SE533680C2 - Metod och anordning för detektering av läkemedel i ett prov - Google Patents

Description

533 B80 2 är utveckling av alternativa metoder önskvärda, för att bestämning av en mängd eller koncentration av till exempel warfarin som finns i en patients blod, vilka helst skall vara mer robusta och mer känsliga. i i Det skall observeras att andra tekniker har föreslagits har för mätning .av proteinbindning, vilka inkluderar dialys, ultrafiltrering, cirkulär dikroism och yttre fluorescens. I Sammanfattning ' Mot bakgrund av föregående är ett syfte med uppfinningen att tillhandahålla en förbättring av ovan nämnd känd teknik. Mer specifikt är ett syfte att tillhandahålla en metod och anordning för effektiv detektering för en mängd vitamin K-motverkande antikoagulant såsom warfarin som finns i en patient., Således tillhandahålls en metod fór mätning av en- vitamin K- I motverkande antikoagulant som finns i ett prov, varvid metoden innefattar: belysning av provet med ljus från en ljuskälla för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid excitationen av provet resulterar i en _» fluorescensemission från provet; mätning av fluorescensemission från provet; bestämning av en fluorescenslivstid för fluorescensemission provet; i bestämning av enøintensitet (amplitud) fór fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden; och bestämning av en mängd av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten av den fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden.

Fluorescenslivstiden och intensiteten beskriven ovan kan häniörasitíll som en första fluorescenslivstid och en första intensitet, i vilket fall metoden kan innefatta; bestämning av i) en andra eller ii) en andra och en' tredje fluorescenslivstid för provets fluorescensemission; bestämning av intensiteter för fluorescensemission vid respektive fluorescenslivstid; och bestämning av mängden antikoagulant, som en funktion av intensiteterna för fluorescensemissionen vid respektive fluorescenslivstider. V Bestämning av en mängd warfarin innefattar också möjlighetenatt bestämma en koncentration av warfarin, eftersom ett koncentrationsvårde -år associerat med ett mängdvärde. Således kan en ”mängd” tolkas som en ”koncentration” och vice versa, så länge koncentrationsvärdet kan bestämmas genom att använda mängdvärdet i kombination med ett volyrnvärde för provet.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls en anordning för mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som finns i ett prov, varvid 533 BBQ 3 anordningen innefattar: en ljuskålla anordnad för att belysa-provet med ljus för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid excitationen av provet resulterar i en fluorescerande ernission av provet; mätningsorgan anordnade att mäta fluorescensemissionen från provet; och åtminstone en processor anordnad att i) bestämma en fluorescenslivstid för provets fluorescensemission, ii) bestämma en intensitet för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden, och iii) bestämma en mängd av antikoagulanten, som en funktion av fluorescensïemissionens* intensitet vid fluorescenslivstiden.

Den uppfmningsenliga apparaten kan innefatta organ för vara konfigurerad att utföra vilket som helst av sârdragen beskrivna ovan och nedanför i samband med den uppfinningsenliga metoden, och har motsvarande fördelar§ I synnerhet kan enandra eller en andra och en tredje fluoresöenslivstid med associerade intensiteter bestämmas och användas fór att estirnera mängden.

Kortfattat medger den fluorufora egenskapen för warfarins coumarin- I ringstruktur (de Melo et al., J Phys. Chem. 1994, 98, 6054-6058) tidsupplöst" fluorescensspektroskopisk detektion av detta läkemedel. » Senare .forskning (Karlsson et al., J. Phys. Chem. B_2007, lll, '10520- 10528) som använder sig av en serie av teoretiska och spektroskopiska studier som belyser warfarins komplexa karaktär, och i synnerhet dess mediumberoende~ isomering, kan illustrera varför till exempel spektroskopibaserade metoder för direkt bestämning av warfarin inte funnits tillhands.

Utredandet av förhållandet mellan molekylär miljö, isomerisk fördelning och de spektroskopiska särdragen för warfarin har oväntat tillhandahållit en grund för utveckling av warfarindetekterings- och kvantifieringsmetoder, vilka kan _ särskilja warfarin i olika tillstånd, till exempel bundet till protein eller fri i plasma.

Såsom angett tillhandahåller uppfinningen tidsupplöst i fluorescensspektroskopisk detektering och kvantifiering av warfarin som är bundet till protein eller fri i plasma. I detalj främjar detta en ny och alternativ metod för effektiv och direkt övervakning av warfarins effekt på blodkoagulering. I Kort beskrivning av ritninøarna Utfórningsfonner av uppfinningen beskrivs härefter, genom exempel, med hänvisning till de bifogade schematiska ritningar-na, ivilka fig. 1 visar en anordning enligt uppfinningen för detektering av en vitamin K-motverkande antikoagulant, 533 680 4 fig. 2 visar användarutrustning som inkorporeraranordningen ijfig. 1, fig. 3 visar ett flödesschema för mät- och analysmetod enligt en utföringsform av uppfinningen, och tig. 4 visar en mängd warfarin vid olika fluorescenslivstider och intensitetsvärden.

Detaljerad beskrivning av föredragna utföringsfonner Med hänvisning till fig. 1 har en anordning 102 fór detektering av vitamin K-motverkande antikoagulant en behållare 118 som innehåller ett prov 116 som skall analyseras för förekomsten av ett läkemedel såsom warfarin eller något annat derivat av coumarin.

I En excitationsljusskälla 114 för att återupprepat belysa provet 116 med pulser av excitationsljus tillhandahålls. Ljuskällan 114 är företrädesvis en pulslaser men kan också vara en ljusemitterande diod (LED). En driv- och kontrollenhet 1 12 för ljuskällan innefattar en kraftkälla fór lasern: och är anordnad för att generera en startsigrial 1 10 till en fotontidtagningsenhet 124. Repetitionshastigheten för det exciterande ljusefär tillräckligt låg för att medge påtaglig försvagning av fluorescensen för provet 116 före nästa excitationspuls. En pulsfrekvens av till exempel runt 1 MHz kan vanligtvis vara lärnplig. Varaktigheten av pulsen för excitationsljuset ska vara väsentligt kortare än fluorescenslivstíden för fluoreforen (dvs. läkemedlet) för att få tillförlitliga livstidsmätningar.

En typisk fluorofor har en fluorescenslivstid inom-området 0,02'-20 ns och en lämplig längd av ljuspulsen kan vara i storleken 0,001 ins. Pulsfrekvensen är ett exempel på en parameter som vanligtvis justeras för provet som undersöks. I tillägg underlättar ljuskällan 114 och driv- och kontrollenheten 112 för ljuskällan justering av andra parametrar såsom antalet pulser och intensiteten för excitationsljuset för att ta hänsyn till tillexempel mängden fluorofor i provet, erforderlig måtnoggrannhet för resultatet etc.. Ljuskällor, såsom pulslasrar eller ljusemitterande dioder med ovan beskrivna särdrag och med tillhörande driv- och kontrollenheter är kända inom teknikområdet och är kommersiellt tillgängliga.

Positionerad angränsande behållaren l 18 som innehåller provet 1 16 är en fotodetektor 120 vilken har som syfte att detektera de emitterade fluorescenta fotonerna. Olika optiska komponenter är placerade mellan provet 118 ochidetektorn 120. Till exempel används flera linser för att maximera mängden fluorescerande ljus som samlas från provet 118 och för att fokusera ljuset på detektorn 120; Vidare 533 B80 5 kan dikroiska speglar och filter användas för att välja ett vàglångclsområde för att förhindra excitationsljuset från att nå detektorn 120, så att enbart ljus som har ett våglängdsområde som motsvarar fluorescensspektrat för fluoreforen når detektorn 120.

En optisk komponent kan också användas för att dela upp det fluorescerande ljusets ljusstråle i flera ljusstrålar som sedan riktas mot olika detektorer. Denna stråluppdelning kan uppnås på olika sätt, till exempel genom att använda en stråldelningskub eller genom att använda flergrenad fiberoptik. »Sådana komponenter är välkända inom teknikområdet och år kommersiellt tillgängliga på marknaden.

Fotodetektom 120 innefattar ett fotonräknande fotomultiplikatorrör (PMT) men andra detektorer såsom en lavinfotodiod kan användas. Signalen från fotodetektorn l20 år vanligtvis förstärkt i en för-förstärkare 122. Efter förstärkning kan signalen gå igenom en diskriminatorenhet som tar bort oönskat brus fiån signalen och som enbart behåller de elektriska pulser som genereras av fotonema på PMTn. Diskriminatorenheten år sedan kopplad till en fotorrtidsrälmirxgsenhet 124.

Fotontidsräkningsenheten 124 innefattar en snabb analog-till-digital- omvandlare (A /D-omvandlare) och ett minne för att lagra datapunkter. Såsom nämnt ovan är det möjligt för mer än en foton per excitation, vilka resulterar från excitationsljuspulsen, att registreras av fotodetektorn 120 oeh-fotontidsberälmmgs- enheten 124. En foton som detekteras av PMT:n kommer att ge en out-put-puls och för att identifiera en PMT-pulsposition i tiden insamlas ett lämpligt antal (såsom 6.- 10) datapunkter per puls.

De insamlade datapunkterna analyseras medelst en modul 126 för bestämning av ankomsttid vilken realiseras som en mjukvaruprogramsmo-dul 'som tillhör antingen fotontidsberäkningsenheten 124 eller alternativt en externidator 130, för att bestämma fluorescensfotonernas ankomsttid. Exempel på lämpliga algoritmer för ankomsttidsberäkriing är kända inom teknikområdet och implementeras i befmtliga utrustningar.

En analysmodul 132 är anordnad att motta och analysera en uppsättning fotonankomsttider från modulen 126 fór bestämriing av ankomsttid.

Denna modul 132 är företrädesvis en mjukvarumodul 13 1 som är implementerad i och som exekveras på datorn 130. Datorn 130 år en mikroprocessor med en associerad minnesanordning (ej visad) men kan vara en konventionell PC. 533 B30 6 Mikroprocessom 130 är utrustad med kommunikationsorgan (ej visade) som är kopplade till andra enheter i systemet 102. i i Installerad i och exekverad i mikroprocessorn 130' finns också en mjukvamprogrammodul 133 för mätstyrning. Såsom fackmannen inser kan installation och exekvering av mjukvarumodulema 126, 132 och 133 i sig utföras på olika sätt och i olika datorkonfigurationer. Till exempel kan mätkontrollenheten exekveras i en PC lärnpad för laboratorieförhållande, modulen 126 för bestämning av ankomsttid kan byggas in i fotontidstagningsenheten, och analysmodulen 132 i en specialmaskin 'konstruerad för de höga beräkningshastigheïter som behövs för viss analys. V _ Fotodetektorn 120, för-förstärkaren 122 och fotontidstagriingsenheten 124 kan i kombination ses som måtorgan anordnade att mäta i fluorescensemissionen från provet 116, medan datorn 130 kan vara processorn som exekverar mjukvara som irnplementerar nedan beskrivna", metod.

Anordningen 102 är emellertid företrädesvis inbyggd i en liten bärbar enhet 202 såsom illustrerad i fig. 2. Denna enhet 202 har en LCD-display 204 för användarinteraktion och kontrollkriappar 206, 208 för kontroll av apparaten via kommandon såsom ”på/ av", ”utför mätning” etc.. En behållare 210 är anordnad på apparatens 202 framsida fór att motta provet, och återstående komponenter i - apparaten i ñg. 1 är anordnade inuti den bärbara apparaten202. Företrädesvis drivs apparaten 202 med hjälp av ett internt batteri men en adapterenhet kan likaväl användas. I Såsom kommer att beskrivas nedan bestäms ganska specifika vården för fluorescenslivstider och associerade intensitetsvården då warfarin år läkemedlet som skall detekteras, vilket gör att komponenterna i anordningen 102 kan_ optimeras och således göra mindre när de används i apparaten 202.

Med hänvisning till fig. 3 beskrivs metoden som utförs i anordningen, vilken utför steg för mätning av vitamin K-motverkande antikoagulant såsom 'v warfarin som finns i provet 1 16. i Metoden kan implementeras i form av mjukvaruinstruktioner, dvs. ett datorprogram för att utföra de häri beskrivna metoderna för enklare utveckling skrivas på ett högnivåspråk såsom Java, C och/ eller C++ men också på andra programspråk såsom, men en begränsat till, tolkade språk. En del moduler och rutiner kan skrivas i assembly eller i mikrokod för att förbättra prestanda och/ eller minnesanvåndning. Det uppskattas vidare att funktionaliteten fór en ellersamtliga 533 GBG 7 av de fimktionella stegen i metoden kan också implementeras genom att använda diskreta hårdvarukomponenter, eller en eller flera applikationsspecifika, integrerade kretsar, eller en programmerad digital signalprocessor eller mikroprocessor.

I metoden belyses 304 först provet 116 med ljus från ljuskällan 114 vilket exciterar antikoagulanten genom antikoagulantens ljusabsorbtion.

Excitationen av provet 1 16 resulterar i en fluorescensemission från provet 11,6, och denna fluorescensemission mäts 306. Härnâst bestäms 308 en fluorescenslivstid T; för fluorescensemissionen, och efter detta bestäms 3 10 en intensitet A1 fór ' fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden Ti. Slutligen bestäms 312 en mängd eller en koncentration c av antikoagulanten som en funktion av intensiteten A1 vid fluorescenslivstiden Ti.

En andra fluorescenslivstid T; för fluorescensemissionen från provet 116 kan bestämmas 3_08b, vilket kan göras samtidigt som bestärnningen av den första fluorescenslivstiden Ti. En intensitet A; för fluorescensemissionen vid den 'andra fluorescenslivstiden T; bestäms också 3 lOb (vid samma tid och på samma sätt som bestårnningen av den första intensiteten A1). I detta fall, när mängden c av _ antikoagulanten bestäms, bestäms 3 12b mängden också som en funktion av den andra intensiteten A; vid den andra fluorescenslivstiden T; genom att använda värdena för T; och A; på. ett liknande sätt som för T; och A1. 'jGenom att ta med intensiteten för den andra fluorescenslivstiden i beräkningen är det möjligt att göra en mer ”noggran” bestämning av mängden warfarin, eftersom olika tillstånd (tex. I obunden warfarin eller warfarin bundet till någon protein) för warfarin visar sig ha olika fluorescenslivstíder. i För samma syfte kan en tredje fluorescenslivstid Tspch en tredje intensitet A3 vid den tredje fluorescenslivstiden T; bestämmasoch användas på ett liknande sätt. Detta i kombination med den andra livstiden T; och intensiteten A;, är särskilt relevant om warfarins bindning till HSA skall tas med i beräkningen vid bestämning av det bästa (unika) terapeutiska fönstret för olika individer.

Relevansen för olika livstider och intensiteter har påvisats vid tester med hjälp av tidsupplöst fluorescensspektroskopiska mätningar vilka warfarins bindning till HSA i PBS (fosfastbuffrad saltlösning) buffert undersöktes. v Under dessa tester kunde det observeras att excitation vid 334 nm ger information om interaktionen för en avprotoniserad (eng: deprotonated) form av warfarin och HSA med tre tydligt urskiljbara fluorescenslivstider med T1 < lOO ps, T;~ 1- 1,5 ns och Tàß3-4 ns. Vid excitation vid 334 nm, samtidigt som HSA inte I 533 B80 8 exciteras, bidrar den avprotonerade formen av warfarin till den observerade emmisionen. isolerad warfarin i PBS gav en icke-upplöst livstid i exciterat tillstånd, dvs. TlslOO ps. Från dessa experiment observerades det att den kortaste fluorescenslivstiden som uppmättes (T1) uppkom från den fria, obundna delen av' warfarin lösningen, vilken var tillgänglig fór huvuddelen av lösningen, medan »de två längre livstiderna (Tg, Ta) uppkom, från till HSAv-bundna tillstånd. Således har det kunnat påvisats att användning av olika livstider förbättrar noggrannheten vid bestämning av lämplig warfarindosering för varje patient. i Bestärnningen av mängden c kan innefatta jämförelse av intensiteten A1, A2, A3 för åtminstone någon fluorescenslivstid Tl, Tg, Ta med ett känt intensitetvärde Aten, Aten, Ana associerat med ett bestämt (känd) mängdvârde cfef. På ett liknande sätt kan bestämningen av c innefatta jämförelse av åtminstone en fluorescenslivstid T1, Tg, T; med en känd fluorescenslivstid Tran, Tran, Tmß associerat med ett bestämt mängdvärde cmf. w Denna jämförande operation illustreras ytterligare av diagrammet ifig. 4 där x-axeln representerar den totala mängden warfarin (vilken hänför sig till I mängden warfarin) som finns i ett prov av rnänniskoblod (vilket väsentligen motsvarar mängden som finns i en PBS-buffer), och y-axeln representerar det uppmätta intensitetsvärdena (Ann, Anm, Amra) som ett procenuttal av den totala mängden warfarin (cmf), dvs. summan av Ann, Amy, och Amf; är 100 % eller 1,00. ' Eftersom varje intensitet (amplitud) är förknippad med en relativt konstant fluorescenslivstid (Tfefi, Tfefz, Tnß) är det möjligt :att bestämma hur mycket warfarin som är bundet till protein och hur mycket som inte är det.

Såsom indikerat motsvarar intensitetsvärdena och fluorescenslivstiderna i fig. 4 referensvärdena Ann, Anm, Ang; och Tnfl, Tmfg, Tres och genom att känna till A1, A2, A3 och T1, Tz, T; och genom att jämföra dessa vården med referensvärdena så kan mängden warfarin utläsas från diagrammet. i För att förbättra jämförelsen kan bestämningen av mängden c innefatta användning av regressionsanalys fór anpassning av åtminstone ett (men . företrädesvis samtliga) intensitetsvârde A1, A2, A3 fór en fluorescenslivstid T1, Tg, T; med ett känt intensitetsvärde Ann, Ang, Afeß associerat med ett bestämt I mängdvärde cnf. Det samma gäller för fluorescenslivstiden T1, Tg, Ta, dvs. bestänmingen av mängden c kan innefatta användning av regressionsanalys fór anpassning av åtminstone en fluorescenslivstid T1, T2, TS meden känd - fluorescenslivstid Tran, Tree, Tree associerad med ett bestämt mängdvârde caf. 533 B80 9 Användning av regressionsanalys av detta sätt är ett exempel på att använda korrelation mellan fluorescenslivstiderna T1, T2, Ta och kända fluorescenslivstider Tran, Tran, Tran associerade med ett bestämt mängdvärde cmf, och andra metoder kan likaväl användas. _ Metoden kan också innefatta beräkning av en sannolikhetsfördelning vid bestämningen 3 IQ av ett íntensitetsvärde A1, A2, A3 för fluorescensernissionen vid fluorescenslivstiden Ti, Te, Ta. För detta syfte samt för utföring av ovannämnda regressionsanalys kan det allmänt tillgängliga GNU Scientific Library användas.

Såsom indikerat innefattar mätningen av fluorescensemissionen från provet utförande av tidsupplösta fluorescensspektroskopiska mätningar. Ljuset från ljuskällan som används har en väsentligen konstant våglängd, och har mer specifikt en våglängd som är lämplig för excitering av warfarin-, såsom en våglängd mellan 305 nm till 350 nm, eller mer specifikt 334 nm. För att förbättra resultatet kan provet 116 röras runt när mätningarna för fluorescensemissionen utförs, vilket betyder att behållaren innefattar omrörningsorgan.

För att illustrera ett numeriskt exempel som använder diagrammeti fig. 4, kan ett blodprov från en patient typiskt uppvisa en förstafluorescenslivstid -T1 med ett uppmätt intensitetsvärde Am av 0,51. I detta fall, såsom de streckade linjema indikerar i fig. 4, är den uppmätta mängden warfarin cm då 6,25 uM.

Således jämförs den uppmätta intensiteten för den första fluorescenslivstiden med kända intensitetsvärden (värdena på y-axeln i fig. 4) som är associerade med ett bestämt warfarinmångdvärde (värdena på x-axeln i fig. _4).

Eftersom en lämplig kurva (den för den första fluorescenslivstiden) används, inkluderar bestärrmingen av mängden också jämförelse av fluorescenslivstiden med en känd fluorescenslivstid (dvs. med en av kurvorna i diagrammet i fig. 4) som är associerad med ett bestämt warfarinmängdvärde. i Även om de numeriska exemplen diskuterar den första fluorescenslivstiden så gäller samma sak fór den andra och tredje fiuorescenslivstiden. Naturligtvis, för att förbättra resultatet kan olika statistiska metoder användas för att vikta de uppmätta värdena A1, A2, As för att förbättra resultatet, tex. de på grund av varierande mätnoggrarmhet ger något olika mângdvärden.

Om en koncentration ska bestämmas från mängden warfarin så divideras mängden warfarin med volymen av provet för vilken mängden bestämdes. 533 B80 10 Vidare kan fördelningen av A1, A2, A3 användas för att analysera warfarinets tillstånd (obundet eller en typ av bunden warfarin). i Mängden warfarin kan också användas för att bestämma en koagulationstid för blodet. Koagulationstid år emellertid ofta individuell för patienten från vilken provet togs, och för att korrelera koagulationstiden med ett mängd / koncentrationsvärde för warfarin kan empiriska metoder användas, dvs. en uppsättning koagulationstider bestäms fór en uppsättning blodprov som har' olika mängd / koncentrationsvärden för warfarin. När korrelationen väl är utförd så är kunskap om warfarínets mängd / koncentrationsvärde tillräckligt för att bestämma om läkemedlet är inom sitt terapeutiska fönster.

Exempel _ Vid genereringen av datan (se fig. 4) som är nödvändig för att bestämma mängden i ett godtyckligt prov så som beskrivits ovan, användes en experimentell version av anordningen i fig. 1 för mänskligt blod buffrat med en fostfatbuffrad saltlösning (PBS). 'Det skall noteras att även om en bufferlösning användes, så., erhålls väsentligen samma resultat för blod som fås direkt från en människa. I vilket fall fungerar den experimentella apparatversionen på samma sätt som! apparaten 102 ifig. 1.

I den experimentella apparatversionen utfördes tidsupplöst fluorescensspektroskopiska mätningar i ett tidskorrelerat system för mätning av enskilda fotoner (TCSPC), IBH 5000M (Jobin Yvon IBH Ltd., Glasgow, UK).“ Fluorescenslivstidema (sönderfallstiderna) Ti med associerade amplituder Ai ~ bestämdes genom att använda en ljusemitterande diod, NanoLED- 17 (HORIBA Jobin Yvon IBH) som alstrade 334 nm (bindningsexperiment fór warfarin-mänsklig blodplasma i PBS) och excitationspulser vid 1,0 MHz upprepningshastigheter. En monokromator med singel-gitter (modell SOOOM IBH] med en 'spektral bandbredd inställd på 32 nm användes. Datan samlades in i 4048 kanaler och _ tidskalibreringen var 13,4 ps/ kanal. Fluorescensemissionenidetekterades med en IBH TBS-04 fotondetekteringsrnodul vid TCSPQ-förhållanden, och den fulla bredden vid halvt maximum (fwhm) för den instrumentala responsfunktíonen var typiskt runt 560 ps, vilken mättes med en upphängning (eng: suspension) av kiselpartildar (Ludox TMA-34 Sigma-Aldrich) upplösta i avjoniserat vatten: i Alla experiment utfördes genom att mäta kinetiken, huvudsakligen vid 390 nm (bindningsexperiment för warfarin-mänskligt blodplasma i PBS) vid en 533 B80 11 vinkel av 90° i förhållande till excitationsljuset. Tidsupplöst fluorescensdata analyserades genom användning av IBH DAS6 mjukvara för sönderfallsanalys, vilken fungerar baserat på algoritmer för minsta kvadratanpassning och rekonvultion med-experimentell svarsfunktion. Tre sönderfallstider behövdes generellt för att erhålla tillfredställande resultat, dvs. X2 s 1,2.

Anpassningsresultaten från tids-(Ü-beroendet presenterades som amplituder (Ai) och sönderfallstider (Ti) i förhållande till ekvationen (2): I t t Fu) = A0 + Ale? + Azeï + Aß-Ü; i Nyligen frusen plasma erhölls och initialt samlades mänskligt blod i rör med additiv av citrat. I ett andra steg separerades plasma genom centrifugeríng vid 3000-3500xg vid rumstemperatur i 20 min ochilagrades slutligen vid -80°C. _ Bufferlösningen som användes var fostatbuffrad saltlösning (PBS) bestående av 0,5 M N a2HPO4 (Scharlau)/ KH2PO4 (Merck) och 0,1 M NaC1 vid pfí 7,3.

Samtliga fluorescensspektroskopiska mätningar utfördes typiskt under kontinuerlig omrörning genom att använda en standard kvarts-cuvett (1 cm strålgång, total volym 3 ml) vid rumstemperatur. Före fluorescensexperimenten, vilka studerade bindningen av warfarin till blodserumplasmaproteiner, tinades prov av nyligen frusen plasma till 37°C och alikvoter (600 pl) blandades såsom 'ses i tabellen nedan med olika mängder inom det terapeutiska fönstret för läkemedlet [0,1 - 14 pM) warfarin i PBS (total volym 2 ml, inkuberingstiden 10 min).

Data erhållen från experimenten visas i tabell 1 nedan.

Livstider (ns) -Ampnma (%) _ lWarfarin) uM n 12 1:3 A1 A2 A3 X2 PLAsMA o 0.07 1.9 8.4 87 7 6 1.04 (14mg/mL) 0.5 0.07 1.8 7.8 84 11 6 1.09 10 0.15 1.5 4.3 44 43 14 11.18 Hsmoßs ing/mi.) 10 0.22 1.3 3.7 25 45 29- 0.82 Tabell 1 533 580 12 Även om olika utföringsforzner av uppfinningen beskrivits och visats så är uppfinningen inte begränsad till dessa utan kan också utformas på andra sätt genom ramen för det som anges i följande krav. I synnerhet uppfinningen' implementeras genom att använda andra tekniker för att excitera ett prov. Till exempel kan skinnet eller ögat på en patient belysas varefter" fluorescensemissionen från ett läkemedel i skinnet/ ögat sedan mäts. Efterföljande steg år sedan liknande med tekniken som används nå: provet och blod eller någon annan kroppsvåtska, men som angivet, ,màste”provet” inte nödvändigtvis avlägsnas eller tas från en - patient.

Claims (12)

533 E80 13 PATENTKRAV

1. Metod för mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som fmns i ett prov (1 16), varvid metoden innefattar: belysning (304) av provet (1 16) med ljus från en ljuskälla (114) för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid excitationen av provet (116) resulterar i fluorescensemission från provet (116)), i mätning (306) av fluorescensemissionen från provet (1 16) , bestämning (308) av en fluorescenslivstid (T1) för fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (3 10) av en intensitet (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (T1), och _ bestämning (3 12) av en mängd (c) av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (T1). i

2. Metod enligt krav 1, vidare innefattande stegen: bestämning (308b) av en andra fluorescenslivstid (Tg) för fluorescensemissionen från provet (1 16) , bestämning (310b) av en intensitet (A2) för fluorescensemissionen vid den ' andra fluorescenslivstiden (Tg), och bestämning (3 12b) av mängden (c) antikoagulant, som en funktion av . intensiteten (A2) fór fluorescensemissionen vid den andra fluorescenslivstidene (Tz).

3. Metod enligt krav 2, vidare innefattande stegen: I bestämning (308c) av en tredje fluorescenslivstid (Tg) för fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (3 100) av en intensitet (A3) fór fluorescensemissionen vid den tredje fluorescenslivstiden (Tg), och bestämning (312c) av mängden (c) antikoagulant, som en funktion av intensiteten (Pa) för fluorescensemissionen vid den tredje fluorescenslivstiden. (Tg).

4. Metod enligt något av kraven 1-3, varvid bestâmningen (312) 'av ' mängden (c) innefattar jämförelse av intensiteten (A1; A2; A3) för åtminstone en fluorescenslivstid (T1; Tg; T3) med ett känt intensitetsvärde (Amfig Amf-g; Afeß) associerat med ett bestämt mängdvärde (cfef). _

5. 4. Metod enligt något av kraven 1-4, varvid bestâmningen (312) av mängden (c) innefattar jämförelse av åtminstone en fluorescenslivstid (T1; Tg; Ta) 533 B80 14 med en känd fluorescenslivstid (Tnm Tree; Tfefa) associerad med ett bestämt mängdvårde (cnf). i

6. Metod enligt något av kraven 1-5, varvid bestämningen (312) av mängden (c) innefattar användning av regressionsanalys för anpassning av åtminstone ett intensitetsvârde (A1; A2; A3) för en fluorescenslivstid (T1; T2; Ta.) imed ett känt intensitetsvärde (Ann: Art-n; Aras) associerat med ett bestämt mângdvärde (Cmf). _ 4

7. Metod enligt något av kraven 1-6, varvid bestämningen (312) av mängden (c) innefattar användning av korrelation mellan åtminstone en i fluorescenslivstid (T1; T2; T3) och åtminstone en känd fluorescenslivstid (T,ef1; Trem; Tmfg) associerad med ett bestämt mängdvärde (om). i

8. Metod enligt något av kraven 1-7, varvid mätningen (306) av fluorescensemissionen från provet (116) innefattar utförande av tidsupplösta fluorescensspektroskopiska mätningar.

9. Metod enligt något av kraven 1-8, varvid den vitamin K-motverkande antikoagulanten är ett syntetiskt derivat av coumarin.

10. Metod enligt något av kraven 1-9, varvid den vitamin K-motverkande antikoagulanten warfarin. I ,

11. 1 l. Metod enligt något av kraven 1-10, varvid provet består av mänskligt prov. V g

12. Anordning fór mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som finns i ett prov (116), varvid anordningen innefattar: _ en ljuskålla (114) anordnad att belysa (304) provet (_ 1 16) med ljus för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid exciteringen av provet (l 16) resulterar i en fluorescensemission från provet (1 16), mätorgan (120, 122, 124) anordnade att mäta fluorescensemissionfrån provet (116), och åtminstone en processor (130) anordnad att - bestämma en fluorescenslivstid (Tl) för fluoresceïnsernissionen från provet (1 16) - bestämma en intensitet (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (T1), och - bestämma en mängd (c) av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten (A 1) för fluorescensemissionen vidffluorescenslivstiden (T1).