CN1434130A - 常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学分子生物学检测技术领域，是一种用于检测常染色体显性遗传型多囊肾病的试剂盒。本发明根据该病患者I、II型致病基因的结构特点，合成相应引物，采用分子生物学技术结合单链构象多态性分析法或高压液相色谱仪分析法进行检测，能直接测出常染色体显性遗传型多囊肾病致病基因的突变位点和突变类型，为及早防治该病，摆脱致病基因在受累家系世代间的传递提供了有效途径。

Description

常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学分子生物学检测技术领域，是一种用于检测常染色体显性遗传型多囊肾病的试剂盒。

背景技术

常染色体显性遗传型多囊肾病是一种十分常见的、与遗传有关的肾脏疾病，起病过程隐匿，患者多30岁后才发病，可引起机体双侧肾脏多发囊肿，并伴有其它多脏器功能异常，最终多数患者因肾功能衰竭死亡。对该疾病的临床诊断，主要是利用影像学技术和家族遗传病史而作出的，该诊断方法虽然简便、直接，但仅适用于机体已有多发性肾脏囊肿出现时才可确诊，难以提早诊断，及早治疗。对该疾病的分子诊断，主要是利用微卫星连锁分析技术，通过检测几个与常染色体显性遗传型多囊肾病致病基因紧密连锁的遗传标记物在家系世代间变化而作出间接的诊断，该检测技术可以从基因水平通过间接反映机体是否携带致病基因而提早诊断，但无法直接检测出致病基因突变的具体位置和类型，易受家系世代间基因同源重组的影响而降低诊断准确率，目前已很少采用。

常染色体显性遗传型多囊肾病是由于I型致病基因和II型致病基因突变所致，其中85％患者与前者突变有关，而与后者突变相关的比例仅占15％。I型致病基因位于人类染色体16p13.1，长53kb，包含46个外显子，其中1-33外显子位于重复序列区，34-46外显子位于非重复序列区。II型致病基因位于人类染色体4q13，长68kb，包含15个外显子。I、II型致病基因的核苷酸序列详见Genbank，登录号分别为L39891及U50928。由于常染色体显性遗传型多囊肾病致病基因结构复杂，其中I型致病基因存在多个同源序列，直接降低了检测的特异性。受其影响，目前大多数致病基因突变研究仅限于I型致病基因的部分区域，即使国外个别研究小组初步进行了其全基因突变检测( Rossetti S.，Strmecki L.，Gamble V.，et al.Mutation analysis of the entire PKD1 gene：genetic and iagnostic implications.Am J Hum Genet，2001，68：46-63)，但采用的分子生物学技术种类繁多，缺乏统一性和可重复性。因而，研制常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，直接检测出其I型致病基因和II型致病基因全序列突变的具体位置和突变类型，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供一种直接用于检测常染色体显性遗传型多囊肾病I型致病基因和II型致病基因突变位点和突变类型的试剂盒。

根据常染色体显性遗传型多囊肾病基因的结构特点和针对I型致病基因和II型致病基因全序列顺序，本发明试剂盒中有数十对引物，其原因在于：

1.I型致病基因和II型致病基因序列长，至今未发现致病基因存在突变热点，为能实现全基因范围内的突变筛查，设计引物数量相应增加。

2.I型致病基因由重复序列区与非重复序列区组成，重复序列区内还存在同源序列。为克服同源序列的干扰，对重复序列区设计了长链PCR引物，该引物可以特异性扩增出I型致病基因序列，扩增产物平均长度为4.2kb(而一般PCR扩增片段长度多在1.6kb以下)，因此长链PCR引物的引入是数量增加的另一原因。

3.采用单链构象多态性分析方法或采用高压液相色谱仪分析方法对PCR扩增产物进行初步筛检时，两者对筛检产物的长度均有限制，前者以160-400bp为最佳范围，后者则以片段不超过600bp为宜。而I型致病基因采用长链PCR特异性扩增所得产物不适合上述分析方法的要求，故必须再以长链PCR特异性扩增产物为模板，通过巢式PCR进行第二次扩增，将长链PCR扩增出的长片段通过巢式PCR扩增分割成短片段，以便用于单链构象多态性分析方法或采用高压液相色谱仪分析。巢式PCR引物的引入是引物数量增加的又一重要原因。

4.根据I、II型致病基因的结构特点，PCR扩增产物既可采用单链构象多态性分析方法筛检也可通过高压液相色谱仪筛检，本发明分别设计了两套相应PCR引物，其中有相当数量的引物是两种分析方法可以共用的，但为了使用方便，防止差错，故在两种筛检方法共用的试剂盒内同时配置了两套引物以供选择，从而使试剂盒引物数量明显增加。

本发明引物的核苷酸序列分别见表1、表2和表3。其中I型致病基因采用单链构象多态性分析方法筛检的PCR扩增正、反向引物参见序列表1，通过高压液相色谱仪分析方法的PCR扩增正、反向引物参见序列表2。II型致病基因采用单链构象多态性分析方法筛检的PCR扩增产物同样适用高压液相色谱仪分析方法，其PCR扩增正、反向引物参见序列表3。上述各引物可按常规引物合成方法制备。

为便于叙述，先介绍试剂盒内的引物混合物代号：

1.用于单链构象多态性分析的I型引物混合物，用I-S-n表示，其中I表示I型致病基因，S表示单链构象多态性分析方法，n表示I型致病基因的引物编号。

2.用于高压液相色谱仪分析的I型引物混合物，用I-H-n表示，其中H表示高压液相色谱仪分析方法，I与n同上。

3.II型引物混合物，用II-SH-n表示，其中II表示II型致病基因，SH表示本系列引物对单链构象多态性分析方法及高压液相色谱仪分析方法均适用，n表示II型致病基因的引物编号。

试剂盒内其它试剂的代号是：

1.专用于单链构象多态性分析法的I型阴性对照物，用-I-S表示，正常对照物，用+I-S表示；专用于高压液相色谱仪分析法的I型阴性对照物，用-I-H表示，正常对照物，用+I-H表示。

2.在单链构象多态性分析法以及高压液相色谱仪分析法中，II型阴性对照物，均用-II-SH表示，正常对照物，均用+II-SH表示。

3.显色液代号：

分别用显色液A、显色液B、显色液C、显色液D、显色液E、显色液F表示。

本发明试剂盒包括如下试剂：

1.采用单链构象多态性分析法筛检的I型引物混合物82管，分别以I-S-1、I-S-2、I-S-3、…、I-S-82表示。其中I-S-1至I-S-8为长链PCR引物，共8对，I-S-9至I-S-65为巢式PCR引物，共57对，其余为非重复区PCR引物，共17对，分别为I-S-66至I-S-82。

2.采用高压液相色谱仪分析筛检的I型引物混合物72管，分别以I-H-1、I-H-2、I-H-3、…、I-H-72表示。其中I-H-1至I-H-8为长链PCR引物，共8对，I-H-9至I-H-59为巢式PCR引物，共51对。其余为非重复区PCR引物，共13对，分别为I-H-60至I-H-72。

3.II型引物混合物17管，分别用II-SH-1、II-SH-2、II-SH-3、…、II-SH-17表示。

4.I型阴性对照物各1管，分别用-I-S和-I-H表示；I型正常对照物各1管，分别用+I-S和+I-H表示；II型阴性对照物1管，用-II-SH表示；II型正常对照物1管，用+II-SH表示。

5.上样缓冲液1管。

6.显色液A、B、C、D、E、F各1瓶。

其中I型致病基因的两套引物中完全相同的有：

1.长链PCR引物：I-S-1至I-S-8与I-H-1至I-H-8分别对应相同；

2.巢式PCR引物相同的有31对，分别为：

I-S-14同I-H-13，I-S-15同I-H-14，I-S-16同I-H-15，I-S-17同I-H-16，I-S-18同I-H-17，I-S-19同I-H-18，I-S-20同I-H-19，I-S-22至I-S-28分别同I-H-22至I-H-28，I-S-47同I-H-42，I-S-48同I-H-43，I-S-49同I-H-44，I-S-50同I-H-45，I-S-51同I-H-46，I-S-52同I-H-47，I-S-53同I-H-48，I-S-54同I-H-49，I-S-55同I-H-50，I-S-56同I-H-51，I-S-57同I-H-52，I-S-58同I-H-53，I-S-59同I-H-54，I-S-60同I-H-55，I-S-61同I-H-56，I-S-64同I-H-58，I-S-65同I-H-59。

3.非重复序列区引物相同的有2对，即I-S-66同I-H-60，I-S-67同I-H-61。

上述各试剂分别为：

1.引物混合物：各引物混合物均为200μl/管。

I型引物混合物：含三羟甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸钾0-170mmol/L，二甲亚砜0-10％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脱氧核苷三磷酸500-1200μmol/L，乙酸镁0-2.5mmol/L或氯化镁0-2mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶16-80U，正、反向引物各2-6μmol/L。

II型引物混合物：其三羟甲基氨基甲烷、二甲亚砜、辛基苯氧基聚乙氧乙醇浓度与I型引物混合物相同，脱氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化镁2mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。

2.对照物

(1)I型和II型阴性对照物：灭菌去离子超纯水，各0.4ml/管。

(2)I型和II型正常对照物：含正常基因100ng/μl，各0.4ml/管。

3.上样缓冲液：10ml/管

其中含蔗糖10％，溴酚兰0.01％，二甲苯青0.01％。

4.显色液：

(1)显色液A：无水乙醇，60ml/瓶。

(2)显色液B：浓硝酸，10ml/瓶。

(3)显色液C：30％硝酸银溶液，10ml/瓶。

(4)显色液D：25％碳酸钠溶液，60ml/瓶。

(5)显色液E：乙酸，60ml/瓶。

(6)显色液F：37％甲醛溶液，6ml/瓶。

附图说明：

图1为本发明试剂盒的引物于常染色体显性遗传型多囊肾病I型致病基因结构的相对位置示意图；

图2为本发明试剂盒引物于常染色体显性遗传型多囊肾病II型致病基因结构的相对位置示意图；

图3为实施例5电泳图谱示意图；

图4为实施例6电泳图谱示意图；

图5为实施例7高压液相色谱仪分析峰图。

具体实施方式

上述各试剂具体制备方法如下：

1.引物混合物各溶液的制备

(1)0.8mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液

在800ml去离子超纯水中加入96.9克三羟甲基氨基甲烷，用浓盐酸调pH值为8.9，用去离子超纯水定容至1L。

(2)1.7mol/L乙酸钾溶液

在800ml去离子超纯水中加入166.8克乙酸钾，充分溶解后，用去离子超纯水定容至1L。

(3)二甲亚砜溶液

将浓度大于99％的二甲亚砜溶液按10ml/瓶分装备用。

(4)20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇

取浓度为106.5％(w/v)的商品化辛基苯氧基聚乙氧乙醇(上海华美生物工程技术有限公司)1.88ml，用去离子超纯水定容至10ml。

(5)脱氧核苷三磷酸溶液

将浓度为10mmol/L的商品化脱氧核苷三磷酸溶液(日本TaKaRa公司)按1.5ml/管分装备用。

(6)250mmol/L乙酸镁溶液

在800ml去离子超纯水中加入35.61克乙酸钾，充分溶解后，用去离子超纯水定容至1L。

(7)200mmol/L氯化镁溶液

在800ml去离子超纯水中加入19.06克乙酸钾，充分溶解后，用去离子超纯水定容至1L。

(8)热稳定型脱氧核苷酸聚合酶溶液

将酶活性为4U/μl的商品化热稳定型脱氧核苷酸聚合酶(美国Applied Biosystems公司)按1.5ml/管分装备用。

(9)各引物溶液，浓度均为50μmol/L。

将合成所得的各引物粉末，分别用灭菌去离子超纯水稀释至浓度为50μmol/L，按0.5ml/管分装备用。

2.各引物混合物的制备(按8人份使用量，200ul/管)

实施例1：制备引物混合物I-S-1

取浓度为0.8mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液20μl，1.7mol/L乙酸钾溶液20μl，二甲亚砜溶液20μl，20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇2μl，10mmol/L脱氧核苷三磷酸溶液24μl，250mmol/L乙酸镁溶液2μl，酶活性为4U/μl热稳定型脱氧核苷酸聚合酶20μl，50μmol/LI-S-1正、反向引物各8μl，充分混匀后，用灭菌去离子超纯水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃备用。此时终浓度分别为：三羟甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸钾170mmol/L，二甲亚砜10％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脱氧核苷三磷酸1200μmol/L，乙酸镁2.5mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶80U，正、反向引物各2μmol/L。

引物混合物I-H-1制备方法同实施例1。

实施例2：制备引物混合物I-S-2

取10mmol/L脱氧核苷三磷酸溶液10μl，酶活性为4U/μl热稳定型脱氧核苷酸聚合酶4μl，其它各成分所取的量同实施例1。充分混匀后，用灭菌去离子超纯水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃备用。

引物混合物I-S-3至I-S-8及I-H-2及I-H-8制备方法同实施例2。

实施例3：制备I-S-9引物混合物

取浓度为0.8mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液20μl，20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇2μl，10mmol/L脱氧核苷三磷酸溶液24μl，200mmol/L氯化镁溶液2μl，酶活性为4U/μl热稳定型脱氧核苷酸聚合酶5μl，50μmol/L I-S-9正、反向引物各8μl，充分混匀后，用灭菌去离子超纯水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃备用。此时终浓度分别为：三羟甲基氨基甲烷80mmol/L，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脱氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化镁2.5mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。

引物混合物I-S-10至I-S-65、I-S-67至I-S-73、I-S-78至I-S-80以及I-H-9至I-H-59、I-H-61至I-H-65和I-H-70制备方法同实施例3。

实施例4：制备引物混合物I-S-66

取二甲亚砜溶液20μl，其它各成分所取量同实施例3。此时终浓度分别为：三羟甲基氨基甲烷80mmol/L，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，二甲亚砜10％，脱氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化镁2.5mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。

引物混合物I-S-74至I-S-77、I-S-81、I-S-82及I-H-60、I-H-66至I-H-69、I-H-71、I-H-72制备方法同实施例4。

3.I、II型阴性及正常对照物的制备

(1)阴性对照物-I-S、-I-H与-II-SH的制备

用灭菌去离子超纯水按0.4ml/管分装于0.5ml薄壁管中，置-20℃备用。

(2)正常对照物+I-S、+I-H与+II-SH的制备

将正常人外周血10毫升，按常规酚氯仿方法(《分子克隆》实验指南，金冬雁编译，第465-467页)分别抽提其基因组，用灭菌去离子超纯水稀释成浓度为100ng/μl，以此作为正常I、II型致病基因模板溶液，按0.4ml/管分装于0.5ml薄壁管中，置4℃冰箱备用。使用时，用灭菌去离子超纯水稀释为50ng/μl的工作浓度。

4.上样缓冲液的制备

在80ml去离子超纯水中，分别加入10克蔗糖、0.01克溴酚兰和0.01克二甲苯青，充分混匀溶解后，用去离子超纯水定容至100ml，按10ml/管分装，室温备用。其终浓度分别为蔗糖10％，溴酚兰0.01％，二甲苯青0.01％。

5.显色液的制备

(1)显色液A

将无水乙醇按60ml/瓶分装备用。

(2)显色液B

将浓硝酸按10ml/瓶分装备用。

(3)显色液C

在80ml去离子超纯水中，加入30克硝酸银，充分混匀溶解后，用去离子超纯水定容至100ml，10ml/瓶分装，置4℃冰箱避光保存。其为30％硝酸银溶液。

(4)显色液D

在80ml去离子超纯水中，加入25克无水碳酸钠，充分混匀溶解后，用去离子超纯水定容至100ml，按60ml/瓶分装备用。其为25％碳酸钠溶液。

(5)显色液E

将乙酸按60ml/瓶分装备用。

(6)显色液F

将37％甲醛溶液按6ml/瓶分装备用。

6.组装试剂盒

(1)组装单链构象多态性分析法检测试剂盒：分别取上述制备的引物混合物I-S-1至I-S-82，II-SH-1至II-SH-17，对照物-I-S、+I-S、-II-SH和+II-SH各1管，上样缓冲液1管及显色液A、B、C、D、E和F各1瓶置于试剂盒内，即为本发明专用于通过单链构象多态性分析途径来检测突变的试剂盒。

(2)组装高压液相色谱仪分析法检测试剂盒：分别取上述制备的引物混合物I-H-1至I-H-72及II-SH-1至II-SH-17各1管，对照物-I-H、+I-H、-II-SH和+II-SH各1管置于试剂盒内，即为本发明专用于通过高压液相色谱仪分析途径来检测突变的试剂盒。

(3)组装两种分析法兼用的检测试剂盒：分别取上述制备的引物混合物I-S-1至I-S-82、I-H-1至I-H-72及II-SH-1至II-SH-17各1管，对照物-I-S、+I-S、-I-H、+I-H、-II-SH和+II-SH各1管，上样缓冲液1管及显色液A、B、C、D、E和F各1瓶置于试剂盒内，即为两种分析法兼用的检测试剂盒。

当然，还可以按需组装成专测I型或II型致病基因突变等各种试剂盒。试剂盒的使用

众所周知，常染色体显性遗传型多囊肾病是由于I、II型致病基因突变所致，究竟是哪一个核苷酸发生了突变呢？采用本试剂盒检测时，可按如下程序进行：根据I型致病基因突变占该病患者的85％、非重复序列区较重复序列区容易扩增这一特点，可先扩增I型致病基因非重复序列区，经单链构象多态性分析法或高压液相色谱仪分析法筛检，如果筛检出异常核苷酸片段，则将该样品及相应的正常对照进一步作核苷酸序列分析，通过与正常序列比对，找出突变位点。若此区域未筛检出异常核苷酸片段，则不必作核苷酸序列分析，而是进一步作II型致病基因序列区的PCR扩增，因为该序列区比I型致病基因重复序列区较易扩增，扩增片段按同法筛检，当II型致病基因序列区也未筛检到异常核苷酸片段时，再检测I型致病基因的重复序列区。这种检测程序可减少盲目性，提高检测效率。

检测的步骤如下：

1.制备待测个体基因组溶液；

2.以所制备的基因组为模板，用试剂盒中的引物混合物进行PCR扩增；

3.将PCR扩增所得核苷酸片段，用单链构象多态性方法或高压液相色谱仪进行筛检，通过与正常对照物PCR扩增结果相比对，筛检出异常核苷酸片段；

4.对异常核苷酸片段和相应的正常核苷酸片段进行核苷酸序列测定，通过与正常序列比对，确定突变位点和突变类型。

上面所说的单链构象多态性分析法，是检测DNA突变常用的方法之一。其原理是：DNA加热变性形成两条单链，若其中一条单链有核苷酸突变，该单链所形成的三维结构与相应的正常单链不同，那么在与正常对照物同时进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时导致迁移速度出现差异，电泳带不在同一位置，从而确定其为异常核苷酸片段。

至于高压液相色谱仪分析法是一种检测DNA突变的新方法，其使用离子层析柱，利用突变基因与正常基因间细微碱基差异导致它们在层析柱中滞留时间的不同来进行分析。该分析方法实现了筛检过程的半自动化，检测速度大大加快。但所使用的专用仪器价格昂贵，相应增加了检测费用，目前还难以普及。

本发明的优点和积极效果：

使用本发明试剂盒检测常染色体显性遗传型多囊肾病，操作简便，重复性好，检测区域涵盖面广，可直接检测出致病基因的突变位点和突变类型。且由于长链引物和巢式引物的引入，避免了I型致病基因中同源序列的干扰，提高了检测的准确率。使用高压液相色谱仪筛检可明显提高检测敏感度，并大大缩短检测周期。本发明试剂盒可用于常染色体显性遗传型多囊肾病家系的基因诊断和产前诊断，为及早防治、摆脱致病基因在受累家系世代间的传递提供了有效途径。

现结合以下2个实施例，对本发明试剂盒用单链构象多态性分析法进行突变检测作详细说明。

实施例5：王某，男性，32岁，体检B超诊断“双侧多囊肾伴多囊肝”，其母亲和舅舅有多囊肾病史多年，父亲身体健康。

1.制备待测人员的基因组溶液

收集王某和其母亲的外周血2ml，按常规酚氯仿方法分别制备其基因组，用灭菌去离子超纯水将其稀释为50ng/μl的溶液，置4℃冰箱备用。

2.I型致病基因非重复序列区的突变检测

(1)PCR扩增：取17只PCR扩增管，编号为A I-S-66、A I-S-67、…、A I-S-82，分别加入上述王某基因组溶液2μl作为扩增模板，再依次加入23μl灭菌去离子超纯水，混匀后，95℃5分钟，立即于冰水中静置3分钟，依次加入引物混合物I-S-66、I-S-67、…、I-S-82各25μl，混匀后，95℃1分钟，然后95℃30秒，退火40秒(推荐退火温度参见表1，下同)，72℃40秒，循环35次，最后72℃10分钟，得17个PCR扩增核苷酸片段，置4℃备用。按同样方法，对王某母亲基因组、阴性对照物和正常对照物进行PCR扩增，其中王某母亲反应管编号分别为B I-S-66、B I-S-67、…、B I-S-82，阴性对照物和正常对照物的反应管编号分别为-I-S-66、-I-S-67、…、-I-S-82和+I-S-66、+I-S-67、…、+I-S-82。

(2)单链构象多态性分析

将上述扩增所得核苷酸片段按相应编号分组，即样品A I-S-66、B I-S-66与对照-I-S-66和+I-S-66编为一组，依次共编成17组。以第一组为例按如下步骤操作：

①将核苷酸片段热变性

取A I-S-66、B I-S-66、+I-S-66和-I-S-66各2μl，分别与10μl上样缓冲液混匀后置95℃6分钟，使双链核苷酸片段变性成二个单链核苷酸片段，置冰水备用；

②电泳

按常规方法制备8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为0.5倍稀释的TBE(0.045mol/L三羟甲基氨基甲烷、0.045mol/L硼酸和0.001mol/L乙二胺四乙酸)，以电压300V先预电泳15分钟，再取上述变性后的样品各6μl，分别点样，以溴酚兰染料刚移出凝胶为止。

③显色

显色液分别作如下配制：

a液：取显色液A10ml，用蒸馏水稀释至100ml，备用。

b液：取显色液B1ml，用蒸馏水稀释至100ml，备用。

c液：取显色液C0.5ml，用蒸馏水稀释至100ml，加显色液F120ul混匀备用。

d液：取显色液D10ml，用蒸馏水稀释至100ml，备用。

e液：取显色液E10ml，用蒸馏水稀释至100ml，备用。

将上述电泳后的凝胶在各配制好的显色液中作如下显色处理：

依次将凝胶在a液中浸泡10分钟；在b液中浸泡5分钟，用蒸馏水漂洗2次，每次1分钟；在c液中浸泡60分钟，用蒸馏水漂洗2次，每次1分钟；在d液中浸泡5分钟，待黄褐色条带显色清晰；在e液中浸泡5分钟；最后用蒸馏水浸泡漂洗30分钟，再照相。各组筛选结果发现，A I-S-77和B I-S-77各有一条电泳带与正常对照物+I-S-77的迁移位置不同(见图4)，说明核苷酸片段异常，于是对这两个样品及其正常对照物+I-S-77进行核苷酸序列测定。

(3)核苷酸序列测定：核苷酸序列测定结果为：正常对照物+I-S-77核苷酸序列为-GGGTAGCCTACGCCC AGCTGGCCAT-，而A I-S-77和B I-S-77核苷酸序列为-GGGTAGCCTACGCCC GGCTGGCCAT-，由此可见后两者均发生置换突变：即I型致病基因组第50906位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G，从而确定王某及其母亲的常染色体显性遗传型多囊肾病是由于I型致病基因突变所造成的，突变位点在其第44外显子中，突变类型为碱基置换所引起的错义突变。

实施例6：赵某，女性，28岁，怀孕3个月。体检B超诊断“双侧多囊肾伴多囊肝”，其父亲和叔叔有多囊肾病史多年，母亲身体健康，现利用本发明试剂盒检测其常染色体显性遗传型多囊肾病致病基因突变位点和突变类型，并对怀孕胎儿进行产前诊断，是否患有遗传型多囊肾病的可能。

1.待测人员基因组溶液的制备

赵某和其父亲基因组的制备方法与实施例5相同。对胎儿的检测用羊水中的胎儿脱落细胞制备其基因组。

通过羊水穿刺途径搜集胎儿羊水至少1.5ml，离心5分钟后弃上清，沉淀为胎儿的脱落细胞。用10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液(含有1mmol/L乙二胺四乙酸二钠)洗涤沉淀，加10μl 0.1mol/L氢氧化钠和2mol/L氯化钠混合溶液，并摇匀，100℃沸水煮2分钟，再强烈振荡后离心10分钟，取上清液，经紫外分光光度计定量并用灭菌去离子超纯水将其稀释成浓度为50ng/μl的基因组溶液，置4℃冰箱中备用。

2.I型致病基因非重复序列区的检测

检测方法同实施例5，检测结果三者均未见异常，故进行II型致病基因的检测。

3.II型致病基因的突变检测

(1)PCR扩增：取17只PCR扩增管，编号为A II-SH-1、A II-SH-2、…、A II-SH-17，分别加入上述赵某基因组溶液2μl作为扩增模板，再依次加入23μl灭菌去离子超纯水，混匀后，95℃5分钟，立即于冰水中静置3分钟。依次加入引物混合物II-SH-1、II-SH-2、…、II-SH-17各25μl，混匀后，95℃1分钟，95℃30秒，退火40秒(推荐退火温度参见表3，下同)，72℃40秒，循环35次，最后72℃10分钟，得PCR扩增核苷酸片段17管，置4℃备用。同样方法，进行赵父基因组、赵某的胎儿基因组、阴性对照物和正常对照物的PCR扩增，其中赵父PCR产物的编号为B II-SH-1、B II-SH-2、…、B II-SH-17，赵某胎儿PCR产物的编号为C II-SH-1、C II-SH-2、…、C II-SH-17，阴性对照物和正常对照物的编号分别为-II-SH-1、-II-SH-2、…、-II-SH-17和+II-SH-1、+II-SH-2、…、+II-SH-17。

(2)单链构象多态性分析

分析方法同实施例5，结果也未见异常核苷酸片段，故最后对I型致病基因重复序列区进行检测。

4.I型致病基因重复序列区(包括外显子1至外显子33)的突变检测

(1)长链PCR扩增：

①外显子1的长链PCR扩增：取1只灭菌的PCR扩增管，编号为A I-S-1，加入赵某基因组溶液16μl，用灭菌去离子超纯水补充体积至25μl，混匀后，98℃5分钟，立即于冰水中，静置3分钟。加引物混合物I-S-125μl，混匀后，95℃1分钟，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循环35次，最后72℃10分钟，得长链PCR扩增产物A I-S-1置4℃备用。

按同法分别得赵父的PCR扩增产物B I-S-1，胎儿的PCR扩增产物C I-S-1，阴性对照物的PCR扩增产物-I-S-1和正常对照物的PCR扩增产物+I-S-1。

②外显子2至外显子8的长链PCR扩增：取7只灭菌的PCR扩增管，编号分别为AI-S-2至A I-S-8，各加入赵某基因组模板溶液10μl，用灭菌去离子超纯水补充体积至40μl，混匀后，98℃5分钟，立即于冰水中静置3分钟。依次向各管分别加入引物混合物I-S-2至I-S-8各50μl，混匀后，95℃1分钟，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循环35次，最后72℃10分钟，得PCR扩增产物A I-S-2至A I-S-8，置4℃备用。

按同法，分别得赵父的PCR扩增产物B I-S-2至B I-S-8，胎儿的PCR扩增产物C I-S-2至C I-S-8，阴性对照物的PCR扩增产物-I-S-2至-I-S-8和正常对照物的PCR扩增产物+I-S-2至+I-S-8。

(2)巢式PCR扩增：

①外显子1的巢式PCR扩增：取3只灭菌的PCR扩增管，编号为A I-S-9、A I-S-10、A I-S-11，分别加入赵某A I-S-1长链PCR扩增产物1μl，用灭菌去离子超纯水补充体积至25μl，混匀后，95℃5分钟，立即于冰水中静置3分钟。依次加入引物混合物I-S-9、I-S-10、I-S-11各25μl，混匀后，95℃1分钟，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循环30次，最后72℃10分钟，分别得PCR扩增产物A I-S-9、A I-S-10、A I-S-11，置4℃备用。

按同法，分别得赵父的PCR扩增产物B I-S-9、B I-S-10、B I-S-11，胎儿的PCR扩增产物C I-S-9、C I-S-10、C I-S-11，阴性对照物的PCR扩增产物-I-S-9、-I-S-10、-I-S-11和正常对照物的PCR扩增产物+I-S-9、+I-S-10、+I-S-11

重复序列区其它外显子的巢式PCR扩增的操作步骤同上述外显子1，只是不同的模板需选用相应的PCR引物。其对应关系如下：

    I-S-2扩增选用I-S-12至I-S-19，I-S-3扩增选用I-S-20至I-S-26，

    I-S-4扩增选用I-S-27至I-S-44，I-S-5扩增选用I-S-45至I-S-52，

    I-S-7扩增选用I-S-53至I-S-59，I-S-8扩增选用I-S-60至I-S-65。

巢式PCR扩增产物的编号分别为：赵某的为A I-S-12、A I-S-13、…、A I-S-65，赵父的为B I-S-12、B I-S-13、…、B I-S-65，赵某胎儿的为C I-S-12、C I-S-13、…、C I-S-65，阴性对照物-I-S-12、-I-S-13、…、-I-S-65，正常对照物+I-S-12、+I-S-13、…、+I-S-65。

如果采用高压液相色谱仪检测，则相应的巢式PCR扩增引物为：

  I-H-1扩增选用I-H-9至I-H-11，I-H-2扩增选用I-H-12至I-H-18，

  I-H-3扩增选用I-H-19至I-H-26，I-H-4扩增选用I-H-27至I-H-39，

  I-H-5扩增选用I-H-40至I-H-47，I-H-7扩增选用I-H-48至I-H-54，

  I-H-8扩增选用I-H-55至I-H-59。

由于I-S-6或I-H-6的PCR扩增产物片段较短，仅为300bp，因此不必进行下一轮巢式PCR扩增，可与上述得到的巢式PCR产物一起进行单链构象多态性分析或高压液相色谱仪分析。

(3)单链构象多态性分析

将上述巢式PCR产物按相应编号分组，例如A I-S-9、B I-S-9、C I-S-9、+I-S-9和-I-S-9编为一组，共分成57组，分别进行单链构象多态性分析，操作方法同实施例5。结果发现其中赵某的A I-S-30、赵父的B I-S-30存在异常带型，而赵某的胎儿C I-S-30带型正常(见图5)于是对A I-S-30、B I-S-30、C I-S-30及+I-S-30的样品分别进行核苷酸序列测定。

(4)核苷酸序列测定：核苷酸序列测定结果为：+I-S-30和C I-S-30的核苷酸序列为-CTACCACGTGC GCCTGGAGGTCAA-，而A I-S-30、B I-S-30为-CTACCACGTGCCTGGAGGTCAA-，比对结果，在常染色体显性遗传型多囊肾病I型致病基因组第27678位开始缺失两个碱基GC，由此可见后两者均发生移码突变，从而确定赵某及其父亲的常染色体显性遗传型多囊肾病是由于I型致病基因突变所造成的，突变位点在其第15外显子，突变类型为碱基缺失所引起的移码突变。而C I-S-30序列正常，说明胎儿没有携带母亲赵某的常染色体显性遗传型多囊肾病突变致病基因。

下面通过一个实施例，对本发明试剂盒用高压液相色谱仪进行突变检测作详细叙述。

实施例7：李某，男性，62岁，2年前体检B超诊断“双侧多囊肾”，有多囊肾病史家族史。

1.基因组溶液的制备、长链和巢式PCR扩增产物的制备同实施例5，只是所选用的引物不同，其扩增产物的编号分别为A I-H-60、A I-H-61、…、A I-H-72。正常对照物PCR扩增产物的编号分别为+I-H-60、+I-H-61、…、+I-H-72。

2.高压液相色谱仪分析

①取26只灭菌的PCR扩增管，编号分别为A I-H-60至A I-H-72和+I-H-60至+I-H-72，依次加入上述相同编号的PCR扩增产物各10μl后，按下列步骤进行变性预处理：95℃3分钟，缓慢冷却至65℃，温度下降速度控制在0.1℃/秒；65℃30分钟；继续缓慢降温至37℃，静置10分钟，然后将样品和对照物按相应编号一对一编组，例如A I-H-60和+I-H-60为一组，全部分别上样到高压液相色谱仪(美国Transgenomic公司，WAVE核苷酸分析系统)。有关上样—洗脱—平衡的操作按其提供的操作说明书进行。结果均未发现异常峰型，从而可确定李某的常染色体显性遗传型多囊肾病不是由于I型致病基因非重复序列区突变所造成的。

3.II型致病基因的突变检测

(1)用II-SH-1至II-SH-17引物对II型致病基因进行PCR扩增，其过程同实施例6，所得李某和正常对照物的扩增产物编号分别为A II-SH-1、A II-SH-2、…、A II-SH-17和+II-SH-1、+II-SH-2、…、+II-SH-17。

(2)进行高压液相色谱仪分析则同上。检测的峰型参见图6，结果发现A II-SH-8出现异常峰型，则将A II-SH-8和正常对照物+II-SH-8进行核苷酸序列测定。

(3)核苷酸序列测定。核苷酸序列测定结果为：正常对照物+II-SH-8的核苷酸序列为-GGAAATT CGCATTCACAAACTA-，而A II-SH-8为-GGAAATTGCATTCACAAACTA-，比对结果，在常染色体显性遗传型多囊肾病II型致病基因组外显子6中第202位缺失一个碱基C，由此可见后者发生移码突变，从而确定李某常染色体显性遗传型多囊肾病是由于II型致病基因突变所造成的，突变位点在其第6外显子，突变类型为碱基缺失所引起的移码突变。

表1单链构象多态性检测常染色体显性遗传型多囊肾病I型致病基因突变引物的核苷酸序列

引物混合物代号	引物编号	核苷酸序列		退火温度	外显子编号
						正向引物	反向引物
		I-S-1	1					5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-CCACCTCATCGCCCCTTCCTAAGCAT-3’	69℃	1
I-S-2	2			5’-ATTTTTTGAGATGGAGCTTCACTCTTGCAGG-3’	5’-CGCTCGGCAGGCCCCTAACC-3’	68℃	2-7
		I-S-3	3					5’-CCGCCCCCAGGAGCCTAGACG-3’	5’-CATCCTGTTCATCCGCTCCACGGTTAC-3’	68℃	8-12
I-S-4	4			5’-TGGAGGGAGGGACGCCAATC-3’	5’-GTCAACGTGGGCCTCCAAGT-3’	68℃	13-15
		I-S-5	5					5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-GCAGGGTGAGCAGCTGGGGCCATCCTA-3’	70℃	15-21
I-S-6	6			5’-GAGGCTGTGGGGGTCCAGTCAAGTGG-3’	5’-AGGGAGGCAGAGGAAAGGGCCGAAC-3’	72℃	22
		I-S-7	7					5’-CCCCGTCCTCCCCGTCCTTTTGTC3’	5’-AAGCGCAAAAGGGCTGCGTCG-3’	69℃	23-28
I-S-8	8			5’-GGCCCTCCCTGCCTTCTAGGCG-3’	5’-GTTGCAGCCAAGCCCATGTTA-3’	68℃	29-34
		I-S-9	9					5’-GGTCGCGCTGTGGCGAAGG-3’	5’-CGGCGGGCGGCATCGT-3’	68℃	1
I-S-10	10			5’-CCTGAGCTGCGGCCTCCG-3’	5’-CAGTTGACGCGGCAGGCG-3’	66℃	1
		I-S-11	11					5’-TGCGAGCCCCCCTGCCTC-3’	5’-AACCCGCCCACGCCCGCCCGTCC3’	66℃	1
I-S-12	12			5’-CTTGGGGATGCTGGCAATG-3’	5’-GGGATTCGGCAAAGCTGATG-3’	62℃	2
		I-S-13	13					5’-CCATCAGCTTTGCCGAATCC-3’	5’-AACTGGGAGGGCAGAAGGG-3’	62℃	3
I-S-14	14			5’-AGTGGGGGGCTGGCATAGAC-3’	5’-TGAGCCCTGCCCAGTGTCT-3’	62℃	4
		I-S-15	15					5’-GAGCCAGGAGGAGCAGAACCC-3’	5’-AGAGGGACAGGCAGGCAAAGGG-3’	65℃	5
I-S-16	16			5’-CCCAGCCCTCCAGTGCCT-3’	5’-CCCAGGCAGCACATAGCGAT-3’	65℃	5
		I-S-17	17					5’-CCGAGGTGGATGCCGCTG-3’	5’-AACGAGGGTGTCAACGGTCAG-3’	65℃	5
I-S-18	18			5’-ACCGTTGACACCCTCGTTCC-3’	5’-TCTCTGCCCCAGTGCTTCAG-3’	64℃	6
		I-S-19	19					5’-CTGTGAGGGTGGGAGGATGG-3’	5’-CGCTCGGCAGGCCCCTAACC-3’	56℃	7
I-S-20	20			5’-TCTGTTCGTCCTGGTGTCCTG-3’	5’-GGAGGGCAGGTTGTAGAACGTG-3’	64℃	8
		I-S-21	21					5’-GGTAGGGGGAGTCTGGGCTT-3’	5’-GAGGCCACCCCGAGTCC-3’	64℃	9
I-S-22	22			5’-GTTGGGCATCTCTGACGGTG-3’	5’-GGAAGGTGGCCTGAGGAGAT-3’	64℃	10
		I-S-23	23					5’-GGGGTCCACGGGCCATG-3’	5’-AAGCCCAGCAGCACGGTGAG-3’	64℃	11
I-S-24	24			5’-GCTTGCAGCCACGGAAC-3’	5’-GCAGTGCTACCACTGAGAAC-3’	64℃	11
		I-S-25	25					5’-TGCCCCTGGGAGACCAACGATAC-3’	5’-GGCTGCTGCCCTCACTGGGAAG-3’	67℃	11
I-S-26	26			5’-GAGGCGACAGGCTAAGGG-3’	5’-CATGAAGCAGAGCAGAAGGC-3’	64℃	12
		I-S-27	27					5’-TGGAGGGAGGGACGCCAATC-3’	5’-GAGGCTGGGGCTGGGACAAG-3’	67℃	13
I-S-28	28			5’-CCCGGTTCACTCACTGCG-3’	5’-CCGTGCTCAGAGCCTGAAAG-3’	64℃	14
		I-S-29	29					5’-CGGGTGGGGAGCAGGTGG-3’	5’-GCTCTGGGTCAGGACAGGGGA-3’	67℃	15
I-S-30	30			5’-CGCCTGGGGGTGTTCTTT-3’	5’-CACATGCTCCACTGTTGCCTCC-3’	64℃	15
		I-S-31	31					5’GCCCCCGTGGTGGTCAGC-3’	5’-CAGGCTGCGTGGGGATGC-3’	67℃	15
I-S-32	32			5’-CTGGAGGTGCTGCGCGTT-3’	5’-CTGGCTCCACGCAGATGC-3’	67℃	15
		I-S-33	33					5’-CGTGAACAGGGCGCATTA-3’	5’-GCAGCAGAGATGTTGTTGGAC-3’	65℃	15
I-S-34	34			5’-CCAGGCTCCTATCTTGTGACA-3’	5’-TGAAGTCACCTGTGCTGTTGT-3’	60℃	15
		I-S-35	35					5’-CTACCTGTGGGATCTGGGG-3’	5’-TGCTGAAGCTCACGCTCC-3’	67℃	15
I-S-36	36			F：5’-GGGCTCGTCGTCAATGCAAG-3’	5’-CACCACCTGCAGCCCCTCTA-3’	67℃	15
		I-S-37	37					5’-CCGCCCAGGACAGCATCTTC-3’	5’-CGCTGCCCAGCATGTTGG-3’	64℃	15
I-S-38	38			5’-CGGCAAAGGCTTCTCGCTC-3’	5’-CCGGGTGTGGGGAAGCTATG-3’	64℃	15
		I-S-39	39					5’-CGAGCCATTTACCACCCATAG-3’	5’-GCCCAGCACCAGCTCACAT-3’	65℃	15

I-S-40	40	5’-CCACGGGCACCAATGTGAG-3’	5’-GGCAGCCAGCAGGATCTGAA-3’	64℃	15
						I-S-41	41	5’-CAGCAGCAAGGTGGTGGC-3’	5’-GCGTAGGCGACCCGAGAG-3’	67℃	15
I-S-42	42	5’-ACGGGCACTGAGAGGAACTTC-3’	5’-ACCAGCGTGCGGTTCTCACT-3’	64℃	15
						I-S-43	43	5’-GCCGCGACGTCACCTACAC-3’	5’-TCGGCCCTGGGCTCATCT-3’	67℃	15
I-S-44	44	5’-GTCGCCAGGGCAGGACACAG-3’	5’-GTCAACGTGGGCCTCCAAGT-3’	68℃	15
						I-S-45	45	5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-TGATGGGCACCAGGCGCTC-3’	69℃	15
I-S-46	46	5’-CATCCAGGCCAATGTGACGGT-3’	5’-CCTGGTGGCAAGCTGGGTGTT-3’	64℃	15
						I-S-47	47	5’-TAAAACTGGATGGGGCTCTC-3’	5’-GGCCTCCACCAGCACTAA-3’	56℃	16
I-S-48	48	5’-GGGTCCCCCAGTCCTTCCAG-3’	5’-TCCCCAGCCCGCCCACA-3’	67℃	17
						I-S-49	49	5’-GCCCCCTCACCACCCCTTCT-3’	5’-TCCCGCTGCTCCCCCCAC-3’	67℃	18
I-S-50	50	5’-GATGCCGTGGGGACCGTC-3’	5’-GTGAGCAGGTGGCAGTCTCG-3’	67℃	19
						I-S-51	51	5’-CCACCCCCTCTGCTCGTAGGT-3’	5’-GGTCCCAAGCACGCATGCA-3’	64℃	20
I-S-52	52	5’-TGCCGGCCTCCTGCGCTGCTGA-3’	5’-GCAGGGTGAGCAGGTGGGGCCATCCTA-3’	67℃	21
						I-S-53	53	5’-CTGCACTGACCTCACGCATGT-3’	5’-GCCAAAGGGAAAGGGATTGGA-3’	62℃	23
I-S-54	54	5’-GCTCATCTTTCTGGTGG-3’	5’-CCCCCAAGAACAAGGC-3’	56℃	23
						I-S-55	55	5’-TATGCTTTCAGGCCCGTGGCA-3’	5’-AGAGCCCATACCCGGTCCAGTCC-3’	62℃	24
I-S-56	56	5’-GGACTGGACCGGGTATGGGCTCT-3’	5’-CACCCAGGCCCTCCTCGACTC-3’	62℃	25
						I-S-57	57	5’-CTCTATCCTGAGAAGGC-3’	5’-TGAGAGCAGGGGAGGC-3’	62℃	26
I-S-58	58	5’-CAGGCCAAAGCTGAGATGACTTG-3’	5’-AGAGGCGCAGGAGGGAGGTC-3’	62℃	27
						I-S-59	59	5’-CCCTCTGCCCCCGCATTG-3’	5’-AAGCGCAAAAGGGCTGCGTCG-3’	62℃	28
1-S-60	60	5’-TCCGTGGGAGGTTGGG-3’	5’-GCCACACAGGTGAGGC-3’	64℃	29
						I-S-61	61	5’-CCTCTTCCTGCCCAGCCCTTC-3’	5’-CTTCCCGAGCAGCCTTTGGTG-3’	62℃	30
I-S-62	62	5’-GTCCCATATATCCAGCATTCT-3’	5’-ACAGTGTCTTGAGTCCAAGC-3’	56℃	31
						I-S-63	63	5’-GCCTTGGCGCAGCTTGGACT-3’	5’-ACACCCAGCAAGGACACGCA-3’	65℃	32
I-S-64	64	5’-GGTTTGCTCGGAAGCCC-3’	5’-TGAGCTTCAGAGCCCCCTCCTC-3’	61℃	33
						I-S-65	65	5’-TGCAGCTGGGCCCACCCT-3’	5’-CTGGGGATCCCATGAGGC-3’	60℃	34
I-S-66	66	5’-TCAAGAAACTGCCCGCC-3’	5’-GGGGCTACGCAAGCAC-3’	64℃	35
						I-S-67	67	5’-GACAGGTGTGCTTGCGTAGCC-3’	5’-GATGGAGGCCTGTAGCCTACCCC-3’	66℃	36
I-S-68	68	5’-GCTGTGGCTGTGGCTGTCTC-3’	5’-CGGGCTCTCTACCAGGGTGTC-3’	66℃	36-37
						I-S-69	69	5’-GGTCTTGCTGGAAGCCCTGTAC-3’	5’-CATGCCATGTAGCCTCTTGACC-3’	64℃	37
I-S-70	70	5’-CACCCCACGGCTTTGCAC-3’	5’-CTTTGCAGACGGTAGGCGTG-3’	66℃	37-38
						I-S-71	71	5’-CATGCTTTTTCTGCTGGTGACC-3’	5’-GCTCTGGGCTGGACTGGTTC-3’	66℃	38-39
I-S-72	72	5’-CGTGCTGCTGCCCTACGTC-3’	5’-CGTCCCCGAGCCATTGTG-3’	66℃	39-40
						I-S-73	73	5’-TTCAGCACCAGCGATTACGAC-3’	5’-CCTGTTGTCCAGCCAGTTGTG-3’	60℃	40-41
I-S-74	74	5’-AGCTGCACAACTGGCTGGAC-3’	5’-CCGAGGTGAGCAGAGGCAG-3’	64℃	41-42
						I-S-75	75	5’-AGGTGTGCCTGCTGCTGTT-3’	5’-CCACCTGGTCGAAGCTAGTG-3’	60℃	43
I-S-76	76	5’-CTGACCGCCAGTGGACCC-3’	5’-TCGGCATAATGTCTTGCCAAAG-3’	60℃	43-44
						I-S-77	77	5’-CCAGTGGTCCGTCTTTGG-3’	5’-GGGGTGACAGGTGCCAGGAC-3’	64℃	44-45
I-S-78	78	5’-TCTACCCTGTGTCCTGCCGAG-3’	5’-AGGAACAACTCCACCATCTCGTAG-3’	60℃	45
						I-S-79	79	5’-GGCTGGGGGCTGTTATTCTC-3’	5’-TGGAGGAGCGAGAGGGCAG-3’	66℃	45-46
I-S-80	80	5’-TCCGCTTTGAAGGGATGGAG-3’	5’-GGGAGGGCTCAGGCTCACAC-3’	66℃	46
						I-S-81	81	5’-GGGACAAGGTGTGAGCCTGAG-3’	5’-CAAGGCGGCTGGGCAGTG-3’	68℃	46
I-S-82	82	5’-GATCTTCCCGTGGCCCAT-3’	5’-GTGTCCACTCCGACTCCA-3’	58℃	46

表2高压液相色谱仪检测常染色体显性遗传型多囊肾病I型致病基因突变引物的核苷酸序列

引物混合物代号	引物编号	核苷酸序列		退火温度	外显子编号
						正向引物	反向引物
		I-H-1	1					5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-CCACCTCATCGCCCCTTCCTAAGCAT-3’	69℃	1
I-H-2	2			5’-ATTTTTTGAGATGGAGCTTCACTCTTGCAGG-3’	5’-CGCTCGGCAGGCCCCTAACC-3’	68℃	2-7
		I-H-3	3					5’-CCGCCCCCAGGAGCCTAGACG-3’	5’-CATCCTGTTCATCCGCTCCACGGTTAC-3’	68℃	8-12
I-H-4	4			5’-TGGAGGGAGGGACGCCAATC-3’	5’-GTCAACGTGGGCCTCCAAGT-3’	68℃	13-15
		I-H-5	5					5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-CAGGGTGAGCAGGTGGGGCCATCCTA-3’	70℃	15-21
I-H-6	6			5’-GAGGCTGTGGGGGTCCAGTCAAGTGG-3’	5’-AGGGAGGCAGGAAAGGGCCCGAAC-3’	72℃	22
		I-H-7	7					5’-CCCCGTCCTCCCCGTCCTTTTGTC-3’	5’-AAGCGCAAAAGGGCTGCGTCG-3’	69℃	23-28
I-H-8	8			5’-GGCCCTCCCTGCCTTCTAGGCG-3’	5’-GTTGCAGCCAAGCCCATGTTA-3’	68℃	29-34
		I-H-9	9					5’-GGTCGCGCTGTGGCGAAGG-3’	5’-CGGCGGGCGGCATCGT-3’	68℃	1
I-H-10	10			5’-CCTGAGCTGCGGCCTCCG-3’	5’-CAGTTGACGCGGCAGGCG-3’	66℃	1
		I-H-11	11					5’-TGCGAGCCCCCCTGCCTC-3’	5’-AACCCGCCCACGCCCGCCCGTCC3’	66℃	1
I-H-12	12			5’-TAGGGGCTCTGGCCCTGAC-3’	5’-CCAGCCAGGACCCCACCCAAAG-3’	55℃	2-3
		I-H-13	13					5’-AGTGGGGGGCTGGCATAGAC-3’	5’-TGAGCCCTGCCCAGTGTCT-3’	62℃	4
I-H-14	14			5’-GAGCCAGGAGGAGCAGAACCC-3’	5’-AGAGGGACAGGCAGGCAAAGG-3’	65℃	5
		I-H-15	15					5’-CCCAGCCCTCCAGTGCCT-3’	5’-CCCAGGCAGCACATAGCGAT-3’	65℃	5
I-H-16	16			5’-CCGAGGTGGATGCCGCTG-3’	5’-AACGAGGGTGTCAACGGTCAG-3’	65℃	5
		I-H-17	17					5’-ACCGTTGACACCCTCGTTCC-3’	5’-TCTCTGCCCCAGTGCTTCAG-3’	64℃	6
I-H-18	18			5’-CTGTGAGGGTGGGAGGATGG-3’	5’-CGCTCGGCAGGCCCCTAACC-3’	56℃	7
		I-H-19	19					5’-TCTGTTCGTCCTGGTGTCCTG-3’	5’-GGAGGGCAGGTTGTAGAACGTG-3’	64℃	8
I-H-20	20			5’-GGTAGGGGGAGTCTGGGCTT-3’	5’-CTGGGAACCACTCTGGTGGC-3’	64℃	9
		I-H-21	21					5’-GGTAGGGGGAGTCTGGGCTT-3’	5’-CACCCACCACCCAGAGTCCC-3’	64℃	9
I-H-22	22			5’-GTTGGGCATCTCTGACGGTG-3’	5’-GGAAGGTGGCCTGAGGAGAT-3’	64℃	10
		I-H-23	23					5’-GGGGTCCACGGGCCATG-3’	5’-AAGCCCAGCAGCACGGTGAG-3’	64℃	11
I-H-24	24			5’-GCTTGCAGCCACGGAAC-3’	5’-GCAGTGCTACCACTGAGAAC-3’	64℃	11
		I-H-25	25					5’-TGCCCCTGGGAGACCAACGATAC-3’	5’-GGCTGCTGCCCTCACTGGGAAG-3’	67℃	11
I-H-26	26			5’-GAGGCGACAGGCTAAGGG-3’	5’-CATGAAGCAGAGCAGAAGGC-3’	64℃	12
		I-H-27	27					5’-TGGAGGGAGGGACGCCAATC-3’	5’-GAGGCTGGGGCTGGGACAAG-3’	67℃	13
I-H-28	28			5’-CCCGGGTTCACTCACTGCG-3’	5’-CCGTGCTCAGAGCCTGAAAG-3’	64℃	14
		I-H-29	29					5’-TGGGGAGCAGGTGGGGGTGC-3’	5’-AGACGCCGCACATCCGCCTGGGCCG-3’	64℃	15
I-H-30	30			5’-CGTGCGCCTGGAGGTCAAC-3’	5’-GGCTGCGTGGGGATGCAG-3’	68℃	15
		I-H-31	31					5’-CGTGCTGGTCTTCGTCCTGG-3’	5’-TGTAGCGGTAGGGGAACGG-3’	64℃	15
I-H-32	32			5’-GTTTGTGCAGCTCGGGGAC-3’	5’-AAGCGTGGGTGACCTCCG-3’	65℃	15
		I-H-33	33					5’-CCCGCCAGCTACCTGTGG-3’	5’-GCGGAGCCCACCTCGTTC-3’	66℃	15
I-H-34	34			5’-CTTCCGCTCCGTGGGCAC-3’	5’-GGAGGCGGCCACCATCAG-3’	65℃	15
		I-H-35	35					5’-AGCGCCTGGGCCGACTGCAC-3’	5’-AGCTGCCCCCAAAAGGGC-3’	65℃	15
I-H-36	36			5’-GAGCCCGGAGGCAGCTTC-3’	5’-GGGAGCACCTCGGGGTTG-3’	66℃	15
		I-H-37	37					5’-AGCTGTCACCTTCCGCCTG-3’	5’-GCACCTGGATCTCCAACAGCC-3’	67℃	15
I-H-38	38			5’-GCTGGTCATCCTGTCGGGC-3’	5’-CACCAGGTTGGAGGCGTTC-3’	66℃	15
		I-H-39	39					5’-CCAGGGCCGAGCACTCCTAC-3’	5’-GTCAACGTGGGCCTCCAAGT-3’	67℃	15
I-H-40	40			5’-AGCGCAACTACTTGGAGGCCC-3’	5’-TGGGGTCGTAGGACTCGCTC-3’	66℃	15

I-H-41	41	5’-CGCCTGGTGCCCATCATTG-3’	5’-GGACGGGTGAGGGGCATG-3’	66℃	15
						I-H-42	42	5’-TAAAACTGGATGGGGCTCTC-3’	5’-GGCCTCCACCAGCACTAA-3’	56℃	16
I-H-43	43	5’-GGGTCCCCCAGTCCTTCCAG-3’	5’-TCCCCAGCCCGCCCACA-3’	67℃	17
						I-H-44	44	5’-GCCCCCTCACCACCCCTTCT-3’	5’-TCCCGCTGCTCCCCCCAC-3’	67℃	18
I-H-45	45	5’-GATGCCGTGGGGACCGTC-3’	5’-GTGAGCAGGTGGCAGTCTCG-3’	67℃	19
						I-H-46	46	5’-CCACCCCCTCTGCTCGTAGGT-3’	5’-GGTCCCAAGCACGCATGCA-3’	64℃	20
I-H-47	47	5’-TGCCGGCCTCCTGCGCTGCTGA-3’	5’-GCAGGGTGAGCAGGTGGGGCCATCCTA-3’	67℃	21
						I-H-48	48	5’-CTGCACTGACCTCACGCATGT-3’	5’-GCCAAAGGGAAAGGGATTGGA-3’	62℃	23
I-H-49	49	5’-GCTCATCTTTCTGGTGG-3’	5’-CCCCCAAGAACAAGGC-3’	56℃	23
						I-H-50	50	5’-TATGCTTTCAGGCCCGTGGCA-3’	5’-AGAGCCCATACCCGGTCCAGTCC-3’	62℃	24
I-H-51	51	5’-GGACTGGACCGGGTATGGGCTCT-3’	5’-CACCCAGGCCCTCCTCGACTC-3’	62℃	25
						I-H-52	52	5’-CTCTATCCTGAGAAGGC-3’	5’-TGAGAGCAGGGGAGGC-3’	62℃	26
I-H-53	53	5’-CAGGCCAAAGCTGAGATGACTTG-3’	5’-AGAGGCGCAGGAGGGAGGTC-3’	62℃	27
						I-H-54	54	5’-CCCTCTGCCCCCGCATTG-3’	5’-AAGCGCAAAAGGGCTGCGTCG-3’	62℃	28
I-H-55	55	5’-TCCGTGGGAGGTTGGG-3’	5’-GCCACACAGGTGAGGC-3’	64℃	29
						I-H-56	56	5’-CCTCTTCCTGCCCAGCCCTTC-3’	5’-CTTCCCGAGCAGCCTTTGGTG-3’	62℃	30
I-H-57	57	5’-GAGCAGGTCTGAGCTGCCG-3’	5’-GCACCAGGGCTCGAGGTTTC-3’	62℃	31-32
						I-H-58	58	5’-GGTTTGCTCGGAAGCCC-3’	5’-TGAGCTTCAGAGCCCCCTCCTC-3’	61℃	33
I-H-59	59	5’-TGCAGCTGGGCCCACCCT-3’	5’-CTGGGGATCCCATGAGGC-3’	60℃	34
						I-H-60	60	5’-TCAAGAAACTGCCCGCC-3’	5’-GGGGCTACGCAAGCAC-3’	64℃	35
I-H-61	61	5’-GACAGGTGTGCTTGCGTAGCC-3’	5’-GATGGAGGCCTGTAGCCTACCCC-3’	66℃	36
						I-H-62	62	5’-TCCATCACGGGGGACCCCTCT-3’	5’-AAAGGGGGACAGGAGTGTCCT-3’	65℃	37
I-H-63	63	5’-AAAGCCCTGCTGTCACTGTGG-3’	5’-TAGGGTCTGGCTGGACTAAAG-3’	65℃	38
						I-H-64	64	5’-GGGTCTCTGGTGGCCGCTCA-3’	5’-ATGCCAGAGCTCCGCTAAAGG-3’	66℃	39
I-H-65	65	5’-CACTCCTGTTCCCTTTTGATG-3’	5’-CGGCACTCCTGGAGAACTACT-3’	65℃	40
						I-H-66	66	5’-CGGCCTCCTGACCAGCCTGGCTC-3’	5’-TAGGCCAGCGGGGGCCGGAGGAGTG-3’	66℃	41
I-H-67	67	5’-TGCCACCCGCTCCTACTGA-3’	5’-TGGAGGCGCGGGGTCT-3’	70℃	42
						I-H-68	68	5’-CGTCCCTCCCGCCCTCCTGA-3’	5’-TCTCTCTGCTTGCAGCCCTGGGGTGTG-3’	68℃	43
I-H-69	69	5’-GCCTCGCTGCTCTTCCTG-3’	5’-GCTGAGCTGAGCTAAGACGCCCTCC-3’	66℃	44
						I-H-70	70	5’-AGCTCAGCTGTACGCCCTCA-3’	5’-TCTCCCTCTCCCCCCCACTG-3’	65℃	45
I-H-71	71	5’-GAGAGGGACACGCCCTGGGCTCTGC-3’	5’-GGCAAGGCGGCTGGGCAGTGCTGG-3’	66℃	46
						I-H-72	72	5’-CCCGTGGCCCATCCCCGGGCCTGCGG-3’	5’-TACGTGCAGCCATTCTGCCTGGCCC-3’	66℃	46

表3染色体显性遗传型多囊肾病II型致病基因突变检测引物的核苷酸序列

引物混合物代号	引物编号	核苷酸序列		退火温度	外显子编号
						正向引物	反向引物
		II-SH-1	1					5’CCGCCCCCGCCGCGCGCCGGACGCCAGTGACC3’	5’CCTGCCGGGAGCACGACGAG3’	70℃	1
II-SH-2	2			5’GCCCCCGCCGCCGCGGCCTCCCCTTCTCCT3’	5’CTGGGCTGGGGCACGGCGGG3’	72℃	1
		II-SH-3	3					5’GGGGGCTACCACGGCGCGGGC3’	5’CGGCCCGCCGCCCCCGCCCGCGGCCGTTCTGGTTCGTGCATCTG3’	70℃	1
II-SH-4	4			5’AAATGATATCTTTTCTTTTCTTCA3’	5’AACTTTCCCATTAGTGCAAG3’	56℃	2
		II-SH-5	5					5’GGCGTTCATTTGGATCTTTC3’	5’TGTGATAGAGAGGTACTTTCA3’	56℃	3
II-SH-6	6			5’CTTTTTCAAAGATGTTTCCTTTGC3’	5’CCGAGTGCCAATGAGTCACA3’	56℃	4
		II-SH-7	7					5’GCCTCAAGTGTTCCACTGAT3’	5’ACCACACAGAAATAGGAGGG3’	56℃	5
II-SH-8	8			5’TTGTTATTGTTTTAATTGTTCTTA3’	5’TTGTAGAATAGAATAGGAAATTTGG3’	56℃	6
		II-SH-9	9					5’TTGGTGAAGAAAAATATACTAGTCA3’	5’TGGAACTCATTTTTTTTAAAGA3’	56℃	7
II-SH-10	10			5’TTTTATTATACACAGTCACACC3’	5’CTACTCTGACTAAATTTTTCTTCTT3’	56℃	8
		II-SH-11	11					5’TTTGGTTTTGTATTGTGGTG3’	5’AAGGATTTACGAAGTTTAAATTG3’	56℃	9
II-SH-12	12			5’TTTTTGCCCTCCTTTCATTTA3’	5’GAAACAATGCTCATTTTATGTC3’	56℃	10
		II-SH-13	13					5’AAACCAAGTCTTTTATTTTTTCTC3’	5’AGAACCTCAGGAAGCATGATT3’	56℃	11
II-SH-14	14			5’GATGAATGTTATCTGTATCCTCTC3’	5’TAGGTACCAAATCAAATCCG3’	56℃	12
		II-SH-15	15					5’GTCTCAGTGTTCTGCTCCTC3’	5’CAAATTCTGCCAATTCCTTTA3’	56℃	13
II-SH-16	16			5’TTTGTCCCTCTGTACTGTGTTT3’	5’AAATACAACTGTCAGCAACATA3’	56℃	14
		II-SH-17	17					5’TGACCCCCAACACCAGTTTC3’	5’GGACAGCCACTTCCTCACTT3’	56℃	15

Claims (14)

1.一种常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，包括致病基因引物混合物、阴性对照物、正常对照物，其特征在于致病基因引物混合物的成分为：

三羟甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸钾0-170mmol/L，二甲亚砜0-15％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脱氧核苷三磷酸500-1200μmol/L，乙酸镁0-2.5mmol/L或氯化镁0-2mmol/L，热稳定型脱氧核苷酸聚合酶16-80U以及致病基因正、反向引物各2-6μmol/L。

2.按权利要求1所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的致病基因引物混合物为I-H-1至I-H-72。

3.按权利要求1所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的的致病基因引物混合物为II-SH-1至II-SH-17。

4.按权利要求3所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的致病基因引物混合物还包括I-H-1至I-H-72。

5.按权利要求1所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，还包括上样缓冲液和显色液，其特征在于所说的致病基因引物混合物为I-S-1至I-S-82。

6.按权利要求1所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，还包括上样缓冲液和显色液，其特征在于所说的致病基因引物混合物为II-SH-1至II-SH-17。

7.按权利要求5所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的致病基因引物混合物还包括II-SH-1至II-SH-17。

8.按权利要求5、6、7所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的上样缓冲液成分为：蔗糖10％，溴酚兰0.01％及二甲苯青0.01％。

9.按权利要求5、6、7所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的显色液成分分别为：显色液A——无水乙醇；显色液B——浓硝酸；显色液C——30％硝酸银溶液；显色液D——25％碳酸钠溶液；显色液E——乙酸；显色液F——37％甲醛溶液。

10.按权利要求8所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的显色液成分分别为：显色液A——无水乙醇；显色液B——浓硝酸；显色液C——30％硝酸银溶液；显色液D——25％碳酸钠溶液；显色液E——酸；显色液F——37％甲醛溶液。

11.按权利要求7所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的致病基因引物混合物还包括I-H-1至I-H-72。

12.按权利要求8所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的引物混合物还包括I-H-1至I-H-72。

13.按权利要求9所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于所说的致病基因引物混合物还包括I-H-1至I-H-72。

14.按权利要求10所述的常染色体显性遗传型多囊肾病检测试剂盒，其特征在于致病基因引物混合物还包括I-H-1至I-H-72。

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