CN1424320A

CN1424320A - 雪胆素类衍生物及其制备方法和作为抗菌剂的应用

Info

Publication number: CN1424320A
Application number: CN 02134164
Authority: CN
Inventors: 邱明华; 宝福凯; 高娟; 聂瑞麟
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2002-11-21
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2003-06-18
Anticipated expiration: 2022-11-21
Also published as: CN1202119C

Abstract

本发明的提供一种与现有技术不同的雪胆素衍生物，其制备方法，以该化合物为有效成分的抗菌剂。

Description

雪胆素类衍生物及其制备方法和作为抗菌剂的应用

技术领域：本发明涉及雪胆素衍生物，其制备方法，以该化合物为有效成分的抗菌剂。

技术背景：现有技术中未对雪胆素的衍生物和类似物的活性和结构进行深入研究，迄今没有从葫芦科雪胆属植物中雪胆素类四环三萜类物质在抗菌抗炎的活性及应用方面的报告。

发明内容：本发明的目的在于提供一种与现有技术不同的雪胆素衍生物，其制备方法，以该化合物为有效成分的抗菌剂。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

如结构式(I)所示的雪胆甲素异构体化合物，

R₁＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8；Glc，Xyl，Ar

R₂＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₃＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₄＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₅＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

本发明同时提供了式(I)雪胆素类衍生物的制备方法，不涉及化合物的全合成，是在从植物中分离出雪胆素类化合物的基础上，就原有的骨架，用常规的酯化反应制备。

更具体地方法是：取丽江雪胆地下块茎粉碎后用乙醇回流提取3次，每次4小时，减压浓缩得浸膏，溶于水后先用石油醚60-90℃萃取，再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和的正丁醇萃取；乙酸乙酯部分进行反复硅胶柱层析分离，洗脱剂分别用：石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；纯甲醇，正丁醇部分先经D101大孔树脂柱层析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脱，80％乙醇洗脱流分经硅胶柱层析，分别用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇为洗脱剂，从乙酸乙酯萃取部位，从氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脱馏分，得式(I)化合物。

此外，本发明还提供了一种抗菌剂，其中含有抗菌有效量的式(I)化合物和抗菌学上可接受的载体。

同时提供了式(I)化合物在制备抗菌剂中的应用。

具体实施方式：下面结合实施例进一步对本发明实质性内容进行说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

1、提取与分离：

取丽江雪胆地下块茎风干，称取2公斤，粉碎后用乙醇回流提取3次，每次4小时。提取液减压浓缩得浸膏201.6克，溶于水后先用石油醚(60-90℃)萃取，再用乙酸乙酯萃取，得43.7克，最后用水饱和的正丁醇萃取，得99.1克。乙酸乙酯部分进行反复硅胶柱层析分离，洗脱剂分别用：石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；纯甲醇。正丁醇部分先经D101大孔树脂柱层析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脱，80％乙醇洗脱流分经硅胶柱层析，分别用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇为洗脱剂。共得化合物21个。其中从乙酸乙酯萃取部位，从氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脱馏分，得到3个新葫芦素类化合物，称为雪胆素D(200mg)，雪胆素E(800mg)，雪胆素F(500mg)。

2、新雪胆素的结构鉴定：

雪胆素D，白色粉末，C₃₄H₅₂O₉，M：604；[α]_D ²⁷.2+11.7°(c，0.34 in CDCl₃)，mp110-115℃；IR ν _max ^KBr3446，2977，1736，1697，1371，1251，1026cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：5.67(1H，d，J＝5.8Hz，H-6)，5.10(1H，t，J＝7.96，7.92Hz，H-16β)，1.94，1.92，1.44，1.15，1.40，1.18，1.18，1.11，0.98，0.95(30H，s，10×CH₃)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ，C-1-C-30：30.4t，68.3d，78.7d，41.6s，137.8s，120.7d，23.8t，33.7d，47.9s，42.4d，212.4s，48.6t，48.4s，50.0s，43.3t，74.2d，54.0d，20.1q，18.9q，78.5s，24.2q，212.4s，29.2t，35.2t，81.0s，26.5q，28.0q，19.5q，20.9q，25.3q；25-OAc：171.4s，22.4q；16-OAc：171.4s，20.9q.FAB^-MS(neg.)m/z：603[M-H]^-，EI-MS m/z..544[M-CH₃COOH]⁺，447[M-CH₃COOH-C₆H₉O]⁺，387，219，113。

雪胆素E，白色粉末，C₃₂H₅₀O₈，M：560；[α]_D ^27.1+7.8°(c，0.55 in CHCl₃)；IRν_max ^KBr3448，2974，1735，1696，1376，1249，1041，1028cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ5.63(1H，d，J＝5.36Hz，H-6)，5.09(1H，t，J＝7.96，8.12Hz，H-16β)，1.87，1.34，1.15，1.15，1.10，1.10，0.96，0.92(27H，s，9×CH₃)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ，C-1-C-30：30.8t，68.2d，78.8d，41.5s，137.9s，120.5d，23.7t，33.7d，47.8s，42.4d，212.5s，48.5t，48.4s，50.0s，43.3t，74.2d，53.9d，20.0q，18.9q，78.4s，24.2q，213.7s，29.0t，37.1t，9.8s，26.5q，29.2q，19.5q，20.9q，25.3q；16-OAc：170.0s，20.9q；FAB-MS(neg.)，561[M-H]^-，EI-MS m/z：544[M-H₂O]⁺，447[M-H₂O-C₆H₉O]⁺，387，219，142，113。

雪胆素F，白色粉末，C₄₀H₆₂O₁₄，M：766；IRν_max ^KBr：3448，2978，2881，1735，1372，1026cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：5.67(1H，d，J＝5.5Hz，H-6)，5.41(1H，t，J＝7.75，8.3Hz，H-16β)，1.97，1.95，1.46，1.45，1.39，1.25，1.21，1.12，1.06，0.94(30H，s，10×CH₃)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ，C-1-C-30：30.5t，73.2d，77.3d，41.3s，138.0s，120.0d，23.7t，33.7d，47.8s，42.5d，212.5s，48.7s，50.0s，43.3t，74.1d，54.0d，20.1q，18.7q，78.7s，24.3q，213.5s，27.6t，35.1t，81.0s，26.5q，25.9q，19.5q，20.8q，25.5q，170.1s，22.2q，170.0s，20.8q；25-OAc：170.1s，22.2q；16-OAc：170.0s，20.8q；2-O-Glu：101.1d，75.5d，77.8d，69.4d，76.3d，61.4t；FAB-MS(neg.)m/z：765[M-H]^-；EI-MSm/z：603[M-163]⁺，447，369，219，113。

3、雪胆素C的制备方法：

雪胆甲素300mg加适量氢氧化钾-乙醇溶液，加热回流0.5-1.5小时，加入大量水之后，再加盐酸酸化，减压除去乙醇，放置冷却后，用氯仿提取。提取液用蒸馏水洗后，氯仿层蒸干，残留物加少量乙醇，再加适量水放置，析出雪胆素C晶体，约280mg。TLC检测：氯仿∶丙酮(1∶1)Rf＝0.57；氯仿∶甲醇(10∶1)Rf＝0.58；丙酮∶甲醇(3∶1)Rf＝0.70。

雪胆素C

雪胆素C的结构鉴定：白色针晶，C₃₂H₅₀O₈；M：562；mp 163-170℃。IRν_max ^KBr：3433，2971，2932，2883，1692，1615，1451，1432，1391，1261，1134cm^-1。¹H NMR(C₅D₅N，400MHz)δ：1.06，1.20，1.26，1.32，1.36，1.41，1.43，1.56(24H，s，8xCH₃)，2.24(3H，s，COCH₃)，2.95(1H，d，J＝6.5Hz，17-H)，3.22(1H，d，J＝14.5Hz，12-He)，3.40(1H，d，J＝8.7Hz，3-H)，4.11(1H，m，16-H)，4.64(1H，brs，12-H)，5.67(1H，m，6-H)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ，C-1-C-30：34.73t，71.05d，81.47d，42.86s，142.46s，118.62d，24.12t，34.41d，48.15s，43.31d，212.93s，48.91s，51.10s，46.23t，70.23d，59.56d，89.46s，207.42s，42.18s，35.98t，71.44s，184.80s，15.52q，19.02q，20.19q，20.42q，22.37q，22.47q，25.47q，29.47q，30.59q.EI-MS m/z(％)：544[M-H₂O，]⁺(2)，526[M-2H₂O]⁺(7)，508[M-3H₂O]⁺(7)，486，468(9)，184(46)，166(100)，150(51)，139(47)，126(40)，107(25)，95(17)，79(12)，69(16)，59(51)。

R＝H 雪胆素DR＝Glc 雪胆素E

雪胆素F

4、雪胆素D，雪胆素E，雪胆素F，雪胆素C等化合物的体外抑菌试验4-1材料与方法

材料

(1)培养基：营养肉汤(本室自配)

(2)微孔细胞培养板及微量移液器(本室自备)

(3)菌种：A、大肠杆菌(ATCC8099)；B、伤寒沙门杆菌(ATCC14028)；C、福氏痢疾杆菌(ATCC12022)；D、普通变形杆菌(ATCC14153)；E、黄色葡萄球菌(ATCC6538)。均由北京生物制品所提供。

(4)供试样品：四环三萜葫芦素类化合物雪胆素C，雪胆素D，雪胆素E，雪胆素F。以黄连素为对照。其原液浓度为50mg/ml。4-2方法：

(1)样品配制：用适量二甲亚矾(DMS)溶解样品，用无菌肉汤稀释，雪

胆素C-F原液浓度(mg/ml)分别为33.75、16.25、18.00、21.00、

18.33、26.67、70.00。以黄连素为对照。其原液浓度为50mg/ml。

(2)菌液配制：将适量各菌接种于肉汤，37℃培养18小时，取出比浊测

浓度，稀释为10⁵个/ml含菌量

(3)MIC试验采用微量稀释法，用12×8的96孔微孔稀释板进行。每排

12孔，每排的第1~10孔各加入50ml用培养基稀释成一系列药液，第11孔

加50ml培养基，第10孔加0.1ml培养基作空白对照，第12孔加5％DMS为

溶剂对照，然后在第1~9孔加入50ml菌液，使第1~8孔中的药液浓度倍比

递减(见表1)。操作完成，振荡混合后，在37℃下培养24小时，取出在

黑色背景下观察结果。无菌生长孔中所含药液最低的药物浓度即为该样品的

MIC。

表1四种化合物在各微孔中的浓度(mg/ml)H 原液 1 2 3 4 5 6 7 8雪胆素 20.00 10.05 5.25 2.63 1.31 0.66 0.33 0.16 0.08C雪胆素 20.00 10.00 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08D雪胆素 26.67 13.34 6.67 3.33 1.62 0.83 0.42 0.21 0.10

E雪胆素 18.33 9.17 4.58 2.29 1.15 0.57 0.29 0.14 0.07

F黄连素 50.00 25.00 12.50 6.25 3.13 1.56 0.78 0.39 0.20

5、结果八种化合物对五种细菌的MIC(mg/ml)(见表2)

表2 八种化合物对五种细菌的MIC(mg/ml)菌种雪胆素C 雪胆素D 雪胆素E 雪胆素F 黄连素A ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 12.50B ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 25.00C ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 1.56D ＞10.5 ＞10.00 ＞13.34 ＞9.17 ＞50E 1.31 10.00 ＞13.34 ＞9.17 ＞50

从上可以得出本发明与现有技术相比所具有的优益效果在于：八种四环三萜类化合物中，雪胆素C、雪胆素D两种对金黄色葡萄球菌有很好的抗菌活性，MIC均≤10mg/ml，效果与黄连素类似或稍好。金黄色葡萄球菌的耐抗生素菌株日益增多，其中耐青霉素G的菌株比例已达96％~98％。

本发明确定了雪胆素甲、乙的化学结构属于四环三萜葫芦素类物质，为葫芦素F的衍生物，其抗菌活性试验表明：雪胆素(甲素、乙素混合物)对福氏杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏杆菌等都有不同程度的抗菌活性。在浓度低达0.1mg/ml的情况下，也显示抗菌作用。以氯霉素作阳性对照，结果表明雪胆素对伤寒杆菌、痢疾杆菌和引起化脓性金色葡萄球菌的抗菌作用相当强，对结核杆菌也有作用。雪胆素的毒性也比较低，小鼠口服10g/kg，无中毒反应；而该药临床使用成人剂量肌肉注射为1-2mg/day，口服为15-30mg/day，由此可见该药安全性极高。只是静脉注射剂量增大时，对一些动物心脏有一定影响，如麻醉犬静脉注射剂量为40mg/kg时，血压、呼吸、心率无明显改变，豚鼠腹腔注射剂量为40mg/kg时，心电图无变化；而兔子静脉注射剂量为20-40mg/kg时，出现传导阻滞，最后心跳停止。

实施例2

丽江雪胆片：取丽江雪胆细粉300-500克，加敷料适量，压制成1000片丽江雪胆片。功能：清热解毒，抗菌消炎。用于急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎，咽喉炎等；用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次0.3-0.5克。

实施例3

雪胆素C片：取雪胆素C(折百)50克，加敷料适量，压制成10000片雪胆素C片。功能：清热解毒，抗菌消炎。作用：急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎等；主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌、结核杆菌感染。用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次5-10毫克。

实施例4

雪胆素C注射液：取雪胆素C(折百)50克，加敷料适量，配制成10000支雪胆素C注射液。功能：清热解毒，抗菌消炎。作用：急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎等；主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌、结核杆菌感染。用法与用量：每日2-3次，每次5-10毫克。

实施例5

雪胆素D片：取雪胆素D(折百)50克，加敷料适量，压制成10000片雪胆素C片。功能：清热解毒，抗菌消炎。作用：急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎等；主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌、结核杆菌感染。用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次5-10毫克。

实施例6

雪胆素E片：取雪胆素F(折百)50克，加敷料适量，压制成10000片雪胆素C片。功能：清热解毒，抗菌消炎。作用：急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎等；主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌、结核杆菌感染。用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次5-10毫克。

实施例7

雪胆素F片：取雪胆素F(折百)50克，加敷料适量，压制成10000片雪胆素C片。功能：清热解毒，抗菌消炎。作用：急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎等；主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌、结核杆菌感染。用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次5-10毫克。

实施例8

丽江雪胆素片：丽江雪胆乙醇提取物，用乙酸乙酯分配，得到总雪胆素类物质含量占70％以上的粗丽江雪胆素，取100克，加敷料适量，压制成10000片丽江雪胆素片。功能：清热解毒，抗菌消炎。用于急性细菌性痢疾，急性肠胃炎，扁桃腺炎，咽喉炎等；用法与用量：饭后服用；每日2-3次，每次10-20毫克。

Claims

1.如结构式(I)所示的雪胆素类衍生物，

R₁＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8；Glc，Xyl，Ar

R₂＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₃＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₄＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

R₅＝COCH₃，COCH₂CH₃，CO(CH₂)nCH₃ n＝1-8

2.权利要求1式(I)化合物的制备方法，其特征是雪胆素类衍生物不涉及化合物的全合成，是在从植物中分离出雪胆素类化合物的基础上，就原有的骨架，用常规的酯化反应制备。

3.根据权利要求2所述的雪胆素类衍生物的制备方法，其特征是取丽江雪胆地下块茎粉碎后用乙醇回流提取3次，每次4小时，减压浓缩得浸膏，溶于水后先用石油醚60-90℃萃取，再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和的正丁醇萃取；乙酸乙酯部分进行反复硅胶柱层析分离，洗脱剂分别用：石油醚；氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；纯甲醇，正丁醇部分先经D101大孔树脂柱层析，依次用10％，20％，80％和95％乙醇洗脱，80％乙醇洗脱流分经硅胶柱层析，分别用氯仿∶甲醇；氯仿∶甲醇∶水；甲醇为洗脱剂，从乙酸乙酯萃取部位，从氯仿∶丙酮；氯仿∶甲醇洗脱馏分，得式(I)化合物。

4.抗菌剂，其中含有抗菌有效量的权利要求1化合物和抗菌学上可接受的载体。

5.权利要求1中的化合物在制备抗菌剂中的应用。