CN1432129A - 荧光测量方法和设备以及利用该方法和设备的样本评定设备 - Google Patents

Abstract

用从激励光源1提供的脉冲式激励光照射样本S，借助聚光系统3和分光镜4通过光测器5检测该样本S生成的荧光，并且使荧光时间波形在控制器6中的数据处理单元62里受到数据分析，从而计算波形数据以及诸如荧光寿命等物理量。其中，相对于数据分析使用的时间轴固定地排列激励光时间波形，在把荧光时间波形和拟合范围从比激励光峰值早的初始位置向较晚的终止位置移动的同时进行多次拟合计算，并且根据一预定的选择准则选择最佳的测量波形数据。这样实现无论荧光时间波形中是否存在波动都可精确并高效计算波形数据等的荧光测量方法和设备，以及实现使用它们的样本评定设备。

Description

荧光测量方法和设备以及利用 该方法和设备的样本评定设备

技术领域

本发明涉及用于测量从用激励光激励的样本释放的荧光的时间波形以及进行数据分析，从而计算波形数据等的荧光测量方法和设备，并且涉及利用上述方法和设备的样本评定设备。

背景技术

在以时间分辨方式测量样本中生成的荧光从而获取诸如荧光寿命信息的荧光测量设备中，一旦用来自激励光源的脉冲式激励光照射而该样本被激励时，通过诸如光电倍增器等光测器检测从该受激样本产生并发射的荧光，尤其是荧光强度随时间的变化。接着，对由从该光测器输出的荧光检测数据得到的荧光时间波形进行数据分析，例如在数据处理单元中执行的算术运算，从而计算波形数据、荧光寿命等等。

在这种荧光测量设备中获得的荧光时间波形变成荧光衰变时间波形，其中在激励光照射后释放的荧光的强度随时间衰变。然而，实际上，荧光时间波形是在这样的状态下测量的，其中从荧光分量导出的指数型荧光衰减时间波形和由设备响应的时间波形造成的激励光时间波形(例如从该设备产生的激励光的有限脉宽)彼此卷积。

从而，当通过数据分析计算波形数据、荧光寿命等时，利用独立于被测的荧光时间波形测出的激励光时间波形使荧光衰变时间波形和设备响应时间波形彼此卷积。同时，利用一个诸如指数函数的函数系统对荧光衰变时间波形进行拟合计算，从而计算波形数据以便确定时间波形以及诸如荧光寿命之类的物理量(例如参见日本专利公开2911167号)。

上述含有拟合计算的数据分析所使用的荧光时间波形和激励光时间波形通常通过利用相同的测量系统，即相同的光学系统、光测器等测量，以防由于测量系统配置上的差异影响这些时间波形。这里，通过在彼此不同的时刻测量荧光和激励光得到这些时间波形。当这样通过使用相同的测量系统进行独立的测量操作时，由于随着时间该测量设备的工作状态偏移时间波形之间中出现的波动成为数据分析中的一个问题。

尤其是，用来获取诸如荧光寿命信息的荧光测量设备近来已经进展到应用于各种各样的样本评定领域，例如用于半导体晶片的晶体品质评定。而且，由于这种荧光测量设备应用领域的扩大，已经需要在尽可能短的时间内连续进行数次荧光计量操作，例如为了通过荧光计量学评定一块半导体晶片上的多个部分。

这里，由于例如因热等造成测量设备工作状态的变化以及用作为激励光源的脉冲式激光光源的振荡定时对用来和光测器同步的时钟信号的定时的波动这些现象，每次荧光计量操作中的测量条件随时间变化。这样，如果简单地使用在分离的荧光计量操作中得到的各个荧光时间波形，荧光时间波形在时间轴上的位置会偏离通过分离的测量操作在这些荧光计量操作之前确定的激励光时间波形。

由于因此测得的荧光时间波形在数据分析的时间轴上偏离相对于该时间轴固定的激励光时间波形，例如通过卷积完成的拟合计算之类的数据分析因为该时间上的偏离而不能正确进行，从而不能准确地计算波形数据和荧光寿命。如果每次当进行荧光计算时进行激励光测量，尽管抑制了时间波形偏移的影响，但荧光计量和样本评定所需的时间可能变得更长。

发明内容

鉴于上述诸问题，本发明的一个目的是提供能够和荧光时间波形中的波动无关地正确并有效计算波形数据等的荧光测量方法和设备，并且提供使用该方法和设备的样本评定设备。

为了达到这样的目的，本发明的荧光测量方法包括(1)用脉冲式激励光照射样本的激励步骤；(2)检测从该用激励光激励的样本释放的荧光的光检测步骤；以及(3)数据处理步骤，其对一个通过光检测步骤检测到的荧光时间波形进行数据分析，该数据分析包括在为该荧光时间波形固定地设置的充当预定时间范围的拟合范围中的拟合计算，从而计算波形数据；(4)其中，在该数据处理步骤中，供拟合计算使用的时间轴上排列一个事先确定的激励光时间波形及该荧光时间波形，以把该荧光时间波形的荧光峰值设在比大致和该激励光时间波形的激励光峰值重合的时间位置早或者晚一预定时间宽度的初始位置上，接着，在相对于该时间轴把该荧光时间波形和拟合范围或者把激励光时间波形从该初始位置朝该时间轴上的位于其上该荧光峰值和该激励光峰值大致重合的时间位置的另一侧的终止位置移动的同时，在多个彼此不同的时间位置上参照该激励光时间波形分别进行拟合计算，并且把一个根据预定的选择准则从多个分别在这些拟合计算中算出的波形数据项中选出的波形数据项用作为最终测量波形数据。

本发明的荧光测量设备包括：(a)用于对样本照射脉冲式激励光的激励装置；(b)用于检测从该用激励光激励的样本释放的荧光的光检测装置；以及(c)数据处理装置，用于对一个通过该光检测装置检测到的荧光时间波形进行数据分析，该数据分析包括在为该荧光时间波形固定地设置的充当预定时间范围的拟合范围中的拟合计算，从而计算出波形数据；(d)其中该数据处理装置在时间轴上排列供拟合计算使用的一个事先确定的激励光时间波形及该荧光时间波形，以把该荧光时间波形的荧光峰值设在比大致和该激励光时间波形的激励光峰值重合的时间位置早或者晚某预定时间宽度的一初始位置上，接着，在相对于该时间轴把该荧光时间波形和拟合范围或者把激励光时间波形从该初始位置朝该时间轴上的位于其上该荧光峰值和该激励光峰值大致重合的时间位置的另一侧的终止位置移动的同时，在多个彼此不同的时间位置上参照该激励光时间波形分别进行拟合计算，并且把一个根据预定的选择准则从多个分别在这些拟合计算中算出的波形数据项中选出的一个波形数据项用作为最终测量波形数据。

在上述荧光测量方法和设备中，为了拟合计算相应地把从荧光测定术分别测量的一个荧光时间波形和一个激励光时间波形按预定的时间位置分别排列在时间轴上。接着，从荧光峰值比激励光峰值早或晚预定时间宽度的初始位置向相反一侧(从较早的初始位置到较晚的终止位置或者从较晚的初始位置到较早的终止位置)的终止位置移动荧光时间波形或激励光时间波形。

若这样测得的荧光时间波形在时间轴方向上不存在偏离，则荧光时间波形和激励光时间波形在时间轴上的相应位置(时间位置)彼此重合，荧光时间波形的荧光峰值会位于激励光峰值的时间位置处或者更晚位置处。这样，如果在时间轴上适当地设定用来规定数据分析中相互移动荧光和激励光时间波形范围的初始位置和终止位置，当不存在偏离时上述荧光时间波形位置总是包含在该移动范围内。

相比起来，在依据本发明的荧光测量方法和设备中，在如上所述于时间轴上移动荧光的或者激励光的时间波形时执行多次拟合计算，从而从单个荧光时间波形确定多个波形数据项，并且在把一个充当选择准则的量变为一个判定拟合计算的结果是否合适等的判定准则的情况下从多个波形数据项中选出一个最佳测量波形数据项。这使得不论荧光时间波形是否偏移都能以足够精确度有效地计算波形数据、各个物理量等等。

在数据分析中，相对于荧光时间波形而不是对于时间轴把规定用于进行拟合的数据范围的时间范围(拟合范围)设定到一个固定时间位置上。当移动该荧光时间波形时，在时间轴上和该荧光时间波形一起移动该拟合范围，从而执行各次拟合计算。因此，多个拟合计算中的每一个总是在最佳状态下进行的。

在荧光或者激励光的时间波形的移动范围内的多次拟合计算中，最好根据波形数据、各物理量等所需的数值精度适当地设置时间轴上的的用来执行各次拟合计算等的移动间距。对于初始位置和终止位置，根据离激励光峰值等的时间宽度规定该初始位置。可以和初始位置一样根据离激励光峰值的宽度设定终止位置，或者，每次执行拟合计算时可以根据选择准则进行判定并且可以把确定将选取的波形数据的时间位置用作为终止位置从而结束数据分析。

依据本发明的样本评定设备包括上述荧光测量设备以及样本评定装置，该样本评定装置用于通过比较由该荧光测量设备的数据处理装置得到的测量波形数据和事先确定的基准波形数据来评定该样本。

这样就实现了一种即使当测得的荧光时间波形在时间轴上偏移时仍能准确地和有效地评定样本的样本评定设备。尤其在用来评定半导体晶片等的设备中，对样本(半导体晶片)的各个部分重复地进行荧光计量操作。即使在这种情况下，使用上述荧光测量设备可以使因各次荧光计量操作之间出现的测量条件波动而造成的荧光时间波形的偏移带来的影响最小化。

这样配置的样本评定设备不仅可用于上述的半导体晶片质量评定，还可以用于各种样本评定，例如药品研制中的大规模筛选。

附图说明

图1示出荧光测量设备的一实施例；

图2是一个曲线图，示出激励光和荧光的时间波形的一个例子；

图3是一个曲线图，示出激励光和荧光的时间波形的另一个例子；

图4A至4D是用来解释图1中示出的荧光测量设备中的数据分析方法的示意曲线；

图5是示意曲线，用于示出如何从多个波形数据项中选择一个测量波形数据；

图6是一个流程图，示出图1中所示的荧光测量设备中的荧光测量方法的一个例子；

图7示出样本评定设备的一实施例；以及

图8是一个流程图，示出图7中所示的样本评定设备中的样本评定方法的一个例子。

具体实施方式

以下，参照各附图详细说明依据本发明的荧光测量方法和设备以及使用它们的样本评定设备的优选实施例。在对各附图的说明中，用彼此相同的数字表示彼此相同的部分，不再赘述。各附图中的尺寸比例并不总是和所作出的说明相匹配。

图1示出依据本发明的荧光测量设备的一实施例。该荧光测量设备包括一个用于向由样本保持装置2保持的样本S照射激励光的激励光源1，一个用于检测从用激励光激励的样本S释放的荧光的光测器5，以及一个用于驱动并控制激励光源1和光测器5的控制器6。在图1中，保持在作为样本保持装置2设置的样本室内的气状等状态的样本S为样本S的一个例子。

作为激励光源1，使用一个可以把具有预定波长和时间宽度的脉冲波提供为激励光的脉冲式光源。所采用的光测器5例如是能进行时间分辨测量以得到时间波形的光电倍增器(PMT)或超高速扫描摄影机。

在保持样本S的样本保持装置2和光测器5之间设置一个聚光系统3和一个分光镜4。聚光系统3具有必要的光学器件例如透镜，并且把由激励光源1发出的激励光激励的样本S内的受激部分生成的并且在各方向上释放的荧光聚光并会聚到光测器5。

分光镜4充当波长选择装置，用于选择由光测器5检测的光分量中的一个预定波长范围中的光分量并且使该选定的光分量入射到光测器5。作为这种波长选择装置，不仅可以使用分光镜也可以使用波长选择滤光器等。由例如分光镜4或波长选择滤光器之类的波长选择装置选择的光的波长范围被适当地设定在或者改变到其中含有要由光测器5检测的荧光或激励光的波长的波长范围。

用来控制荧光测量设备等的各个部分的操作的控制器6包括一个驱动控制单元61，一个数据处理单元62以及一个范围设定单元63。可用作为这种控制器的例如是个人计算机(PC)，其调用控制软件、数据处理软件等等，从而实现作为控制器6所需的各种功能。

激励光源1、分光镜4和光测器5由控制器6的驱动控制单元61提供的时钟信号及其它控制信号驱动。这样，相对于在预定时钟时间间隔从激励光源1提供的脉冲式激励光，光测器5检测一旦由各个激励光脉冲照射从样本S释放的荧光以及该荧光随时间的变化。根据检测信号基于这样检测到的荧光的荧光检测数据馈入控制器6。

根据基于来自驱动控制单元61的时钟信号等的数据分析指令，数据处理单元62对从光测器5输入的检测信号执行数据处理，例如必要的信号处理和数据分析。最初，在对荧光检测数据的数据分析中，为从样本S释放的荧光确定表示荧光强度中的瞬时变化的荧光时间波形并且由于与该时间波形对应的激励光脉冲，该时间波形由光测器5检测到。

对这样得到的荧光时间波形进行数据分析，其中包括使该时间波形和某预定曲线(函数系统)等拟合的拟合计算，从而计算波形数据、必要的物理量等。这样计算出来的波形数据和物理量的例子包括各种物理量，例如各个用来确定时间波形的曲线形式的参数、各荧光分量的荧光寿命，和荧光强度。范围设定单元63设定供数据处理单元62中的拟合计算使用的拟合时间范围(以下称为拟合范围)。后面会说明具体的数据分析方法，拟合范围设定，等等。

最好根据需要把用于显示由数据处理单元62得到的荧光时间波形、计算出的波形数据、荧光寿命时间等的显示器7(见图1)连接到控制器6。

当在上述配置中从激励光源1提供脉冲式激励光并且照射样本S时(激励步骤)，该受激励的样本S释放荧光，接着，借助聚光系统3和分光镜4由光测器5检测该荧光(光检测步骤)。然后，在控制器6的数据处理单元62中，对这样测得的荧光时间波形进行数据分析，从而计算波形数据等等(数据处理步骤)。

现在具体地解释图1中示出的荧光测量设备中的荧光测量方法并同时示出它的数据分析方法(数据处理方法)。

首先解释激励光脉冲照射后通过荧光测量得到的荧光时间波形。

图2示出从激励光源1向样本S发射的激励光的时间波形以及激励光脉冲照射后从样本S释放的荧光的时间波形的例子。在该图中，横坐标表示用于数据分析的时间轴(纳秒)，而纵坐标表示激励光或者荧光的检测数量(计数；检测出的强度)。这里，为了和荧光衰减的时间波形为指数型这个事实一致，纵坐标上和荧光强度对应的检测到的数量是以对数尺度表示的。横坐标上的时间轴对应于从测量荧光或激励光时刻经过的时间。

这里，图2中的除荧光时间波形之外的激励光时间波形是在荧光时间波形的数据分析中要涉及到的一个时间波形(以下将描述)。为了防止测量系统配置中的差异影响这些时间波形，通常通过使用同一个测量系统，即荧光计量所使用的同一个光系统、测光器等测量激励光的时间波形。

在图1中示出的配置下，例如当样本保持装置2保持一个不产生的荧光的散射体以替代样本S接受荧光计量时，可以借助聚光系统3和分光镜4通过光测器5测量激励光。替代地，可以设置一个把部分激励光引导到该光测器的分立光学系统。至于由分光镜4(或者波长选择滤光器等)实现的波长选择，由于激励光和荧光具有彼此不同的波长，因此需要在改变选用的波长范围的同时进行激励光测量。

当用脉冲式激励光测样本时，从该样本释放的荧光的荧光强度表示激励光照射之后荧光衰减随时间的瞬时变化。在可以忽略激励光脉冲的时间宽度的情况下，由时间上的改变造成的荧光时间波形变成指数型荧光衰减时间波形。接着，从该指数型衰减曲线的振幅和衰减因子，可以计算出样本中被激励的荧光的荧光强度和荧光寿命。

另一方面，在荧光测量设备中实际测到的荧光时间波形是由于设备响应的影响而在一定程度上对理想衰减曲线变形的时间波形。也就是说，该荧光时间波形是在以下状态中得到的，即其中由荧光自身的瞬时变化造成的上述指数型荧光衰减时间波形与由激励光的有限脉冲时间宽度、和光路径相关的时间偏移等等所确定的激励光时间波形相卷积。

在图2中所示的时间波形的例子中，激励光时间波形E表明激励光脉冲具有不能被忽略的约为几纳秒的脉冲时间宽度。与之相比，荧光时间波形F和这种激励光时间波形E卷积，从而它的检测数量随着开始提供激励光而上升，并且在荧光强度在某时间点达到峰值(以下称为荧光峰值)之前不断增加，在此之后荧光强度大致指数式地(在对数尺度下线性地)衰减。这里，如图2中所示，该荧光峰值在时间轴上的时间位置位于激励光时间波形中的激励光强度峰值(以下称激励光峰值)的时间位置处或者之后。

现在解释一种用于从荧光时间波形计算波形数据、荧光寿命等的数据分析方法。

为了通过对如上所述的与激励光时间波形E相卷积的荧光时间波形F进行数据分析以获得诸如波形数据和荧光寿命的信息，该数据分析必须包括拟合计算，以便利用由适当的函数系统(例如指数函数)和参数(例如振幅和衰减因子)假设的激励光时间波形E和荧光衰减时间波形进行去卷积。

在该数据分析中，拟合计算(去卷积运算)隔离和荧光时间波形F卷积的激励时间波形E的分量，从而提取荧光衰减时间波形。这样，根据对荧光衰减时间波形的拟合计算结果，不仅计算例如振幅和衰减因子等波形数据，而且计算例如荧光强度和荧光寿命等物理量。

上述对荧光时间波形F进行的拟合计算是与在时间轴上设定拟合范围的同时进行的，该拟合范围是一个用来规定供检测到的荧光时间波形F中的拟合计算使用的检测数据的时间范围。作为这种拟合范围的一个例子，图2中示出一个相对于荧光时间波形F设置的时间范围Rt。

这里，在测量期间，随着从用来去卷积的激励光时间波形的测量到荧光测量的时间流逝或者随着反复地执行要完成的多次荧光计量操作的时间流逝，荧光测量设备的运行状态可能偏移。在这种情况下，因各次荧光计量操作之间设备状态的变化造成的荧光时间波形的波动可能在数据分析上是成问题的。

例如当把脉冲式激光光源用作为激励光源1时，它的振荡计时相对于从控制器61的驱动控制单元61提供的用来同步驱动的时钟信号可能会在一定的时间范围程度内变化。在这种情况下，对样本S的激励光照射计时偏离该时钟信号计时，从而时间波形在时间轴上的时间位置也会相对于激励光脉冲照射下产生的荧光偏移。

图3示出发生荧光时间波形偏移的情况下的激励和荧光的时间波形。相对于用于拟合计算的时间轴把激励光时间波形E排列在一个固定的时间位置，从而把它排列在当为每次荧光计量操作进行荧光时间波形F的数据分析中不存在时间波形偏移的情况下与荧光时间波形F(参见图2)对应的时间位置上。这样，如果在荧光时间波形F如图3中所示向该时间轴的较早侧或者较晚侧偏移情况下测量该荧光时间波形F，则激励光时间波形E和荧光时间波形F在该时间轴上会彼此偏离，从而不能正确地进行去卷积运算。另外，在执行拟合计算中如果把拟合范围Rt设置在相对于时间轴为固定的一个时间范围上也会成问题，因为拟合范围Rt和荧光时间波形F类似地彼此偏离。

相比起来，图1中示出的实施例的荧光测量设备以及其所实现的荧光测量方法在相对于时间轴移动荧光时间波形F以及拟合范围Rt的同时顺序地于各个彼此不同的时间位置为数据分析执行多次拟合计算。然后，从在各次拟合计算分别算出的多个波形数据项中选择一个最佳的波形数据项作为最终测量波形数据，从而实现一种使每次荧光计量运算中的时间波形里的偏移(例如上述的荧光时间波形F中的偏移)的影响最小化的数据分析。

图4A至4D是示意曲线，用来解释采用图1中示出的荧光测量设备的荧光测量方法中的数据分析方法。这里，在图4A至4D中示出的每个示意曲线图中，横坐标表示数据分析的时间轴t(对应于测量中时间的流逝)，而纵坐标通过对数尺度表示激励光和荧光的检出数量(对应于激励光强度和荧光强度)。

在图4A至4D的每个图中，为了简化解释和示意，用忽略其脉冲时间宽度的脉冲波形表示激励光时间波形E，而荧光时间波形F用一个其上升段和衰减段在对数指标下变成线性的三角波形表示。对于激励光波形E，把时间轴上固定激励光峰值的时间位置定义为t₀。

图4A示出这样的状态，其中所测量的荧光时间波形F相对于用于拟合计算的时间轴沿该时间轴的“+”方向(正方向)偏移，而激励光时间波形E相对于该时间轴固定地排列。如果在该情况下把数据分析中拟合计算所使用的拟合范围设定为相对于该时间轴为固定的时间范围RO(虚线)，由于荧光时间波形F的偏移，该时间波形F会偏离拟合范围RO，从而不会得到作为拟合计算结果的正确的波形数据和物理量。

相反，在该实施例的荧光测量方法中，如在图4A中用时间范围Rt(实线)示出那样，拟合范围设置成是相对于荧光时间波形F而不是相对于时间轴固定的一时间范围。通过利用初始荧光计量运算或者实际测量之前进行的初步荧光计量运算中的荧光时间波形在控制器6的范围设定单元63中自动地或者由操作者人工地设定拟合范围Rt(范围设定步骤)。

接着，移动如图4A中所示在偏离激励光时间波形E的时间位置处测量的荧光时间波形F，直至激励光峰值和荧光峰值各自的时间位置实际上彼此重合(图4B)。然后，进一步移动荧光时间波形并且将其排列成把荧光峰值定位到初始位置t₁，其中t₁比实际上和激励光峰值重合的时间位置t₀早预定的时间宽度(t₁＜t₀)(图4C)。

上述初始位置t₁是数据分析中要进行的多次拟合计算的开始位置的时间位置。接着，把荧光时间波形F从比激励光峰值时间位置t₀要早的初始位置t₁移动到比该时间位置t₀晚的终止位置t₂(t₂＞t₀)(图4D)。

这里，在从初始位置t₁按“+”方向顺序地以预定的移动时间间距移动荧光时间波形F的同时，在每个这样的移动时间位置处进行一次拟合计算，从而计算波形数据。在这种情况中，由于如上面所述把拟合范围Rt设置成是一个相对于荧光时间波形F固定的时间范围，因此它和荧光时间波形F一起相对时间轴移动。

从在各个时间位置处执行的多次拟合计算算出的各个波形数据项中，根据一个预定的选择准则选为最佳的数据项充当对于该荧光时间波形F的最终测量波形数据。作为用于波形数据的选择准则，使用一个充当判定准则以便判定所执行的拟合计算的结果是否合适等的量，从而选择最佳拟合计算结果，并由此计算最终测量波形数据以及诸如荧光寿命之类的各物理量。

根据上述荧光测量设备和方法，如果在时间轴上适当地排列规定执行多次拟合计算时移动荧光时间波形的范围的初始位置t₁和终止位置t₂，则总会把其中时间波形里不存在偏移的情况下的荧光时间波形F的时间位置包含在该移动范围内。在该移动范围内移动该荧光时间波形F的同时，执行多次拟合计算，从而从单个荧光时间波形F确定多个波形数据项，并且根据预定的选择准则从多个波形数据项中选择最佳的测量波形数据项。其中，无论该荧光时间波形中是否出现偏移，总是可以以足够的精度和数值精确性有效地计算波形数据、诸如荧光寿命等等物理量。

另外，由多次拟合计算中的每一次使用的拟合范围Rt设定为是对荧光时间波形F而不是对时间轴固定的时间范围，在移动荧光时间波形F时移动拟合范围Rt，同时在每个时间位置上进行拟合计算(参见图4C和4D)。从而，每次拟合计算都能在合适的状态下执行。

对于荧光时间波形F从初始位置t₁到终止位置t₂的移动，最好适当地设定时间轴上的移动时间间距，从而对要确定的量例如波形数据和荧光寿命产生所需的数值精度，并且在按该移动间距移动的每个时间位置上执行拟合计算。按这样设定移动时间间距可以改进每次算出的值的精度并且同时改进包含有拟合计算等的数据分析的效率。作为设置移动时间间距方法的一个具体例子，如果把时间波形数据数字化到多个通道中，可以当每一次荧光时间波形F移动1个通道或者多个通道时执行拟合计算。

至于初始位置t₁和终止位置t₂，可以通过距离事先设定的激励光峰值时间位置t₀的时间宽度来规定初始位置t₁。另一方面，可以如初始位置t₁那样根据距离时间位置t₀的时间宽度等等来设定终止位置t₂，或者每次执行拟合计算时可进行基于上述选择准则的判定，并且结束数据分析时同时把判定选用该波形数据的时间位置定义为终止位置。

最好事先在控制器6的范围设定单元63里设定用于荧光时间波形F的拟合范围Rt。作为在范围设定单元63中设定拟合范围的具体方法的一个例子，可以从通过初始荧光计量运算或初步荧光计量运算得到的荧光时间波形自动地设定。替代地，当在显示器7上显示该荧光时间波形时，可以由操纵鼠标器光标等的操作员人工地设定该范围。

把拟合范围Rt设成相对于荧光时间波形F是固定的时间范围的方法是这样具体实现的：当在时间轴上通过荧光时间波形F的荧光峰值的时间位置规定该荧光时间波形时，参照该荧光峰值设定拟合范围。这可以为通过各次测量操作得到的荧光时间波形设定各自合适的拟合范围。

作为一种具体的拟合范围，时间范围最好设定成不包括时间波形对统计偏差和噪声敏感的上升部分和下降部分(时间波形的二个端部分)，以使荧光的检测数量较少。更具体地，例如存在一种方法，其中把荧光峰值的荧光强度用作为基准荧光强度，并且根据相对于该基准荧光强度的预定荧光强度百分比范围(例如，至少20％)设定拟合范围的起始点和终止点。在另一种方法中，荧光峰值在时间轴上的位置充当基准时间位置，并且根据相对于该基准时间位置确定的预定时间范围来设定拟合范围的起始点和终止点。

这里，可以把拟合范围设成是它的起始位置和终止位置都位于在该荧光峰值后面的衰减波形内，或者设成为该起始点位于在该荧光峰值前面的上升波形内而该终止点位于在该荧光峰值后面的衰减波形内。

至于用于从通过多次拟合计算算出的各个波形数据项中选择最终测量波形数据的选择准则，最好使用在这些拟合计算中确定的χ²值。现参照图5中示出的曲线解释该选择方法。图5是一条示意曲线，示出从初始位置t₁到终止位置t₂进行的多次拟合计算中得到的各个χ²值中的变化，图中横坐标表示荧光时间波形已经移动到的时间位置，而纵坐标表示在各个时间位置上通过拟合计算得到的对应的χ²值。

χ²值(χ平方值)是一个作为指标的判定值，用来判定在近似计算，例如拟合计算中所使用的非线性最小二乘法中执行的每次拟合的计算结果是否合适，并且当拟合条件较好时它为接近1的较小值(χ²＞1)。也就是说，当在上述数据分析方法中从早于时间位置t₀的初始位置t₁开始各次拟合计算时，随着该荧光时间波形F的时间位置沿“+”方向移动，χ²值减小。接着，在某位于激励光峰值时间位置或更后处的时间位置t_c上达到最小后，χ²值朝着终止位置t₂重新增大。

如果把经χ²值为最小的拟合计算算出的波形数据，即通过在图5的时间位置t_c处的拟合计算算出的波形数据选择为最终测量波形数据，则可以从多个波形数据项中选出一个最佳的测量波形数据项。当把作为由拟合计算确定的一个值的χ²值用作为判定准则时，可以以一种有效的方式自动地执行含有波形数据选择的数据分析。

图6是一个流程图，其示出数据处理方法的一个例子，其中通过拟合计算得到的χ²值充当用来选择波形数据的准则。

在该数据分析方法中，最初通过一个参照荧光峰值、时间范围等的荧光强度百分比范围相对于该荧光时间波形F设定拟合范围(步骤S101)。接着，在时间轴上向其上荧光峰值实际上和激励光峰值重合的时间位置t₀移动通过测量得到的荧光时间波形F，并且沿“-”方向按一预定的时间宽度作进一步的移动，从而把该荧光时间波形F设置在初始位置t₁处(S102)。然后，在该初始位置t₁处，在使用上述拟合范围的情况下执行第一次拟合计算(S103)，从而计算第一波形数据和χ²值。

接着，开始在初始位置t₁和终止位置t₂之间执行多次拟合计算。即，沿“-”方向朝着终止位置t₂按预定的移动时间间距(例如，按+1通道)移动该荧光时间波形F(S104)，并且在该移到的时间位置上执行下一个拟合计算(S105)。然后，把通过该拟合计算得到的χ²值和通过前一次拟合计算得到的χ²值进行比较(S106)。

如果该次运算中的χ²值不大于前一次运算中的χ²值，则χ²值尚未达到最小值(参见图5)，从而重复荧光时间波形F的移动(S104)和拟合计算(S105)。如果该次运算中的χ²值大于前一次运算中的χ²值，则前次运算中的χ²值是多次拟合计算中得到的各个χ²值中的最小值。从而，在这种情况下，结束该多次拟合计算，并且把在前次运算中(例如-1通道)的荧光时间波形F的时间位置处拟合计算算出的波形数据选择为最终测量波形数据(S107)。

上述数据分析方法可以对每次荧光计量操作得到的荧光时间波形计算波形数据和物理量例如荧光寿命，并且同时不论荧光时间波形是否发生偏移都能保持足够的精度和数据分析效率。

上述荧光测量设备和方法可以应用于用来评定各种样本的品质等的样本评定设备中。

近来，荧光测量设备(荧光寿命测量设备)已经进展到应用于评定半导体晶片的晶体品质等。当评定半导体晶片时，必须事先评定要用到产品中的该晶片的晶体品质分布以便改进生产率。当把荧光测量设备用于这种品质评定时，利用要评定的半导体晶片作为样本通过荧光计量术确定荧光寿命及荧光强度并且和基准样本的荧光寿命及荧光强度比较，从而评定该半导体晶片每个部分的晶体品质。

图7示出使用本发明的荧光测量设备的样本评定设备的一实施例。在该实施例中，以固定在充当样本保持装置2的样本保持台2a上的状态保持要评定的样本S(例如，半导体晶片)。

激励光源1位于样本保持台2a上保持的样本S的上方，这样从激励光源1提供的激励光脉冲通过透镜11并且进行通过构成聚光系统3的半透明反射镜32和透镜31，从而照射样本S上的预定照射位置，该位置是样本S中一个要被评定的部分。来自样本S上被激励光脉冲激励的该部分的荧光经由透镜31、半透明反射镜32、可变光衰减器33、透镜34构成的聚光系统3以及分光镜4(或诸如波长选择滤光器等波长选择装置)入射到光测器5上。这里，可变光衰减器33用于根据需要设定它的光衰减以在测量激励光或荧光时调整光量。

控制器6不仅具有驱动控制单元61、数据处理单元62和范围设定单元63，还具有一个通过参照荧光计量结果评定样本的样本评定单元64。驱动控制单元61、数据处理单元62和范围设定单元63的功能、操作等类似于图1中示出的荧光测量设备里的作用、操作等。

另一方面，样本评定单元64把通过包括数据处理单元62中执行的多次拟合计算的数据分析得到的测量波形数据和事先确定的基准波形数据进行比较。接着，从该数据比较的结果评定该样本S内待评定部分的品质等等。

图8是一个流程图，示出利用图7中所示的样本评定设备的样本评定方法的一个例子。图8中示出的样本评定方法示意了一种方法，其中，在用充当一个可移动台的样本保持台2a在X-Y方向上移动样本S的同时，顺序地用来自激励光源1的激励光脉冲照射样本S上的各个部分，从而通过荧光计量术进行评定，正如为半导体晶片等的每个部分进行的品质评定那样。

在该样本评定方法中，首先实现供数据分析中的拟合计算使用的激励光时间波形(步骤S201)。这里，由于激励光的波长不同于要测量的荧光的波长，故把分光镜4(或波长选择滤光器)的选择波长区段切换到激励光波长并且予以设定。

如前面在图1的荧光测量设备中提到那样，可以在把替代样本S的不生成荧光的散射体固定在样本保持台2a上时进行测励光的测量。此刻，可以通过放在聚光系统3中的可变光衰减器33调整入射到光测器5上的激励光的量。

接着，在把分光镜4(或波长选择滤光器)的波长选择区段切换到荧光波长并且设定时，在样本保持台2a上固定一个要变成样本评定的基准的参照样本，并且测量该参照样本中的荧光时间波形(S202)。如果已经测量并准备好了该参照样本里的荧光时间波形，则可以不必进行参照样本的荧光计量而直接读出并使用该时间波形数据。

一旦获得该参照样本中的荧光时间波形，参照该时间波形设定拟合范围(S203)。在用来设定拟合范围的方法的一个具体例子中，在和控制器6连接的显示器7上展示该参照样本里的荧光时间波形，并且操作员通过操纵鼠标器光标等指示一拟合范围的初始点和终止点。根据如此指出的初始点和终止点，控制器6的范围设定单元63设定随后的实际荧光测量所使用的拟合范围。具体地，根据相对于荧光峰值处的荧光强度的强度百分比范围或者根据相对于荧光峰值的时间位置的时间范围，固定地设定相对于荧光时间波形的拟合范围。

接着，采用这样设定的拟合范围，对该参照样本里的荧光时间波形进行数据分析，该数据分析包括前述数据分析方法中的多次拟合计算，从而计算基准波形数据以及从中导出的荧光寿命和荧光强度(S204)。不过，若该荧光时间波形不偏移，对于计算该基准波形数据单次拟合计算就足够了。

一旦获得基准波形数据，把要评定的测量样本S放在充当可移动台的样本保持台2a上的预定位置处，并且开始借助荧光计量术的样本评定。

首先驱动样本保持台2a，从而移动测量样本S以便用来自激励光源1的激励光脉冲照射该测量样本S的某预定部分(S205)，并且在从激励光源1提供激励光脉冲的同时测量该测量样本S中的荧光时间波形(S206)。接着，在上述拟合范围内进行多次拟合计算，以对该得到的荧光时间波形进行数据分析，从而计算测量波形数据以及从中导出的荧光寿命和荧光强度(S207)。

接着，在样本评定单元64中，对为该测量样本S计算的测量波形数据和事先为该参照样本确定的基准波形数据进行比较，以评定该待评定的测量样本S的各个部分，从而判定品质是否合适等等(S208)。至于测量波形数据和基准波形数据之间的比较，可以彼此比较这些波形数据本身，或者可以利用荧光寿命值和荧光强度值彼此相比较。

在完成样本评定后，审查是否已经对需要评定的测量样本S的所有评定部分进行了荧光计量以及样本评定(S209)。如果所有部分都已进行过，则结束对该测量样本S的全部荧光计量和样本评定。如果存在尚未进行测量和评定的评定部分，则进一步移动该测量样本S(S205)，以便重复地进行测量、计算及评定(S206，S207，S208)。

这种样本评定设备实现一种即使荧光时间波形出现偏移仍可准确地和有效地评定样本的设备。特别地，在一种半导体晶片评定设备或类似物中，重复地对样本(半导体晶片)的各个部分执行多次荧光计量操作。当采用上述荧光测量设备时，在这种情况下同样可以使各次荧光计量操作之间出现的时间波形偏移造成的影响为最小。

也就是说，为了减小荧光时间波形中随着时间的偏移的影响，可以在所执行的多次荧光计量操作的每次之前测量激励光时间波形。如果这样每次都测量激励光，样本评定所需要的时间会变得更长。尤其是，为了更详细地评定半导体晶片等的品质，需要一种高分辨率、高处理率的自动评定，这使得在半导体晶片的整个表面上有相当大量的要评定的部分，从而增加了用于样本评定的测量时间。

与之相反，在上述样本评定设备中，即使当初始测量了激励光时间波形后只是对样本的各个部分重复地执行荧光计量，通过采用由多次拟合计算实现的数据分析，也可以使荧光计量期间发生的时间波形偏移所造成的影响为最小。从而，可以在短的时间内准确地和高效地完成对样本上各个部分的评定。尤其是，由于事先设定所需的状态，例如拟合范围、用来开始多次拟合计算的初始位置等等，可以自动地对测量样本S上的每个部分执行所有的荧光计量、数据分析和样本评定。

不受上述各实施例的限制，可以以各种方式修改依据本发明的荧光测量方法和设备。例如，最好根据待测量的样本S的类型、荧光的波长、激励光源1和光测器5之间的位置关系等使如图1所示的该设备配置中的聚光系统3、波长选择装置(分光镜4)等具有适当的配置。尽管在图1和图7中示出的实施例里驱动控制单元和数据处理单元设备在同一个控制器6中，但也可以把它们设置为分立的驱动控制器和数据处理器。

至于激励光和荧光的测量，可以在荧光计量后测量激励光，并且可以对每个相应的时间波形执行上述数据分析。尽管在图8的流程图中初始利用参照样本进行荧光计量，但也可以不使用参照样本，而从通过在测量样本里进行的初始荧光计量操作得到的荧光时间波形设定拟合范围等。

至于荧光和激励光的时间波形在时间轴上的排列和移动，可以采用各种各样的数据分析方法，而不必受前面所述的，把激励光时间波形排列在时间轴的固定时间位置上并在把荧光时间波形从初始位置移动到终止位置的同时执行拟合计算的方法的限制。

即，更一般地，在时间轴上排列激励光时间波形和荧光时间波形，以把该荧光时间波形的荧光峰值放在比大致和该激励光时间波形的激励光峰值重合的时间位置早或者晚一预定时间宽度的初始位置上，接着，相对于该时间轴把该荧光时间波形和拟合范围或者把该激励光时间波形从该初始位置朝该时间轴上的该荧光峰值和该激励光峰值大致重合的时间位置另一侧的终止位置移动，从而可以得到不论该荧光时间波形是否出现偏移都能准确地和有效地计算波形数据、各个物理量等的荧光测量方法和设备。

例如，在上面所述的实施例中，如图4A至4D中所示，把荧光时间波形F设置在比激励光峰值早的初始位置t1处(图4C)，并且接着在把该荧光时间波形F朝晚于该激励光峰值的终止位置t2(图4D)移动的同时执行各次拟合计算。另一种数据分析方法可以是这样的，荧光时间波形从位于比激励光峰值晚的时间位置处的初始位置，例如图4D中所示的初始位置移动到比激励光峰值早的终止位置。替代地，在相对于时间轴固定地排列荧光时间波形F的同时，可以以类似的方法把激励光时间波形E从初始位置移动到终止位置。

但是，为了简化数据分析过程，最好在把激励光时间波形E和荧光时间波形F之一设置在时间轴上的固定位置处的情况下，相对于该时间轴移动另一个波形。

同样，可以类似地以各种方式修改样本评定设备。例如，在图8中示出的流程图中，如果当测量荧光时间波形(S206)时在样本中荧光减弱，则可跳过数据分析(S207)和样本评定(S208)。

尽管作为例子把半导体晶片的品质评定作为要评定的样本予以了解释，本发明同样可以使用其它各种各样的样本。例如已经把用微滴液盘等作为药物研制过程中的样本情况下的荧光寿命测量、时间分辨荧光各向异性测量等当作是掩膜筛选、药物筛选等中的有效评定手段。和半导体晶片中一样，在这样的情况下需要高生产率的自动评定，从而采用图7的样本评定设备、图8的流程图等能实现有效的样本评定。

依据本发明的荧光测量方法和设备以及使用它们的样本评定设备能够用作为无论是否在荧光时间波形中出现偏移都可以足够精度计算波形数据和物理量如荧光寿命的荧光测量方法和设备，以及使用它们的样本评定设备。

即，相对于供用来确定荧光寿命等的数据分析所使用的时间轴，把激励光和荧光的时间波形排列在它们的预定时间位置上，并且在把荧光时间波形和拟合范围或者把激励光时间波形从其上荧光峰值比激励光峰值早或晚预定时间宽度的初始位置朝相反一侧的终止位置移动的同时执行多次拟合计算。接着，从这样确定的多个波形数据项中，根据一选择准则，例如通过拟合计算得到的χ²值选择一个最佳的测量波形数据。这使得无论是否在荧光时间波形中出现偏移都能以足够精确度有效地计算波形数据以及诸如荧光寿命等物理量。

这种荧光测量设备和样本评定设备可以大大缩短测量及评定所需要的时间，尤其当在半导体晶片品质评定、药物研制中的筛选等中进行多次荧光计量操作时。另外，由于测量和评定变得如此有效，预期在除半导体晶片评定和药物研制中的筛选之外的大范围的样本评定中的应用变成可能。

Claims (13)

1.一种荧光测量方法，包括：

用脉冲式激励光照射样本的激励步骤；

检测从用所述激励光激励的所述样本释放的荧光的光检测步骤；以及

数据处理步骤，其对一个通过所述光检测步骤检测到的荧光时间波形进行数据分析，该数据分析包括在为所述荧光时间波形固定地设置的充当预定时间范围的拟合范围中的拟合计算，从而计算出波形数据；

其中，在所述数据处理步骤中，

在供所述拟合计算使用的时间轴上排列一个事先确定的激励光时间波形以及所述荧光时间波形，以把所述荧光时间波形的荧光峰值放在比和所述激励光时间波形的激励光峰值大致重合的时间位置早或者晚一预定时间宽度的初始位置上，并且

接着，在相对于所述时间轴把所述荧光时间波形和拟合范围或者把所述激励光时间波形从所述初始位置向所述时间轴上的位于所述荧光峰值和所述激励光峰值大致重合的所述时间位置的另一侧的终止位置移动的同时，在多个彼此不同的时间位置上参照所述激励光时间波形分别进行拟合计算，以及

把一个根据预定的选择准则从多个在各所述拟合计算中分别算出的波形数据项中选出的波形数据项用作为最终测量波形数据。

2.依据权利要求1的荧光测量方法，其中，在所述数据处理步骤中，把所述激励光时间波形和所述荧光时间波形之一排列在所述时间轴上的一个固定时间位置处，并且相对于所述时间轴移动另一个时间波形。

3.依据权利要求1的荧光测量方法，其中，在所述数据处理步骤中，根据所述测量波形数据确定荧光寿命。

4.依据权利要求1的荧光测量方法，其中，在所述数据处理步骤中，将所述各拟合计算中相应确定的χ²值充当所述选择准则，并且把在产生最小χ²值的所述拟合计算中算出的所述波形数据选择为所述测量波形数据。

5.依据权利要求1的荧光测量方法，其中，在所述数据处理步骤中，一个参照所述荧光时间波形的所述荧光峰值设定的时间范围充当所述拟合范围。

6.依据权利要求1的荧光测量方法，还包括在所述激励步骤之前的设定所述拟合范围的范围设定步骤。

7.一种荧光测量设备，包括：

激励装置，用于以脉冲式激励光照射样本；

光检测装置，用于检测从用所述激励光激励的所述样本释放的荧光；以及

数据处理装置，用于对一个由所述光检测装置检测到的荧光时间波形进行数据分析，该数据分析包括在为所述荧光时间波形固定地设置的充当预定时间范围的拟合范围中的拟合计算，从而计算出波形数据；

其中所述数据处理装置在供所述拟合计算使用的时间轴上排列一个事先确定的激励光时间波形以及所述荧光时间波形，以把所述荧光时间波形的荧光峰值放在比和所述激励光时间波形的激励光峰值大致重合的时间位置早或者晚一预定时间宽度的初始位置，并且

接着，在相对于所述时间轴把所述荧光时间波形和拟合范围或者把所述激励光时间波形从所述初始位置向所述时间轴上的位于所述荧光峰值和所述激励光峰值大致重合的所述时间位置的另一侧的终止位置移动的同时，在多个彼此不同的时间位置上参照所述激励光时间波形分别进行拟合计算，以及

把一个根据预定的选择准则从多个在各所述拟合计算中分别算出的波形数据项中选出的波形数据项作为最终测量波形数据。

8.依据权利要求7的荧光测量设备，其中所述数据处理装置把所述激励光时间波形和所述荧光时间波形之一排列在所述时间轴上的一个固定时间位置处，并且相对于所述时间轴移动另一个时间波形。

9.依据权利要求7的荧光测量设备，其中所述数据处理装置根据所述测量波形数据确定荧光寿命。

10.依据权利要求7的荧光测量设备，其中所述数据处理装置把各所述拟合计算中相应确定的χ²值用作为所述选择准则，并且把产生最小χ²值的所述拟合计算中算出的所述波形数据选择为所述测量波形数据。

11.依据权利要求7的荧光测量设备，其中所述数据处理装置把一个参照所述荧光时间波形的所述荧光峰值设定的时间范围用作为所述拟合范围。

12.依据权利要求7的荧光测量设备，还包括用于事先设定所述拟合范围的范围设定装置。

13.一种样本评定设备，包括：

依据权利要求7的荧光测量设备；以及

样本评定装置，用于通过比较从所述荧光测量设备的所述数据处理装置中得到的所述测量波形数据和事先确定的基准波形数据来评定所述样本。

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