ; 1 éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de Λ/-méthylmorpholine. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est porté à 0°C puis une solution de NaBH4 (60 mg ; 1.58 mmol ; 2 éq) dans H20 (2 ml) est rapidement additionnée. Dès la fin du dégagement gazeux (5 minutes), la solution est diluée avec H20 (2 ml) et THF (2 ml) puis agitée 5 minutes à température ambiante. La solution est concentrée, diluée avec du CH2CI2 et H20, neutralisée avec une solution de HCI 1M puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS0 , filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ Acétone 4/1) permet de recueillir le produit de réduction (387 mg ; 46%) sous forme d'un solide cristallin blanc. A une solution de cet alcool (313 mg ; 0.29 mmol) et de 1H-tétrazole (62 mg ; 0.88 mmol ; 3 éq) dans du THF anhydre (12 ml) à température ambiante et sous argon est additionné le dibenzyl-diéthyl phosphoramidite à 85% (267 μl ; 0.67 mmol ; 2.3 éq). On observe rapidement la formation de cristaux blancs dans le milieu réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le mélange réactionnel est porté à -20°C puis une solution de mCPBA (57-86% ; 187 mg ; 1 ,08 mmol ; 3.7 éq) dans du CH2CI2 (8 ml) est additionnée. On observe la disparition des cristaux. Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de Na2S203 saturée (5 ml) est ajoutée puis le mélange réactionnel est agité 10 minutes. La solution est ensuite diluée à l'éther, puis la phase organique est séparée et lavée avec une solution de Na2S203 saturée (5x), une solution de NaHC03 saturée (2x) et une solution de HCI 1M (1x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ acétone 8/1 puis 5/1) permet de recueillir le phosphotriester (361 mg ; 93%) sous forme d'un solide amorphe.
Ce produit est soumis à une réaction d'hydrolyse de l'acétal benzyloxyméthyl en milieu THF-HCI aqueux ce qui fournit le (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodécanoyl- oxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-décane- 1 ,10-diol 1-dibenzylphosphate.
2.9.4 (3S.9R)-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hvdroxytétradécanoylaminol-décan-1 , 10-diol 1 -dihvdroqénophosphate 10- (6,7-dihvdroxyheptanoate)
Le produit obtenu ci-dessus est O-acylé en position 10 avec de l'acide hept-6- énoique en présence de EDCI dans le dichlorométhane à 0°C en présence de DMAP (voir section 2.3.1). Cet ester hepténoique est ensuit soumis à une réaction d'hydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium (catalytique) et d'oxyde de N- méthylmorpholine (voir section 2.3.2), ce qui fournit le diol correspondant (ester 6,7- dihydroxyheptanoique). Ce produit est déprotégé par hydrogénolyse dans l'éthanol sous pression atmosphérique d'hydrogène en présence de charbon palladié (voir section 2.3.3). 2.9.5. (3S,9R)-3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-[(R)- 3-hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -dihvdrogénophosphate 10-(6-oxohexanoate) Le diol déprotégé obtenu ci-dessus est soumis à une réaction d'oxydation périodique dans un mélange isopropanol-eau (mode opératoire, voir section 2.2.1).
2.9.6 (3S,9R)-3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylaminol-4-oxo-5-aza-9-[(R)-
S-hvdroxytétradécanovIaminol-décan-I .IO-diol 1-dihvdroqénophosphate 10-(6-hvdroxyhexanoate) (=OM-197-FV8)
A une solution du dérivé 6-oxohexanoique obtenu ci-dessus (4.5 mg, 0.0043 mmol) dans de l'isopropanol à 90% (20 ml) est ajouté une solution (0.2 ml) de NaBH4 dans du méthanol (1 mg/ml). Le mélange est agité pendant 3 min à 25°C, puis un excès d'acide acétique (0.2 ml) est ajouté. La purification par HPLC préparative sur colonne C18 permet de recueillir le produit OM-197-FV8 (2mg, 44%), en solution dans de l'isopropanol à 90%. ES/MS: m/z 1048.5 [M+H]+; 950.5 [M+H-(HO)2OPOH]+ (Figure 16).
EXEMPLE 2.10.
2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino} pentyle (-OM-144-FP9) (Figure 17)
2.10.1. Trifluorométhanesulfonate de hept-6-ényle
L'anhydride triflique Tf20 ((CF3 'S02)20, 11 ml ; 6.76 mmol) est ajouté goutte à goutte à -15°C à une solution de hept-6-èn-1-ol (515 mg ; 4.51 mmol) et de Et3N (627 μl ; 4.51 mmol) dans le CH2CI2 (10 ml) et le mélange est agité 30-45 minutes à -15°C jusqu'à disparition de l'alcool. Après retour à température ambiante, le milieu est dilué au CH2CI2 et lavé successivement avec H20, avec une solution aqueuse saturée de NaHC03, une solution aqueuse saturée de NaCI. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur MgS04 et concentrée sous vide pour conduire à un résidu qui est repris dans un mélange ethyl acetate/ether de pétrole (1/2) et filtré sur gel de silice (élimination des sels de triéthylamine formés lors de la réaction). Après evaporation du filtrat, le triflate attendu est obtenu avec un rendement de 87% (956 mg) et est utilisé dans l'étape suivante sans autre purification. Rf: 0.8 dans acétate d'éthyle/éther de pétrole, 1/2. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm: 5.7 ; 5.0 ; 4.45 ; 2.0 ; 1.8 ; 1.4. 13C-RMN (CDCI3, 62.89 MHz); δ en ppm : 138.21 ; 114.95 ; 77.68 ; 33.40 ; 29.13 ; 28.10 ; 24.53.
2.10.2. (2R)-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-5-(hept-6-ényl)amino-pentan- 1-ol
Une solution du triflate fraîchement préparé ci-dessus (956 mg, 3.88 mmol), dans du CH2CI2 (10 ml) est additionnée goutte à goutte à une solution de (2R)-5-amino-2- [(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (Section 1.1.2) (1.69 g ; 3.88 mmol) dans du CH2CI2 (10 ml) et le mélange est agité 4 heures à température ambiante sous argon. Après dilution au CH2CI2, le milieu réactionnel est lavé avec une solution aqueuse saturée en NaHC03 puis avec H20. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur MgS0 et concentrée sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution avec CH2CI2/MeOH 15/1) permet de recueillir l'aminé secondaire attendue (862 mg ; 43%). Rf : 0,3 (CH2CI2/MeOH 8/1). ES/MS : m/z 532.0 [M+H]\ RMN 1H (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm : 7.2-7.4 ; 7.1 ; 5.8 ; 5.0 ; 4.6 ; 3.95 ; 3.5 ; 2.9 ; 2.5 ; 2.1 ; 1.9-1.5 ; 1.5-1.2 ; 0.9. RMN 13C (CDCI3, 62.89 MHz); δ en ppm : 172.17 ; 138.28 ; 138.21 ; 128.39 ; 127.96 ; 127.71 ; 114.82 ; 76.80 ; 71.40 ; 63.81 ; 50.87 ; 48.30 ; 47.75 ; 41.57 ; 34.10 ; 33.39 ; 31.89 ; 29.66 ; 29.62 ; 29.33 ; 28.19 ; 28.03 ; 25.21 ; 26.11 ; 25.78 ; 22.82 ; 22.66 ; 14.10. RMN 1H (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm : 7.2-7.4 ; 6.75 ; 5.8 ; 5.0 ; 4.5 ; 3.9 ; 3.5 ; 2.5 ; 2.0 ; 2.1 ; 1.7-1.2 0.9. RMN 13C (CDCIs, 62.89 MHz); δ en ppm : 171.77 ; 138.68 ; 138.14 ; 128.23 127.72 ; 127.56 ; 114.22 ; 76.64 ; 71.37 ; 64.58 ; 51.45 ; 49.79 ; 49.37 ; 41.53 33.90 ; 33.53 ; 31.77 ; 29.65 ; 29.20 ; 28.64 ; 28.57 ; 25.00 ; 26.68 ; 25.93 ; 22.53 13.98 (spectres du sel d'ammonium et de la base libre, respectivement).
2.10.3. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(diphényloxyphosphoryl- oxy)butanoate de {2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-5-(hept-6-ényl) amino)pentyle A une solution de l'aminé secondaire obtenue ci-dessus (163 mg ; 0.307 mmol ; 1éq) et d'acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-[(R)3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]butanoïque (Section 1.1.1) (278 mg ; 0.368 mmol ; 1.2 éq) dans du CH2CI2 (25 ml) est ajouté la N,N-diisopropyléthylamine (DIEA) (54 μl; 1 éq). Le milieu est refroidi à 0°C et on ajoute ensuite de l'EDCI (71 mg ; 1.2 éq) et du 1-hydroxy-7- azabenzotriazole (HOAt) (41 mg ; 1 éq). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à 0°C puis 90 heures à température ambiante. La solution est alors lavée avec H20 et la phase organique est séchée sur MgS04 puis évaporée sous vide à 40°C. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 15/1) permet de recueillir le produit de O-acylation (126 mg ; 32%).
2.10.4. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-(diphényloxyphosphoryl- oxy)butanoate de {2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-5-(6,7- dihvdroxyheptyl)amino)pentyle Une solution fraîchement préparée d'Os04 à 2.5% dans la pyridine (1.1 ml ; 1.9 éq) est ajoutée goutte à goutte à 25°C à une solution du produit de O-acylation obtenu ci-dessus (70 mg ; 0.055 mmol) dans de la pyridine anhydre (5 ml). Le mélange est agité de 24 à 48 heures à température ambiante puis est traité par addition de Na2S205 et enfin dilué au CH2CI2, lavé successivement avec H20, avec une solution aqueuse HCI 1 N et à nouveau avec H20. La phase organique résultante est séchée sur MgS04, filtrée, évaporée et le résidu obtenu est soumis à une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 15/1 à 10/1) qui permet de recueillir le diol attendu (27 mg ; 38%). HPLC (210 nm) : TR = 37.25 min. ES/MS : m/z 1307.0 [M+H]+.
2.10.5. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihvdroxy-phosphoryl- oxy)butanoate de {2-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]-5-(6,7-dihvdroxy- heptvnamino)pentyle (=OM-144-FP8) a. Débenzylation
A une solution du diol obtenu ci-dessus (50 mg, 0.038 mmol) dans un mélange MeOH qualité HPLC/AcOH (5/0.2 ml) est ajouté le catayseur (Pd/C 10%) (10 mg). Le mélange réactionnel est agité 4 heures sous H2 (pression atmosphérique) à température ambiante. Le catalyseur est éliminé par filtration sur filtre millipores et le filtrat évaporé pour conduire, sans autre purification, au produit débenzylé (46 mg ; 99%). HPLC (210 nm): TR = 35.13 et 35.51 min (observation des deux diastéréoisomères). ES/MS: m/z 1217.0 [M+H]+. b. Déphénylation :
Le catalyseur (Pt02) (25 mg ; 3.8 eq) en suspension dans EtOH qualité HPLC (0.5 ml) est préactivé sous H2 pendant 10 minutes. Une solution, préalablement dégazée sous argon, du produit débenzylé obtenu ci-dessus (35 mg, 0.029 mmol) dans EtOH qualité HPLC (2 ml) est ajoutée à la suspension de catalyseur. Le mélange réactionnel est alors agité pendant 2 heures sous H2 à température ambiante. Le catalyseur est filtré sur filtre millipores et le filtrat évaporé pour conduire, sans autre purification, à l'ester phosphate attendu (26 mg, 87%). HPLC (210 nm) : TR = 29.3 et 30.9 min (observation des deux diastéréoisomères). ES/MS : m/z 1064.8 [M+H]+, 1086.8 [M+Na]+, 1108.8 [M-H+2Na]+ (Figure 18).
2.10.6. 2-f(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihvdroxy-phosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1-5-(6-oxohexyl)amino) pentyle (=OM-144-FP9) 1.87 ml.Nal04 0.1M (40.17 mg , 20 éq.) sont ajoutés à 10 mg (9.39 μmol, 1 éq.) du produit déprotégé préparé ci-dessus dans un mélange isopropanol-eau (1 :1). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol. TR = 30.0 et 31.5 min (observation de deux diastéréoisomères). ES/MS : m/z 1032.8 [M+H]+, 1054.8 [M+Na]+.
EXEMPLE 2.11.
(2R, 8R)-2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-nonane-1,9-diol 1-O-carboxy-méthyl éther 9-0-(6- oxohexanoate) (=OM-112-FV7) (Figure 19)
La D-serine est protégée sous forme de dérivé N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl) [Ref: Chen et Wang, Synthesis (1989), 36-37], puis la fonction OH alkylée avec le bromoacetate de benzyle en présence de NaH (2 equiv.). La fonction amine est libérée par traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, puis acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoique en présence de triéthylamine. Le dérivé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amine (2R)-5- amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (voir 4.1.1) en présence de IIDQ pour donner le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4- aza-8-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1-O-benzyloxycarbonyl- méthyl éther. Ce produit est ensuite O-acylé avec l'acide hept-6-ènoique en présence de EDCI. La double liaison de l'ester auxiliaire est hydroxylée avec le tétroxyde d'osmium (catalytique, en présence de N-méthylmorpholine N-oxyde), puis le diol déprotégé par hydrogénolyse en présence de palladium sur charbon dans l'éthanol. Le produit OM-112-FV-7 est obtenu par traitement avec du periodate de sodium dans un mélange isopropanol-eau. C65Hι03N3Oι2. MM: 1010.45.
EXEMPLE 2.12.
(2S,8R)-1-(Carboxyméthyl)thio-2-[(R)-3-tétradécanoyloxytétra-décanoylamino]- 3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytétradécanoy-lamino]-nonan-9-ol 9-0-(7-amino- heptanoate) (-OM-212-AH1) (Figure 20)
La D-cystéine est S-alkylée avec le bromoacetate de p-méthoxybenzyle en présence de carbonate de sodium en milieu THF-eau. La S-benzyloxycarbonylmethyl cystéine ainsi obtenue est N-acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-tétradécanoyloxy- tétradécanoique, puis le dérivé S-alkylé N-acylé de la D-cystéine est couplé avec l'amine (2R)-5-amino-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentan-1-ol {obtenue par hydrogénolyse de la (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1- ol, voir 4.1.1} en présence de IIDQ. Le produit ainsi obtenu est O-acylé sélectivement en position primaire avec l'ester dérivé de HOBt et de l'acide 7-(p- methoxybenzyloxy-carbonylamino)heptanoique. Les deux groupes p- méthoxybenzyle sont ensuite éliminés par traitement de l'ester avec de l'acide trifluoroacétique aqueux. C59Hn2N OιoS. MM :1069.64. EXEMPLE 2.13.
(2R, 8R)-2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-nonane-1,9-diol 1-0-(2,2-di-carboxyéthyl) éther 9- O-(β-oxohexanoate) (=OM-312-FV7) (Figure 21) Le dérivé N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl) de la D-serine est O-alkylé avec le methylènemalonate de dibenzyle en présence de NaH. La fonction amine est libérée par traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, puis acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodéca-noyloxytétradécanoique en présence de triéthylamine. Le dérivé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amine (2R)-5- amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (voir 4.1.1) en présence de IIDQ pour donner le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4- aza-8-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1 -0-[2,2-bis-(benzyloxy- carbonyl)ethyl] éther. Ce produit est O-acylé avec l'acide hept-6-énoique en présence de EDCI, puis l'ester hepténoyle soumis à une hydroxylation avec le tétroxyde d'osmium. Les groupes benzyles sont éliminés par hydrogénolyse en présence de palladium sur charbon dans l'éthanol. Le produit OM-312-FV-7 est obtenu par traitement du produit débenzylé avec du periodate de sodium dans un mélange isopropanol-eau. C58H 05N3Oι4. MM: 1068.49.
EXEMPLE 2.14.
3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-1,10-diol-1-dihydrogénophosphate 10-(6- bromoacetamidohexanoate) (≈OM-412-BA7) (Figure 22) Le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra- décanoylamino]-1 , 10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10-(6-aminohexanoate) (voir 4.2.3.3) est soumis à une réaction de bromoacétylation avec l'ester succinimidyloxy de l'acide bromoacétique dans un milieu eau-DMF en présence de triéthylamine. Le produit final est purifié par HPLC. C57H108BrN4O13P. MM: 1168.4.
EXEMPLE 2.15. (3RS, 9R)-3-[(R)-3-Hydroxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-décane-1,10-diol 1-dihydrogéno- phosphate 10-O-(6-oxohexanoate) (OM-512-FV7) (Figure 23)
L'acide 2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-4-diphényloxyphosphoryloxy-buta- noique [obtenu par N-acylation du sel trifluoroacétique de l'0-(diphényl- oxyphosphoryl)-DL-homosérinate de benzyle avec le chlorure de l'acide (R)-3- benzyloxytétradécanoique, puis coupure de l'ester de benzyle par hydrogénolyse dans l'éthanol en présence de triéthylamine et de charbon palladié] est couplé avec le (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodécanoyl-oxytétradécanoylamino]pentan-1-ol [obtenu par N-acylation du sel trifluoro-acétique du (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-amino- pentan-1-ol avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoique, puis déprotection du groupe amino en C-5 par hydrogénolyse dans l'éthanol en présence de triéthylamine et de charbon palladié] en présence de IIDQ. L'amide ainsi formé est O-acylé sur la fonction OH libre avec l'acide 6-hepténoique en présence de EDCI pour donner l'ester correspondant. La double liaison de l'ester auxiliaire est soumise à une réaction d'hydroxylation avec le tétroxyde d'osmium ; le groupe benzyle est ensuite éliminé par hydrogénolyse sur charbon palladié et le phosphate libéré par hydrogénolyse sur noir de platine. La fonction diol est soumise à une réaction d'oxydation périodique pour générer le dérivé 6-oxohexanoyle OM-512-FV7. C55H1o4N3013P. MM: 1046.42.
EXEMPLE 2.16.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, -N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamîno]pentyf}amide (≈ OM-197-MC-AC) (Figure 24)
2.16.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl1-D-aspartique, -N-((4R)-5-[6-
(benzyloxycarbonylamino)hexanoyloxy]-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoyl- amino]pentyl)amide β-benzyl ester A une solution d'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-
{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino] pentyljamide β-benzyl ester
(400 mg, 0.38 mmol) et d'acide 6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (220 mg, 0.83 mmol) dans du CH2CI2 sec (15 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (162 mg, 0.85 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (12 mg, 98 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1 N puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 9/1 puis 4/1) permet de recueillir le produit de couplage (395 mg 81%) sous forme d'un solide blanc. 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.46 173.29 ; 171.83 ; 171.14 ; 170.12 ; 156.38 ; 138.19 ; 136.60 ; 133.30 ; 128.51 128.42 ; 128.31 ; 127.99 ; 127.70 ; 127.58 ; 119.97 ; 76.49 ; 71.23 ; 71.06 ; 66.73 66.47 ; 49.21 ; 47.83 ; 41.42 ; 40.73 ; 39.14 ; 35.46 ; 34.38 ; 33.86 ; 33.70 ; 31.84 29.57 ; 29.46 ; 29.28 ; 29.10 ; 26.01 ; 25.54 ; 25.17 ; 25.08 ; 24.94 ; 24.31 ; 22.61 14.05.
2.16.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyπ-D-aspartique, α-N-((4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-r(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]pentyl)amide Une solution du composé préparé ci-dessus (340 mg, 0.26 mmol) dans un mélange CH2CI2/méthanol 5/1 (24 ml) contenant de l'acide acétique (2 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (40 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α -N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide (238 mg, rendement quantitatif). C55Hιo4N4010. ES/MS : m/z 981.9 ([M+H]+) (Figure 25).
EXEMPLE 2.17. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, -N-{(4R)-5-(6- succinylamidohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylaminoJ pentyl}amide (≈ OM-197-MC-AC-Succ) (Figure 24)
A une solution du produit de l'exemple 2.16 (Section 2.16.2) (50 mg; 0.051 mmol) dans la pyridine (3 ml) sont ajoutés successivement l'anhydride succinique (11 mg, 0.11 mmol) et la 4-N,N-diméthylaminopyridine (7 mg; 0.57 mmol). Après 6h d'agitation à 50°C sous Ar, du méthanol (2 ml) est ajouté et le milieu réactionnel est encore agité 15 min à temp. ambiante. Le solvant est évaporé et le produit purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant: CH2CI2/MeOH 7:1 puis 5:1); le produit est obtenu sous la forme d'un solide blanc (42 mg; 74%). C5gHιo8N4Oι3 ES/MS: m/z 1082 ([M+H]+). Rf = 0.1 (CH2CI2/MeOH 4:1).
EXEMPLE 2.18.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, -N-{(4R)-5- glycinyloxy-4-f(R)-3-hydroxytétradecanoylaminoJ pentyl}amide (= OM-197-MC-Gly) (Figure 24)
2.18.1 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-((4R)-5- benzyloxycarbonylaminoacétoxy]-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoyl- amino]pentyl)amide β-benzyl ester A une solution d'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino] pentyljamide β-benzyl ester (300 mg, 0.29 mmol) et de Λ/-benzyloxycarbonylglycine commerciale (101 mg, 0.49 mmol) dans du CH2CI2 sec (10 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (93 mg, 0.48 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (6 mg, 49 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1 N puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 8/1 puis 6/1) permet de recueillir le produit de couplage (313 mg ; 88%) sous forme d'un solide blanc. 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.71 ; 173.49 ; 171.80 ; 171.68 ; 171.21 ; 170.21 ; 170.06 ; 169.94 ; 169.84 ; 156.41 ; 138.18 ; 136.16 ; 135.26 ; 128.46 ; 128.40 ; 128.33 ; 128.26 ; 128.04 ; 127.93 ; 127.65 ; 127.55 76.49 ; 71.14 ; 71.07 ; 70.93 ; 66.90 ; 66.67 ; 66.38 ; 66.26 ; 49.21 ; 49.03 ; 47.72 47.66 ; 42.58 ; 41.83 ; 41.68 ; 41.32 ; 39.02 ; 35.58 ; 35.39 ; 34.34 ; 33.84 ; 31.80 29.52 ; 29.24 ; 29.06 ; 28.31 ; 28.13 ; 25.34 ; 25.12 ; 25.03 ; 24.89 ; 22.57 ; 14.01.
2.18.2. Acide N-f(R -3-dodécanoyloxytétradécanovn-D-aspartique, α-N-((4R)-5- glvcinyloxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradecanoylamino1 pentvDamide (≈ OM-197-MC-Glv) (Figure 24)
Une solution du composé préparé ci-dessus (268 mg, 0.22 mmol) dans un mélange CH2CI2/éthanol 5/1 (12 ml) contenant de l'acide acétique (2 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (30 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α -N-{(4R)-5-glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyl}amide (200 mg, rendement quantitatif). C5iH96N4O10. ES/MS : m/z 925.7 ([M+H]+), 947.8 ([M+Na]+). (Figure 26).
EXEMPLE 2.19.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, -N-{(4R)-5- succinyloxy-4-f(R)-3-hydroxytétradecanoylaminoJ pentyljamide (= OM-197-MC-Succ) (Figure 27)
2.19.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovπ-D-aspartique, α-N-((4R)-5- succinyloxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-benzyl ester
A une solution d'anhydride succinique (25 mg, 0.25 mmol) dans du CH2CI2 sec (2 ml) en présence de Et3N (40 μl, 0.29 mmol) à 0°C est additionnée une solution de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[ (R)-3-benzyloxytétradecanoylamino] pentyl}amide β-benzyl ester (Section 1.2.2)
(150 mg, 0.14 mmol) dans du CH2CI2 sec (5 ml). Le milieu réactionnel est agité 10 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec du CH2CI , lavé avec une solution de HCI 1 N puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS0 , filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone = 9/1 contenant 2% d'acide acétique) permet de recueillir l'acide (148 mg, 90%) sous forme d'un solide blanc ; 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 175.03; 173.55 173.35; 171.92; 171.72; 171.36; 170.97; 170.60; 170.46; 170.41; 138.05; 135.24 128.85; 128.76; 128.41; 128.27; 128.20; 128.03; 127.59; 76.48; 71.31 ; 70.77; 66.67 65.08; 49.20; 48.11; 41.48;41.31; 39.02; 35.80; 34.26; 34.13; 33.84; 31.77; 29.50 29.21 ; 29.03; 25.05; 24.99; 24.83; 22.54; 13.98.
2.19.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovπ-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- succinyloxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradecanoylamino] pentyl)amide (= OM- 197-MC-Succ) (Figure 27) Une solution du composé obtenu ci-dessus (124 mg, 0.11 mmol) est dissous à chaud dans de l'EtOH (qualité HPLC) (12 ml) contenant de l'acide acétique (1 ml) puis hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (15 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 10 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le di-acide (102 mg ; 97%). C53H97N3Oι2. ES/MS : m/z 968.6 ([M+H]+), 990.7 ([M+Na]+). (Figure 28).
EXEMPLE 2.20.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJ pentyljamide β-N-(3- aminopropyl)amide (≈ OM-197-AP) (Figure 29)
2.20.1 Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartigue, α-N-((4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl>amide Une solution du β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxy- tétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétra- decanoylamino] pentyl}amide (Section 1.2.2) (2.53 g ; 2.4 mmol) dans un mélange EtOH/EtOAc 1/1 (150 ml) contenant Et3N (4 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (120 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes. Le résidu est ensuite mis en solution dans un mélange /-PrOH/CH2CI2 1/1 (100 ml) et agité pendant 10 minutes à température ambiante avec une résine Amberlite IR-120 (H+) (5 ml). La résine est éliminée par filtration et le filtrat évaporé à sec pour donner l'acide libre (2.25 g ; 97%) sous forme d'un solide cristallin blanc. (Rf=0,45 dans CH2CI2/ MeOH 9/1 contenant 1 % d'acide acétique; révélateur U.V. et phosphomolybdique). PF = 115-117°C.
2.20.2 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyll-D-aspartigue, α-N-((4R)-5- hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1pentyl)amide β-N-(3- benzyloxycarbonylaminopropyl)amide
Une solution de IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (98 mg, 0.32 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (3 ml) est additionné à une solution du composé préparé ci-dessus (250 mg, 0.26 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (15 ml) à 0°C et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0°C puis une solution de chlorhydrate de 3-benzyloxycarbonylamino-propylamine commercial (70 mg, 0.29 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (7 ml) contenant de la triéthylamine (40μl, 0.29 mmol) est additionnée. Après 18 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 20/1) permet de recueillir le produit de couplage (217 mg ; 78%) sous forme d'un solide blanc.
2.20.3 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartigue, α-N-((4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1 pentvDamide β-N-(3- aminopropyDamide (= OM-197-AP) Une solution du composé préparé ci-dessus (50 mg, 44 μmol) dans un mélange CH2CI2/lsopropanol 1/1 (8 ml) contenant de l'acide acétique (1 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (10 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 6 à 8 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α -N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyl}amide β-N-(3- aminopropyl)amide (32 mg, 80%). CszH^NsOs. ES/MS : m/z 924.8 ([M+H]+), 1848.8 ([2M+H]+). (Figure 30).
EXEMPLE 2.21.
Acide N-[(R)-3~dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5- hydroxy-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide β-N-[(1S)-1- carboxy-5-aminopentyl]amide (≈ OM-197-Lys) (Figure 31)
2.21.1 Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl1-D-aspartique, α-N-((4R)-5- hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylaminolpentyl}amide β-N-[(1 S)-1 - benzyloxycarbonyl-5-benzyloxycarbonylaminopentvnamide Une solution de IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (114 mg, 0.38 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) est additionné à une solution de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[ (R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide (Section 2.20.1) (300 mg, 0.31 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (20 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes à température ambiante puis une solution de chlorhydrate de ε-Λ/-benzyloxycarbonyl-L-lysine benzyl ester commercial (140 mg, 0.34 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) contenant de la triéthylamine (48 μl, 0.34 mmol) est additionnée. Après 18 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 30/1 puis 20/1) permet de recueillir le produit de couplage (317 mg, 77%) sous forme d'un solide blanc. 13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.68; 172.35; 171.92 170.74; 170.62; 170.54; 156.75; 156.52; 138.31 ; 136.54; 135.12; 128.54; 128.40 128.28; 128.21 ; 127.96; 127.577; 127.59; 76.67; 71.40; 71.18; 67.20; 67.09; 66.48 64.67; 52.30; 51.19; 41.64; 40.34; 39.24; 37.58 ; 34.40; 34.10; 31.83; 29.58; 29.27 29.09; 25.16; 25.11; 24.93; 22.60; 14.04. 2.21.2 Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyll-D-aspartigue, -N-((4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1pentyl|amide β-N-[(1S)-1- carboxy-5-aminopentyl]amide (= OM-197-Lys) Une solution du composé préparé ci-dessus (93 mg, 71 μmol) dans un mélange CH2CI2/éthanol 1/1 (20 ml) contenant de l'acide acétique (0.5 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (17 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α -N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-N-[(1 S)-1 - carboxy-5-aminopentyl]amide (71 mg, rendement quantitatif). C55H105N5O10. ES/MS : m/z 996.9 ([M+H]+), 1018.9 ([M+Na ). (Figure 32).
EXEMPLE 2.22.
Acide N-[(R)~3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide β-N- [(1S)-1-carboxy-5-aminopentyl]amide (= OM-197-Lys-AC) (Figure 31)
2.22.1 Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl1-D-aspartigue, α-N-{(4R)-5-(6- benzyloxycarbonylaminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl aminolpentvDamide β-N-[(1S)-1-benzyloxycarbonyl-5-benzyloxycarbonyl- aminopentvπamide
A une solution d'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-
{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-N-[(1S)-1- benzyloxycarbonyl-5-benzyloxycarbonylaminopentyl]amide (Section 2.21.1) (317 mg,
0.24 mmol) et d'acide 6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (128 mg, 0.48 mmol) dans du CH2CI2 sec (15 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (93 mg,
0.48 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (12 mg, 98 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1N puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 5/1) permet de recueillir le produit de couplage (266 mg ; 71 %) sous forme d'un solide blanc.
2.22.2 Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovn-D-aspartique, α-N-((4R)-5-
(6-aminohexanoyloxy)-4-r(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]pentyl>amide -
N-f(1S)-1-carboxy-5-aminopentyl]amide (= OM-197-Lvs-AC)
Une solution du composé préparé ci-dessus (236 mg, 151 μmol) dans un mélange
CH2CI2/isopropanol 1/1 (20 ml) contenant de l'acide acétique (1 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (100 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α
-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide - N-[(1S)-1-carboxy-5-aminopentyl]amide (140 mg, 83%). C61Hιi6N60ιι. ES/MS : m/z
555.5 ([M+Hf2), 1110.0 ([M+H]+) (Figure 33).
EXEMPLE 2.23.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5- hydroxy-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide β-N-[(1S)-1,2- dicarboxy-ethyljamide (= OM-197-Asp) (Figure 34)
2.23.1 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovn-D-aspartique, α-N~f(4R)-5- hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl)amide β-N-[(1S)- 1 ,2-bis(benzyloxycarbonyl)ethvnamide
Une solution de IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (96 mg, 0.32 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) est additionné à une solution d'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3- benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide (Section 2.20.1) (252 mg, 0.26 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (20 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes à température ambiante puis une solution du sel de paratoluènesulfonate de l'acide L-aspartique dibenzyl ester commercial (141 mg, 0.29 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) contenant de la triéthylamine (40 μl, 0.29 mmol) est additionnée. Après 18 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 20/1) permet de recueillir le produit de couplage (260 mg ; 78%). 13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.68 ; 171.92 ; 171.17 ; 170.60 ; 170.46 ; 170.37 170.18 ; 170.06 ; 138.31 ; 138.19 ; 135.20 ; 135.12 ; 134.87 ; 128.48 ; 128.26 128.18 ; 127.75 ; 127.63 ; 127.56 ; 76.66 ; 71.40 ; 71.19 ; 70.98 ; 68.79 ; 67.59 66.85 ; 65.14 ; 64.73 ; 51.25 ; 50.17 ; 48.78 ; 48.67 ; 41.70 ; 39.37 ; 39.21 ; 37.50 35.94 ; 34.48 ; 34.38 ; 34.10 ; 31.81 ; 29.54 ; 29.25 ; 29.08 ; 27.93 ; 25.56 ; 25.14 25.09 ; 24.91 ; 22.58 ; 14.02.
2.23.2 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl1-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hvdroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl)amide β-N-[(1 S)-1 ,2- dicarboxyethyl]amide (= OM-197-Asp) Une solution du composé préparé ci-dessus (260 mg, 207 μmol) dans un mélange
CH2CI2/isopropanol 1/1 (20 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à
10% (50 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 4 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner le diacide (108 mg, 88%). C53H98N4012. ES/MS : m/z 983.7 ([M+H]+), 1005.8 ([M+Na]+). (Figure 35).
EXEMPLE 2.24.
Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, a-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide β-N- [(1S)-1,2-dicarboxyethyl]amide (= OM-197-Asp-AC) (Figure 34)
2.24.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanovπ-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- benzyloxycarbonylaminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl amino]pentyl)amide β-N-[(1 S)-1 ,2-bis(benzyloxycarbonyl)ethyl1amide
A une solution d'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-N-[(1 S)-1 ,2- bis(benzyloxycarbonyl)ethyl]amide (Section 2.23.1) (158 mg, 0.13 mmol) et d'acide 6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (84 mg, 0.32 mmol) dans du CH2CI2 sec (6 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3- diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (61 mg, 0.32 mmol) et la 4- diméthylaminopyridine (4 mg, 33 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1 N ; les phases sont ensuite séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 6/1) permet de recueillir le produit de couplage (83 mg ; 44%). 13C-RMN (62,89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.69, 173.53, 173.26, 171.21 , 171.11 , 170.61 , 170.38, 170.31 , 170.22, 156.36, 138.26, 136.58, 135.20, 134.87, 128.48, 128.38, 128.31 , 128.27, 128.19, 127.95, 127.55, 76.50, 71.24, 71.10, 67.58, 67.48, 66.79, 66.42, 65.69, 49.99, 48.77, 47.86, 41.70, 41.49, 40.70, 39.15, 37.50, 35.94, 34.44, 34.37, 33.97, 33.67, 31.80,29.54, 29.24, 29.07, 28.37, 25.98,25.55, 25.13, 25.08, 24.91 , 24.28, 22.58, 14.02.
2.24.2 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1pentyl)amide β-
N-[(1S)-1 ,2-dicarboxyethyllamide (= OM-197-Asp-AC)
Une solution du composé préparé ci-dessus (80 mg, 0.053 mmol) dans un mélange
CH2CI2/éthanol 1/4 (10 ml) contenant de l'acide acétique (1 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (50 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner le diacide (61 mg, rendement quantitatif) ; SM : Cale. pour CsgH^gNsOis 1095.8 ; Trouvé : m/z 1097.0 ([M+H]+). (Figure 36). EXEMPLE 2.25.
Acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-f(R)-3- hydroxytétradécanoylaminoJpentyl}amide (= OM-197-NO2-AC) (Figure 37)
2.25.1. Acide N-acétyl-D-aspartique, β-benzyl ester A une solution d'anhydride acétique (85 μl, 0.90 mmol) dans l'acétonitrile (1 ml) est ajoutée une solution de H-D-Asp(OBn)-OH commercial (Senn Chemicals, CH- Dielsdorf) (200 mg, 0.90 mmol) dans un mélange CH3CN/H20/Et3N (3.5/1.0/0.4 ml). Le milieu réactionnel est agité 18h à température ambiante. Le solvant organique est évaporé et la phase aqueuse résiduelle refroidie à 0°C, acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% jusqu'à pH=3 et extraite avec EtOAc (2 x). Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgS04, filtrées et évaporées. Le β-benzyl ester de l'acide N-acétyl-D-aspartique obtenu sous forme d'un solide cristallin blanc (192 mg, 81%) est utilisé dans l'étape suivante sans autre purification. (Rf=0,30 dans CH2CI2/MeOH 20/1 contenant 2% d'acide acétique ; révélateur U.V. et phosphomolybdique)
2.25.2 Acide N-acétyl-D-aspartique. α-N-((4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-benzyl- oxytétradécanoylamino] pentvDamide β-benzyl ester Une solution de IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (254 mg ; 0,84 mmol ; 1 ,2 éq) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) est additionnée à une solution du β-benzyl ester de l'acide N-acétyl-D-aspartique préparé ci-dessus (185 mg ; 0,70 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (15 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis une solution de (2R)-5- amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-o! (Section 1.1.2) (334 mg ; 0,77 mmol ; 1 ,1 éq) dans du CH2CI2 anhydre (10 ml) est ajoutée. Après 3 heures d'agitation, le solvant est évaporé. Une purification du produit résiduel par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 5/3 puis acétone) permet de recueillir le produit de couplage (369 mg ; 78%). (Rf=0,22 dans CH2CI2/acétone 5/2 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique). 13C-RMN (62,89 MHz, CD3OD), δ en ppm : 171,92 ; 171 ,23 ; 171 ,07 ; 170,61 ; 170,35 ; 138,11 ; 135,24 128,40 ; 128,24 ; 128,02 ; 127,69 ; 127,59 ; 71 ,25 ; 67,57 ; 64,56 ; 51 ,03 ; 49,41 41 ,51 ; 39,21 ; 35,90 ; 33,88 ; 31 ,73 ; 29,46 ; 29,17 ; 28,32 ; 28,02 ; 25,35 ; 25,24 24,97 ; 22,83 ; 22,51 ; 13,97 ; SM : Cale, pour C39H59N307 681 ,4 ; Trouvé : m/z 682,5 ([M+H]+), 704,5 ([M+Naf).
2.25.3 Acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-((4R)-5-f6-(benzyloxycarbonylamino)
' 5 hexanoyloxy]-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1 pentvDamide β- benzyl ester
A une solution d'acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3- benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-benzy! ester (200 mg, 0.29 mmol) et d'acide 6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (156 mg, 0.59 mmol) dans du
10 CH2CI2 sec (8 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (112 mg, 0.59 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (7 mg, 59 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis une solution HCI 1 N ; les phases sont ensuite
15 séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/acétone 6/1) permet de recueillir le produit de couplage (200 mg ; 73%) sous forme d'un solide blanc. 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.65, 171.71, 171.26, 170.30, 156.41 , 138.16, 136.60, 135.33, 128.57, 128.46, 128.38, 128.20, 128.04, 127.76,
20 127.62, 71.21 , 66.80, 66.53, 65.72, 65.63, 49.36, 47.80, 41.36, 40.76, 39.22, 39.13, 35.79, 33.75, 31.88, 29.61 , 29.31 , 28.58, 28.52, 26.04, 25.48, 25.11 , 24.36, 23.13, 22.64, 14.09.
2.25.4. Acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-r(R)-3- 25 hydroxytétradécanoylaminolpentyllamide (OM-197-NO2-AC)
Une solution du composé préparé ci-dessus (200 mg, 0.22 mmol) dans un mélange CH2CI2/éthanol 1/1 (16 ml) contenant de l'acide acétique (2 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (40 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est 30 éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide (132 mg, rendement quantitatif) ; SM : Cale, pour C3ιH58N408 614.43 ; Trouvé : m/z 615.5 ([M+Hf), 629.5 ([M+NH4 ), 637.5 ([M+Na]+) (Figure 38).
EXEMPLE 2.26.
Acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, a-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoy- loxy)-4-f(R)-3-hydroxytétradécanoylaminoJ entyljamide (- OM-197-N'(C10- 20C8)-AC) (Figure 39)
2.26.1. 2-Hvdroxyoctanoate de benzyle
A une solution d'acide-2-hydroxyoctanoïque racemique commercial (1 ,00 g, 6,2 mmol) dans l'acétate d'éthyle de qualité HPLC (30 ml) sont ajoutés successivement le bromure de benzyle (2,22 ml; 18,7 mmol), la triéthylamine (2,6 ml; 18,7 mmol) et l'iodure de tétrabutylammonium (1 ,15 g; 3,12 mmol). La solution est agitée 18 heures à température ambiante puis le solvant est évaporé. Le résidu est repris dans de l'éther puis cette phase organique est lavée avec une solution de NaHC03 saturée puis avec H20 (2χ). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée pour donner le 2-hydroxyoctanoate de benzyle brut (Rf=0,57 dans éther de pétrole/ EtOAc 3/1 ; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.26.2. 2-Décanoyloxyoctanoate de benzyle A une solution de l'ester précédemment obtenu (780 mg ; 3,12 mmol) dans du CH2CI2 sec (15 ml) à 0°C sont ajoutés de la pyridine (0.9 ml) puis le chlorure de décanoyle (654 mg ; 3,43 mmol) au goutte à goutte. Le mélange est agité 20 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est versé dans de l'eau glacée contenant NaHCθ3 (5%). La phase organique est séparée, lavée avec une solution de HCI 1N puis avec H20 (2χ). La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/EtOAc 30/1) permet de recueillir le 2-décanoyloxyoctanoate de benzyle pur. 2.26.3. Acide 2-décanoyloxyoctanoïque
Le 2-décanoyloxyoctanoate de benzyle obtenu ci-dessus (515 mg ; 1 ,27 mmol) dans de l'EtOH de qualité HPLC (40 ml) est hydrogéné en présence de Pd sur charbon à 10%) (100 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration sur membrane millipore. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'acide 2-décanoyloxyoctanoïque (rendement quantitatif).
2.26.4. Acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, β-benzyl ester A une solution d'acide 2-décanoyloxyoctanoïque (317 mg ; 1.01 mmol) dans du THF anhydre (2 ml) à -15°C et sous argon sont ajoutés successivement la N- méthylmorpholine (111 μl ; 1.01 mmol ; 1éq) et l'isobutyl chloroformate (131 μl ; 1.01 mmol ; 1éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de N- méthylmorpholine. Après 30 minutes d'agitation à -15°C, une solution de H-D- Asp(OBn)-OH commercial (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf) (225 mg ; 1.01 mmol ; 1éq) dans un mélange CH3CN/H20 3,5/1 (9 ml) contenant Et3N (0.4 ml) est alors ajoutée. Le mélange réactionnel est ensuite agité une nuit à température ambiante. La phase organique est ensuite évaporée puis la phase aqueuse refroidie à 0°C, acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% jusqu'à pH=3 et extraite avec EtOAc (2x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/ EtOAc 2/1 contenant 2% d'acide acétique) suivi d'une coévaporation au toluène permet de recueillir le β-benzyl ester de l'acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D- aspartique (140 mg ; 27%).
2.26.5. Acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, α-N-((4R)-5-hvdroxy-4-[ (R)-3-benzyloxytétradécanoylamino] pentyl}amide β-benzyl ester
IIDQ (98 mg ; 0.32 mmol ; 1.2 éq) est additionné à une solution du β-benzyl ester de l'acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique (140 mg ; 0.27 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (15 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis une solution de (2R)-5-amino-2-[(R)-3- benzyloxy-tétradécanoylamino]pentan-1-ol (Section 1.1.2) (129 mg ; 0.30 mmol ; 1.1 éq) dans du CH2CI2 anhydre (5 ml) est additionnée. Après 18 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 5/1 puis CH2CI2/Acétone 1/1) permet de recueillir le produit de couplage (197 mg ; 78%). (Rf=0.30 dans CH2CI2/Acétone 5/1; révélateur U.V. et phosphomolybdique).
2.26.6. Acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-[6-(benzyl- oxycarbonylamino)hexanoyloxyl-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoyl- amino] pentvDamide β-benzyl ester
A une solution du β-benzyl ester de l'acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide (197 mg,
0.21 mmol) et d'acide 6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoïque (112 mg, 0.42 mmol) dans du CH2CI2 sec (8 ml) à 0°C et sous argon sont successivement ajoutés le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide commercial (81 mg,
0.42 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (6 mg, 42 μmol). Le mélange réactionnel est ensuite agité 30 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite lavé avec de l'eau puis avec une solution HCI 1 N ; les phases sont ensuite séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution
CH2CI2/acétone 6/1) permet de recueillir le produit de couplage (170 mg ; 68%).
2.26.7. Acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartigue, α-N-((4R)-5-(6-amino hexanoyloxy)-4- (R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]pentyl}amide
Une solution du composé préparé ci-dessus (150 mg, 0.13 mmol) dans un mélange CH2CI2/éthanol 1/1 (16 ml) contenant de l'acide acétique (2 ml) est hydrogénée en présence de Pd sur charbon à 10% (40 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 12 à 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour donner l'acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- (6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide (110 mg, rendement quantitatif) ; SM : Cale, pour C47H88N4O10 868.65 ; Trouvé : m/z 870.0 ([M+H]+), 884.0 ([M+NH4]+), 891.5 ([M+Na]+).(Figure 40). EXEMPLE 2.27.
Purification et analyse des composées selon l'invention
Les produits de synthèse et des pseudodipeptides acylés portant un bras auxiliaire fonctionnalisé sont solubilisés dans un mélange eau - isopropanol (1 :1 v/v). La quantité nécessaire de bicarbonate d'ammonium 2M est ensuite ajoutée pour atteindre une concentration de 50 mM.
2.27.1. Purification
La purification est effectuée par HPLC préparative en phase inverse dans les conditions suivantes :
Colonne: Bondapack C18 PrepPak, 40 x 200 mm, 15-20 μm, 300 A, Waters Phase mobile: A: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium
B: isopropanol - eau (2:8, v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium
Débit: 40 ml/min Elution: Adsorption isocratique sur la colonne : 40% B (60% A), 10 minutes
Gradient A: B : 40 à 80% B en 10 minutes
Elution isocratique 80% B, 30 minutes
Lavage : 100% B, 10 minutes
Détection: UV, 210 nm
Au cas où la présence de produits aromatiques serait observée (étape de déprotection incomplète), une purification plus fine doit être effectuée. Cette purification supplémentaire est réalisée dans les conditions suivantes:
Colonne: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 μm, 100 A, Macherey-Nagel
Phase mobile: A: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium B: isopropanol - eau (2:8, v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium
Débit: 5 ml/min Elution: Adsorption isocratique sur la colonne: 40% B (60% A), 10 minutes Elution isocratique : 84% B, 30 minutes Lavage : 100% B, 10 minutes
Détection: UV, 210 Système : Waters 2000
Les fractions contenant les composés d'intérêt sous forme de sel d'ammonium sont rassemblées et concentrées par adsorption sur phase C18 Bondapack, 15-20 μm, 300 A, Waters. Le contre ion peut ensuite être échangé par lavage au moyen d'une solution aqueuse d'un sel de métal alcalin (tel que NaCI ou KCI, par exemple) à 10 g/L dans l'eau - isopropanol (9:1 , v/v). Après élimination de l'excédent de sel par passage de 5 volumes d'un mélange eau - isopropanol (9:1 , v/v) sur la colonne, le composé est élue avec de l'isopropanol pur.
2.27.2. Suivi de la purification
Après chaque étape, les fractions sont analysées par chromatographie analytique HPLC en phase inverse selon les conditions suivantes :
Colonne: Supelcosil C18, 3 μm, 4.6 x 150mm, 100 A, Supelco
Phase mobile: A: eau - acétonitrile (1 :1 , v/v), 5mM TBAP
B: eau - isopropanol (1:9, v/v), 5mM TBAP
TBAP : phosphate de tétrabutylammonium
Débit: 1 ml/min Elution: Gradient A:B (75:25 à 0:100) en 37.5 minutes Détection: UV, 210 et 254 nm Chromatographe: Pour ces analyses, différents chromatographes HPLC ont été utilisés (HP1050 Ti séries, HP1090 séries M, LabChrom-
Shimadzu). Les temps de rétention selon le système utilisé peut varier d'environ une minute pour un composé donné. 2.27.3. Dosage et analyse de pureté des produits finaux
Le dosage et le contrôle de pureté des produits obtenus sont réalisés par HPLC/UV dans les conditions chromatographiques décrites ci-dessus. Selon ces analyses les puretés obtenues des produits varient entre 97 et 100%. Afin de mettre en évidence la présence d'impuretés inactives en UV, des analyses LC/ES-MS ont été réalisées (ionisation de type electrospray, mode positif). Pour satisfaire aux conditions d'ionisation, les conditions chromatographiques suivantes ont été utilisées :
Colonne: Vydac C4, 5 μm, 4.6 x 150mm, 300 A Phase mobile: A: eau - acétonitrile (1 :1 , v/v), 0.05% TFA
B: eau - isopropanol (1 :9, v/v), 0.05% TFA Débit: 1 ml/min
Elution: Gradient A:B (80:20 à 0:100) en 20 minutes
Température : 40°C
2.27.4. Analyses spectroscopiques
Spectrométrie de masse
Les spectres ES/MS (modes positif et négatif) ont été mesurés sur des spectromètres de masse de différents types (Finnigan LCQ, ion trap; Micromass Quattro II, triple stage quadrupole; Micromass Z-Bio-Q, triple stage quadrupole). Des analyses complémentaires de type MS/MS ont également été réalisées.
Résonance magnétique nucléaire Les spectres 1 H-RMN et 13C-RMN ont été mesurés sur des appareils de type Bruker DPX à 250.13 et 62.89 MHz. 3eme série d'exemples: préparation des conjugués
EXEMPLE 3.1.
Conjugués avec le peptide FGFG Comme le montrent les schémas de synthèses présentés dans les Figures 5, 8, 15, 17, 19, 21 et 23, une réaction de dihydroxylation vicinale est réalisée sur les pseudodipeptides acylés portant un bras auxiliaire de type oléfinique pour conduire à la formation d'une fonction diol stable. Une réaction d'oxydation périodique est ensuite effectuée pour créer une fonction aldéhyde sur le bras auxiliaire. Cette dernière permet, par une réaction d'amination réductrice, de coupler par exemple un peptide de petite taille tel que FGFG (Phénylalanine-Glycine-Phénylalanine-Glycine, Sigma). Une étape de purification de l'aldéhyde est toutefois nécessaire afin d'éliminer les sels présents en solution. Cette purification de l'aldéhyde est réalisée sur phase Bondapack C18 (Waters), 15-20 μm, 300 A, selon la procédure suivante :
- adsorption après dilution dans un mélange isopropanol-eau (1:3)
- élution des sels avec un mélange isopropanol-eau (1 :9)
- élution de l'aldéhyde avec un volume minimum d'isopropanol
La réaction de couplage par amination réductrice est réalisée en solution aqueuse en respectant une stœchiométrie égale entre les fonctions aldéhyde (bras auxiliaire du pseudodipeptide acylé) et les fonctions aminés disponibles sur le peptide ou la protéine à coupler.
Dans l'exemple du peptide FGFG, 2 mg d'OM-197-FV7 purifié (1.86 μmol, 1 éq.) ont été ajoutés à une solution de 0.8 mg de FGFG (1.86 μmol, 1 éq.) dissous dans 1 ml H20-MeCN (1 :1). La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante pour former l'imine. L'étape de réduction est ensuite effectuée par adjonction de 92 μl de NaBH3CN 1 M (5.77 mg, 50 éq.) pour former une liaison carbone-azote particulièrement stable (Figure 41). Le conjugué est purifié dans un premier temps sur colonne Vydac C4 pour éliminer le peptide n'ayant pas réagi, puis sur phase Bondapack C18 (Waters) pour obtenir le sel de sodium (voir paragraphe : purification et analyse des composés selon l'invention). Le conjugué est ensuite resolubilisé dans H20 stérile 0.01% triéthanolamine (TEoA) pour satisfaire aux conditions des tests d'activités biologiques. Le spectre de masse ES/MS enregistré après purification est présenté en Figure 43 et met en évidence un ion moléculaire [M+H]+ à m/z 1457.4, indiquant le couplage attendu. Les ions visibles entre m/z 400 et 900 ont été identifiés par des analyses MS/MS comme étant des fragments provenant du pic moléculaire du peptide conjugué. Les ions correspondant au peptide FGFG initial (m/z 427 A [M+H]+, m/z 853.0 [2M+H]+, Figure 42) n'ont pas été détectés.
EXEMPLE 3.2.
Conjugués avec le peptide (NANP)6P2P3o Le composé OM-197-FV7 obtenu par le schéma de synthèse présenté en Figure 5 peut être couplé, par exemple, à un peptide d'intérêt pharmaceutique tel que (NANP)6P2P3o [Valmori ét al., 1992, J. immunol. 149, 717-721], dont la séquence est la suivante :
(NANP)6QYI ANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
Le peptide (NANP)6p2P3o présente quatre sites de conjugaison possibles (amine terminale + trois lysines). 5 mg d'OM-197-FV7 purifié (4.64 μmol, 4 éq) ont été ajoutés à une solution de 7.49 mg de (NANP)6P2P3o (1 16 μmol, 1 éq) dissous dans 1 ml H20-isopropanol (1 :1) La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 230 μl de NaBH3CN 1 M (14.43 mg, 50 éq). ) La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H20 pendant 24 heures, (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce). L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel montre la présence de trois types de molécules, comme le montrent les chromatogrammes présentés en Figure 44: les pics correspondant au peptide libre (pic A), au peptide monoconjugué (pic B) et au peptide biconjugué (pic C) sont clairement visibles. Les enveloppes ioniques enregistrées pour chacun d'eux sont présentées aux Figures 45, 46 et 47 et attestent d'une conjugaison covalente à une ou deux molécules de OM-197-FV pour le monoconjugué et le biconjugué, respectivement.
Figure 45 : Peptide (NANP)6P2P3o (peptide libre). PM: 6451
Ions à m/z 1076.2 (A6), 1291.2 (A5), 1613.7 (A4). Figure 46 : Monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P30. PM: 7481 ions à m/z 1247.8 (B6), 1497.4 (B5), 1871.2 (B4). Figure 47 : Biconjugué (OM-197-FV)2-(NANP)6P2P3o. PM: 8511 Ions à m/z 1419.6 (C6), 1703.3 (C5), 2129.1 (C4).
L'analyse par SDS-PAGE des conjugués OM-197-FV-(NANP)6P2P3o a permis de mettre en évidence différentes bandes distinctes correspondant au peptide n'ayant pas réagi, au monoconjugué et au biconjugué. Dans les conditions électrophorétiques utilisées (gradient 10-20% polyacrylamide, tampon tris-tricine, Bio Rad, #161-1108), les standards en présence ont permis d'évaluer à environ mille uma la différence entre les bandes d'intérêts, confirmant le couplage de une ou deux molécules d'OM-197-FV sur le peptide.
EXEMPLE 3.3.
Conjugués avec le peptide P2P30
D'autres peptides peuvent également être couplés par amination réductrice aux composés portant un bras auxiliaire de type aldéhyde. On présentera par exemple le couplage d'OM-197-FV7 au peptide P2P3o- Ce dernier correspond à la partie épitope T de la toxine tenanus toxoid et présente la séquence suivante:
KQYI ANS FIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
Le peptide P2P3o présente cinq sites de conjugaison possibles (amine terminale + quatre lysines) et une masse de 4200 uma. Cinq équivalents de OM-197-FV7 ont donc été engagés. Les conditions réactionnelles décrites ci-dessus ont été appliquées. Après dialyse contre H20 (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce), les spectres de masse des conjugués obtenus ont été mesurés par LC/ES- MS et comparés à ceux enregistrés pour le peptide libre P2P3o qui présente des ions multiplement chargés m/z 840.9 (A5), 1050.9 (A4) et 1401.0 (A3) qui constituent l'enveloppe ionique (Figure 48) d'un peptide de masse moléculaire de 4200 uma. Le spectre ES/MS du monoconjugué OM-197-FV-P2P3o présente des ions multiplement chargés m/z 872.8 (A6), 1047.1 (A5), 1308.6 (A4) et 1744.4 (A3) (Figure 49) qui constituent l'enveloppe ionique d'un conjugué de masse moléculaire de 5230 uma, correspondant au greffage d'une molécule de OM-197-FV sur une molécule de peptide P2P3o par amination réductrice.
De même, le spectre de masse obtenu pour le biconjugué (OM-197-FV)2-P2P30 ne laisse aucun doute quant à la présence de deux molécules de OM-197-FV par unité de peptide. L'enveloppe ionique constituée par les ions m/z 1044.5 (A6), 1253.1 (A5), 1566.3 (A4) et 2088.4 (A3) (Figure 50), qui après transformation attestent de la masse moléculaire attendue pour le biconjugué (6261 uma).
EXEMPLE 3.4.
Conjugués avec le peptide (NANPjβCS. T3 Un couplage similaire peut être réalisé sur le peptide (NANP)3CS.T3 (TNO, PM: 3527 uma), dont la séquence est la suivante :
NANPNANPNANPDIE KIAKMEKASSVFNWNS
Après dialyse contre H20, les ions observés sur les spectres ES/MS indiquent des masses moléculaires de 4557 et 5587 uma, correspondant aux valeurs attendues pour les composés mono- et biconjugués.
EXEMPLE 3.5.
Conjugués avec le peptide MR99B
Le composé OM-197-MC-FV6, obtenu par le schéma de synthèse présenté en Figure 8, peut être couplé, par exemple, à un peptide d'intérêt pharmaceutique tel que PyCS 245-253. Ce peptide, correspondant à la partie épitope T de Plasmodium yoelii [Franke, E.D. et al., 1997, J. Immunol. 159, 3424-3433], présente la séquence suivante :
SYVPSAEQI (PyCS 245-253)
Afin de ne pas modifier la partie épitope-T lors de l'étape de conjugaison, les acides aminés SER ont été ajoutés pour former un peptide appelé MR99B, de séquence :
SERSYVPSAEQI (MR99B)
Du fait de sa séquence dépourvue de lysine, le peptide MR99B présente un site unique de conjugaison par amination réductrice (sur l'amine terminale). Ainsi, 2 mg d'OM-197-MC-FV6 purifiés (2.04 μmol, 1.4 éq.) sont ajoutés à une solution de 2 mg de MR99B (1.47 μmol, 1 éq.) dissous dans 1 ml H20-isopropanol (1 :1) La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 29.4 μl de NaBH3CN 1M (29.4 μmol, 20 éq.). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel permet de mettre en évidence la formation d'un conjugué OM-197-MC-FV-MR99B de masse moléculaire attendue (2330.4 uma, Figure 51), comme l'attestent les spectres présentés en Figures 52 (enveloppe ionique) et 53 (spectre transformé).
La purification du conjugué OM-197-MC-FV-MR99B est réalisée par chromatographie liquide semi-préparative sur phase C4 dans les conditions suivantes :
Colonne: Vydac C4l 250 x 10mm, 5 μm, 300A (Vydac)
Phase mobile: A: eau - MeCN (9:1 , v/v), 0.05% TFA B: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 0.05% TFA
Débit: 2.5 ml/min
Elution: Elution isocratique : 65%) B, 20 minutes
Lavage : 100% B, 10 minutes
Détection: UV, 210 nm Système : HPLC 1050
Afin de montrer que la partie antigènique du peptide n'est pas affectée par la conjugaison, une digestion à la trypsine du conjugué OM-197-MC-FV-MR99B est réalisée. 0.5 mg de conjugué sont incubés 24 heures à 25°C avec 83 μg de trypsine (Roche, #109819) (ratio substrat-enzyme (6 :1)) dans 1 ml de tampon 50mM Tris HCI, 2 mM CaCI2, pH 8.
L'analyse LC/ES-MS après la réaction est présentée en Figure 54 et permet de mettre en évidence deux fragments dont les spectres ES-MS sont présentés en Figures 55 et 56. Le premier fragment exhibe des ions à m/z 993.5 ([M+H]+) et 1015.6 ([M+Na ) et correspond au peptide CSPy 245-253 (Figure 55). Le second fragment présente des ions à m/z 678.1 ([M+H]+2) et 1355.0 ([M+H]+), indiquant la présence d'une structure de type OM-197-MC-FV-SER (Figure 56). Un troisième pic est également observé. Il correspond aux deux fragments SYVPS et AEQI (coéluants dans ces conditions chromatographiques). Cette réaction est également observée lors de la digestion de MR99B seul.
Ces résultats montrent clairement que la conjugaison ne modifie pas la partie épitope-T du peptide MR99B, comme l'illustre le schéma de la Figure 51.
EXEMPLE 3.6.
Conjugués avec le peptide MR99A Afin d'augmenter le degré de conjugaison de OM-197-MC-FV d'un peptide et augmenter le ratio adjuvant/antigène sans modifier la partie épitope-T, des séquences de type KGG peuvent être greffées au peptide à conjuguer. Ainsi, une séquence KGGKGGK peut, par exemple, être greffée au peptide MR99B, pour donner le peptide MR99A suivant :
KGGKGGKSERSYVPSAEQ MR99A Celui-ci présente alors quatre sites de conjugaison possibles pour une réaction d'amination réductrice (trois lysines et l'amine terminale). Ainsi, 12 mg d'OM-197- MC-FV6 purifié (12.2 μmol, 12 éq.) ont été ajoutés à une solution de 2 mg de MR99A (1.01 μmol, 1 éq.) dissous dans 1 ml H20-isopropanol (1:1) La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 242 μl de NaBH3CN 1M (244 μmol, 242 éq.). La solution est agitée pendant 2 heures à température ambiante. L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel permet de mettre en évidence différents pics correspondant aux différents degrés de conjugaison de molécules d'OM-197-MC-FV sur le peptide MR99A. Les spectres de masse correspondant au triconjugué (OM-197-MC-FV)3- MR99A (4870 uma) sont montrés aux Figures 57 (enveloppe ionique) et 58 (spectre transformé), alors que les spectres présentés en Figures 59 (enveloppe ionique) et 60 (spectre transformé) attestent de la formation du tétraconjugué (OM-197-MC- FV)4-MR99A (5834 uma). Des ions correspondant à une forme pentaconjuguée sont également observés. Ce résultat montre que la lysine, dans certaines conditions réactionnelles (excès d'OM-197-MC-FV), n'est pas le seul acide aminé à pouvoir réagir par amination réductrice.
La purification des tri- et tétra-conjugués (OM-197-MC-FV)3-4-MR99A est réalisée par chromatographie liquide semi-préparative sur phase C4 dans les conditions suivantes :
Colonne: Vydac C4, 250 x 10mm, 5 μm, 300A (Vydac)
Phase mobile: A: eau - MeCN (9:1 , v/v), 0.05% TFA
B: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 0.05% TFA Débit: 2.5 ml/min
Elution: Elution isocratique : 85% B, 20 minutes
Lavage : 100% B, 10 minutes Détection: UV, 210 nm
Système : HPLC 1050
Comme dans le cas du monoconjugué OM-197-MC-FV-MR99B, une digestion à la trypsine est réalisée sur les polyconjugués (OM-197-MC-FV)n-MR99A afin de déterminer si la partie antigènique (CSPy 245-253) n'est pas affectée par la conjugaison. 1 mg de polyconjugué est incubé 24 heures à 25°C avec 166 μg de trypsine (Roche, #109819) (ratio substrat-enzyme (6 :1)) dans 1 ml de tampon 50mM Tris HCI, 2 mM CaCI2, pH 8.
L'analyse LC/ES-MS après réaction permet de mettre en évidence de nombreux fragments correspondant à des clivages à divers endroits du peptide MR99A. Parmi ceux-ci, on relèvera le fragment présentant des ions à m/z 993.5 ([M+H]+) et 1015.6 ([M+Na]+) et correspondant au peptide CSPy 245-253. La présence de ce dernier atteste de l'intégrité de la partie épitope-T du peptide même après une conjugaison multiple. Deux fragments, observés par leurs ions triplement chargés à m/z 1621.4 ([M+H]3+) et 1942.8 ([M+H]3+, sont particulièrement intéressants. En effet, ils correspondent aux fragments (OM-197-MC-FV)4-KGGKGGKSER et (OM-197-MC- FV)5-KGGKGGKSER, respectivement. L'observation de ces derniers montre que les différentes molécules d'OM-197-MC-FV sont effectivement greffées sur la séquence ajoutée à CSPy 245-253, même dans le cas où des acides aminés autres que la lysine ont réagi lors de l'étape d'amination réductrice. On soulignera également que la présence de plusieurs molécules de OM-197-MC-FV, stériquement importante, sur un peptide n'affecte pas l'activité de protéase telle que la trypsine. Ce résultat prend dès lors une importance particulière dans le cas, par exemple, de conjugaison à une prodrogue où le principe actif peut être libéré après un clivage sélectif d'une liaison seccable.
EXEMPLE 3.7.
Conjugués avec des peptides de Ag85c
Les structures porteuses d'un bras auxiliaire de type formylevaléryle peuvent être conjuguées à de nombreux peptides d'intérêt pharmaceutique. Nous citerons, par exemple, le greffage par amination réductrice de molécules d'OM-197-MC-FV sur l'amine terminale de peptides synthétiques dont les séquences dérivent de celle d'une protéine antigènique de Mycobacterium tuberculosis. Les peptides initiaux sont les suivants :
MR100 YLQVPSASMGR 1208.4 uma
MR101 MVQIPRLVANNTRIWVYC 2176.6 uma LR72 PYAASLSGFLNPSEGWWPTLIGLAM 2676.1 uma
Après réaction avec OM-197-MC-FV, les conjugués suivants ont été observés par analyses LC/ES-MS: à titre d'exemple OM-197-MC-FV-MR100 qui montre une masse moléculaire de 2171.0 uma (Figure 61 et 62). Alternativement les conjugués OM-197-MC-FV-MR101 , 3140.0 uma et OM-197-MC-FV-LR72, 3643.0 uma ont également été obtenus.
EXEMPLE 3.8.
Dimère de structures de type OM-197
La technique d'amination réductrice peut également être appliquée pour la synthèse de dimère de structures de type OM-197.
Par exemple, un dimère peut être formé avec deux composés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé tels que OM-197-MC-FV et OM-197-MC-AC. Ainsi, 1 mg d'OM-197-MC-FV6 purifié (0.98 μmol, 1 éq.) est ajoutés à une solution de 1 mg de OM-197-MC-AC (0.98 μmol, 1 éq.) dissout dans 1 ml H20-isopropanol (1 :9) La solution est agitée pendant 1 heure à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 19.6 μl de NaBH3CN 1 M (19.6 μmol, 20 éq.). ) La solution est agitée 12 heures à température ambiante. L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel permet de mettre en évidence la formation d'un dimère OM- 197-MC-FV-OM-197-MC-AC de masse moléculaire attendue (1945.5 uma), comme l'atteste le spectre présenté en Figure 63. Cette molécule présente ainsi deux fonctions acide carboxylique aux extrémités du squelette porteur des chaînes acylés.
Dans la structure présentée en Figure 63, un des groupes carboxyliques peut être remplacé, par exemple, par un groupe phosphorylé en réalisant cette synthèse à partir d'un composé de type OM-197-MP-AC ou OM-197-MP-FV Par une réaction d'amination réductrice similaire à celle décrite ci-dessus entre deux composés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé (OM-197-MP-FV et OM-197-MC-AC), un dimère OM-197-MP-FV-OM-197-MC-AC a pu être obtenu. Le spectre ES/MS présenté en Figure 64 atteste de la masse moléculaire attendue pour ce composé (2011.9 uma).
EXEMPLE 3.9.
Conjugaison de composés porteurs d'un bras auxiliaire de type amino
Les composés porteurs d'un bras auxiliaire de type amino peuvent également être conjugués à des antigènes peptidiques par une réaction d'amination réductrice. Il est en effet possible d'exploiter, par exemple, la présence d'une serine terminale dans la séquence des peptides à conjuguer. Dans un premier temps, une oxydation périodique est réalisée sur le peptide, conduisant à la formation d'un groupement glyoxylyle (-CO-CHO) très réactif. Ce dernier peut alors réagir par amination réductrice avec une amine primaire présente sur le bras auxiliaire fonctionalisé des composés de type OM-197.
Le peptide synthétique MR99B peut par exemple être conjugué au composé OM-197-MC-AC, comme le montre le schéma de synthèse de la Figure 65. Pour ce faire, 147 μl de Nal04 0.1 M (14.6 μmol, 20 éq.) sont ajoutés à une solution 1 mg de peptide MR99B (0.73 μmol, 1éq.) dissout dans 1 ml d'eau. La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. L'aldéhyde ainsi obtenu est purifié sur phase C18 et reccueilli dans 1 ml isopropanol-eau (1 :1). 0.72 mg du composé OM-197-MC-AC (0.73 μmol, 1éq.) est ensuite ajouté, ainsi que 1 ml de tampon borate 0.2M, pH 9.2. Après agitation à température ambiante pendant 30 minutes, la réduction est effectuée en ajoutant 14.6 μl de NaBH3CN 1 M (14.6 μmol, 20 éq.). La solution est agitée pendant 24 heures à température ambiante.
L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel permet de mettre en évidence la formation d'un conjugué OM-197-MC-AC-MR99B de masse moléculaire attendue (2299.1 uma, Figure 65), comme l'attestent les spectres présentés en Figures 66 (enveloppe ionique) et 67 (spectre transformé). D'autres composés porteurs d'un bras auxiliaire de type amino peuvent être conjugués de façon similaire. On citera pour exemple, OM-197-MC-AP, OM-197-MP-AC, OM-212-AH1 , OM-197-MC-Gly, OM-197-MC-Lys, OM-197-Lys-AC ou OM-197-Asp-AC.
EXEMPLE 3.10.
Conjugués avec ovalbumine
Les protéines, comme l'ovalbumine par exemple, se prêtent particulièrement bien au couplage par amination réductrice. Les nombreuses lysines présentes dans la séquence (20 lysines pour l'ovalbumine) sont autant de sites de congaison possibles pour les pseupeptidolipides portant un bras auxiliaire fonctionnalisé avec un groupe aldéhyde. En variant la stœchiométrie de la réaction d'amination réductrice (ratio pseudodipeptide acylé / protéine), différents degrés de conjugaison peuvent être obtenus.
1 mg d'OM-197-FV7 purifié (0.928 μmol, 10 éq) a été ajouté à une solution de 4 mg d'ovalbumine (0.09 μmol, 1 éq) dissous dans 5 ml H20. La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 46 μl de NaBH3CN 1 M (2.89 mg, 50 éq). ) La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H20 pendant 24 heures, (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce).
De par sa taille et une hétérogénéité propre, l'ovalbumine pose de nombreux problèmes analytiques. Par conséquent, la caractérisation d'un conjugué OM-197- FV-ovalbumine par spectrométrie de masse s'avère particulièrement délicate. Afin de mettre en évidence la réaction de conjugaison, des analyses SDS-PAGE ont été réalisées sur les différents lots de conjugués OM-197-FV-ovalbumine. Comme le montre le gel présenté en Figure 68 (B) (gradient 4-20% polyacrylamide), une masse supérieure d'environ 3000 uma à l'ovalbumine initiale (ligne 2) est observée pour les conjugués OM-197-FV-ovalbumine (lignes 3, 4 et 5). Cette différence de masse suggère ainsi la présence de plusieurs molécules de OM-197-FV par molécule d'ovalbumine. Les analyses LC/UV réalisées sur phase C confirment ce résultat. En effet, dans ces conditions, l'ovalbumine initiale apparaît clairement à Rt=11.3 min, alors qu'après la réaction de conjugaison, le pic correspondant à l'ovalbumine initiale a complètement disparu démontrant une réaction quantitative de l'ovalbumine. Le conjugué OM-197-FV-ovalbumine n'est par contre pas élue. Ce comportement chromatographique indique également la présence de plusieurs molécules d'OM- 197-FV sur l'ovalbumine, empêchant ainsi l'élution du conjugué dans ces conditions.
EXEMPLE 3.11.
Conjugués avec hémagglutinine H1N1
La protéine d' hémagglutinine H1 N1 constitue également un exemple de choix pour illustrer le couplage entre les molécules de type OM-197 et un antigène de type protéinique.
1 mg d'OM-197-FV7 purifié (0.928 μmol, 15 éq) a été ajouté à une solution de 5 mg de H1 N1 (hémagglutinine A / Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) (0.06 μmol, 1 éq) dissous dans 8 ml H 0. La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 46 μl de NaBHsCN 1 M (2.89 mg, 50 éq). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H20 pendant 24 heures (cassette de dialyse 3.5 Kd).
Le conjugué OM-197-FV-H1 N1 a été analysé par SDS-PAGE dans les conditions utilisées pour le conjugué OM-197-FV-ovalbumine (gradient 4-20% polyacrylamide). Les profils électrophorétiques obtenus pour la protéine initiale (ligne 6) et le conjugué avant et après dialyse (lignes 8 et 7, respectivement) sont présentés en Figure 68 (C). La protéine H1 N1 apparaît sous la forme de trois bandes, dont deux correspondent aux sous-unités HA1 et HA2 décrites dans la littérature (Swiss-Prot, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva). Dans le cas des conjugués OM-197-FV- H1 N1 , une différence de masse est observée pour chacune des bandes, mettant ainsi en évidence le couplage de molécules de OM-197-FV sur la protéine H1 N1. EXEMPLE 3.12.
Conjugué avec AZT (Figure 69)
A une solution d'AZT (200 mg ; 0,749 mmol) dans de la pyridine (4 ml) sont ajoutés successivement de l'anhydride succinique (150 mg ; 0,5 mmol) et de la 4- diméthylaminopyridine (50 mg ; 0,41 mmol). Après 12 heures à 50°C, du méthanol (2 ml) est additionné et le milieu réactionnel est encore agité 15 minutes à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite concentré et le produit purifié par chromatographie Flash sur gel de silice avec l'éluant suivant : CH2CI2 /MeOH : 5/1. Le produit est alors obtenu sous forme d'un solide blanc (266 mg ; 97%). Cι4H17N507 (M = 367 g /mol) ; Rf = 0,25 (CH2CI2 /MeOH : 4/1)
A une solution du dérivé succinyle de l'AZT ainsi obtenu (60 mg ; 0,163 mmol) dans du THF (3 ml) à 0°C et sous argon sont ajoutés successivement de la triéthylamine (24 μl ; 0,172 mmol) et du chloroformiate d'éthyle (14 μl ; 0,172 mmol). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de triéthylamine. Après 40 minutes d'agitation, on ajoute à 0°C une solution du dérivé aminocaproyle (Ex. 2.16) (160 mg ; 0,163 mmol) dans un mélange DMF:eau 9/1 (10ml) contenant de la triéthylamine (24 μl ; 0,172 mmol). Le mélange réactionnel est alors agité 15 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante avant d'être évaporé sous pression réduite. Le produit brut est alors repris avec du dichlorométhane (15 ml) et de l'eau (5 ml). La phase organique est séparée. La phase aqueuse est acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% puis extraite avec du dichlorométhane (2 x). Les phases organiques sont alors combinées, séchées sur MgS04, filtrées et concentrées. Une purification par chromatographie sur gel de silice avec l'éluant suivant (CH2CI2 /MeOH : 9/1 puis 7/1) permet de recueillir le composé conjugué avec l'AZT (123 mg ; 57%) sous forme d'un solide blanc. Rf = 0,2 (CH2CI2 /MeOH : 4/1) ; CβgHugNgOiβ (M = 1329 g /mol) ; trouvé : m/z = 1330.9 ([M+H]+). HPLC analytique : Tr = 24.437 min, colonne C18 Supelcosil (15 cm X 4.6 mm, 3 μm, 100Â) ; solvant A = 50% MeCN, 5mM TBAP ; solvant B = 90% 2-propanol, 5mM TBAP. Gradient : 25-100% B en 37.5 min., détection UV à 210 nm. HPLC preparative : sur colonne C18 Kromasil (25 cm X 21 mm, 5 μm, 100A), solvant A = 50% MeCN, 5mM TBAP ; solvant B = 90% 2-propanol, 5mM TBAP. Elution du produit à 80% B
Phase finale : passage en sel de Na+ par SPE, phase C18 Bondapack 15 μm, élution avec 90 %> 2-propanol.
Conjugué avec d4T (Figure 69)
A une solution de d4T (200 mg ; 0,89 mmol) dans de la pyridine (4 ml) sont ajoutés successivement de l'anhydride succinique (179 mg ; 0,786 mmol) et de la 4- diméthylaminopyridine (109 mg ; 0,89 mmol). Après 12 heures d'agitation à température ambiante, du méthanol (2 ml) est additionné et le milieu .réactionnel est encore agité 15 minutes à température ambiante puis évaporé. Le produit brut est ensuite purifié par chromatographie Flash sur gel de silice avec l'éluant suivant : (CH2CI2 /MeOH : 5/1). Le produit est obtenu sous forme d'un solide blanc (280 mg ; 97%). C14Hι6N207 (M = 324 g /mol) ; Rf = 0,25 (CH2CI2 /MeOH : 4/1)
A une solution du dérivé succinyle du d4T ainsi obtenu (60 mg ; 0,185 mmol) dans du THF (3 ml) à 0°C et sous argon sont ajoutés successivement de la triéthylamine (27 μl ; 0,194 mmol) et du chloroformiate d'éthyle (16 μl ; 0,194 mmol). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de triéthylamine. Après 40 minutes d'agitation, on ajoute à 0°C une solution du dérivé aminocaproyle (Ex. 2 .16) (181 mg ; 0,185 mmol) dans un mélange DMF :eau 9/1 (10ml) contenant de la triéthylamine (27 μl ; 0,194 mmol). Le mélange réactionnel est alors agité 15 minutes à 0°C puis une nuit à température ambiante avant d'être évaporé sous pression réduite. Le produit brut est alors repris avec du dichlorométhane (15 ml) et de l'eau (5 ml). La phase organique est séparée. La phase aqueuse est acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% puis extraite avec du dichlorométhane (2 x). Les phases organiques sont alors combinées, séchées sur MgS04, filtrées et concentrées. Une purification par chromatographie sur gel de silice avec l'éluant suivant : (CH2CI2 /MeOH : 9/1 puis 7/1) permet de recueillir le composé conjugué avec le d4T (107 mg ; 45%) sous forme d'un solide blanc. Rf = 0,2 (CH2CI2 /MeOH : 4/1) ; CegHnδNsOie (M = 1287 g /mol), found : m /z : 1288 (MH+) ; 1310 (Na). HPLC analytique : Tr = 24.455 min, colonne C18 Supelcosil (15 cm X 4.6 mm, 3 μm, 100A), solvant A = 50% MeCN, 5mM TBAP ; solvant B = 90% 2-propanol, 5mM TBAP. Gradient : 25-100% B en 37.5 min., détection UV à 210 nm.
HPLC preparative : sur colonne C18 Kromasil (25 cm X 21 mm, 5 μm, 100A), solvant A = 50% MeCN, 5mM TBAP ; solvant B = 90% 2-propanol, 5mM TBAP. Elution du produit à 80% B
Phase finale : passage en sel de Na+ par SPE, phase C18 Bondapack 15 μm, élution avec 90 % 2-propanol.
4eme série d'exemples: étude pharmacologique des composés selon l'invention [in vitro)
EXEMPLE 4.1.
Test de détermination de l'endotoxicité L'endotoxicité a été déterminée par le test Limulus Amoebocyte Lysate chromogénique cinétique (Charles River'Endosafe produit R1708K lot EK2251 E). Ce test LAL a été utilisé pour démontrer la faible endotoxicite des composés de l'invention.
Le principe biologique de ce test est basé sur l'initiation par les endotoxines bactériennes d'une proenzyme présente dans le lysat des amoebocytes de Limulus (LAL) qui active une cascade de serine protéases. En présence d'un substrat incolore (S-2834 peptide couplé à la p-nitroaniline), le clivage du chromophore conduit à la libération de p-nitroaniline (pNA) et au développement d'une coloration jaune qui peut être suivi spectrophotométriquement à 405 nm.
. eπdotoxine
1. proenzyme >enzyme
2. substrat > peptide + p-nitroaniline
Le test cinétique chromogénique est basé sur le fait que la quantité d'endotoxine est inversement proportionnelle au temps nécessaire pour atteindre une densité optique
(D.O.) de 0.2. La concentration est déterminée par rapport à une courbe standard de
0.005 à 50 EU/ml.
Les produits sont testés à partir de dilution (5 x, 10 x, 50 x, 100 x, 500 x ou 1000 x) de la solution de produit à 0.1 mg/ml. Le résultat LAL correspond à la première dilution qui n'est plus inhibitrice pour le recouvrement d'une surcharge en LPS.
Les résultats sont exprimés en EU (unité d'endotoxine) par rapport à une solution étalon standard internationale (EC-6). Pour cette série de dosage 1 EU représente environ 0.08 ng LPS E. co// 055 :B5. Tableau des résultats LAL pour les différents pseudodipeptides acylés porteurs d'un
Tous les pseudolipopeptides testés présentent une endotoxicite faible. Pour beaucoup de produits cette endotoxicite est même inférieure au seuil de détection du test. La détermination quantitative de l'endotoxicité est limitée du fait de la nécessité de diluer les échantillons pour retrouver la surcharge. Même les composés les plus actifs dans ce test LAL ont une activité endotoxinique 5000 x plus faible que le LPS. Les pseudolipopeptides de l'invention sont intéressants du fait de leur faible endotoxicite et de leurs activités biologiques. Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués à l'ovalbumine :
Il semblerait que le fait de coupler l'OM-197-FV à l'ovalbumine crée une augmentation de l'activité LAL détectée. Cette augmentation est peut être due à un changement dans la manière dont la molécule d'OM-197-FV est présentée. Les autres produits de la série ovalbumine ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. L'activité LAL maximale est de 2.4 ng équivalent LPS par injection (25 μg/injection) pour les produits de couplage, pour les autres groupes l'activité LAL maximale est de 0.012 ng équivalent LPS par injection.
Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués à l'hémaglutinine H1 N1 :
Les produits de la série H1 N1 ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. Le couplage n'a pas d'effet sur l'activité LAL. L'activité LAL maximale est de 0.008 ng équivalent LPS par injection (5 μg/injection). Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués au peptide (NANP)6P2P30 :
* n.d. non dosable en LAL car il s'agit d'une émulsion
Les produits de la série (NANP)6P2P3o ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. Le couplage n'a pas d'effet sur l'activité LAL. L'activité LAL maximale est de 0.03 ng équivalent LPS par injection (20 μg/injection).
EXEMPLE 4.2.
Détermination de la prolifération des cellules souche de la moelle osseuse de souris stimulées par les produits de l'invention
4.2.1. Expérience de prolifération
Des souris mâles C57/BL6 de 6 semaines sont sacrifiées par inhalation de C02. Les os des membres postérieurs, la hanche, le tibia et le fémur sont prélevés. La moelle est extraite de la lumière osseuse par injection de milieu Eagle modifié par Dulbecco (milieu DH) au travers des extrémités qui ont été préalablement sectionnées. Les cellules souches sont lavées et remises en suspension dans du milieu DH complété par 20 % de sérum de veau fœtal (SVF). La concentration cellulaire est ajustée à 500000 cellules/ml.
Les produits en solution dans le milieu DH additionné de 20 % SVF, d'acides aminés et d'antibiotiques, sont dilués en série directement dans la microplaque. Les produits sont testés en triplicat et chaque microplaque comprend un contrôle négatif composé de milieu seul. Le volume final dans chaque puits est de 100 μl. 100 μl de suspension cellulaire sont ajoutés aux dilutions de produits et les cellules sont incubées pendant 7 jours dans une étuve à 37 °C, sous 8 % de C02, saturée en humidité. La prolifération est déterminée par la mesure de l'oxydation d'un substrat chromogénique XTT (2,3-bis[2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl]-2H-tetrazolium-5- caboxanilide) dans les mitochondries des cellules vivantes.
A la fin de l'incubation, 50 μl de la solution XTT substrat (1 mg/ml de XTT + phénazine méthosulfate à 0.008 mg/ml) sont ajoutés à chaque puits. Après 8 heures d'incubation à 37 °C sous 8 % de C02 dans une étuve saturée en humidité, les microplaques sont lues au spectrophotomètre à 492 nm contre une référence à 690 nm.
Les résultats sont exprimés en moyenne + écart-type sous forme de courbe dose-réponse. Les valeurs du contrôle négatif composé de milieu DH (moyenne ± écart type) sont également indiquées sous forme graphique.
A partir de la courbe dose réponse, 3 points particuliers de la courbe sont calculés : Max : amplitude maximale de la courbe et sa concentration correspondante EC50 : concentration correspondant au 50 % de l'amplitude maximale Min : première concentration induisant une prolifération significative correspondant au blanc + 3 x écart-type
Les concentrations correspondant à IΕC50 et au min sont déterminées à partir des segments de droite reliant les différents points de la courbe.
Si la courbe n'atteint pas de maximum mais continue de monter pour la plus forte concentration testée, un signe « > » est placé avant les valeurs de « Max » et de « EC50 ».
Si la courbe ne descend pas au-dessous de la limite du blanc + 3 x écart-type la concentration minimale est donnée comme « < » la concentration la plus faible testée. 4.2.2. Présentation des résultats
Prolifération des cellules souches de la moelle osseuse induite par des pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé La figure 70 présente l'activité de différents pseudodipeptides acylés et montre l'influence du bras auxiliaire fonctionnalisé sur la capacité à induire la prolifération des cellules souches de moelle de souris.
Certains pseudodipeptides acylés sont capables d'induire une prolifération supérieure à celle induite par le contrôle positif, composé de LPS de E. coli. La concentration minimale de produit capable d'induire une prolifération significative est plus importante que celle du contrôle positif. Cette concentration minimale de produit est fortement influencée par la fonctionalité du bras auxiliaire. La figure 71 présente l'activité des pseudodipeptides acylés couplés à une drogue. Cette activité démontre que malgré le couplage les composés conservent une partie de leur activité. Il n'a pas été possible de distinguer entre une activité intrinsèque ou une activité résultant du couplage de la liaison ester par les estérases intracellulaires. L'activité antivirale de ces produits tendrait à démontrer qu'une partie au moins des liaisons esters ont été clivées. Quel que soit le mécanisme, la conservation d'une activité biologique démontre tout l'intérêt de cette association -> activité antivirale + activité du produit.
Tableau résultat présentant l'induction de la prolifération des cellules souches de moelle par les différents pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé répondant à la formule générale I : nd = non déterminable Tous les pseudodipeptides acylés de l'invention à part les composés avec des chaînes raccourcies sont capables d'induire une prolifération significative des cellules souche de moelle. EXEMPLE 4.3.
Détermination de la production d'oxyde nitrique par des macrophages murins stimulés par les produits de l'invention
4.3.1. Expérience de production d'oxyde nitrique : Des souris mâles C57/BL6 de 6 semaines sont sacrifiées par inhalation de C02. Les os des membres postérieurs, la hanche, le tibia et le fémur sont prélevés. La moelle est extraite de la lumière osseuse par injection de milieu Eagle modifié par Dulbecco (milieu DH) au travers des extrémités qui ont été préalablement sectionnées. Les cellules souches sont lavées et remises en suspension (concentration cellulaire environ 40000 cellules/ml) dans du milieu DH complété par 20 % de sérum de cheval (SH) et 30 % de surnageant de L929. Les L929 sont une lignée de fibroblastes murins dont le surnageant est riche en facteur de croissance pour les macrophages (M-CSF). La suspension cellulaire est distribuée dans des boîtes de Pétri qui sont incubées 8 jours à 37 °C sous 8 % de C02 dans une étuve saturée en humidité.
Après 8 jours les cellules souches se sont différenciées en macrophages matures. Les macrophages sont détachés par un passage au froid, lavés et resuspendus dans du milieu DH complété par 5 % de sérum fœtal de veau (SFV), des acides aminés et des antibiotiques. La concentration cellulaire est ajustée à 700000 cellules par ml.
Les produits en solution dans le milieu DH additionné de 5 % de SVF, d'acides aminés et d'antibiotiques, sont dilués en série directement dans la microplaque. Les produits sont testés en triplicat et chaque microplaque comprend un contrôle négatif composé de milieu seul. Le volume final dans chaque puits est de 100 μl. 100 μl de suspension cellulaire sont ajoutés aux dilutions de produits et les cellules sont incubées pendant 22 heures dans une étuve à 37 °C, sous 8 % de C02, saturée en humidité. A la fin de l'incubation avec les produits, 100 μl de surnageant sont prélevés et la concentration de nitrite est déterminée par la réaction de Griess. 100 μl de réactif de Griess (5mg/ml de sulfanilamide + 0,5mg/ml de chlorhydrate de N-(1-naphthyléthylène diaminé)) dans de l'acide phosphorique à 2,5 % aqueux, sont ajoutés à chaque puits. Les microplaques sont lues au spectrophotomètre à 562 nm contre une référence à 690 nm. La concentration en nitrite est proportionnelle à celle de l'oxyde nitrique produit. La concentration en nitrite est déterminée par rapport à une courbe standard.
Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type sous forme de courbe dose/réponse. A partir de la courbe dose réponse, 3 points particuliers de la courbe sont calculés :
Max : amplitude maximale de la courbe et sa concentration correspondante
EC50 : concentration correspondant au 50 % de l'amplitude maximale
Min : première concentration induisant une prolifération significative correspondant au blanc + 3 * écart-type Les concentrations correspondant à IΕC50 et au min sont déterminées à partir des segments de droite reliant les différents points de la courbe.
Si la courbe n'atteint pas de maximum mais continue de monter pour la plus forte concentration testée, un signe « > » est placé avant les valeurs de « Max » et de
« EC50 ». Si la courbe ne descend pas au-dessous de la limite du blanc + 3 * écart-type la concentration minimale est donnée comme « < » la concentration la plus faible testée.
4.3.2. Présentation des résultats Production d'oxyde nitrigue par les macrophages murins induite par des pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé La figure 72 présente l'activité de différents pseudodipeptides acylés et montre l'influence du bras auxiliaire fonctionnalisé sur la capacité à induire la prolifération des cellules souches de moelle de souris. L'OM-197-MP-AC (R/S.R) est capable d'induire une prolifération supérieure à celle induite par le contrôle positif, composé de LPS de E. coli. La concentration minimale de produit capable d'induire une prolifération significative est néanmoins beaucoup plus importante que celle du contrôle positif. La production de NO par les macrophages murins stimulés par les pseudodipeptides acylés est fortement influencée par la fonctionalité du bras auxiliaire.
La figure 73 présente l'activité des pseudodipeptides acylés couplés à une drogue. Cette activité démontre que malgré le couplage les composés conservent une partie de leur activité. Il n'a pas été possible de distinguer entre une activité intrinsèque ou une activité résultant du couplage de la liaison ester par les estérases intracellulaires. L'actrivité antivirale de ces produits tendrait à démontrer qu'une partie au moins des liaisons esters ont été clivées. Quel que soit le mécanisme, la conservation d'une activité biologique démontre tout l'intérêt de cette association -> activité antivirale + activité du produit.
Tableau résultat présentant l'induction de la production d'oxyde nitrique par les macrophages murins par les différents pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé répondant à la formule générale I : nd = non déterminable
Tous les pseudodipeptides acylés de l'invention à part les composés avec des chaînes raccourcies (production marginale pour OM-197-N'(C10-2OC8)-MC-AC) sont capables d'induire une production significative d'oxyde nitrique par les macrophages murins.
EXEMPLE 4.4.
Test de différentiation des cellules dendritiques
La capacité des produits de l'invention à induire la maturation des cellules pré- dendritiques en cellules dendritiques a été évaluée. Les paramètres suivants ont été mesurés: l'incorporation du Dextran-FITC et l'expression des molécules de surface CD83, CD86.
4.4.1. Protocole expérimental
Les cellules mononucléées du sang périphérique sont isolées à partir de "buff coats" de donneurs sains. Les monocytes purifiés par adhérence sont remis en suspension dans du milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF), du GM-CSF et de l'IL-4 à 10 ng/ml à raison de 1 x 106 cellules/ml. Les cellules sont distribuées dans des boîtes de Pétri à raison de 10 x 106 cellules par boîte et cultivées pendant 6 jours avec un changement de milieu après 3 jours. Les cellules ainsi obtenues sont appelées cellules prédendritiques (DC-6). La maturation des cellules prédendritiques en cellules dendritiques matures est réalisée par incubation avec les dilutions de produits ou de LPS (témoin positif) pendant 3 jours supplémentaires (voir sous produits). Au jour 9 (DC-9), les cellules sont récoltées, et les différents paramètres indicateurs de la maturation des cellules dendritiques: l'expression des molécules de surface CD83, CD86 ainsi que la capacité d'incorporer du Dextran-FITC sont évalués. Tous ces paramètres sont analysés par FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Finlande).
L'expression des molécules de surface est exprimée en % de la fluorescence moyenne des cellules stimulées par LPS (témoin positif) ; l'incorporation du Dextran est calculée par rapport à celle des cellules maintenues dans le milieu et est exprimée en %>.
Produits : les solutions mères de OM-197-MC, OM-197-FV6, et OM-197-MP-AC (R/S,R) sont préparées à 0.5 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau, additionnée de 0.1% triéthanolamine. Les solutions sont incubées à 37°C pendant 20 min, agités vigoureusement pendant 3 min puis dilués à 100 μg/ml dans du milieu de culture RPMI 1640 et utilisés en dilution à partir de 10 μg/ml jusqu'à 0.03 μg/ml. Produit de référence : lipopolysaccharide de E. coli (LPS, DIFCO, Détroit, Ml, U.S.A.), solution stock 5 mg/ml dans PBS. Une solution intermédiaire est préparée à 100 μg/ml dans du milieu de culture RPMI 1640. Les concentrations testées sont des dilutions à partir de 1 μg/ml jusqu'à 0.03 μg/ml.
Dans une autre série d'expériences tous les pseudodipeptides acylés ont été lyophilisés et resolubilisés directement dans de l'eau apyrogène. Les différents produits ainsi que le LPS contrôle sont testés à la concentration de 10 μg/ml. Les résultats sont exprimés en % de cellules dendritiques et en moyenne de fluorescence pour la phagocytose du dextran ou l'expression du marqueur de surface CD86. Ces résultats représentent la moyenne de 2 à 6 expériences suivant les produits.
4.4.2. Evaluation des résultats
Les cellules dendritiques immatures (DC-6) issues de la différenciation des monocytes, par l'effet conjugué de GM-CSF et d'IL-4, sont capables d'incorporer le Dextran-FITC. Au cours du processus de maturation, les cellules perdent la capacité d'incorporer le Dextran-FITC. Les analyses sont effectuées au stade de différenciation DC-9.
Les résultats (Figure 74) sont exprimés en % de l'incorporation du Dextran-FITC observée dans les cellules non stimulées incubées avec le milieu seul. Les cellules traitées avec du LPS ou de l'OM-197-MP-AC (R/S,R) ne conservent respectivement que 15% et 22% de phagocytose, Il faut au moins 1 μg/ml d'OM-197-MP-AC (R/S.R) pour induire une diminution maximale d'incorporation de Dextran alors que 0.1 μg/ml de LPS induisent une diminution équivalente. 10 μg/ml d'OM-197-MC sont nécessaires pour induire une diminution de 22 % de la phagocytose. De plus pour des concentrations inférieures à 3 μg/ml il n'y a aucun effet de l'OM-197-MC sur la phagocytose. LOM-197-FV6 ne semble avoir aucun effet sur la maturation des cellules dendritiques. L'expression des molécules de surface costimulatrices est un autre critère de maturation des DC. L'augmentation de l'expression des CD83 et CD86 (Figures 75 et 76 respectivement) a été testée. Les résultats sont exprimés en % de la moyenne de fluorescence par rapport à l'expression de ces marqueurs induite par le LPS. Ces résultats corroborent parfaitement ceux obtenus à partir de la phagocytose. L'OM- 197-MP-AC (R/S,R) induit une augmentation de l'expression des molécules de surface dès 0.1 μg/ml, alors qu'il faut au moins 1 μg/ml pour que l'OM-197-MC commence à augmenter l'expression de CD83 et de CD86. LOM-197-FV6 n'a aucun effet sur l'expression des molécules de surface caractéristique des cellules dendritiques.
Ces résultats montrent un comportement très différent pour les pseudodipeptides acylés en fonction de leur bras auxiliaire. L'OM-197-MP-AC (R/S.R) montre une capacité exceptionnelle à induire une différenciation des cellules DC-6 en DC-9 déjà à partir de 0.1 μg/ml, alors qu'il faut des concentrations supérieures à 1 μg/ml pour que l'OM-197-MC commence à induire cette différentiation, et que IOM-197-FV6 est totalement dépourvu de ce type d'activité.
Phagocytose du dextran margué à la fluorescéine et expression du CD86 après stimulation des cellules prédendritigues (DC6) par les pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé répondant à la formule générale I Différentiation des cellules prédendritigues en cellules dendritigues matures. A la concentration de 10 μg/ml de nombreux pseudodipeptides acylés sont capables d'induire la différentiation des cellules prédendritiques en cellules dendritiques. La fonctionnalité portée par le bras auxiliaire module cette capacité à activer les cellules prédendritiques. Le pseudodipeptide acylé OM-197-MC-AC-Succ-AZT couplés à une drogue présente une capacité significative à induire la différentiation en cellules dendritique. L'effet de la formulation des pseudodipeptides acylés est particulièrement important sur la capacité à induire la différentiation des cellules prédendritiques en cellules dendritiques. Certains produits présentent des activités très différentes suivant qu'ils ont été dissous en présence ou en absence de 0.1 % TEOA.
EXEMPLE 4.5.
Analyse de l'induction de la protéine MxA dans les cellules dendritiques
La capacité des produits de l'invention à induire la production de la protéine antivirale MxA par des cellules pré-dendritiques a été évaluée. La production de MxA par les cellules a été mesurée après séparation élecrophorétique SDS-PAGE par western blotting.
4.5.1. Protocole expérimental
Les cellules dendritiques au stade DC-6 obtenues comme décrit précédemment ont été stimulées ou pas avec IFN- (500 U/ml), LPS (1 μg/ml), TRANCE (100 ng/ml),
CD40L (1 μg/ml), OM-197-MP-AC (1 μg/ml) ou OM-197-FV6 (1 μg/ml) pendant 48 h.
L'extraction et l'analyse des protéines a été effectuée comme suit: les cellules sont récupérées, puis lavées 3 fois avec du PBS (phosphate buffered saline) et lysées dans un tampon 100 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1% Triton-100 contenant 1 mM PMSF (fluorure de phenylmethylsulfonyle) et 1 μg/ml pepstatine comme inhibiteurs de protéases. La lyse est effectuée à raison de 106 cellules pour
100 μl de tampon,
5 fois concentré contenant 60 mM Tris-HCI (pH 6.8), 10% glycérol, 2% SDS, 14.4 M 2-mercaptoéthanol et 0.1% bromophénol). Les échantillons sont chauffés à 95°C pendant 5 min dans des tubes Ependorf fermés. L'électrophorese est effectuée sur un minigel de 10 cm x 10 cm à 12% d'acrylamide avec une quantité d'échantillon équivalant au même nombre de cellules. La migration est effectuée avec le tampon suivant: 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3.
Transfert sur membrane: les protéines sont transfères du gel SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose. (tampon de transfert : 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol, pH 8.3).
Incubation avec les anticorps: le transfert est vérifié par une coloration de la membrane au rouge Ponceau. Les sites non spécifiques sur la membrane sont bloqués avec 5% de lait écrémé dans TBS (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.4) pendant 1 h à température ambiante. La membrane est incubée dans une solution de l'anticorps monoclonal anti-MxA (clone 143) dilué 1 :100, (v/v) dans TBS-lait. La membrane est lavée 3 fois avec TBS-0.1% Tween 20. La membrane est incubée avec un second anticorps anti-souris couplé à la péroxydase (HRP, Sigma) dilué 1 :1000, (v/v). La membrane est lavée 3 fois avec TBS-Tween. Les bandes contenant la MxA sont révélées après incubation de la membrane avec les réactifs de chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia). Dans ce système, HRP catalyse une réaction de chemiluminescence basée sur le luminol qu'on peut détecter sur un film.
4.5.2. Résultats Les DC-6 ont été stimulées pendant 0, 2h, 4h, 24h (Figure 77) ou 48 h (Figure 78) comme suit.
Les western blots présentés dans les Figures 77 et 78 montrent la production de
MxA au cours du temps: une augmentation significative de la protéine MxA est induite par les produits OM-197-AC5 et OM-197-FV6 après 24h (Fig 77) et respectivement après 48h (Fig 78). Cette production de MxA est équivalente à celle induite par le contrôle positif LPS ou l'IFNα. Cette production est supérieure à celle induite respectivement par le contrôle négatif, le TRANCE (une cytokine de la famille du TNF-α qui induit aussi la maturation des cellules dendritiques) ou le CD40L (un autre agent maturant des cellules dendritiques)
Les composés selon l'invention OM-197-MP-AC et OM-197-FV6 montrent des propriétés antivirales par leur capacité à induire la protéine MxA.
EXEMPLE 4.6.
Détermination de la capacité des composés selon l'invention à activer la production de TNF-α par les cellules mononucléaires du sang périphérique humain
4.6.1. Protocole
Les cellules mononucléaires du sang périphérique sont isolées à partir de "buffy coats" de donneurs sains. Les cellules des "buffy coats" sont remises en suspension et les cellules mononucléaires séparées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia). Les cellules mononucléaires purifiées sont resuspendues dans du milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de SFV, des antibiotiques, du mercaptoéthanol et de la L-glutamine. La concentration cellulaire est ajustée à 2 x 106 cellules vivantes par ml.
100 μl de chacune des solutions de pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, dilués à 100, 10 ou 1 μg/ml dans le milieu RPMI 1640, sont déposés dans la microplaque. Les conditions sont testées en trois exemplaires, et chaque microplaque comprend un témoin négatif composé de milieu seul. Les dilutions de LPS de E. coli (1 à 0.00001 μg/ml) servent de témoin positif.
100 μl de la suspension cellulaire sont ajoutés à chaque puits contenant les dilutions de produits ou des témoins. Les cellules sont incubées avec les produits pendant 18 heures dans une étuve à 37 °C, saturée en humidité sous 5 % de C02. A la fin de l'incubation les microplaques sont centrifugées, et les surnageants sont assemblés et congelés à - 80 °C sous forme d'aliquot jusqu'au dosage par ELISA. La concentration de TNF-α produite par les cellules mononucléaires est déterminée par ELISA chemiluminescent (kit R&D QuantiGIo # QTA00). Les surnageants dilués 4 x sont déposés dans chaque puits de la microplaque dans laquelle l'anticorps anti-TNF-α humain est lié. La microplaque est incubée 4 heures à température ambiante. Après lavage, l'anticorps anti-TNFα humain conjugué à la peroxydase est ajouté. Après une incubation de 2 heures et un lavage intensif, le substrat chemiluminescent est ajouté et la luminescence est lue au bout de 20 minutes. La concentration de TNF-α contenue dans les surnageant est déterminée par rapport à une courbe standard allant de 7000 à 0.7 pg/ml.
Les résultats sont exprimés en pg/ml de TNF-α produit. Les résultats présentés sont tirés d'une expérience représentative de l'activité des pseudodipeptides acylés.
4.6.2. Résultats
Production de TNF-α induite par les pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé répondant à la formule générale I par les cellules mononucléaires du sang périphérique.
Le contrôle négatif composé de milieu RPMI induit une production de TNF-α de base en dessous de la limite de détection de 0.7 pg/ml. Production de TNF-α induite par le LPS E. coli par les cellules mononucléaires du sang périphérique.
Le contrôle positif composé de LPS de E. coli induit une forte production de TNF-α même pour les concentrations les plus faibles testées.
La plus part des pseudodipeptides acylés induisent une production de TNF-α importante, même si cette production reste inférieure à celle induite par le contrôle positif. Il faut également des concentrations plus élevées que celle du LPS pour induire une production significative de TNF-α.
Certains composés, OM-197-MC et OM-197-MC-MP induisent une production significative uniquement à la concentration de 100 μg/ml.
La fonctionnalité amine est particulièrement intéressante pour l'induction de la production de TNF-α, d'une part en augmentant amplitude et en diminuant la concentration minimale de produit nécessaire pour induire une réponse significative. Les pseudodipeptides acylés à chaînes raccourcies OM197-N'C2-MC-AC et OM- 197-N'(C10-2OC8)-MC-AC n'induisent pas du tout de production de TNF-α même à la concentration de 100 μg/ml.
EXEMPLE 4.7.
Détermination de la capacité des composés selon l'invention à inhiber la production de TNF-α par les cellules mononucléaires du sang périphérique humain, induite par le lipopolysaccharide d'E. coli (LPS)
4.7 A . Protocole Les cellules mononucléaires du sang périphérique sont isolées à partir de "buffy coats" de donneurs sains. Les cellules des "buffy coats" sont remises en suspension et les cellules mononucléaires séparées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia). Les cellules mononucléaires purifiées sont remises en suspension dans du milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de SFV, des antibiotiques, du mercaptoéthanol et de la L-glutamine. La concentration cellulaire est ajustée à 2 x 106 cellules vivantes par ml.
L'inhibition par les produits est déterminée par une préincubation des produits avec les cellules mononucléaires, et l'ajout, après 1 heure, de dilutions en série de LPS induisant la production de TNF-α. La concentration inhibitrice des différents pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé est de 10 μg/ml. Le LPS d'E. coli est dilué en série de 1 à 0.00001 μg/ml (facteur de 10 x). 50 μl de produits dilués à 10 μg/ml dans le milieu RPMI 1640 sont déposés dans la microplaque. Chaque condition (produit à 10 μg/ml + LPS d'E. coli dilué) est testée en triplicat et chaque microplaque comprend un témoin négatif composé de milieu seul. La détermination de la production de TNF-α induite par le LPS seul (sans inhibition) est obtenue en ajoutant les dilutions de LPS d'E. coli à du milieu RPMI. 100 μl de la suspension cellulaire sont ajoutés à chaque puits contenant les dilutions de produits ou des contrôles. Les cellules sont incubées avec les produits pendant 1 heure dans une étuve à 37 °C, saturée en humidité sous 5 % de C02.
A la fin de la pré-incubation 50 μl des dilutions en série de LPS d'E. coli sont ajoutés. L'incubation des cellules mononucléaires avec le produit et le LPS est poursuivie pendant 18 heures. A la fin de la stimulation des cellules les microplaques sont centrifugées, et les surnageants sont assemblés et congelés à - 80 °C sous forme d'aliquot jusqu'au dosage par ELISA.
La concentration de TNF-α produite par les cellules mononucléaires est déterminée par ELISA chemiluminescent (kit R&D QuantiGIo # QTA00). Les surnageants dilués 4 x sont déposés dans chaque puits de la microplaque dans laquelle l'anticorps anti-TNF-α humain est lié. La microplaque est incubée 4 heures à température ambiante. Après lavage, l'anticorps anti-TNFα humain conjugué à la peroxydase est ajouté. Après une incubation de 2 heures et un lavage intensif, le substrat chemiluminescent est ajouté et la luminescence est lue au bout de 20 minutes. La concentration de TNF-α contenue dans les surnageant est déterminée par rapport à une courbe standard allant de 7000 à 0.7 pg/ml. L'inhibition est caractérisée par la concentration de LPS d'E. coli qui en co- incubation avec les produits induit une production de 50 % de TNF-α par rapport au témoin incubé seulement avec le RPMI. Plus cette concentration est élevée et plus le produit est inhibiteur. Cette concentration est calculée à partir des valeurs d'inhibition de la production de TNF-α =100 - (Production de TNF-α induite par le produit et le LPS)/(Production de TNF-α induit par le LPS seul)*100. A partir de ces données d'inhibition la concentration est extrapolée sur le segment de droite qui joint les 2 dilutions de LPS entourant l'inhibition de 50 %.
La capacité des produits à induire l'inhibition de la production de TNF-α par le LPS est également caractérisée par l'inhibition maximale. La concentration de LPS correspondant à cette inhibition maximale (inhibition > 95 %) est également représentative du pouvoir inhibiteur des produits. Les résultats sont calculés à partir d'une expérience représentative contenant tous les produits.
4.7.2. Résultats
Inhibition par des pseudodipeptides acylés porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé répondant à la formule générale I de la production de TNF-α induite sur des cellules mononucléaires humaines par le LPS. Le contrôle négatif composé de milieu RPMI induit une production de TNF-α de base en dessous de la limite de détection de 0.7 pg/ml.
Tous les pseudodipeptides acylés sont capables d'induire une inhibition de la production de TNF-α induite par le LPS de E. coli. La concentration de produit nécessaire à cette inhibition est fonction de la fonctionnalité du bras auxiliaire et de la longueur des chaînes d'acide gras. Même les pseudodipeptides acylés couplés à une drogue par une liaison ester sont capables d'induire cette inhibition.
EXEMPLE 4.8.
Détermination de la capacité des composés selon l'invention à activer la cytototoxicité des cellules NK contre des cellules cibles de la lignée K562.
4.8.1. Protocole Les PBMCs ont été isolés à partir de buffy coats selon le protocole décrit précédement dans l'exemple 4.6. Brièvement, après centrifugation sur Ficoll et 3 lavages les PBMCs ont été distribués dans une plaque à 6 puits à raison 3 x 106 cellules/ml dans 3 ml de milieu RPMI contenant 10%o FCS et incubés soit avec le milieu seul, soit stimulés avec IFN-γ (1000 U/ml), LPS (1 μg/ml), OM-197-AC5 (1 μg/ml), ou OM-197-FV6 (1 μg/ml). Les cellules ont été incubées ainsi pendant 24h. Les cellules K562 (lignée cellulaire humaine leucémique, ATCC #CCL 243, 20110-2209 Manassas (VA), U.S.A.) sont maintenues en culture dans du milieu RPMI contenant 10% de FCS avec 2 passages par semaine. Pour la mesure de la cytotoxicité les PBMC et les cellules K562 sont lavés 2 fois avec HBSS et resuspendus dans du milieu RPMI sans rouge de phénol contenant 5% de FCS. Les PBMC sont répartis dans une plaque à 96 puits à fond rond de façon à obtenir les rapports PBMC : cibles de 20:1 , 10:1 , 5:1 dans un volume de 50 μl. On ajoute ensuite 5000 cellules K562 (cibles) par puits dans 50 μl de RPMI sans rouge de phénol. Le volume final est de 100 μl. La plaque est centrifugée pour favoriser le contact puis incubée à 37°C pendant 4 h. La cytotoxicité est déterminée avec le kit CytoTox 96 non-radioactif basé sur la mesure de LDH libéré au cours de la lyse cellulaire (kit #G1780, lot #124100, Promega, Madison, Wl) suivant le protocole du fournisseur. Le pourcentage de cytotoxicité est calculé selon la formule ci-dessous :
DO K562+PBMC " D0 PBMC -DO K562 seules
% de cytotoxicité : x ioo O lyse total K562 - DO «562 seules
4.8.2. Résultats
Les composés OM-197-AC5 et OM-197-FV6 induisent une activité NK similiaire ou légèrement inférieure à celle induite par le LPS testé à la même concentration (1 μg/ml). EXEMPLE 4.9.
Détermination de la capacité des composés selon l'invention à induire la prolifération des lymphocytes de souris.
4.9.1. Description de l'expérience
Les cellules spléniques d'un groupe de 4 souris CBA naïves sont poolées, mises en culture en quadriplicat en l'absence ou en présence de l'adjuvant OM-197-MP-AC
(0.1 à 10 μg/ml). La réponse proliférative de ces cellules est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-TdR) après 1 ou 2 jours de culture. Les valeurs reportées dans le tableau représentent la moyenne arithmétique + la déviation standard de 4 cultures
Adjuvant: la solution mère de OM-197-MP-AC est préparée à 0.9 mg/ml dans de l'eau pour injection additionnée de 0.1 % triéthanolamine.
Résultats Le produit OM-197-MP-AC stimule la prolifération des cellules spléniques in vitro. Cet effet, maximum après un jour de culture, augmente l'incorporation de thymidine par un facteur de 5 à la concentration de 1 μg/ml et de 12 à la concentration de 10 μg/ml. Après un jour de culture, le produit OM-197-MP-AC, à la concentration de 1 μg/ml, exerce un effet mitogène aussi puissant que la Concanavaline A à 5 μg/ml (voir Tableau 1).
Tableau 1. Mesure de la réponse proliférative de cellules spléniques murines à l'adjuvant OM-197-MP-AC Les valeurs reportées sur le tableau représentent la moyenne arithmétique ± la déviation standard des mesures d'incorporation de cultures en quadruplicat. La Concanavaline A (5μg/ml), utilisée comme contrôle positif, donne une valeur d'incorporation de thymidine de 37.5 ± 6.2 x 103 CPM après un jour de culture.
EXEMPLE 4.10.
Détermination de l'activité antivirale des conjugués des composés selon l'invention à l'AZT et au d4T comme prodrogue. 4.10.1. Protocole
La lignée lymphocytaire T MT-4 immortalisée par une infection par HTLV, un virus qui provoque une forme de leucémie a été utilisée pour tester l'activité antivirale (anti-VIH) des composés selon l'invention conjugués à l'AZT et respectivement au d4T. Ces cellules ont la propriété de ne pas survivre à une infection par le VI H. Le test est basé sur la protection par le produit (comme l'AZT) contre cet effet dévastateur du virus.
Les produits sont testés par dilution sérielle du produit dans une plaque à 96 puits. Dans la partie supérieure de la microplaque, les produits testé à différentes concentrations avec des cellules et le virus (en triplicat), ce qui permet de déterminer la concentration de produit qui protège les cellules de l'effet dévastateur du virus. La concentration à laquelle nous observons une réduction de 50%) du nombre de cellules vivantes est l'IC50 du produit. La quantification des cellules vivantes se fait avec le MTT, un composé tetrazolium jaune qui est réduit enzymatiquement (dans les mitochondries des cellules vivantes) vers un formazan qui est pourpre. Les puits qui contiennent des cellules en bon état ont une couleur pourpre, si les cellules sont mortes une coloration jaune persiste. La mesure de la densité optique (OD) permet de quantifier cet effet.
La cytotoxicité d'un produits est évaluée de la même façon dans la partie inférieure de la plaque où le test est effectué par dilution des produits incubés sur les cellules sans virus, ce qui permet de déterminer l'effet toxique des produits sur les cellules. Il est rapporté sous la forme d'un CC50, la concentration à laquelle 50% des cellules meurent par l'effet toxique du produit. La sélectivité (indice de sélectivité, SI) d'un produit est définie comme CC50/IC50. Ce paramètre est important, un bon produit a un indice de sélectivité élevé.
4.10.2. Résultats Les produits selon l'invention conjugués à l'AZT (OM-197-MC-succ-AZT) ou au d4T possèdent des propriétés anti-virales contre le VIH 1 IIIB et le VIH 2 ROD. Résultats de deux expériences (en triplicat) sur les cellules MT-4:
Les composés selon l'invention conjugués avec l'AZT ou le d4T montrent des activités antivirales dans ce modèle de cellules MT-4. L'un des avantages de ces prodrogues réside dans la nature lipidique des conjugués qui permet d'une part le ciblage des composés vers les cellules infectées en libérant les composés antiviraux dans les réservoirs à virus et d'autre part de moduler l'activité immunologique des cellules cibles.
EXEMPLE 4.11.
Détermination de la capacité des composés selon l'invention à activer la maturation des cellules pré-dendritiques de souris en cellules dendritiques. 4.11.1. Protocole
Obtention des cellules dendritiques: les fémurs et les tibias des souris (C57BI/6, âge 8 à 10 semaines) ont été vidés de leur moelle. La suspension de moelle a été passée à travers un tamis cellulaire de 70 μm de manière à obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules de moelle ont été resuspendues dans du milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM) complété avec 10% de sérum fœtal de veau (SVFi) inactivé par la chaleur et des antibiotiques. Les cellules ont été incubées toute la nuit à 37°C, sous C02 dans une étuve saturée en humidité, dans des microplaques de 6 puits. Le jour suivant (jour 0) les cellules non-adhérentes ont été collectées et lavées. Les cellules vivantes ont été comptées par exclusion de bleu de trypan. La concentration cellulaire a été ajustée à 2 x 105 cellules/ml dans du IMDM contenant 20 ng/ml de GM-CSF murin recombinant (rmGM-CSF) et 20 ng/ml d'IL-4 murin recombinant (rmlL-4) et l'incubation a été poursuivie. Le 3eme jour du rmGM-CSF et du rmlL-4 frais, à une concentration de 10 ng/ml, ont été ajoutés. Le 6eme jour les cellules non-adhérentes ont été collectées, lavées, et comptées par exclusion de bleu de trypan. La concentration cellulaire a été ajustée à 2 x 105 cellules/ml dans du IMDM contenant du rmGM-CSF et du rmlL-4 10 ng/ml, et l'incubation a été poursuivie. Le 8e e jour, les cellules non-adhérentes constituées de cellules dendritiques immatures et matures (CD-DM) ont été récoltées et utilisées pour l'incubation avec les produits.
Incubation avec les produits selon l'invention: les CD-DM ont été incubées à une concentration de 5x105 cellules/ml dans des micro-plaques de 24 puits en présence des activateurs suivants : le contrôle positif LPS d'Esche chia coli 0111 :B4 à 100 ng/ml ; le contrôle négatif IMDM ; ainsi que des 2 composés selon l'invention OM-197-MC-FV5 et l'OM-197-MP-AC aux concentrations de 0.1, 1 et 10 μg/ml. Après 48h d'incubation, les cellules ont été collectées et conservées pour des analyses en cytométrie de flux. Analyse par cytométrie de flux: Les CD-DM ont été lavées dans du PBS contenant 2% de SVFi et 0.01% d'azide de sodium (Tampon FACS). Puis elles ont été incubées sur glace pendant 30 minutes avec des concentrations optimales en anti-CD86, anti-CD40, anti-MHCII conjugué au FITC, et anti-CD80 conjugué à la peroxidase. Ensuite les cellules ont été lavées 3 fois. Le marquage des anti-CD86 et anti-CD40 a été effectué par l'incubation des cellules sur glace pendant 30 minutes avec des anticorps d'âne anti-lg de rat conjugué à la peroxydase. Après l'incubation, les cellules ont été lavées et resuspendues dans du tampon FACS. La fluorescence a été mesurée sur un cytomètre de flux FACScan™. 15000 événements ont été analysés par échantillon. Les cellules qui ont été incubées avec du conjugué seul ont servi de contrôle négatif.
4.11.2 Résultats Expression des cellules
Les produits selon l'invention sont capable d'induire la maturation des cellules prédendritiques en cellules dendritiques. Ces résultats obtenus in vitro sont en accord avec les observations effectuées in vivo chez la souris. In vivo, les traitements i.v. et s.c. d'OM-197-MP-AC, 20 μg et 5 μg respectivement par souris, induisent la maturation et la migration des cellules dendritiques dans la rate, de la zone marginale (située entre les pulpes rouge et blanche) vers la pulpe blanche, où sont localisées les cellules T. Les immuno-colorations des coupes histologiques de rates des animaux traités avec les produits selon l'invention revellent la collocalisation des cellules dendritiques matures et des cellules T dans la pulpe blanche, comme avec le traitement par le LPS, alors que chez les animaux non traités, il n'y a ni migration, ni maturation observée. 5ème série d'exemples: étude pharmacologique des composés selon l'invention [in vivo)
EXEMPLE 5.1.
Evaluation des propriétés de pseudodipeptides acylés portant un auxiliaire fonctionnalisé mélangé ou couplé au (NANP)ep2Pso dans un modèle d'immunisation de souris
5.1.1. Protocole expérimental
Antigène: le peptide (NANP)6P2P3o comprend la séquence répétée (NANP) de Plasmodium falciparum et deux séquences de la toxine tétanique (P2: 830-843 et P30: 947-967) Ce peptide est connu comme étant un épitope T-helper et a démontré sa capacité à induire une réponse immunitaire élevée et de longue durée en présence d'adjuvants classiques. Le peptide a été obtenu par synthèse selon la méthode décrite dans la littérature (Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721). La solution mère de l'antigène est préparée à 0.4 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau à pH 8.0.
Adjuvants: les solutions mères des pseudodipeptides acylés (OM-197-MP, OM-197- FV6 et OM-197-MC) sont préparées à 1 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau, additionnée de 0.1% triéthanolamine. Le témoin positif est constitué par l'adjuvant incomplet de Freund (IFA de Difco, Détroit, Ml, U.S.A.) et le témoin négatif est une solution de 0.9% NaCI/eau.
Dans le cadre de ce protocole expérimental, l'adjuvant et l'antigène sont formulés sous la forme de mélange ou de conjugués décrits précédemment. Deux types de conjugués (OM-197-FV)n-(NANP)6P2P3o ont été testés. Ceux-ci correspondent à des degrés de conjugaison différents, soit 1, 2 ou 3 molécules de OM-197-FV par molécule de peptide (mélange de mono-, bi- et triconjugué, n=1, 2 et 3, respectivement), soit 1 molécule de OM-197-FV par molécule de peptide (monoconjugué, n=1).
Immunisation: des souris femelles BALB/c âgées de 6 semaines (6 souris par groupe) sont immunisées à deux reprises, par injection sous-cutanée à la base de la queue de 0.1 ml. Les quantités administrées sont de 20 μg d'antigène et de 50 μg d'adjuvant lors de la première injection et de 10 μg d'antigène et de 50 μg d'adjuvant lors de la seconde. Dans le cas des conjugués, la partie antigène est déterminante pour le calcul de la dose injectée.
Schéma d'immunisation et des prélèvements :
Prélèvements du sang :
Obtention du sérum: des prélèvements de sang sont effectués aux temps 0 et 5 semaines. Le sang est laissé reposer 60 min à 37°C, puis placé pendant une nuit à 4°C. Le sérum est ensuite congelé à -80°C jusqu'au dosage des anticorps. 5.1.2. Détermination des anticorps IqG anti-(NANP)aP2P3o:
Le dosage des anticorps IgG dirigés spécifiquement contre l'antigène (NANP)δP2P3o est réalisé par ELISA. La fixation de l'antigène est effectuée en microplaque à 96 puits (Maxisorp F 96, Nunc, DK) par incubation pendant une nuit en chambre humide à 4°C avec dans chaque puits 0.1 ml de PBS (phosphate buffered saline) contenant 0.001 mg/ml d'antigène (NANP^PΛo- La saturation de la microplaque est effectuée avec du PBS contenant 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Fluka, CH). Les plaques sont lavées avec du PBS contenant 0.05%) de Twe'en 20 (Sigma, Saint- Louis, MO, USA). Les sérums prélevés à 5 semaines sont dilués en série avec le tampon de dilution (PBS contenant 2.5% de lait en poudre dégraissé et 0.05%o de Tween 20), puis transférés dans la microplaque et laissés 1 h à température ambiante (TA). Les plaques sont ensuite lavées avec du PBS. La solution de dilution contenant l'anticorps polyclonal anti-immunoglobuline G de souris conjugué à la phosphatase alcaline (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) est ajoutée aux plaques et incubée 1 h à TA. Les plaques sont lavées avec du PBS et les anticorps spécifiques mis en évidence par réaction colorimétrique avec le substrat de la phosphatase alcaline, le p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, USA.). L'absorbance à 405 nm est mesurée avec un lecteur de microplaque (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), chaque condition est déterminée en duplicat. Les résultats présentés sont la moyenne des absorbances mesurées à 405 nm obtenues pour les souris de chaque groupe.
5.1.3. Résultats : réponse spécifique
La production spécifique des anticorps IgG anti-(NANP)6P2P3o déterminée par ELISA, est présentée graphiquement pour les souris ayant reçu deux immunisations (Figure 79).
Deux injections d'un mélange antigène + adjuvant (OM-197-FV6 ou OM-197-MC) induisent une réponse sérologique largement supérieure à celle observée lors de l'injection de l'antigène seul. L'immunisation avec le monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P30 induit une réponse en anticorps IgG légèrement supérieure à celle obtenue avec le mélange antigène + OM-197-FV6. Un degré de conjuguaison plus élevé (OM-197-FV)ι,2|3 -(NANP)6P2P30 n'améliore pas la réponse sérologique contre cet antigène. Le mélange de l'adjuvant OM-197-MP et du monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P3o augmente de façon significative la réponse sérologique à cet antigène et dépasse les valeurs obtenues avec le contrôle positif constitué du mélange (NANP)6P2p3o + IFA.
Des résultats similaires sont obtenus lorsque la capture des anticorps est effectuée par ELISA en utilisant comme antigène le peptide (NANP)6NA (Figure 80).
EXEMPLE 5.2.
Groupe d'immunisation ovalbumine : détermination d'anticorps spécifiques générés chez la souris après 1 et 2 administrations par voie sous-cutanée.
5.2.1. Description de l'expérience
Le but de cette étude est de comparer la réponse sérologique induite par l'injection d'un mélange adjuvant + antigène (OM-197-MP + ovalbumine) à celle élicitee par un conjugué avec ce même antigène (OM-197-FV-ovalbumine). Pour cela 30 souris BALB/c (femelles, 8 semaines d'âge au début du traitement) ont été réparties dans les 3 groupes suivants : Solutions :
Groupe A: la solution mère d'antigène seul (ovalbumine, Fluka AG, Buchs, Suisse) été préparée à la concentration de 125 μg/ml dans H20 + 0.01% thiomersal. Groupe B: la solution mère du mélange antigène + adjuvant (ovalbumine + OM-197- MP) contient 125 μg/ml d'ovalbumine et 250 μg/ml de OM-197-MP dans H20 + 0.01%) thiomersal.
Groupe C: la solution mère du conjugué OM-197-FV-ovalbumine est à la concentration de 125 μg/ml de protéine dans H20+ 0.01% thiomersal.
Préparations des solutions pour l'injection : chaque solution mère est incubée 15 minutes à 37°C, puis dans chaque cas un volume adéquat de NaCI (14%) est ajouté à chaque solution pour obtenir une solution isotonique (0.9% NaCI). Le tout est vortexé pendant 3 minutes.
Immunisations: les injections ont eu lieu à jours 0 et 14. Les solutions sont administrées par voie sous-cutanée (100 μl en 2 sites différents, au total 200 μl par animal). Les prises de sang ont eu lieu à jours 14 et 28 (ponction retro-orbitale).
Dosage des immunoglobulines anti-ovalbumine: les immunoglobulines sériques spécifiques pour ovalbumine suivantes ont été déterminées en duplicats par ELISA : lgG1 , lgG2a, et IgM. En bref, des plaques micropuits (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) ont été incubées (coating ovemight) à 4°C avec 100 μl de ovalbumine (0.5 μg) dans un tampon bicarbonate (pH 9.6). Après lavage avec 0.5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) les sérums ont été dilués 50, 200 et 800 fois (solution de dilution: phosphate buffered saline (PBS) + 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02% Tween-20)). 100 μl de chacun des sérums dilués ont été ajoutés aux puits. Cette incubation a duré 45 minutes à 37°C.
Après un second lavage, les lgG1 , lgG2a et IgM spécifiques pour ovalbumine sont incubées 30 minutes à 37°C avec 100 μl des anticorps (rat anti-souris) anti-lgG1 conjugués à la peroxydase (Serotec, Oxford, UK) , lgG2a conjugués à la peroxydase (Pharmingen, San Diego, CA, USA) et IgM conjugués à la biotine (Pharmingen, San Diego, CA, USA), dilués au préalable dans le tampon PBS/BSA/Tween (dilutions : 250, 1000, et 500 fois respectivement). Pour les IgM, après un lavage supplémentaire, une 3eme incubation a été nécessaire (30 min à 37°C) avec une solution 1/100 de streptavidine conjuguée à la peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
Après lavage, 100 μl d'une solution de 1 ,2 phenylène diaminé (OPD, Merck, Darmstadt, D) sont ajoutés pour détecter la peroxydase conjuguée aux anticorps secondaires anti-lgG1 , tandis que pour les lgG2a et IgM, le réactif utilisé est le 3',3',5',5'-tétramethylbenzidine (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, USA). Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par l'ajout de 100 μl de 2N H2S04. Les absorbances sont mesurées à 490 nm avec un lecteur de plaques Bio Rad 3550.
5.2.2. Résultats
Les résultats de chaque mesure à 490 nm sont exprimés en unités arbitraires (u.a) par ml. Ceci a été possible par comparaison de chaque échantillon avec une référence préparée à partir de dilutions d'un pool des échantillons à 28 jours provenants du groupe A (animaux injectés avec ovalbumine seule). Par définition le pool d'échantillons dilué 50 fois est à la concentration de 1000 u.a./ml. Les résultats individuels ont ensuite été corrigés selon le facteur de dilution correspondant (50, 200, ou 800 fois) et sont présentés dans les Figures 81, 82 et 83 : les cercles vides correspondent à la moyenne à 14 jours et les cercles pleins correspondent à la moyenne à 28 jours; abbréviation Ova = ovalbumine.
Ces résultats indiquent que le conjugué OM-197-FV-ovalbumine est particulièrement immunogène dans le modèle étudié, puisqu'il augmente de façon significative après la deuxième injection les anticorps spécifiques anti-ovalbumine produits par la souris, ceci quelque soit la sous-classe d'immunoglobuline analysée (lgG1 , lgG2a, et IgM). En particulier il faut relever l'augmentation très importante des lgG2a anti- ovalbumine (Figure 84) qui suggère une immunité préférentiellement orientée TH1. Le mélange non covalent ovalbumine + OM-197-MP donne une réponse lgG2a inférieure à celle obtenue avec le conjugué. EXEMPLE 5.3.
Groupe d'immunisation hémagglutinine H1N1 : détermination d'anticorps spécifiques générés chez la souris après 1 et 2 administrations par voie sous- cutanée.
5.3.1. Description de l'expérience
Le but de cette étude est de comparer la réponse sérologique induite par l'injection d'un mélange adjuvant + antigène (OM-197-MP + H1N1) à celle élicitee par un conjugué avec ce même antigène (OM-197-FV-H1 N1). Pour cela 30 souris BALB/c (femelles, 8 semaines d'âge au début du traitement) ont été réparties dans les 3 groupes suivants :
5.3.2. Préparation des solutions injectées
Groupe A: la solution mère de H1 N1 (hémagglutinine A/Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) a été préparée à la concentration de 25 μg/ml dans H20.
Groupe B: la solution mère H1 N1 + OM-197-MP contient 25 μg/ml de H1 N1 et 500 μg/ml de OM-197-MP dans H20.
Groupe C: la solution mère OM-197-FV- H1 N1 (H1 N1 lié de façon covalente à OM-197-FV) est à la concentration de 25 μg/ml dans H20).
Chaque solution mère est incubée 15 minutes à 37°C, puis 135 μl de NaCI (14%) sont ajoutés à 2 ml de chaque solution. Le tout est vortexé pendant 3 minutes. 5.3.3. Injections et dosage des immunoglobulines anti-H1 N1
Les injections ont eu lieu à jours 0 et 14. Les solutions sont administrées par voie sous-cutanée (50 μl en 2 sites différents, au total 100 μl par animal). Les prises de sang ont eu lieu à jours 14 (ponction retro-orbitale).
Les IgM spécifiques pour H1 N1 ont été déterminées en duplicats par ELISA. En bref, des plaques micropuits (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) ont été incubées (coating overnight) à 4°C avec 100 μl de H1 N1 (0.5 μg) dans un tampon bicarbonate (pH 9.6). Après lavage avec 0.5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) les sérums ont été dilués 50, 200 et 800 fois (solution de dilution: phosphate buffered saline (PBS) + 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02% Tween- 20)). 100 μl de chacun des sérums dilués ont été ajoutés aux puits. Cette incubation a duré 45 minutes à 37°C.
Après un second lavage, les IgM spécifiques pour H1N1 sont incubées 30 minutes à 37°C avec 100 μl des anticorps (rat anti-souris) anti-lgM conjugués à la biotine (Pharmingen, San Diego, CA, USA), dilués au préalable dans le tampon Tween (dilution: 500 fois). Après un lavage supplémentaire, une troisième incubation (30 min à 37°C) a été effectuée avec une solution 1/100 de streptavidine conjuguée à la peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
Après lavage, 100 μl d'une solution de 3',3',5',5'-tétraméthylbenzidine (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, U.S.A.) sont ajoutés pour détecter la peroxydase conjuguée aux anticorps secondaires anti- IgM. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par l'ajout de 100 μl de 2N H2S04. Les absorbances sont mesurées à 490 nm avec un lecteur de plaques Bio Rad 3550.
5.3.4. Résultats
Les résultats de chaque mesure à 490 nm sont exprimés en Unités Arbitraires (U.A) par ml. Ceci a été possible par comparaison de chaque échantillon avec une référence préparée à partir de dilutions d'un pool des échantillons à 28 jours provenants du groupe A (animaux injectés avec H1 N1 seul). Par définition le pool d'échantillons dilué 50 fois est à la concentration de 1000 U.A./ml. Les résultats individuels ont ensuite été corrigés selon le facteur de dilution correspondant (50, 200, ou 800 fois) et sont présentés dans la Figure 84: les cercles pleins correspondent à la moyenne à 28 jours.
Les souris immunisées avec le conjugué OM-197-FV-H1 N1 montrent un titre d'anticorps IgM anti-H1 N1 supérieur à celui du contrôle constitué par l'antigène H1N1 seul, ainsi qu'à celui du mélange OM-197-MP + H1 N1.
EXEMPLE 5.4.
Evaluation des propriétés de l'adjuvant OM-197-MP-AC dans un modèle murin d'immunisation par voie s.c. avec l'antigène de Leishmania LmCPb 5.4.1. Description de l'expérience
Des souris CBA reçoivent dans la queue une seule injection sous-cutanée (100 μl) de l'antigène du parasite Leishmania LmCPb (3 μg par souris) ± adjuvant. Deux groupes de 6 souris sont constitués qui reçoivent les traitements suivants: antigène seul (groupe témoin) et respectivement antigène + 50 μg d'OM-197-MP-AC Onze jours après l'injection, les cellules des ganglions lymphatiques inguinaux et périaortiques (2 groupes de 3 souris) sont mises en culture en triplicat en présence de l'antigène purifié LmCPb ou de l'extrait total du parasite (amastigote). Au jour 4, du surnageant est prélevé et conservé à -20°C pour le dosage de l'IL-4 et de l'IFN-γ. Finalement, de la thymidine tritiée (3H-TdR) est ajoutée aux cultures pour la mesure de la prolifération.
Le dosage des cytokines se fait par sandwich-ELISA (kits OptEIA™ IFN-γ et IL-4, BD PharMingen, Basel, Switzerland) et la réponse proliférative est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine (3H-TdR). La mesure de l'incorporation de 3H-TdR exprimées en CPM sous forme de moyenne arithmétique ± la déviation standard 82 pools de 3 souris) et la concentration en IL-4 en pg/ml est donnée individuellement pour chaque pool de 3 souris sous forme de moyenne arithmétique de deux mesures (dosage des cytokines). Antigène : la solution-mère de LmCPb est préparée à la concentration de 150 μg/ml dans PBS.
Adjuvants : la solution mère de OM-197-MP-AC est préparée à 0.9 mg/ml dans de l'eau pour injection additionnée de 0.1% triethanolamine Mélange antigène-adjuvant: La préparation d'adjuvant (4 volumes), préalablement ajustée à la concentration finale adéquate dans du PBS stérile, est mélangée juste avant l'injection avec la solution-mère d'antigène (1 volume).
5.4.2. Résultats Chez des souris CBA immunisées avec l'antigène de Leishmania LmCPb, une dose unique de 50 μg de l'adjuvant OM-197-MP-AC suffit à induire une augmentation (entre 2 et 6 fois) de la prolifération des cellules ganglionnaires mesurée in vitro en réponse à l'antigène purifié (0.6 à 15 μg/ml) ou à un extrait total de la forme amastigote du parasite (entre 2 et 50 x 10"6/ml). Ces résultats sont reportés dans le Tableau 1. De plus, le traitement des souris avec l'OM-197-MP-AC fait apparaître dans le surnageant des cultures ganglionnaires stimulées par l'antigène parasitaire des quantités importantes d'IL-4 (voir Tableau 2), alors que la production d'IFN-γ n'est pas détectée (< 100 pg/ml).
Table 1. Réponse proliférative in vitro de lymphocytes ganglionnaires de souris CBA immunisées avec LmCPb: Effet de l'adjuvant OM-197-MP-AC seul ou en combinaison avec du CpG-DNA déviation standard des mesures d'incorporation effectuées dans deux pools de ganglions lymphatiques (3 souris par pool;. cultures de chaque pool en triplicat).
Table 2: Production d'IL-4 in vitro par des lymphocytes de souris CBA immunisées avec LmCPb: Effet de l'adjuvant OM-197-MP-AC seul ou en combinaison avec du CpG-DNA
Les valeurs reportées dans le tableau représentent la moyenne arithmétique de 2 mesures de cytokines effectuées dans des surnageants de 2 pools (a et b; 3 souris par pool) de cellules ganglionnaires cultivées en triplicat. Conclusion
Le produit OM-197-MP-AC potentialise chez la souris CBA immunisée avec LmCPb (une protéase abondante dans la phase amastigote du parasite Leishmania) une réponse T spécifique évaluée in vitro par la mesure de la prolifération lymphocytaire. De plus, cet adjuvant favorise le développement de lymphocytes anti-LmCPb sécrétant des quantités importantes d'IL-4
EXEMPLE 5.5
Evaluation dans un modèle d'immunisation de souris des propriétés de pseudodipeptides acylés portant un auxiliaire fonctionnalisé couplés ou mélangés à des peptides synthétiques de la protéine du circumsporozoite de Plasmodium yoelii (PyCS 252-260)
Le but de cette expérience est d'évaluer la capacité du pseudodipeptide acylé porteur d'un bras auxilliaire greffé ou mélangé sur un peptide synthétique PyCS 252- 260 de la protéine du circumsporozoite de Plasmodium yoelii, à induire une réponse immune cellulaire et humorale spécifique contre le peptide. 5.5.1. Protocole expérimental
Formulation des antigènes avec les adjuvants: le peptide synthétique PyCS 252-260 correspondant à un épitope T de la protéine du circumsporozoite de Plasmodium yoelii de séquence SYVPSAEQI (Tableau 1). Le peptide 2 MR99B (SERSYVPSAEQI) a été obtenu par ajout des acides aminés SER sur le N-terminal et le peptide 1 MR99A (KGGKGGKSERSYVPSAEQI) a été obtenu par ajout des acides aminés lysine-glycine-glycine attachés au N-terminal du peptide MR99B décrit précédemment, les peptides ont été obtebus par synthèse sur phase solide (F- moc, selon by Merrifield et Atherton (Atherton et al., Bioorg. Chem. 8: 350-351. 1979) avec les réactifs et solvants provenant de Bachem Feinchemikallien (Buddendorf, Suisse), Novabiochem (Lâufelfingen, Suisse) and Fluka (Buchs, Suisse). Les peptides ont été purifiés par HPLC sur phase inverse. Les mono et poly-conjugués des peptides avec le pseudodipeptide acylé porteur d'un bras auxilliaire (OM-197-MC-FV) ont été obtenus comme décrit dans l'exemple 3.6 ([OM-197-MC-FV]n-peptide 1) et l'exemple 3.5 (OM-197-MC-FV-peptide 2). Les solutions finales stériles des peptides conjugués ont été lyophilisées. Immunisations des souris: la dose d'antigène correspond à 20 μg du peptide 2 par souris et par injection (Tableau 2). Avant l'injection, les préparations lyophilisées sont reprises avec NaCI 0.9%, vortexées 3 min and soumises à une sonnication de 10 min at 50°C. Les formulations avec IFA sont préparées par mélange d'un volume d'antigène (14.5 μg peptide PyCS 252-260 plus 50 μg de P30 (épitope T universel) dans le PBS) et d'un volume d'adjuvant.
Des souris BALB/c âgées de 4 semaines (Harlan, Zeist, NL) sont injectées sous- cutanées à la base de la queue. L'injection des formulations est effectuée avec des aiguilles 23" dans un volume finale de 50 μl. Les animaux reçoivent une seconde dose d'antigène au début de la 5eme semaine et une troisième injection au cours de la 9eme semaine.
Tableau 1. Antigèt πes peptides masse Dose / injection séquences synthétiques moléculaire (μg)
Peptide 1 KGGKGGKSERSYVPSAEQI 1978.2 29.0
Peptide 2 SERSYVPSAEQI 1365.5 20.0
PyCS 252-260 SYVPSAEQI 993.1 14.5
Tableau 2. Tableaux des groupes expérimentaux, des immunisations et des prélèvements
Immunisations avec les peptides
7 11 semaines
Réponse anticorps (ELISA)
Evaluations Réponse CTL (ELISPOT)
Prélèvements du sang et des organes lymphoides : Obtention du sérum: des prélèvements de sang sont effectués sur toutes les souris après 7 et 11 semaines. Le sang est laissé reposer 60 min à 37°C, puis placé pendant une nuit à 4°C. Le sérum est ensuite congelé à -80°C jusqu'au dosage des anticorps.
Prélèvement des ganglions inguinaux et de la rate : deux animaux de chaque groupe sont sacrifiés après 7 et respectivement 11 semaines. Les ganglions inguinaux et la rate sont prélevés chirurgicalement et les cellules mises en culture pour évaluation de l'activité CTL par ELISPOT (réponse Interferon-γ). Détermination du titre d'anticorps anti-peptide 1:
Le dosage du titre d'anticorps dirigé spécifiquement contre le peptide 1 (KGGKGGKSERSYVPSAEQI) est réalisé par ELISA. La fixation de l'antigène est effectuée en microplaque à 96 puits (Maxisorp F 96, Nunc, DK) par incubation pendant une nuit en chambre humide à 4°C avec dans chaque puits 0.05 ml de PBS (phosphate buffered saline) contenant 0.001 mg de peptide 1. Les plaques sont lavées avec PBS-0.05% Tween 20 (Sigma, St-Louis, MO, .S.A.) (PBS-T) et la saturation de la microplaque est effectuée avec 5%> de lait maigre dans le PBS-T pendant 1 h à tempéature ambiante. Les sérums individuels (A, B, C, D, E, F, G) des souris prélevés aux temps 9 et 11 semaines sont dilués en série avec le tampon de dilution (PBS contenant 2.5% de lait en poudre dégraissé et 0.05% de Tween 20), puis transférés dans la microplaque et laissés 1 h à température ambiante (TA). Les plaques sont ensuite lavées avec du PBS et la solution de dilution contenant l'anticorps polyclonal de chèvre anti-immunoglobuline de souris conjugué à la phosphatase alcaline (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.) est ajoutée aux plaques et incubée 1 h à TA. Les plaques sont lavées avec du PBS et les anticorps spécifiques mis en évidence par réaction colorimétrique avec le substrat de la phosphatase alcaline, le p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.). L'absorbance à 405 nm est mesurée avec un lecteur de microplaque (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), chaque sérum est déterminé en duplicat. Les résultats présentés sont la moyenne des valeurs obtenues pour les souris de chaque groupe. Le titre d'anticorps est déterminé par la dernière dilution induisant une réponse positive significative, c'est-à-dire avec une valeur de densité optique supérieure à la valeur du bruit de fond additionnée de 3 écart-types. Dosages ELISPOT - interféron-γ:
Les anticorps spécifiques anti-interféron-γ de souris (O1 E703B2) sont fixés par incubation pendant une nuit à 4 °C en chambre humide, d'une solution d'anticorps à 50 μg/ml dans une microplaque ELISPOT dont le fond des puits est couvert de nitrocellulose (Millipore, Molsheim, F),. L'étape de saturation est effectuée par ajout de DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.) contenant 10% de sérum de veau fœtal (FCS, Fakola, CH) pendant 2 heures à 37°C. Les cellules obtenues à partir des organes lymphoides (ganglions inguinaux et rate) sont mises en culture dans les microplaques à 200O00 ou 400O00 cellules par puits, puis co-cultivées pendant 24h à 37°C avec 100O00 cellules présentatrices d'antigène (préalablement puisées avec le peptide PyCS 252-260 à 37°C pendant 1h et irradiées (10 K rads) et lavées 3 fois) ou en présence de Concanavaline A comme contrôle. Après l'incubation, les cellules sont éliminées et après lavage, un second anticorps anti- IFN-γ de souris biotinylé (ANI, 2 μg/ml dans PBS avec 1% BSA) est ajouté pendant 2 h. La streptavidine conjuguée à la phosphatase alcaline (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA) diluée 1 :1000 est ajoutée et incubée 1 h à 37°C, 3 lavages sont effectués avec du PBS contenant 0.05%) de Tween 20, suivi par 3 lavages avec du PBS. La présence des complexes immuns anti-IFN-γ est mise en évidence par l'ajout du substrat BCIP/NBT (Sigma, St-Louis, MO, U.S.A.). La réaction est arrêtée par lavage à l'eau courante. Les spots positifs à l'IFN-γ sont alors comptés au moyen d'un lecteur automatique Biosys GmbH (Karben, Allemagne). Les spots spécifiques correspondent à la différence entre le nombre de spots comptés en présence des cellules puisées avec le peptide et le nombre de spots comptés en l'absence de peptide. Les résultats représentent sont la moyenne des valeurs obtenues pour les souris de chaque groupe. Ils sont exprimés en nombre de spots par million de cellules mises en culture. Résultats
La réponse humorale est présentée dans la Figure 85 (2 semaines après la seconde injection) et dans la Figure 86 (2 semaines après la 3eme injection). Après 2 immunisations, les réponses positives sont observées dans 5 sur les 7 animaux du groupe 5 (animaux ayant été immunisés avec le peptide 1 conjugué par un bras auxiliaire à 4 unités de pseudodipeptide acylé). Dans ce groupe, le pourcentage de souris répondeuses augmente avec la 3eme injection puisque les souris B et D montrent un titre d'anticorps significatif, mais bas. Le groupe 3 immunisé avec le même peptide mélangé avec le même adjuvant ne produit pas de titre d'anticorps significatif. Une réponse émergente est observée après 3 immunisations dans le groupe 7 (monoconjugué avec le peptide 2 complété par l'adjuvant OM-197 libre). Les autres groupes ayant reçu le peptide court ou aucun peptide ne montrent pas de réponse anticorps. En conclusion, le tetraconjugué OM-197-peptide 2 est capable d'induire une réponse anti-corps dans toutes les souris immunisées avec un titre moyen à bas. L'évaluation de l'activité cellulaire est déterminée par la fréquence des CTL, sécrétant de l'interféron-γ , spécifiques à l'épitope PyCS 252-260. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Le contrôle positif est représenté par le groupe 2 et le contrôle négatif représenté par les adjuvants seuls (groupe 1 et 8). Le contrôle de la stimulation des cellules par la Concanavaline A est positif pour toutes les souris. Les groupes 5 (tetra-conjugué) et 7 (monoconjugué + adjuvant) montrent des réponses CTL positives. En conclusion, le peptide conjugué à 4 molécules de pseudodipeptide acylé (OM- 197-peptide 1) est efficace alors que le monoconjugué (OM-197-peptide 2) n'induit pas de CTL. Par contre le monoconjugué complété avec l'OM-197 libre induit des CTL, alors qu'il n'induit pas la production d'anticorps, ce qui est probablement du à la petite taille du peptide 2 (12 acides aminés). Tableau 3: Réponse CTL au peptide PyCS 252-260 EXEMPLE 5.6
Evaluation de la pyrogénicité des pseudodipeptides acylés dans le modèle du lapin.
Le but de cette expérience est de déterminer la plus forte concentration de pseudodipeptide acylé porteur d'un bras auxilliaire greffé qui n'induit pas de fièvre chez un lapin injecté i.v..
Protocole :
15 lapins (New Zealand White Rabbits) ont été répartis dans les groupes suivants:
Groupe 1 : 1.0 mg/kg Groupe 2: 0.1 mg/kg
Groupe 3: 0.01 mg/kg
Groupe 4: 0.001 mg/kg
Groupe 5: eau pour injection
Le jour du test les lapins sont pesés et immobilisés dans des boîtes prévues à cet effet. Des sondes à températures sont introduites dans leur rectum.
1 heure après l'introduction des sondes les températures (préinjections) sont enregistrées pendant 90 minutes et la moyenne est déterminée.
Chaque lapin reçoit ensuite une injection i.v. de produit ou du contrôle (eau stérile à
0.9%o NaCI) via la veine de l'oreille marginale (latérale). La température est mesurée chaques 30 minutes pendant 3 heures. La différence entre la moyenne de préinjection et la température maximum est calculée et reportée.
Pour 3 lapins par groupe le test est considéré comme non pyrogène si la somme des
3 réponses ne dépasse pas 1.15 °C, et pyrogène si la somme dépasse 2.65 °C. Si la valeur obtenue se situe entre deux, le test est refait avec 3 lapins supplémentaires.
Résultat :
Les résultats du test de pyrogénicité des composés OM-197-MC-MP et OM-197-MC-Asp sont présentés ci-après:
Les composés selon l'invention ne sont pas pyrogènes aux doses inférieures à 0.1 mg/kg.

Claims

REVENDICATIONS
1. Nouveaux pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée, à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I (D dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10
Y représente O ou NH,
X et Z représentent un bras auxiliaire fonctionnalisé ou un groupe acide sous forme neutre ou chargée choisi parmi les groupements suivants :
-carboxyle
-carboxy [(Cι-C5)alkoxy]
-carboxy [(Cι-C5)alkylthio]
-phosphono [(Cι-C5)alkoxy] -phosphono [(Cι-C5)alkylt io]
-dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-C5)alkoxy]
-dihydroxyphosphoryloxy [(C1-C5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy
-hydroxysulfonyloxy -hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkoxy]
-hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkylthio]
-hydoxysulfonyloxy [(Cι-Cs)alkoxy]
-hydoxysulfonyloxy [(d-C5)alkylthio] -[carboxy(Cι-C5)alky[]aminocarbonyle -[dicarboxy(Cι-C5)alkyl]aminocarbonyle -[ammonio(Cι-C5)alkyl]aminocarbonyle -{carboxy[amino(Cι-C5)alkyl]}aminocarbonyle avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé.
2. Un composé selon la revendication 1 dans lequel le groupe auxiliaire en X ou Z, répond à la formule générale (II)
A-(CO)r(CH2)s-W (II)
A est O, S ou NH le descripteur r prend une valeur de 0 ou de 1 le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10
W est choisi parmi les groupements :
-formyle
-acétyle
-cyano -halogéno
-amino
-bromo ou iodo-acétamido
-acylamido
.-diacylimido -sulfhydryle
-alkylthio
-hydroxyle
-1 ,2-dihydroxyéthyle
-alkoxy -acyloxy
-vinyle
-ethynyle
-carboxyle libre - carboxyle sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide -azido -thiocyano
Nouveaux pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée, à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I d) dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en C-i - C2 ) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10 X et Z représentent un groupe acide sous forme neutre ou chargée ou un bras auxiliaire fonctionnalisé, avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé,
Y représente O ou NH, le groupe acide X ou Z est choisi de préférence parmi les groupements :
-carboxyle
-carboxy [(Cι-C5)alkoxy]
-carboxy [(CrC5)alkylthio]
-phosphono [(Cι-C5)alkoxy] -phosphono [(C C5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-C5)alkoxy]
-dihydroxyphosphoryloxy
-hydroxysulfonyloxy -hydroxysulfonyl [(d-C5)alkoxy] -hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkylthio] -hydoxysulfonyloxy [(Cι-C5)alkoxy] -hydoxysulfonyloxy [(CrC5)alkylthio] et le bras auxiliaire fonctionnalisé en X ou en Z est défini comme précédemment à l'exception du radical 1,2-dihydroxyéthyle.
4. Un composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel, dans le cas où le substituant X ou Z représente un groupe acide sous forme neutre, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique libre de cet acide.
5. Un composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel, dans le cas où X ou Z est un groupe acide sous forme chargée, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique salifiée, notamment par addition d'une base minérale ou organique, de préférence thérapeutiquement compatible.
6. Un composé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel, dans le cas où le substituant X ou Z représente un groupe auxiliaire de formule générale (III) 0-CO-(CH2)s-W (III) le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10, et en particulier 4, 5 ou 6 et W est choisi parmi les groupements :
-formyle
-amino -hydroxyle
-1 ,2-dihydroxyéthyle et carboxyle.
7. Un composé selon l'une des revendications 1 à 5 répondant à la formule générale IV X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I (IV)
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10 et dans laquelle un des substituants X ou Z est une fonction acide choisie parmi les groupes carboxyle, dihydroxyphosphoryloxy ou un groupe carboxy[(d- C5)alkoxy], carboxy [(C1-C5)alkylthio], [carboxy(Cι-C5)alkyljaminocarbonyle, [dicarboxy(C1-C5)alkyl]aminocarbonyle et {carboxy[amino(C1-C5)alkyl]}amino- carbonyle et dans laquelle l'autre substituant est un radical acyloxy choisi parmi les groupes 6-aminohexanoyloxy, 6-oxohexanoyloxy, 6-hydroxyhexanoyloxy, 6,7-dihydroxyheptanoyloxy et 3-carboxypropanoyloxy.
Les composés selon l'une des revendications 1 à 7, choisis dans le groupe formé de :
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartïque, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10-(6,7- dihydroxyheptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique,
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-(6- oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique,
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyI}amide 5-0-(6, 7- dihydroxyheptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide 5-0-(6- oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyl}amide 5-0-(6- hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - le (3RS,9R)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- aminohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le (3R,9R)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -dihydrogéno-phosphate 10-(6- aminohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le (3S,9R)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -dihydrogéno-phosphate 10-(6- aminohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-(6- hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino} pentyle et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1-0-carboxyméthyl éther 9-0-(6- oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le (2S,8R)-1-(carboxyméthyl)thio-2-[(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoyl- amino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]nonan-9-ol 9-0-(7- amino-heptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1-0-(2,2-dicarboxyéthyl) éther 9- 0-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-1 , 10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10-(6- bromoacetamidohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le (3RS, 9R)-3-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-décane-1 , 10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-O-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyl}amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- succinylamidohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- glycinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- succinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N-(3- aminopropyl)amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N-[(1S)-1- carboxy-5-aminopentyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N- [(1S)-1-carboxy-5-aminopentyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N-[(1 S)-1 ,2- dicarboxyethyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N-
[(1S)-1 ,2-dicarboxyethyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-acétyl-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6-aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- - l'acide N-(2-décanoyloxyoctanoyl)-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique.
Les composés selon les revendications 1 à 7 de formule générale l choisis dans le groupe formé par:
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10-(6,7- dihydroxyheptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-(6- oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyIamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide 5-0-(6, 7- dihydroxyheptanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide 5-0-(6- oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- les (3RS, 9R), (3R, 9R) et (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-décan- 1 ,10-diol 1 -dihydrogéno-phosphate 10-(6-aminohexanoate) et leurs sels d'addition avec une base minérale ou organique - le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy- tétradécanoylamino]-décan-1,10-diol 1 -dihydrogéno-phosphate 10-(6- hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- -le 2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxyoxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl) aminojpentyle et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- I' acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique - l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- succinyloxy-4-[(R)-3-hydroxytétradecanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N- [(1 S)-1-carboxy-5-aminopentyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-(6- aminohexanoyloxy)-4-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino] pentyljamide β-N- [(1 S)-1 ,2-dicarboxyethyl]amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique.
10. Procédé d'obtention des pseudodipeptides N-acylés de formule générale I selon la revendication 1, porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I, qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et YH en position ω d'un acide aminé ω-fonctionnalisé par des réactifs de blocage orthogonaux, en ce qu'on soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, en ce qu'on libère la fonction amine en position (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R est défini comme précédemment, puis libère la fonction alcool ou amino terminale pour obtenir l'amino alcool fonctionnalisé de formule générale V
Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (V)
NHR2
dans laquelle Y représente HO ou NH2,
R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent chacun un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte, avec un dérivé d'un acide aminé ω-fonctionnalisé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme précédemment, m et n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe acide défini comme précédemment qui peut être sous forme libre ou estérifiée, pour former le pseudodipeptide de formule générale VII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH l I (VII)
dans laquelle les substituants Ri, R2, et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale
VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est 1 ou 0 le descripteur s varie de 1 à 10 et de préférence entre 2 et 6, W est choisi parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, - azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un processus de déprotection, de façon à obtenir le dérivé de formule générale I X-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I)
I I
NHRi NHR2
dans laquelle les substituants X, Y, Z, R-i, R2, n, m, p et q ont les significations fournies antérieurement.
11. Procédé d'obtention des pseudodipeptides acylés selon la revendication 10, de formule générale IV X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NHR! NHR2
dans laquelle R-i et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Cι-C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide, sous forme neutre ou chargée, ou un bras auxiliaire fonctionnalisé caractérisé en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
I NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, P et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle R-i est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à
24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0 i
O pour former le pseudodipeptide phosphorylé de formule générale X
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X) i I I
O NHRi NHR2
dans laquelle les substituants R-i, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII)
dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r a une valeur de 0 ou 1 le descripteur s variant de 1 à 10, et de préférence de 2 à 6 W est choisi parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, - amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, - thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XI
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W i I I
O NH Ri NHR2 (XI)
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
12. Procédé d'obtention des pseudodipeptides selon la revendication 10 de formule générale XII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII)
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en d - C2 ) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse puis alkyle la fonction amine avec un agent d'alkylation pour obtenir l'amino alcool de formule générale XIII
W-(CH2)sNH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XIII)
I
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 le descripteur s variant de 1 à 10, et de préférence entre 2 et 7 que l'on condense en présence d'un agent de condensation dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle R-i est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10
et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0
O pour former le pseudodipeptide de formule générale XIV (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)sW (XIV) , I I
dans laquelle les substituants R-t, R2 et les descripteurs m, n, p, q et s sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse,
puis le soumet à une hydrogénation catalytique ou à un processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XV
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W i I I (xv)
O NH R-, NHR2
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, et s ont les significations fournies antérieurement,
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyle, - ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs.
13. Procédé d'obtention selon la revendication 10, des carboxypseudodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
HHR NHR2 dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C-ι-C2 ) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse pour obtenir l' amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, P et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé fonctionnel d'acide aminé ω-carboxylique de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
dans laquelle R^ est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un radical RO-CO- dans lequel R est un groupement alkyle pour former le pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI) I I
NHR! NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est 1 ou 0 le descripteur s varie de 1 à 10, et de préférence de 2 à 6
W est choisi parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, - amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, - thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et on le soumet à un processus de déprotection et notamment à une hydrogénation catalytique de façon à obtenir le dérivé de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-NH-(CH2)P-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W
I I
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
4. Procédé d'obtention de pseudodipeptides selon la revendication 10, de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)cfZ (IV)
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et
(alkyl en CrC24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras auxiliaire fonctionnalisé
qui consiste en ce que l'on bloque la fonction hydroxyle libre d'un pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
NHRi NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse, avec un groupe protecteur labile par acidolyse, libère la fonction carboxyle présente sous forme d'ester, soumet cette fonction carboxylique éventuellement sous forme activée à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool primaire correspondant, convertit cette fonction alcool en ester phosphorique par traitement avec un agent de phosphorylation, libère la fonction hydroxyle protégée par traitement avec un acide, puis la soumet à une réaction de substitution, d'acylation ou d'alkylation avec un réactif de formule générale VIII A-(CO)r(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH le descripteur r est 1 ou 0 le descripteur s varie de 1 à 10 et de préférence de 2 à 6
W est choisi parmi l'un des groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester ou d'un autre dérivé
si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et le produit ainsi formé est déprotégé, par hydrogénolyse, de façon à obtenir le produit de formule générale XI
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W I I
O NH R! NHR2 (XI)
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
15. Procédé d'obtention de phosphodipeptides selon la revendication 10, de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NHRT NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, alkoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Cι-C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 et dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionnalisé
qui consiste en ce que l'on déprotège la fonction carboxyle présente sous forme d'ester dans un pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse comme par exemple le groupe benzyle, puis soumet l'acide ainsi formé à une réaction de couplage peptidique avec un acide aminé ou un diaminoalkane partiellement protégé, en présence d'un agent de couplage peptidique, puis soumet si désiré le produit de couplage à une réaction de substitution, d'acylation ou d'alkylation avec un réactif de formule générale VIII
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est 0 ou 1 le descripteur s varie de 1 à 10 et préférence de 2 à 6
W est choisi parmi l'un des groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, -halogéno, -amino, -bromo- ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle,
-alkylthio, -hydroxyle, -1 ,2-dihydroxyéthyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester ou d'un autre dérivé si nécessaire en présence d'un agent d'activation, et le produit ainsi formé est déprotégé, par exemple par hydrogénolyse, de façon à obtenir le produit de formule générale XVI 11
R3-NH -CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W
I I
NHR1 NHR2 (XVIII)
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement et le groupe R3 représente un groupe aminoalkyle, carboxyalkyle, dicarboxyalkyle ou aminocarboxyalkyle.
16. Les énantiomeres et les diastéréoisomères des composés de formule générale I selon la revendication 1 , de formule générale IV selon la revendication 7, de formule générale XI selon la revendication 11 , de formule générale XII selon la revendication 12, de formule générale XVI selon la revendication 13 ou de formule générale XVIII selon la revendication 15.
17. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel le blocage de la fonction amine en ω sur la chaîne d'un dérivé d'ornithine ou de lysine est effectué par N-benzyloxycarbonylation, après réaction initiale de la fonction acide avec un sel de cuivre, en milieu alcalin, réaction de ce carboxylate de cuivre avec du chloroformiate de benzyle et libération de la fonction carboxylique par chélation du cuivre en milieu acide et successivement α-N-t- butoxycarbonylation, pour obtenir le dérivé α-N-t-butoxycarbonylé et co-N- benzyloxycarbonylé.
18. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel la réduction de la fonction carboxylique libre est effectuée en utilisant le complexe borane-sulfure de diméthyle ou en faisant réagir le dérivé carboxylique avec un chloroformiate d' alkyle pour former un anhydride mixte que l'on réduit ensuite au moyen d'un borohydrure de métal alcalin ou alcalinoterreux, pour obtenir le dérivé hydroxyle correspondant ayant une fonction alcool primaire.
19. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel l'élimination du groupe benzyloxycarbonyle est effectuée par hydrogénolyse dans un solvant hydroxylique contenant de la triéthylamine.
20. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel l'amine libérée est couplée avec un acide α-acylamino ω-phosphorylé carboxylique en présence d'un réactif de couplage peptidique et notamment de IIDQ pour donner un pseudodipeptide phosphorylé protégé.
21. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel le pseudodipeptide est acylé sur la fonction alcool avec un acide ω-fonctionnalisé en présence d'agent d'estérification, et notamment d'EDCI, pour conduire à un ester alcénylé.
22. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel la fonction alcénylé de l'ester alcénylé est soumise à une réaction de dihydroxylation en un diol vicinal que l'on soumet, après déprotection des fonctions du pseudodipeptide à une oxydation par l'acide périodique pour obtenir un composé possédant une fonction aldéhyde.
23. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel le pseudodipeptide est acylé sur la fonction alcool avec un acide ω-amino- alkanoique.
24. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel on effectue une réaction de déprotection complète par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur, pour obtenir un pseudodipeptide portant un bras auxiliaire aminoalkanoyle.
25. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel le partenaire acide de la réaction de couplage est un dérivé de l'acide aspartique ou de l'acide glutamique obtenu par acylation de la fonction amine de l'ester β-benzylique de l'acide aminé par un dérivé d'acide gras en présence d'un agent d'acylation pour obtenir un ester β-benzylique d'acide N-acyl aspartique ou glutamique.
26. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel le dérivé N-acylé de l'acide aspartique ou glutamique est couplé à l' amino alcool -N-acylé dérivé de l'ornithine ou de la lysine puis le pseudodipeptide ainsi obtenu est soumis à une réaction d' hydrogénolyse en présence d'un catalyseur pour fournir le pseudodipeptide portant une fonction carboxylique.
27. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel la fonction hydroxyle du pseudodipeptide est acylée à l'aide d'un acide ω- fonctionnalisé par un groupe alcénylé et dans lequel on soumet le groupe alcénylé aux réactions de dihydroxylation puis de déprotection et d'oxydation par l'acide périodique pour obtenir un composé de formule générale XVII.
28. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel la fonction hydroxyle du pseudodipeptide est acylée à l'aide d'un acide ω- aminoalkanoïque et en ce que l'on soumet le composé aux réactions de déprotection, pour obtenir un composé de formule générale XVII.
29. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10, dans lequel l'amino alcool obtenu par réduction de l'ornithine ou de la lysine est alkyle par un triflate d'ω-alcényle que l'on couple avec un acide α-acylaminé ω-phosphorylé carboxylique en présence d'un agent d'acylation comme l'EDCI, puis soumet le groupe alcénylé à une réaction de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, élimine les groupes protecteurs, et oxyde la fonction diol vicinal par le periodate de sodium pour obtenir un composé à fonction aldéhyde.
30. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel on soumet un dérivé N-protégé de la serine à une O-alkylation, élimine le groupe protecteur de la fonction amine par acidolyse, acyle à nouveau la fonction amine avec un dérivé d'acide gras 3-hydroxylé en présence d'un agent d'acylation pour obtenir un dérivé N-acylé O-alkylé de la serine que l'on couple avec un aminoalcool en présence d'un agent de couplage peptidique puis acyle la fonction OH libre avec un acide alkanoïque ω-fonctionnalisé, pour obtenir un composé de formule générale l dans laquelle X est un groupement carboxyalkyloxy.
31. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel l'acide aminé de départ est la cystéine ou l'homocystéine que l'on alkyle par le bromoacetate de p-méthoxybenzyle puis acyle à l'azote avec un dérivé d'acide gras 3-hydroxylé, couple le dérivé S-alkylé et N-acylé ainsi obtenu avec le
5-amino 2-[3-hydroxytetradecanoylamino]pentan-1-ol en présence d'un agent de couplage peptidique pour obtenir un produit de condensation dont on acyle la fonction alcool primaire libre par un acide alcanoïque ω-fonctionnalisé, et si désiré soumet le produit en résultant à une réaction de déprotection, pour obtenir un composé de formule générale I dans laquelle X est un groupement carboxyalkylthio.
32. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel on soumet un dérivé p-méthoxybenzyloxycarbonylé de la serine à une O-alkylation à l'aide du méthylène malonate de dibenzyle en milieu alcalin, libère la fonction amine par traitement acide puis acyle la fonction amine libérée avec un acide gras 3-hydroxylé en présence d'un agent d'acylation, puis couple le dérivé N- acylé O-alkylé ainsi obtenu avec un amino alcool en présence d'un agent de couplage peptidique pour former un pseudodipeptide que l'on acyle ensuite sur la fonction OH libre avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé par un radical alcénylé ou aminé, soumet le dérivé alcénylé à une réaction de dihydroxylation puis de déprotection par hydrogénolyse puis à une oxydation par l'acide périodique, pour obtenir un composé de formule générale I dans laquelle X est un groupement dicarboxyalkyloxy.
33. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel en partant de l'ester benzylique de l'homosérine O-phosphorylée, on procède à une N-acylation par l'acide 3-benzyloxytétradécanoïque, soumet l'ester de benzyle à une hydrogénolyse sélective, couple cet acide avec le dérivé -N- dodécanoyloxytétradécanoique de l'ornithinol en présence d'un agent de couplage peptidique pour obtenir un pseudodipeptide que l'on acyle sur la fonction hydroxyle restée libre avec un acide alcanoïque ω-fonctionnalisé par un alcénylé ou un amino, en présence d'une carbodiimide et dans le cas d'un dérivé alcénylé soumet celui-ci aux réactions de dihydroxylation puis de déprotection par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur et d'oxydation par l'acide périodique, pour obtenir un composé de formule générale I dans laquelle R1 est un groupe hydroxyalkanoyle et R2 est un groupe acyloxyalkanoyle.
34. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel le pseudodipeptide intermédiaire issu de l'acide aspartique ou glutamique est soumis à une réaction de protection de la fonction hydroxyle libre par un groupe sensible à l'acidolyse, puis on déprotège la fonction carboxyle présente sous forme d'ester par une autre méthode de déprotection et notamment par hydrogénolyse, puis on la réduit, de préférence après activation sous forme d'anhydride mixte, avec un agent de réduction comme un borohydrure de métal alcalin; la fonction hydroxyle ainsi formée est soumise à une réaction de phosphorylation puis le groupe protecteur de l' hydroxyle est hydrolyse en milieu acide et la fonction hydroxyle ainsi régénérée soumise à une réaction d'acylation avec un acide carboxylique ω-fonctionnalisé, puis on soumet celui-ci aux réactions de dihydroxylation puis de déprotection par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur et d'oxydation par l'acide périodique pour former un composé de formule générale XI porteur d'une fonction aldéhyde.
35. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 10 dans lequel le pseudodipeptide intermédiaire issu de l'acide aspartique ou glutamique est soumis à une réaction de déprotection de la fonction carboxyle présente sous forme d'ester, puis couple cette fonction carboxyle avec un aminoalcane ou un acide aminé partiellement protégé, en présence d'un agent de couplage, puis on soumet le produit de couplage soit à une déprotection, notamment par hydrogénolyse, soit à une réaction d'acylation avec un acide alcanoïque ω-fonctionnalisé et dans le cas d'un dérivé alcénylé on soumet celui-ci aux réactions de dihydroxylation, puis de déprotection, notamment par hydrogénolyse, et d'oxydation par l'acide périodique pour obtenir un composé de formule générale I ou de formule générale XVIII.
36. A titre de produits nouveaux, les composés de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis parmi un hydroxyle, un alkyle, un alkoxy, un acyloxy, un amino, un acylamino, un acylthio et un (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10
X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras espaceur fonctionalisé ; - les composés de formule générale XVI :
R-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse - et les composés de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r-(CH2)s-W
I I
NH^ NHR2 (XVII) dans laquelle A est de l'oxygène et les substituants W, R1 f R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement ceux-ci étant sous forme énantiomérique pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères.
37. Les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I selon la revendication 1 , sous forme racemique ou optiquement active, sous forme de diastéréoisomère purs ou en mélange, sous forme neutre ou chargée, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable.
38. Les compositions pharmaceutiques selon la revendication 37, renfermant à titre de principe actif au moins un sel d'un composé de formule générale I, avec une base minérale ou organique, thérapeutiquement compatible.
39. Les compositions pharmaceutiques selon la revendication 37, à base d'un composé de formule générale I, sous forme de diastéréoisomère pur ou en mélange, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule pharmaceutique.
40. Les composés selon la revendication 1 , greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire, et les compositions pharmaceutiques qui renferment de tels conjugués.
41. Les composés selon la revendication 1 , greffés sur un composé pharmacophore pour en améliorer l'action thérapeutique et/ou son ciblage, et les compositions pharmaceutiques renfermant de tels composés.
EP00993510A 1999-12-22 2000-12-21 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise Withdrawn EP1242365A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
WOPCT/IB99/02038 1999-12-22
PCT/IB1999/002038 WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 1999-12-22 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
PCT/FR2000/003650 WO2001046126A1 (fr) 1999-12-22 2000-12-21 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1242365A1 true EP1242365A1 (fr) 2002-09-25

Family

ID=11004948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP00993510A Withdrawn EP1242365A1 (fr) 1999-12-22 2000-12-21 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7799762B2 (fr)
EP (1) EP1242365A1 (fr)
JP (1) JP4902924B2 (fr)
CN (2) CN1434795B (fr)
AR (1) AR035024A1 (fr)
AU (3) AU1581400A (fr)
BR (1) BR0016696A (fr)
CA (1) CA2395197C (fr)
CZ (1) CZ20022194A3 (fr)
HU (1) HUP0204531A3 (fr)
LV (1) LV12886B (fr)
PL (1) PL208584B1 (fr)
RU (1) RU2275378C2 (fr)
SK (1) SK287514B6 (fr)
TW (1) TWI237022B (fr)
WO (2) WO2001046127A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016180852A1 (fr) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés de préparation de cellules t spécifiques de l'antigène à partir d'un échantillon de sang de cordon ombilical
EP3632458A1 (fr) 2013-07-26 2020-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés et compositions pharmaceutiques pour le traitement d'infections bactériennes

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7915238B2 (en) 1999-02-01 2011-03-29 Eisai R & D Management Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
US6835721B2 (en) 1999-02-01 2004-12-28 Eisai Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
AU1581400A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
CA2565500A1 (fr) 2004-05-28 2005-12-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions de vaccin comprenant des virosomes et un adjuvant a base de saponine
RU2396960C2 (ru) * 2004-07-23 2010-08-20 Ом Фарма Комбинированная противоопухолевая терапия и фармацевтические композиции для нее
WO2006095270A1 (fr) * 2005-03-10 2006-09-14 Om Pharma Therapie anticancer combinee ou om-174 et compositions pharmaceutiques afferentes
US20060210590A1 (en) 2005-02-03 2006-09-21 Alk-Abello A/S Minor allergen control to increase safety of immunotherapy
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
AU2006226458B2 (en) 2005-03-23 2012-08-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition
WO2006116423A2 (fr) 2005-04-26 2006-11-02 Eisai Co., Ltd Compositions et procedes destines a l'immunotherapie du cancer
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP3020411A1 (fr) 2005-12-22 2016-05-18 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Vaccin
KR20080105048A (ko) * 2006-03-09 2008-12-03 옴 파르마 면역조절 화합물 및 염증성 사이토킨의 과생성에 관련된 질병의 치료
JP2009531387A (ja) 2006-03-30 2009-09-03 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
DK2043682T3 (da) 2006-07-17 2014-06-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Influenzavaccine
SG173377A1 (en) 2006-07-18 2011-08-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines for malaria
GB2453475B (en) 2006-07-25 2011-01-19 Secr Defence Live vaccine strain
PL2137210T3 (pl) 2007-03-02 2017-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nowy sposób i kompozycje
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
WO2009000825A2 (fr) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccin
ES2626634T3 (es) 2007-12-19 2017-07-25 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Formas solubles de la glucoproteína F del virus de Hendra y Nipah y usos de la misma
PL2222710T3 (pl) 2007-12-24 2017-01-31 Id Biomedical Corporation Of Quebec Rekombinowane antygeny rsv
EA201001479A1 (ru) 2008-04-16 2011-06-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина
WO2010079081A1 (fr) 2009-01-07 2010-07-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procédés de récupération d'un virus ou d'un antigène viral produit par culture cellulaire
GB0901411D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
GB0901423D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
CA2750055A1 (fr) 2009-02-06 2010-08-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procede de purification de virus au moyen d'un gradient de densite
PE20110992A1 (es) 2009-02-17 2012-02-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende un antigeno del virus del dengue
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
US8889146B2 (en) 2009-06-24 2014-11-18 Glaxosmithkline Biologicals, Sa Vaccine
BRPI1015917A2 (pt) 2009-06-24 2019-08-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa antígenos de rsv recombinantes.
HUE058971T2 (hu) 2009-07-15 2022-09-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RSV F fehérjekészítmények és eljárások azok elõállítására
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
US9341623B2 (en) 2009-09-25 2016-05-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunodiffusion assay for influenza virus
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
CA2797059A1 (fr) 2010-05-03 2011-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nouveau procede
GB201009273D0 (en) 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
CA2813522C (fr) 2010-10-15 2022-06-21 Guy Jean Marie Fernand Pierre Baudoux Antigene de polypeptide de cytomegalovirus gb et ses utilisations
WO2012156391A1 (fr) 2011-05-17 2012-11-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccin contre le streptococcus pneumoniae
US20130144540A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-06 Palo Alto Research Center Incorporated Constrained de novo sequencing of peptides
US20150110824A1 (en) 2012-03-18 2015-04-23 Glaxosmithkline Biologicals, Sa Method of vaccination against human papillomavirus
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
SG11201500573RA (en) 2012-08-06 2015-02-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Method for eliciting in infants an immune response against rsv and b. pertussis
DK2970398T3 (da) 2013-03-13 2024-08-05 Us Health Præfusions-rsv-f-proteiner og anvendelse deraf
UY35418A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna que proporciona protección frente a diferentes Picornavirus humanos.
SG11201600709TA (en) 2013-08-05 2016-02-26 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination immunogenic compositions
EP3039127B1 (fr) 2013-08-30 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Production a grande echelle de virus dans la culture cellulaire
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
WO2015130584A2 (fr) 2014-02-25 2015-09-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Adjuvants de vaccins sous forme de nanoparticules lipidiques et systèmes d'administration d'antigènes
WO2015165480A1 (fr) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Compositions de vaccin de cytomégalovirus humain et leur procédé de production
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
WO2016140702A1 (fr) 2015-03-03 2016-09-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Serivces Plateforme d'affichage provenant de protéines d'enveloppe de spores bactériennes
EP3313435A1 (fr) 2015-06-26 2018-05-02 Institute for Research in Biomedicine Nouveaux vaccins pour la prévention et le traitement de la malaria
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
WO2018109220A2 (fr) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Nouvelles protéines f du vrs de pré-fusion recombinant et leurs utilisations
BR112019021824A2 (pt) 2017-04-19 2020-06-02 Institute For Research In Biomedicine Vacinas contra a malária e anticorpos de ligação a esporozoítos de plasmódio
EP3581201A1 (fr) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 polypeptides et leurs utilisations
US20230201334A1 (en) 2019-07-24 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins
EP4255919A2 (fr) 2020-12-02 2023-10-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Nouveaux antigènes
WO2022161598A1 (fr) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Anticorps ciblant largement des coronavirus et leurs utilisations
WO2022162012A2 (fr) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Anticorps ciblant sur un large spectre des coronavirus et leurs utilisations
CN118510790A (zh) 2021-12-13 2024-08-16 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 噬菌体λ-疫苗系统
WO2023144665A1 (fr) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Protéines de cytomégalovirus humain modifiées

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032428A2 (fr) * 1997-12-22 1999-07-01 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Synthese de diamines

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2460290A1 (fr) * 1979-06-29 1981-01-23 Rhone Poulenc Ind Nouveaux tetra- ou pentapeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent
DE4119856A1 (de) * 1991-06-17 1992-12-24 Hoechst Ag N-acyl-s-(2-hydroxyalkyl)-cysteine, deren herstellung sowie deren verwendung als zwischenprodukte zur herstellung von synthetischen immunadjuvantien und synthetischen impfstoffen
DE4123365A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylaminopentansaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4123366A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylpentanoylamidoglycinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPH06206893A (ja) * 1992-09-07 1994-07-26 Suntory Ltd 新規なジサッカライド誘導体
EP0668289A4 (fr) * 1993-09-07 1998-10-21 Suntory Ltd Nouveau derive de disaccharide.
JP3138476B2 (ja) * 1993-09-10 2001-02-26 ペトロヴァックス・インコーポレイテッド 蠕虫感染を防止及び治療するための化合物
CZ290331B6 (cs) * 1993-11-17 2002-07-17 Laboratoires Om S. A. Glukosaminové disacharidy, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek
RU2223262C2 (ru) * 1998-06-30 2004-02-10 Ом Фарма Новые ацилированные псевдодипептиды, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции
AU1581400A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032428A2 (fr) * 1997-12-22 1999-07-01 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Synthese de diamines

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MCGAHREN W.J. ET AL: "(.beta.-Lysyloxy)myoinositol guanidino glycoside antibiotics", JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 46, no. 4, 1981, pages 792 - 799 *
MOON BYUNG JO; KIM SANG KOOK: "Synthesis of enkephalin degrading peptidase inhibitors", BULLETIN OF THE KOREAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 18, no. 7, 1997, pages 778 - 781 *
ROSTOVTSEVA L.I. ET AL: "Peptides of L-.beta.-lysine. III. Synthesis and mass spectrometric study of peptides of L-.beta.-lysine", ZHURNAL OBSHCHEI KHIMII, vol. 41, no. 7, 1971, pages 1604 - 1611 *
ROSTOVTSEVA L.I. ET AL: "Peptides of L-.beta.-lysine. IV. Structure and synthesis of the dipeptide isolated from streptothricin D", ZHURNAL OBSHCHEI KHIMII, vol. 41, no. 7, 1971, pages 1611 - 1616 *
ROSTOVTSEVA L.I.; KIRYUSHKIN A.A.: "Mass spectrometry in the investigation of .beta.-lysine-containing peptides", ORGANIC MASS SPECTROMETRY, vol. 6, no. 1, 1972, pages 1-8 *
See also references of WO0146126A1 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3632458A1 (fr) 2013-07-26 2020-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés et compositions pharmaceutiques pour le traitement d'infections bactériennes
WO2016180852A1 (fr) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés de préparation de cellules t spécifiques de l'antigène à partir d'un échantillon de sang de cordon ombilical

Also Published As

Publication number Publication date
SK287514B6 (sk) 2010-12-07
RU2002119418A (ru) 2004-01-10
AU2006202085A1 (en) 2006-06-15
US20030203852A1 (en) 2003-10-30
PL356405A1 (en) 2004-06-28
HUP0204531A3 (en) 2004-12-28
CN1434795A (zh) 2003-08-06
JP2003518086A (ja) 2003-06-03
CN101164543A (zh) 2008-04-23
CA2395197C (fr) 2013-03-26
SK9202002A3 (en) 2003-04-01
RU2275378C2 (ru) 2006-04-27
CN101164543B (zh) 2012-03-21
US7799762B2 (en) 2010-09-21
TWI237022B (en) 2005-08-01
WO2001046127A1 (fr) 2001-06-28
HUP0204531A2 (hu) 2003-06-28
AU2857201A (en) 2001-07-03
AU2006202085C1 (en) 2012-07-05
CA2395197A1 (fr) 2001-06-28
US8173133B2 (en) 2012-05-08
LV12886B (en) 2003-03-20
US20050192232A1 (en) 2005-09-01
AR035024A1 (es) 2004-04-14
JP4902924B2 (ja) 2012-03-21
CZ20022194A3 (cs) 2002-11-13
PL208584B1 (pl) 2011-05-31
BR0016696A (pt) 2004-06-22
AU2006202085B2 (en) 2012-01-19
CN1434795B (zh) 2012-11-14
US20100215685A1 (en) 2010-08-26
WO2001046126A1 (fr) 2001-06-28
AU1581400A (en) 2001-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2395197C (fr) Pseudodipeptides acyles porteurs d&#39;un bras auxiliaire fonctionnalise
CA2337807C (fr) Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
JP2003518086A5 (fr)
KR100711561B1 (ko) 면역학적 보조제 화합물
US20020176861A1 (en) Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
US20030153532A1 (en) Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
EP0006068A2 (fr) Composés du type muramyl-peptide et médicaments les contenant
KR100898844B1 (ko) 작용기화된 보조 아암을 가진 아실 슈도디펩티드
US20130022628A1 (en) Acyl pseudopeptides which carry a functionalized auxiliary arm
WO2023212650A1 (fr) Diprovocims de nouvelle génération qui activent la réponse immunitaire innée et adaptative
AU2008202882A1 (en) Immunological adjuvant compound

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20020711

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Free format text: AL;LT PAYMENT 20020711;LV PAYMENT 20020711;MK;RO PAYMENT 20020711;SI PAYMENT 20020711

17Q First examination report despatched

Effective date: 20080603

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20130613

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20131024