CN1420789A - 用于靶向的化合物 - Google Patents

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Abstract

一种化合物，其包含靶细胞特异性部分和细胞毒活性部分，其特征在于该化合物的细胞毒活性部分是一种组成型活化的caspase，或者其与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。或者，本发明提供了包含介体部分和细胞毒活性部分的化合物，其特征在于该化合物的细胞毒活性部分是一种组成型活化的caspase，或者其与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。优选本发明的化合物的细胞毒活性部分是组成型活化的caspase－3，caspase－6或caspase－7。本发明进一步提供了编码本发明化合物的核酸，以及这种化合物在医药方面，如在治疗癌症方面的应用。

Description

用于靶向的化合物
本发明涉及化合物，其中的一些可能是化合物的间接细胞毒活性组合，其针对选定的细胞有高亲和性或者可靶向选定的细胞。
背景
具有直接或者间接细胞毒活性的化合物的细胞特异性靶向已被提出作为一种对抗疾病(如癌症)的方法。Bagshawe和其同事曾公开了(Bagshawe(1987)，Br.J.Cancer 56，531；Bagshawe等(1988)Br.J.Cancer 58，700；WO88/07378)包含抗体或其部分和一种酶的偶联化合物，该抗体特异于肿瘤细胞抗原而该酶能将无毒前体药物转变为细胞毒活性化合物。这种细胞毒活性化合物是烷化试剂，如通过假单胞菌(Pseudomonas sp.)CPG2酶的作用从对-N-二(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸释放的苯甲酸芥(mustard)。
Epenetos和其同事公开了(WO91/11201)另一种利用不同前体药物的系统。这种细胞毒活性化合物是生氰的单糖或二糖，如植物化合物苦杏仁苷，其在β-葡糖苷酶和羟基腈裂解酶的作用下释放氰化物。
另一个系统中，公开了抗体-酶偶联物的应用，该偶联物包含作为酶的碱性磷酸酶和前体药物表鬼臼吡喃葡糖苷(etoposide)4’-磷酸或7-(2，-氨乙基磷酸)丝裂霉素或其组合(EP0302473；Senter等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4842)。
Rybak和其同事公开了(Rybak等(1991)J.Biol.Chem.266，21202；WO91/16069)单体胰核糖核酸酶在直接注射进非洲爪蟾卵细胞时的细胞毒活性潜力，以及与人运铁蛋白或直接靶向运铁蛋白受体的抗体相偶联的单体RNA酶的细胞毒活性潜力。这种单体RNA酶杂合蛋白在体外对于人红细胞白血病细胞具有细胞毒活性。
其他方法是体内应用链亲和素偶联的抗体，在适当的时间段之后，再应用放射性生物素(Hnatowich等(1988)J.Nucl.Med.29，1428-1434)，或注射生物素标记的mAb之后注射放射性的链亲和素(Paganelli等(1990)Int.J.Cancer 45，1184-1189)。对非小细胞肺癌进行的先导性放射免疫定位研究获得了可喜的结果(Kalofonos等(1990)J.Nucl.Med.31，1791-1796)。
除了这些例子之外，更常见的是生物素标记的抗体和链亲和素-酶偶联物，其用于酶联免疫分析中。
这些先前的系统使用了相对大的抗体-酶，抗体-链亲和素或抗体-生物素偶联物，并且可能包含高度免疫反应性的非哺乳动物来源的部分。
单链Fv抗体片段(ScFv)表现出快速的穿透(Yokota等(1992)Cancer Res.52，3402-3408)和快速的清除(Colcher等(1990)J.Natl.Cancer Inst.82，1191-1197)。
当在治疗有效的情况下使用前述细胞特异性试剂时，需要满足的条件之一是该细胞特异性试剂在靶细胞上的积累水平比其在其他细胞上的积累水平足够高。进一步的要求是将直接或间接细胞毒活性的试剂带至靶细胞，并且优选所述细胞毒活性试剂是具有高潜力的。
我们现在提出了改进的系统，至少其中的一些利用了新的有用的间接细胞毒活性试剂。
发明简述
本发明第一方面提供了包含靶细胞特异性部分和细胞毒活性部分的化合物，其特征在于该细胞毒活性部分是一种组成型活化的caspase或其与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
凋亡，或称“编程性细胞死亡”是一种高度协调并且进化上保守的细胞死亡形式，其中细胞牺牲性地毁灭自己。它和坏死不同，坏死经常是因化学性或毒性攻击而导致细胞被杀死，而凋亡中细胞以一种系统的方式有意地分解自己，导致产生膜包装的亚细胞片段(“凋亡小体”)。
凋亡对于多细胞生物的健康是关键的，因为哺乳动物细胞不是永生的。例如，该过程对于发育中塑造神经系统和维持免疫系统的正常功能是极重要的。凋亡机制的紊乱可导致疾病。例如，当凋亡过少，可能发生癌症或自身免疫病，当凋亡过多，可能发生休克损伤或神经变性(参见综述：Reed(1999)J.Clin.Oncol.17，2941-2953；Wolf和Green(1999)J.Biol.Chem 274，20049-20052)。
导致凋亡的信号级联复杂而多样。“死亡受体(death receptor)”存在于细胞表面(如Fas或TRAIL受体)，当其活化后，传递一种导致凋亡事件的引发信号(Ashkenazi和Dixit(1998)Science 281，1305-1308)。此外，细胞可检测到能损坏DNA的攻击，如UV或X射线辐射，化疗药物以及病毒感染，如果修补不可行，则将引发细胞死亡(Benjamin，Hiebsch和Jones(1998)Mol.Pharmacol.53，446-450)。
最初在线虫Caenorhabditis elegans中的研究表明有三个基因对于凋亡是必须的；CED-3和CED-4(其促进凋亡)，以及CED-9(其抑制凋亡)。CED-3编码一种带有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(或称“天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)”)，其由CED-4活化并由CED-9灭活。在这些最初的研究之后，又发现了多数C elegans基因在哺乳动物中的对应物，包括多种与CED-3有关的caspase。
执行凋亡的核心在于涉及caspase蛋白酶家族的蛋白水解级联。每一蛋白水解步骤都是不可逆转的，导致产生凋亡形态学特征的多种事件的激活(Reed(1999)J.Clin.Oncol.17，2941-2953；Wolf和Green(1999)J.Biol.Chem274，20049-20052)。
在执行凋亡过程中，起始caspase可活化效应caspase，而效应caspase反过来引发许多下游事件，最终导致凋亡性细胞死亡(Reed(1999)J.Clin.Oncol.17，2941-2953；Wolf和Green(1999)J.Biol.Chem 274，20049-20052)。据认为被剪切的第一个靶点是原凋亡性蛋白(如其他caspase)，其放大细胞致死信号并降低抗-凋亡蛋白(如Bc1-2/XL，Bid)的活性，从而降低对凋亡的抑制。随着凋亡的进展，产生如CAD(caspase活化的脱氧核糖核酸酶)(Enari，Sakahira，Yolayama等(1998)Nature 391，43-50)，凝溶胶蛋白，PAK2，MEKKI和PKCd等组分，这些组分通过诱导染色体DNA的片段化和细胞骨架的破坏直接导致凋亡的表型。caspase也剪切结构蛋白，如核纤层蛋白，肌动蛋白，角蛋白，胞衬蛋白，Gas2，NuMa和SAF-A，促进核的溶解和细胞骨架的破坏。caspase剪切的其他底物包括稳态蛋白，如DNA-PKcs，PARP，U1-70Kda和转录因子，这些因子参与防止细胞修复和大分子的合成。
这些事件基本关闭了细胞，使相邻细胞之间失去接触，重新组构崩解的内部，并向免疫系统发出信号，其指示在细胞崩解为凋亡小体之后可以进行吞噬细胞裂解。
最初的CED-3 caspase与命名为caspase-1或ICE的哺乳动物白细胞介素-1-转化酶有关。这导致发现了其他同源酶，其中的一些与凋亡级联紧密相关。所有的这些同源体都是30-50kDa的原酶，活化后形成异二聚体，而这些异二聚体又进行二聚化形成四聚体(Wilson，Black，Thomson等(1996)Nature370，270-274；Rotonda，Nicholson，Fazil等(1996)Nat.Sruct.Biol.3，619-25)。这些caspase同源酶都识别一种4-氨基酸肽序列，并在天冬氨酸之后剪切(参见以下)(Thornberry，Rano，Peterson等(1997)J.Biol.Chem.272，17907-17911)。
caspase最初以无活性的原酶形式存在，该形式在活细胞中组成型表达，以复杂的方式调节，使其可以引发导致细胞破坏的快速途径。该凋亡途径中各种caspase的活性之间的关系是复杂的。通常，起始caspase被活化，反过来导致效应caspase的活化(表1)，活化的效应caspase介导破坏事件(Reed(1999)J.Clin.Oncol.17，2941-2953；Wolf和Green(1999)J.Biol.Chem274，20049-20052)。起始caspase-8是通过死亡受体引发，而起始caspase-9是通过细胞毒活性试剂引发。caspase-8活化caspase3和7，而caspase-9可活化caspase-6。caspase-3和caspase-6继续导致核凋亡事件。caspase-9也活化caspase-3和-7。
一旦caspase-3和-7(以及可能-6)活化，表示不可逆转地走向细胞死亡。相反，起始caspase的活化仍可能被抗-凋亡事件所阻止。其他caspase，如-2，-4，-10和-13的功能还不太清楚。
                                       表1
名称 替代的名称 caspase的类型 大/小亚基的分子量(KDa) 优选的四肽序列
caspase-11 ICE/Ced 细胞因子加工 20/10 (W/Y/F)-E-H-D
caspase-22 起始 20/12 D-X-X-D
caspase-33 CPP-32 效应/执行子 17/12 D-E-X-D
caspase-44 细胞因子加工 20/10 (W/Y/F)-E-H-D
caspase-55 细胞因子加工 20/10 (W/Y/F)-E-H-D
caspase-66 Mch-2 效应/执行子 18/11 (V/T/I)-E-X-D
caspase-77 CMH-1 效应/执行子 20/12 D-E-X-D
caspase-88 起始 18/11 (L/V/D)-E-X-D
caspase-99 Mch6 起始 17/10 (I/V/L)-E-H-D
caspase-1010 起始 17/12 未知
caspase-1111 细胞因子加工 20/10 未知
caspase-1212 细胞因子加工 20/10 未知
caspase-1313 细胞因子加工 20/10 未知
caspase-1414 细胞因子加工 20/10 未知
表1说明
1Thornberry等(1992)Nature 356：766-774
2Li等(1997)J.Biol.Chem 272：21010-7
3Alnemri等(1996)Cell 87：171
4Kamada等(1997)Oncogene 15：285-90
5Kamada等(1997)CellDeath and Differentiation 4(6)：473-478
6LeBlanc等(1999)J.Biol.Chem.274：23426-36
7Marcelli等(1998)Cancer Res.58：76-83
8Scaffidi等(1997)J.Biol.Chem.272：26953-8
9Srinivasula等(1996)J.Biol.Chem.271：27099-106
10Ng等(1999)J.Biol.Chem.274：10301-8
11Wang等(1998)Cell 92：501-9
12Nakagawa等(2000)Nature 403：98-103
13Humke等(1998)J.Biol.Chem 273：15702-7
14Hu等(1998)J.Biol.Chem 273：29648-53
表1显示了多种已知caspase的特性。
所有的caspase都具有相同的结构。caspase原酶包含一个N末端原结构域，一个包含活性位点半胱氨酸(位于保守的QACXG基元内)的大亚基和一个小亚基，该小亚基也向亚基间活性位点提供残基(Wilson，Black，Thomson等(1994)Nature 370，270-274；Rotonda，Nicholson，Fazil等(1996)Nat.Sturct.Biol.3，619-25；Thornberry，Rano，Peterson等(1997)J.Biol.Chem.272，17907-17911)。在自我激活或者被其他caspase激活后，该原结构域在一个天冬氨酸残基处被剪切，而一个结构域间接头在一个或两个天冬氨酸残基处被剪切，从而将这种单链酶转变为具有酶活性的异二聚体(包含一个大亚基和一个小亚基)。然后这种异二聚体再二聚化成为四聚体。
每个caspase活性位点都有一个保守的带正电荷的“S1口袋(pocket)”，以结合底物肽上带负电荷的天冬氨酸“P1”残基。因此，所有的caspase仅在天冬氨酸残基后的位置剪切。但caspase家族的成员表现出不同的四聚体肽底物特异性(参见表1)。
上游(或者说起始)caspase，如caspase-2，-8，-9和-10，具有一个大的原结构域，其被认为参与由“死亡受体”引起的caspase的募集(recruitment)(参见Cohen，1997，Biochem.326：1-16；Kischkel等，1995，EMBO J.14：5579-5588)。起始受体与死亡复合体的连接导致这些酶被引入彼此很接近的位置，这种位置被认为可通过自我催化过程促进酶的活化(Yang等1988，Mol.Cell.1：319-325；Muzio等1998，J.Biol.Chem.273：2926-2930)。
相反，效应caspase如caspase-3，-6和-7的原结构域较短，并且不被死亡受体所募集。结果，这些caspase保持蛰伏状态，直到由起始caspase通过蛋白水解直接激活(Femandez-Alnemri等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7464-7469；Srinivasula等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：13706-13711)。一旦被激活，这些效应caspase快速破坏细胞的重要结构和调节组分，导致在经历凋亡的细胞中观察到特征性的凋亡表型(Nicholson和Thomberry，1997，Trends Biochem.Sci.257：299-306)。
术语“组成型活化的caspase”包括蛋白或肽，其表现出足以诱导凋亡的带有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶活性，即活性形式的caspase。或者，组成型活化的caspase可能包含一个这类活性caspase的前体，该活性caspase可自发进行自我催化从而转变为活性caspase。
应理解包含组成型活化的caspase的细胞毒活性部分，或与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性的细胞毒活性部分可能在凋亡级联事件中的任一点起作用(如上所述)。例如，该细胞毒活性部分可能包含效应caspase(如caspase-3，caspase-6或caspase-7)的组成型活化变体，其直接引发下游的凋亡事件。或者，该细胞毒活性部分可能包含起始caspase(如caspase-2，caspase-8，caspase-9或caspase-10)的组成型活化变体，其作用于效应caspase以诱导凋亡。
优选实施方案中，该细胞毒活性部分是天然产生的caspase的变体，所述变体是组成型活化的，使得其无需由凋亡级联中其他组分激活而能自发活化。
天然caspase的例子见表1。
“变体”包括包含天然caspase的细胞毒活性部分，其中有保守或非保守的氨基酸插入，缺失或取代，这种改变排除了对天然caspase前体进行加工的需要，而且与活化的天然caspase的凋亡诱导活性相比，该变体的凋亡诱导活性没有显著降低。例如，与天然产生的caspase的凋亡诱导活性相比，该变体可能具有增加的凋亡诱导活性。
这种变体可用本领域内已知的蛋白工程和定点诱变的方法制备(如US4302386)。
Srinivasula等描述了组成型活化的caspase的实例((1998)J.Biol.Chem.273：10107-10111)。所述caspase是天然caspase-3和-6的变体，其中的小亚基和大亚基利用重组技术重排。具体的，亚基位置被逆转，使大亚基的C末端和小亚基的N末端游离，而该大亚基的N末端和小亚基的C末端物理相连。这种亚基重排可通过大亚基的自由C末端和小亚基的N末端的自发折叠和交互突出(interdigitating)从而形成活性位点。相反，天然caspase前体中，这些末端是邻接的并因此不能形成活性位点，直到通过前体多肽的剪切而释放。
优选，该细胞毒活性部分是组成型活化的效应caspase或者与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
更优选，该细胞毒活性部分是组成型活化的效应caspase，选自caspase-3，caspase-6和caspase-7，或者与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
应理解，该细胞毒活性部分可包含组成型活化的caspase的一个片段，其中该片段包含所述组成型活化的caspase的至少一个催化活性部分。因此，该细胞毒活性部分可包含肽或蛋白片段，其基本保留了组成型活化的caspase的凋亡诱导活性，如该细胞毒活性部分可包含组成型活化的caspase的活性位点。
优选该细胞毒活性部分来源于哺乳动物，优选来源于人。将所述哺乳动物蛋白作为本发明化合物的直接或间接细胞毒活性部分是有利的，因为这种化合物产生不良免疫反应的可能性很小。
优选，本发明化合物的细胞毒活性部分可进行寡聚化，如二聚化。靶细胞特异性部分与可寡聚化的细胞毒活性部分的连接提供了增加靶细胞结合位点数目的方法。例如，如果该靶细胞特异性部分与一个可形成二聚体的部分连接，则靶细胞特异性结合位点的数目是二；如果该靶细胞特异性部分与一个可形成四聚体的部分连接，则靶细胞特异性结合位点的数目是四。靶细胞特异性结合位点的数目大于一，因此该化合物可能比仅有一个靶细胞特异性结合位点的化合物对于该靶细胞的亲和力更高。
优选可寡聚化的本发明化合物的细胞毒活性部分不含有链间二硫键也不含有链内二硫键；特征清楚；无毒；稳定；易于制备成适合临床前或临床应用的形式，或者易于制备成临床前或临床应用的制剂；并且亚基单体彼此之间具有高亲和力，即它们包含一个或多个亚基结合位点。
技术人员应理解caspase活性可通过以下一或多个实验测量和/或检测：
(i)基于D-E-V-D类似物型底物水解的分析，该底物经剪切后产生一种可通过比色法检测的产物(这种分析将提供结合常数和催化速率常数，分别为Km和Kcat)(例如，参见Gurut等，1997，Anal.Biochem.251：98-102)；
(ii)涉及对细胞凋亡的生理观察的分析，如利用缩时视频显微镜检术(time-lapsed video microscopy)，其中凋亡的特征是膜起泡和细胞皱缩(例如，参见Loke等，1999，Eur.J.Immunol.29：1793-802；Weisser等，1998，Cytometry31：20-28；Ohta等，1998，Brain Tumor Pathol.15：19-21)；和
(iii)凋亡产物的分析，如TUNEL分析，其中检测已降解的DNA或针对凋亡剪切的降解底物(如PARP)的抗体的量(Vakkala等，1999，Br.J.Cancer81：592-599；Namura等，1998，J.Neurosci.18：3659-3668)。
“靶细胞特异性”部分是指化合物的一个部分，该部分包含一个或多个结合位点，所述位点识别并结合靶细胞上的实体。通过与靶细胞接触，该靶细胞特异性部分随细胞毒活性部分内化。这种内化将细胞毒活性部分送递到胞质中，其在胞质中可接近许多参与凋亡级联的caspase底物。
靶细胞特异性部分识别的实体在所述靶细胞上优势表达，优选是只在所述靶细胞上表达。靶细胞特异性部分可包含一个或多个结合位点，它们针对相同靶细胞类型上表达的不同实体，或者包含一个或多个结合位点，它们针对两种或多种不同靶细胞类型上表达的不同实体。
优选，靶细胞特异性部分以高亲和力识别靶细胞。
“高亲和力”是指靶细胞特异性部分识别靶细胞的结合常数至少是Kd＝10-6M，优选至少是Kd＝10-9M，Kd＝10-10M是适当的，Kd＝10-11M更为适合，Kd＝10-12M也是适当的，更优选Kd＝10-15M或者甚至是Kd＝10-18M。
被识别的实体可能是任何适合的实体，由肿瘤细胞，病毒感染的细胞，病原微生物，作为基因治疗的一部分而引入的细胞，甚至是身体的正常细胞(无论何种原因，期望靶向)所表达，但所述实体在不期望靶向的细胞中不表达，或者至少不以高频表达。被识别的实体经常是抗原。抗原的例子包括下表2中所列出的。
                             表2
1.肿瘤相关抗原
抗原 抗体 现有应用
癌胚抗原 C46(Amersham)85A12(Unipath) 结肠/直肠肿瘤的成像和治疗
胎盘碱性磷酸酶 H17E2(ICRF，Travers和Bodmer) 睾丸和卵巢癌的成像和治疗
全癌(pan carcinoma) NR-LU-10(NeoRxCorporation) 各种癌，包括小细胞肺癌的成像和治疗
多形性表皮粘蛋白(人乳脂肪小体) HMFG1(Taylor-Papadimitriou，ICRF)(Antisoma plc) 卵巢癌，胸膜渗漏，乳腺癌，肺癌和其他普通的表皮癌的成像和治疗
人乳粘蛋白核心蛋白 SM-3(IgG1)1 乳腺癌的诊断，成像和治疗
β-人绒膜促性腺激素 W14 将酶(CPG2)靶向裸鼠的异体移植绒膜癌(Searle等(1981)Br.J.Cancer44，137-144)
人类癌症上的一种碳水化合物 L6(IgG2a)2 碱性磷酸酶的靶向(Senter等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4842-4846)
B淋巴瘤(正常的和恶性的)上的CD20抗原 IF5(IgG2a)3 碱性磷酸酶的靶向(Senter等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4842-4846)
1Burchell等(1987)Cancer Res.47，5476-5482
2Hellstrom等(1986)Cancer Res.46，3917-3923
3Clarke等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，1766-1770
其他抗原包括甲胎蛋白，Ca-125，前列腺特异性抗原和表皮生长因子受体家族，即EGFR的成员，erb B2(如Herceptin抗体)，erb B3和erb B4。
2.免疫细胞抗原
抗原 抗体 现有应用
B-淋巴细胞表面抗原(CD22) RFB4(Janossy，RoyalFree Hospital) B-细胞淋巴瘤的免疫毒素治疗
全T淋巴细胞表面抗原(CD5) H65(Bodmer，KnowlesICRF，Licensed to XomaCorp.，USA) 急性移植物抗宿主疾病，类风湿性关节炎的免疫毒素治疗
3.感染因子相关抗原
抗原 抗体 现有应用
乙型肝炎表面抗原 抗HBs Ag 抗肝细胞癌的免疫毒素
优选实施方案中，靶细胞特异性部分识别并选择性地结合肿瘤细胞抗原。
靶细胞特异性部分优选是抗体或其抗原结合片段。
较方便的是，靶细胞特异性部分包含两个或多个针对靶细胞的结合位点，其中该靶细胞特异性部分是抗体，或其二价片段。所述靶细胞特异性部分可能具有彼此识别相同实体，或识别不同实体的“臂”。
本发明化合物的一个实施方案中，该靶细胞特异性部分具有两“臂”，可识别相同靶细胞上的不同分子，其中所述相同靶细胞上的分子不限定于该细胞类型，而也可能在一些其他的细胞类型中出现。例如，该靶细胞特异性部分的一个“臂”可能识别细胞类型I，II和III上的分子，而另一“臂”可能识别细胞类型I，IV和V上的分子。因此，包含这类靶细胞特异性部分的本发明化合物对于细胞类型I，比对于细胞类型II，III和IV，有更高的特异性。本发明这一方面特别有用，因为已知的完全靶细胞特异性分子很少，而在几种细胞类型上均出现并且可用于本发明这一方面的分子是众所周知的。这种分子通常是已知其交叉反应抗体的那些细胞表面抗原。这种分子的例子在下表3中给出。
                           表3
抗原 细胞类型 抗体
CD9 前B细胞，单核细胞，血小板 MM2/57(IgG2b，小鼠)
CALLA 淋巴样先祖细胞，粒细胞 B-E3(IgG2a，小鼠)
CD13 髓样单核细胞，粒细胞 B-F10(IgG1，小鼠)
CD24 B-细胞，粒细胞 ALB-9(IgG1，小鼠)
CD61 血小板，巨核细胞 PM6/13(IgG1，小鼠)
表3所述抗体一般可从Serotec，Oxford，OX5 1BR，UK获得。
结合表2中列出的多数抗原的单克隆抗体是已知的，但任何情况下，凭借现今关于单克隆抗体的技术，可制备大多数抗原的抗体。这种抗原特异性部分可以是整个抗体，抗体的部分(如Fab或F(ab’)2片段)，合成的抗体片段(如单链Fv片段[SvFv])，或者肽或肽模拟物等。选定的抗原的合适单克隆抗体可通过已知技术制备，如“Monoclonal Antibodies：Amanual of techniques”H Zola(CRC Press，1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniquesand Applications”J G R Hurrell(CRC Press，1982)和Antibody Engineering，APractical Approach，McCafferty，J等ed(IRL Pres，1996)中公开的技术。
抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)参与抗原识别，这一事实最初由早期蛋白酶消化实验所鉴定。通过啮齿类抗体的“人源化”进一步地证实该事实。啮齿类来源的可变区可融合于人来源的恒定区，产生的抗体保留了啮齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6851-6855)。
这种抗原特异性由可变区赋予，并且不依赖于恒定区，这可通过抗体片段(均包含一个或多个可变区)的细菌表达实验得知。这些分子包括Fab样分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science 240，1038)；二硫键连接的Fv分子(Young等，1995，FEBSLett.377：135-139)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶体结构域通过一个柔性寡肽相连接(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)和包含分离的V区的单结构域抗体(dAbs)(Ward等(1989)Nature 341，544)。Winter和Milstein((1991)Nature 349，293-299)有在保留其特异性结合位点的抗体片段的合成中涉及的技术的一般性综述。
“ScFv分子”是指其中VH和VL配偶体结构域通过柔性寡肽连接的那些分子。
Neuberger等(1988，8th International Biotechnology Symposium Part 2，792-799)讨论了嵌合抗体。
适当地制备的非人抗体可用已知方法进行“人源化”，如通过将小鼠抗体的CDR区插入人抗体的框架中。
使用抗体片段而非整个抗体的好处是多方面的。小体积的片段容易被快速地清除，并可能改善肿瘤与非肿瘤的比率。Fab，Fv，ScFv，二硫键Fv和dAb抗体片段可由细菌(如大肠杆菌)表达并分泌，或由真核表达系统(如酵母或哺乳动物系统)表达并分泌，从而可以容易地生产大量的所述片段。
完整的抗体，以及F(ab’)2片段都是“二价”的。“二价”是指所述抗体和F(ab’)2片段有两个抗原结合位点。相反，Fab，Fv，ScFv，二硫键Fv和dAb片段是单价的，仅有一个抗原结合位点。
本发明多种化合物中的一些在图1中例示。当然，细胞毒活性部分可能形成图中所示更高阶的寡聚体，例如三聚体，四聚体，五聚体，六聚体。
被识别的实体可具有或不具有抗原性，但可以通过其他一些方式被识别和选择性地结合。例如，其可能是一种特征性的细胞表面受体，如在黑素瘤细胞中大量表达的促黑激素(MSH)的受体。或者，该实体可能是靶细胞中诱导的实体，如血管发生中的血管表皮生长因子(VEGF)受体。因此，细胞特异性部分可以是特异性结合该实体的化合物或其部分(这种特异性结合是非免疫意义上的)，如作为细胞表面酶的底物或其类似物，或者作为信使。
优选，高亲和力的靶细胞特异性部分包含针对靶细胞的两个或多个不同的结合位点。
靶细胞的不同结合位点可以是或不是两个或多个不同的抗体，或其片段，其定向于该靶细胞上所表达的不同实体。或者靶细胞的不同结合位点可能以其他非免疫性方式识别并选择性地结合该细胞。
另一种情况是，一个或多个结合位点是抗体或其部分，并且针对靶细胞的一个或多个结合位点以其他非免疫性方式识别并选择性地结合该细胞。
具有针对两个或多个靶细胞特异性实体的结合位点的化合物能更特异地结合所述靶细胞，每种不同结合位点有不止一个的化合物以更大的亲和力结合所述靶细胞。将两个或多个结合位点组合(其本身是高特异但低亲和的)，则可能产生对于靶细胞高亲和的本发明化合物，其同时保留有结合位点的特异性。
已知许多靶细胞特异性分子，如表2中公布的那些，其不与另一种直接或间接细胞毒活性部分连接，但却可用于将细胞毒活性试剂导向靶细胞。
因此，本发明进一步的方面提供了一种化合物，其包含介体部分和细胞毒活性部分，其特征在于该细胞毒活性部分是组成型活化的caspase或与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。该细胞毒活性部分可包含有关本发明第一方面化合物的上述任何细胞毒活性部分。
“介体部分”是指化合物中识别靶细胞特异性分子并介导细胞毒活性部分内化至靶细胞胞浆的部分。靶细胞特异性分子可以是本发明第一方面的化合物，或其可以是本领域已知的靶细胞特异性分子，或它们的能通过介体部分识别的衍生物。
在包含天然靶细胞特异性分子的抗体的情况中，所述靶细胞特异性分子可通过该介体的Fc部分识别。
该介体可识别天然的靶细胞特异性分子，但优选该介体识别所述分子的衍生物。
所述衍生物可通过将一个组分(如小分子，例如半抗原)连接于所述分子而制备。该介体(例如抗体或其片段)可识别所述衍生的靶细胞特异性分子的半抗原或其他部分。
使用该方法的好处在于相同组分(如半抗原)可连接到所有类型的靶细胞特异性分子上，而只有包含可识别所述组分的介体和细胞毒活性部分的化合物才可用于将该细胞毒活性试剂送递到该靶细胞。
本发明的一个实施方案中，介体包含HMFG-1抗体或其抗原结合片段(如scFv)，由所述HMFG-1抗体所识别的部分是半抗原，即多态性表皮粘蛋白(PEM)核心肽。该靶细胞特异性分子是另一种包含所述半抗原的抗体，它还在muc-1基因产物的20个氨基酸串联重复中特异性地包含序列为APDTR的肽，这是HMFG-1抗体所识别的PEM的抗原决定簇。EP483961A公开了HMFG-1抗体。
在将这类分子作为合适的侯选分子前，需要证实细胞的特异性，还需要表明，这种特异性仅通过第一靶抗体与靶的相互作用和第二步试剂(此情况中为HMFG-1抗体)与第一抗体的相互作用的组合所赋予。为此目的，第一抗体要被该介体特异性识别，因此需要进行将其与天然抗体区别的稳定的修饰。第一抗体用半抗原进行多重衍生可满足这种需要，还有利于放大，并为该介体提供一种次级靶阵列。
当然，也可使用其他介体，如Fab，F(ab’)2，dAbs，ScFv，二硫键连接的Fv或其他抗体片段。此外，该介体也以非免疫方式识别该组分，如以生物素-链亲和素方式识别。优选被识别的组分是小分子，但该组分也可以是多肽，肽，寡糖等。
本发明第一和第二方面的优选方面中，该化合物是一种融合化合物，包含靶细胞特异性部分或介体部分和细胞毒活性部分，其特征在于该细胞毒活性部分是组成型活化的caspase，或者与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
“融合化合物”包括下述化合物，其包含一个或多个功能不同的部分，其中这些不同的部分被包含于由重组DNA技术所产生的一条多肽链内。
替代的，本发明化合物的靶细胞特异性部分或介体部分与细胞毒活性部分是独立的部分，通过使多肽交联的任何一种传统方式连接在一起，如O’Sullivan等，Anal.Biochem.(1979)100，100-108一般性描述的。例如，抗体部分可富含巯基基团，而酶部分与一种双功能试剂反应，该双功能试剂可与那些巯基基团反应，如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。酰氨键和硫醚键，例如用间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的那些，通常在体内比二硫键更稳定。
本发明的第三方面提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明第一或第二方面的化合物，或者其靶细胞特异性部分，介体部分或细胞毒活性部分。
“核酸分子”包括DNA，cDNA和mRNA分子。
本发明第四方面提供了制备本发明第一和第二方面的化合物的方法，所述方法包括在宿主细胞内表达一种或多种本发明第三方面的核酸分子，并从中分离该化合物。
优选本发明化合物的两个部分作为融合化合物由重组DNA技术产生，其中一段DNA包含编码本发明化合物两个部分的独立的区域，二者或者相邻，或者通过一个编码接头肽的区域所隔开，该接头肽不破坏该化合物的所需特性。利用重组DNA技术制备本发明化合物的好处是多方面的。首先，其可使化合物的两个部分的连接高度精确。第二，“异寡聚体”化合物的构建可由同一宿主中不同重组DNA分子的表达所控制，这些DNA分子编码该“异寡聚体”的各种不同亚基类型。
“异寡聚体”是指下述化合物，其中两种或多种不同的细胞特异性部分连接到可寡聚化的相同或不同的亚基上。两种化合物A和B(各具有不同的靶细胞特异性部分，但是具有共同的可寡聚化的第二部分)在相同宿主细胞中表达，将产生化合物混合群。例如，如果该共同的第二部分可二聚化，将产生三种可能的化合物：A2，AB和B2，相应比率为1∶2∶1。
可通过两步亲和层析将具有每种细胞特异性部分的所需化合物(即AB)分离出来。
将化合物的混合物加载到特异于A的亲和柱，将使A2和AB结合。将这些化合物从该第一柱中洗脱，然后加载到特异于B的亲和柱。结果导致AB，而非A2，结合于该柱。最后，洗脱所需产物AB。
当然，所用的亲和柱的顺序并不重要。
分离具有两个或多个不同结合位点的化合物的相同原理也可应用于将所需化合物从其他异寡聚体的混合物中纯化。
可想象的，该化合物的两个部分可完全或部分地重叠。
然后在合适的宿主中表达DNA，以产生包含本发明化合物的多肽。因此，编码组成本发明化合物的多肽的DNA可根据已知技术使用，根据本文所述进行适当修饰，构建表达载体，然后将该表达载体用于转化合适的宿主细胞，从而表达并产生本发明的多肽。这类技术包括在以下美国专利中公布的技术：1984年4月3日授权于Rutter等的US4440859，1985年7月23日授权于Weissman等的US4530901，1986年4月15日授权于Crowl等的US4582800，1987年6月30日授权于Mark等的US4677043，1987年7月7日授权于Goeddel等的US4678751，1987年11月3日授权于Itakura等的US4704362，1987年12月1日授权于Murrray等的US4710463，1988年7月12日授权于Toole Jr.等的US4757006，1988年8月23日授权于Goeddel等的US4766075，1989年3月7日授权于Stalker等的US4810648，所有这些都为参考目的引入本文。
编码组成本发明化合物的多肽的DNA可与多种其他DNA序列相连以引入合适的宿主。该伴随DNA应基于宿主的性质，DNA引入宿主的方式，以及是希望以附加体形式维持还是希望整合。通常，DNA以表达所合适的方向和正确的阅读框插入表达载体，如质粒。如需要，DNA可连接于所需宿主可识别的合适的转录和翻译调控核苷酸序列，尽管这种控制在表达载体内一般都存在。然后将该载体通过标准技术引入宿主。一般，并非所有的宿主都将被载体所转化。因此，需要选择被转化的宿主细胞。一种选择技术涉及将具有任何必需的控制元件的DNA序列引入表达载体，该DNA序列在转化的细胞中编码可选择的性状，如抗生素抗性。或者，这种可选择性状的基因可位于另一个载体上，该载体用于共转化所需的宿主细胞。
然后将本发明的重组DNA所转化的宿主细胞，在本领域技术人员根据本文所述而了解的适当条件下培养足够长的时间，以许可该多肽的表达，然后回收该多肽。
已知许多表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，酵母(如啤酒糖酵母和巴斯德毕赤氏酵母)，丝状真菌(如曲霉属)，植物细胞，动物细胞(如COS-1，COS-7，CHO，NIH 3T3，NSO和BHK细胞)以及昆虫细胞(如果蝇属，SF9细胞)。
这些包括一个复制子(如原核复制子)的载体也可包括合适的启动子，如可指导基因在转化的细菌宿主细胞(如大肠杆菌)中表达(转录和翻译)的原核启动子。
启动子是一种由DNA序列所形成的表达控制元件，其许可RNA聚合酶的结合和转录的发生。与细菌宿主实例相容的启动子序列通常提供于质粒载体中，该质粒载体包含便于插入本发明DNA区段的限制性位点。
典型的原核载体质粒是pUC18，pUC19，pBR322和pBR329(可获自Biorad Laboratories，Richmond，CA，USA)，pTrc99A和pKK223-3(可获自Pharmacia Piscataway，NJ，USA)和pET系统(T7启动子，Novagen Ltd)。
典型的哺乳动物细胞载体质粒是pSVL，可获自Pharmacia Piscataway，NJ，USA。该载体使用SV40晚期启动子驱动克隆基因的表达，在产生T抗原的细胞(如COS-1细胞)中有最高的表达水平。
可诱导的哺乳动物表达载体的一个例子是pMSG，也可从Pharmacia获得。该载体使用小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列的糖皮质激素-可诱导型启动子驱动克隆基因的表达。
有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可获自Stratagene Cloning System，La Jolla，CA 92037，USA。质粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIps)，包含酵母可选择的标记his3，trp1，leu2和ura3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCps)。
转化酵母细胞(如毕赤氏酵母属)的其它有用载体包括2μ质粒pYX243(可获自R和D Systems Limited)以及整合载体pPICZ系列(可获自Invitrogen)。
发展了多种方法用于将DNA与载体通过互补粘性末端可操作地连接。例如，可将互补的同聚物序列(tract)添加至将要插入载体DNA的DNA节段。然后该载体和DNA节段通过互补同聚物尾之间的氢键连接，形成重组的DNA分子。
包含一个或多个限制性位点的合成接头提供了另一种将DNA节段连接于载体的方法。该DNA节段，如前述由内切核酸酶限制性消化所产生，用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，用酶的3’-5’外切核酸酶活性去除突出的3’单链末端并用这些酶的聚合活性填充3’凹端。
这些活性的组合因此产生平端的DNA节段。这种平端的节段再与高摩尔过量的接头分子在酶的存在下孵育，该酶可催化平端DNA分子的连接，如噬菌体T4 DNA连接酶。因此，反应的产物是在其末端带有多聚接头序列的DNA节段。然后用合适的限制性酶剪切这些DNA节段，将其连接于表达载体，该表达载体已用酶剪切产生了与这些DNA节段相容末端。
包含多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可购自多种来源，包括International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USA。
编码本发明多肽的DNA的优选修饰方式是使用如Saiki等(Science 239，487-491)公开的聚合酶链式反应。
该方法中，将进行酶法扩增的DNA侧翼是两个特异性寡核苷酸引物，这两个引物本身掺入该扩增的DNA。所述特异性引物可包含限制性内切核酸酶识别位点，其用于利用本领域已知方法克隆至表达载体内。
考虑用于实施本发明的典型酵母属是毕赤氏酵母属(Pichia)，糖酵母属(Saccharomyces)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，假丝酵母属(Candida)，球拟酵母属(Torulopsis)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，固囊酵母属(Citeromyces)，Pachysolen，Debaromyces，梅奇酵母属(Metschunikowia)，红冬孢属(Rhodosporidium)，Leucosporidium，Botryoascus，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，拟内孢霉属(Endomycopsis)等。优选的属选自毕赤氏酵母属，糖酵母属，克鲁维氏酵母属，Yarrowia和汉逊氏酵母属。糖酵母属的例子是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，意大利糖酵母(Saccharomyces italicus)和鲁氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)。克鲁维氏酵母属的例子是脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)。汉逊氏酵母属的例子是多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)，异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)和碎囊汉逊氏酵母(Hansenula capsulata)。Yarrowia lipolytica是合适的Yarrowia种属的一个例子。
转化啤酒糖酵母的方法主要由EP251744，EP258067和WO90/01063所述，均在此为参考目的引用。
啤酒糖酵母的合适启动子包括与以下相关的启动子，包括PGK1基因、GAL1或GAL10基因、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡萄糖激酶、α-支配因子信息素、a-支配因子信息素的基因，PRB1启动子，GUT2启动子和涉及5’调节区的部分与其他启动子5’调节区的部分杂合或者与上游活化位点杂合的杂合启动子(如EP-A-258067的启动子)。
转录终止信号优选真核基因的3’侧翼序列，其包含转录终止和聚腺苷酸的正确信号。适当的3’侧翼序列可以，例如，是与所用的表达控制序列天然相连的基因的3’侧翼序列，即相应于该启动子。或者，其可以是不同的，在这种情况中优选啤酒糖酵母AHD1基因的终止信号。
本发明也涉及用本发明多核苷酸载体构建体转化的宿主细胞。该宿主细胞可以是原核或真核。细菌细胞是优选的原核宿主细胞，通常是大肠杆菌菌株，如大肠杆菌菌株DH5(可获自Bethesda Research Laboratories Inc.，Bethesda，MD，USA)和菌株RR1(可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)Rockville，MD，USA(ATCC 31343))。优选的真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，优选脊椎动物如来自小鼠，大鼠，猴或人成纤维细胞系的细胞。优选的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(可获自ATCCCCL61)，NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(可获自ATCC CRL1658)和猴肾衍生的COS-1细胞(可获自ATCC CRL1650或WSφ细胞)。
用本发明的DNA构建体转化合适的宿主细胞通过众所周知的方法实现，所用方法一般基于所用载体的类型。对于原核宿主细胞的转化，参见，如Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110(1972)；和Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， ColdSpring Harbor，NY(1989)。酵母细胞转化的说明见于Sherman等，Methods InYease Genetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1986)。Beggs的方法(Nature，275：104-109(1978))也可使用。对于脊椎动物细胞，用于转染细胞的试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体制剂可从StratageneCloning System，或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877，USA获得。
被成功转染的细胞，即包含本发明DNA构建体的细胞，可通过众所周知的方法鉴定。例如，可以培养引入了本发明表达构建体的细胞以获得本发明的多肽。用Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975)或Berent等，Biotech.，3：208(1985)的方法，可收集，裂解细胞，并检测其DNA内容物是否存在该DNA。或者，可利用抗体如下述检测上清中是否存在该蛋白。
除了直接分析重组DNA的存在与否，当该重组DNA能指导该蛋白的表达时，也可通过众所周知的免疫方法证实成功的转化。例如，被表达载体成功转化的细胞产生表现出合适抗原性的蛋白。收集疑为被转化的细胞样品，并用合适抗体分析蛋白。
因此，除了转化的宿主细胞本身，本发明也考虑营养培养基中这些细胞的培养物，优选单克隆(克隆上是同源的)的培养物，或者来源于单克隆培养物的培养物。优选该培养物也包含该蛋白。
用于培养转化宿主细胞的营养培养基是本领域众所周知的，可购自多种商业途径。
本发明第五方面提供了表达本发明第一或第二方面的化合物或其靶细胞特异性部分，介体部分或者细胞毒活性部分物的载体，所述载体包含本发明第四方面的核酸分子。
本发明第六方面提供了包含本发明第四方面核酸分子或本发明第五方面载体的宿主细胞。
优选，该宿主细胞是细菌细胞或酵母细胞。
本发明第七方面提供了药物组合物，其包含本发明第一或第二方面的化合物和一种可药用载体或赋形剂。
本发明的化合物和组合物以任何合适的方式给药，通常是肠胃外，例如静脉内，腹膜内或，优选(对于膀胱癌)膀胱内给予，以标准的无菌无热原质的稀释剂和载体(例如当静脉给予时的等渗盐水溶液)制剂形式。
本发明第八方面提供了用于医药方面的本发明第一或第二方面的化合物，或者本发明第七方面的组合物。
本发明的化合物和组合物可用于治疗患有任何与细胞群功能紊乱有关的疾病的患者，所述化合物和组合物选择性地靶向并摧毁患者体内的所述细胞群。例如，所述化合物和组合物可用于治疗癌症，如乳腺、卵巢、肺、胃、小肠、血液等的癌症。因此，抗肿瘤细胞抗原的抗体可用于将具有caspase凋亡诱导活性的细胞毒活性部分送递到肿瘤细胞。使用在与靶抗原接触后内化的抗体，以便细胞毒活性部分可进入肿瘤细胞的胞浆中，它在那里引发凋亡级联。
原则上，本发明的化合物和组合物可用于治疗任何哺乳动物，包括宠物如狗和猫，以及农业上重要的动物，如牛、马、绵羊和猪。
优选该患者是人。
本发明进一步的方面提供了本发明第一或第二方面的化合物在制备药物方面的应用，该药物用于治疗与细胞群功能紊乱相关的疾病。
优选该药物用于治疗癌症。
本发明的另一方面提供了一种治疗患者的方法，该患者具有待被破坏的靶细胞，所述方法包含给予所述患者以有效治疗剂量的本发明化合物或组合物。
优选该患者患有癌症。
本发明现在将参照以下附图和实施例进行详细阐述：
图1显示各种类型的本发明化合物的图例。
图2显示表达HMFG1 Fab-caspase融合蛋白的基因的构建。步骤A到G由以下的文本说明。注意最终的构建体pET20HMFGLSCasp3在Bpul102 I位点包含VL-CL表达盒。以同样方式利用pET21b作为起始载体，构建了另外一个构建体，其缺少细胞质表达所需的pel B分泌信号，最终的克隆被称为pET21HMFGLSCasp3。
图3显示构建体的连续的核苷酸序列，其当在大肠杆菌中表达时，将装配成HMFG1 Fab/Caspase-3融合蛋白。该载体骨架是pET20b。序列表示如下：
Pel B分泌信号(下划线)1-66；VH区(斜体)67-420；CH1区421-714；接头肽(下划线)715-759；重排的caspase-3/CPP-32(斜体)760-1277；接头和聚组氨酸标签序列(下划线)1278-1320。附加的T7启动子，和核糖体结合位点1321-1461；Pel B分泌信号(下划线)1462-1527；VL区1462-1869；CL区1870-2193。
图2中所指的限制性位点在图3中以黑体表示。
图4图示表达scFv重排-caspase3融合蛋白的载体(pET20scFvCasp3)的构建。文中说明了步骤A到E。以同样方式利用pET21b作为起始载体，构建了另外一个构建体，其缺少细胞质表达所需的pel B分泌信号，最终的克隆被称为pET21 scFvSCasp3。图中显示了侧翼的氨基酸序列。
图5显示融合基因的连续的核苷酸和氨基酸序列，当该基因在大肠杆菌中表达时，将产生scFv-重排的caspase3融合蛋白。该载体骨架是pET20b。序列为：来自pET20b载体的pel B的末端(1-8)，scFv(9-731)，接头(732-752)，重排的caspase(753-1652)，His-标签(1653-1673)。
图6显示来自载体pET20scFvcasp3的scFv-重排的caspase3融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。P＝细胞沉淀，SN＝细菌上清，M＝分子量标记。时间范围是0到16小时。箭头所指为scFv-重排的caspase3蛋白的位置。
图7显示对scFv和scFv-重排的caspase3融合蛋白的纯CEA进行的ELISA，用抗-HIS抗体(Qiagen)显像。蛋白的起始浓度为PBS中1μg/ml。
图8显示来自SKOV3细胞的细胞裂解物中scFv和scFv-重排的caspase3融合蛋白的PARP分析，包括使全长PARP与测试蛋白在37℃孵育1小时。用Western印迹检测全长(箭头A，130 KDa)以及经剪切的PARP(箭头B，85KDa)。泳道如下：(1)细胞裂解物，未处理的，(2)用scFv-重排的caspase融合蛋白处理的细胞裂解物，(3)仅用scFv处理的细胞裂解物，(4)用纯caspase处理的细胞裂解物。检测抗体为抗-PARP(Santa Cruzbiochemicals Ltd.)。
图9显示7种选出的scFv-caspase3融合蛋白和单独的抗-CEA scFv的细胞毒活性。将50和10微升浓缩的细菌上清液加入LS174T并保持48小时。减去未经处理的细胞的背景值，以获得如Cytotox-96试剂盒所检测的实际的细胞裂解值。
实施例
(A) 组成型活化的caspase的表达
构建编码组成型活化的caspase的核酸分子
使用PCR扩增制备编码组成型活化的caspase-3的DNA构建体，其中小亚基和大亚基的排列顺序是颠倒的，如Srinivasula等(1998)J.Biol.Chem.273：10107-10111所述。
制备表达组成型活化的caspase-3和caspase-6的前体的cDNA
利用PCR制备编码组成型活化的caspase-3和caspase-6的前体的互补DNA(cDNA)。caspase-3的大亚基和小亚基用以下引物扩增，使用caspase-3DNA为模板。
caspase-3大亚基的正向引物：
ATGGAGAACACTGAAAACTCAG
caspase-3大亚基的反向引物：
GTCATCATCAACACCTCAGTCT
caspase-3小亚基的正向引物：
GGATCCATGATTGAGACAGACAGTGG
caspase-3小亚基的反向引物：
ATCAACTTCATCGTGATAAAAATAGAGTTC
将caspase-3 PCR产物分别克隆至pBluescript KS+的SmaI位点。然后将小亚基从KS+载体中用BamHI切出，插入第二个KS+载体的BamHI位点中，该第二个KS+载体包含大亚基。这样就将小亚基放置于与大亚基相同的读码框中。
组成型活化的caspase-6的前体以相似的方式扩增并克隆至KS+载体中。使用以下PCR引物并用caspase-6-His6作为模板：
caspase-6大亚基的正向引物：
ATGAGCTCGGCCTCGGGG
caspase-6大亚基的反向引物：
TTAATCTACTACATCCAAAGG
caspase-6小亚基的正向引物：
GGATCCATGGTAGAAATAGATGCAGCCTCCGTTTAC
caspase-6小亚基的反向引物：
ATCAATTTCAACGTGGTGGTGGTGGTGGTGC
为在细菌(BL21-DE3)中表达该组成型活化的caspase，用BamHI/XhoI切割其cDNA，然后亚克隆至细菌表达载体pET28a中，并与该载体中的His6-T7标签在同一读码框。
在哺乳动物细胞中表达组成型活化的caspase并分析凋亡
为了在哺乳动物细胞中表达组成型活化的caspase并分析其凋亡活性，用pET28a构建体作为模板，T7-标签引物和大亚基的反向引物作为引物，将所述Caspase扩增，然后亚克隆到哺乳动物双表达载体pRSC-LacZ(参见MacFarlane等，1997，J.Biol.Chem.272：25417-25420)中。该载体许可lacZ在劳氏肉瘤病毒启动子控制下表达，许可该待测DNA在巨细胞病毒启动子控制下表达。其也许可该待测cDNA通过T7启动子而体外转录。
为了分析凋亡，用该pRSC-LacZ构建体在不同的凋亡抑制剂的存在或不存在下转染MCF-7或293细胞。细胞在转染30小时后用β-半乳糖苷酶染色，并检查其凋亡的形态学表现。圆形蓝色凋亡细胞与总蓝色细胞的比率是凋亡的指示。
caspase的体外转录
caspase在[35S]甲硫氨酸的存在下，根据供应商的建议在体外用T7-RNA聚合酶偶联的TNT试剂盒(Promega)在兔网织红细胞裂解物中翻译，使用pRSC-LacZ或pET28a构建体作为模板。
(B) HMFG-1 Fab部分/caspase-3重组融合蛋白的构建和制备
1.(a)用caspase-3基因为模板，CASP3SMFW和CASP3SMBK(包含侧翼的BamHI和SalI限制性位点)为引物扩增(PCR扩增)小亚基的亚基因(参见表4)(图2，反应A)。
(b)用caspase-3基因为模板，CASP3LGFW和CASP3LGBK(包含侧翼的NcoI和BamHI限制性位点)为引物扩增(PCR扩增)大亚基的亚基因(参见表4)(图2，反应B)。
                                 表4
                构建HMFG1/caspase-3融合肽时使用的引物
CASP3SMFW
5’AACTGAGGATCCCCGATGGAGAACACTGAAAAC3’
CASP3SMBK
5’AGCTAAGTCGACGTCTGTCTCAATGCCACA3’
CASP3LGFW
5’AACTGCCATGGCGATCGATACAGACAGTGGTGTTGATGAT3’
CASP3LGBK
5’AGCTAAGGATCCACCATCAACTTCATCGTGATAAAAATAGAGTTCTTT 3’
HMFG1VHFM
5’GCATCTGACCATGGCCCAGGTGCAG3’
HMFG1VHBK
5’GCGCTTACCATGGAACCGCCTCCACCAGAGCCACCTCC
GCCTGAACCGCCTCCACCAACTTTCTTGTCCACCTT3’
HMFG1VLFM
5’TCATTCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAG3’
HMFG1VLBK
5’CCATGGCTACTAACACTCTCCCCTGGTGAAGCT3’
HMFGNCODEL1
5’CAGCCGGCAATGGCCGACATC3’
HMFGNCODEL2
5’GAGTGTTAGTAGCAATGGATATCGGAAATT3’
HMFGBPUFW
5’ATATCATGCTAAGCGAAATTAATACGACTCA3’
HMFGBPUBK
5’AATAACGCTCAGCCCATIGCTACTAACACTCTCC3’
2.大亚基的亚基因PCR产物用NcoI/BamHI限制性酶消化，连接至pET20b表达载体(Novagen，参见图2，反应C)的NcoI/BamHI位点。所得的质粒称为pET20LCasp3。小亚基的亚基因PCR产物经消化并连接至pET20LCasp3质粒的BamHI/SalI位点，形成质粒pET20LSCasp3(图2，反应C)。这种构建体可用于在大肠杆菌中表达单独的活性caspase-3，用于检测该重组酶的活性，并对其进行鉴定。
3.从HMFG-1杂交瘤(ICRF)的细胞培养物中，用RNAse easy试剂盒(Qiagen)获得HMFG-1 mRNA。利用寡-dT引物和RT-PCR试剂盒(Qiagen)对该mRNA进行反转录来制备HMFG-1 cDNA。HMFG-1免疫球蛋白的VH-CH1亚基因用PCR从该cDNA中扩增，使用引物HMFG1VHFW和HMFG1VHBK(图2，反应D)。用NcoI消化该PCR产物并连接于pET20LSCasp3的NcoI位点(图2，反应E)。得到的质粒为pET20HVHCasp3。
4.(4)中的HMFG-1 cDNA用于PCR扩增VL-CL亚基因，使用引物HMFG1VLFW和HMFG1VLBK，以制备侧翼具有NcoI位点的表达盒。用NcoI消化该PCR产物，并将其连接于pET20b的NcoI位点。根据Amersham-Pharmacia诱变试剂盒(第二版)的方案，通过寡定点(oligodirected)诱变消除这两个NcoI位点，所用引物为HMFGNCODEL1和HMFGNCODEL2。将得到的质粒用做模板，用引物HMFGBPUFW和HMFGBPUBK(侧翼包含Bpu1102 I位点)扩增该表达盒，将其克隆至pET20VHCasp3中(图2，反应F)。用Bpu1102 I消化该PCR产物，并连接于pET20HVHCasp3的Bpu1102 I位点(图2，反应G)。得到的质粒是一个双顺反子载体，其表达HMFG-1 Fab-Caspase3融合蛋白，被称为pET20HMFGLSCasp3。
5.替代的，可根据同样的流程(步骤1到5)构建融合蛋白，但使用载体pET21d进行胞质表达。所用的大肠杆菌菌株是BL21trxb(Novagen)。
在这种替代方法中使用的大肠杆菌菌株BL21trxb不含有T7 RNA聚合酶基因(即其并非DE3的衍生物)。因此，源于pET-型载体的表达通过使细胞生长于包含100μg/ml氨苄青霉素的2TY培养基中，直至光密度为0.8(37℃)来诱导。接下来，加入(以感染复数为5)M13-T7pol病毒(Invitrogen)，使培养物生长1小时。然后加入IPTG至终浓度为1mM，然后再加入氨苄青霉素(至100μg/ml，假设起初加入的氨苄青霉素已被降解)。继续诱导3到5个小时。
6.用氯化钙化学法将质粒pET20HMFGLSCasp3转化至BL21(λDE3)pLysE(Novagen)中(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2nd ed.)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)。将转化子铺在包含100μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的2TY琼脂平板上(Sambrook，同上)，在37℃生长过夜。挑取菌落，重新划于另一新鲜平板上。
7.挑取一个新鲜单菌落，37℃于5ml的包含100μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的2TY培养基中生长16小时。将该5ml的起始培养物接种于1升的同样培养基中，30℃生长，直到600nm吸收值检测的培养物密度为0.8-1.0之间。在该培养物中加入10ml 100mM IPTG(已过滤除菌，Sigma)，诱导融合蛋白的表达。该培养物在相同条件下继续生长3-5小时。
8.10000g 4℃离心收集细胞。保留上清，在Amicon小室(cell)中用30kDa的截留膜超滤浓缩至终体积为10ml。完整细胞用50ml的B-PER裂解试剂(Pierce)重悬，孵育30分钟以裂解细胞。裂解后的细胞25000g 4℃离心。将两种样品的上清用含2mM MgCl2和1M NaCl的磷酸盐缓冲液透析。透析包括5升溶液的5-6次更换，各在4℃进行3-4时。
9.从细胞提取物或培养物上清中纯化HuHMFG-1 Fab-caspase融合蛋白，即在铜(II)螯合Sepharose柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上通过金属亲和层析纯化。将样品集中，配制在PBS/1 M NaCl(柱缓冲液)中，加到约5ml树脂中。用100ml的柱缓冲液洗该柱。然后，用总体积200ml分布一个0-200mM的咪唑梯度。融合蛋白被80-150mM的咪唑洗脱。
10.亲和层析柱中获得的级分(参见步骤7)在两份平行的10％的SDS-PAGE凝胶中分析(Sambrook，同上)。第一份胶中，分离的样品通过western(参见Harlow和Lane，1988，Antibodies(1st ed.)Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)转移至硝酸纤维素膜。用鼠抗人caspase-3(Roche diagnostics)或鼠抗-多聚组氨酸(Qiagen)，然后用抗-小鼠辣根过氧化物酶(Harlow和Lane，同上)进行免疫印迹分析以确定该融合蛋白的存在与否。通过ECL(Amersham-Pharmacia Biotech)观察阳性信号。对于第二份胶，用考马斯亮蓝(Sigma)染色直接观察蛋白。汇集包含纯的融合蛋白的样品，用2x5升的磷酸盐缓冲液在4℃透析16小时。
11.将经过上述透析的蛋白超滤浓缩到1mg/ml，用特异于caspase-3的肽底物检测其活性。肽，如基于产荧光性-DEVD的肽(Calbiochem)，可用于pH7.4的磷酸盐缓冲液中。通过跟踪荧光的增加以及与如上制备的或购自Calbiochem的纯重组人caspase-3进行比较，监测其活性。用Bradford试验(Sambrook，同上)计算总蛋白浓度。
12.融合蛋白的抗原结合活性通过ELISA检测，使用粘蛋白-表达性肿瘤细胞(如MCF-7细胞系)，用戊二醛将其固定于96孔板上(参见Harlow和Lane，同上)。
(C) 检测小鼠模型中caspase-3的抗原(即PEM)-介导型送递
caspase的体内送递在裸鼠(室内(in-house)饲喂于Imperial College，London的生物医学研究中心(CBS))中得以检测。使用约2周龄的裸鼠，皮下移植了肿瘤，生长2周(参见Deonarain等，1997，Protein Engin.10，89-98)。使用的肿瘤细胞系是MCF-7。将该HuHMFG-1 Fab-caspase融合蛋白(100μl中10-100μg)通过小鼠尾静脉进行注射。每3-5天重复一次剂量，用测径器(calipers)测量肿瘤的三维大小，绘制肿瘤体积与时间的关系图，以评估肿瘤的退化。
(D) 使用caspase-3/huHMFG-1 Fab融合蛋白治疗卵巢癌
诊断有卵巢癌的患者用caspase-3/huHMFG-1 Fab融合蛋白静脉注射处理。典型的，每周给予1到100mg的剂量。
通过本领域众所周知的常规临床方法(如放射成像法)检测治疗应答。
(E) 构建表达scFv-重排的caspase3融合蛋白的载体
1.使用caspase-3基因为模板，用引物CASP3SMFW和CASP3SMBK(其包含侧翼的BamHI和SalI限制性酶切位点)(参见表4)，扩增(PCR扩增)小亚基的亚基因(图4，反应A)。
2.使用caspase-3基因为模板，用引物CASP3LGFW和CASP3LGBK(其包含侧翼的NcoI和BamHI限制性酶切位点)(参见表4)，扩增(PCR扩增)大亚基的亚基因(图4，反应B)。
3.用NcoI/BamHI限制性酶消化大亚基的亚基因PCR产物并连接于pET20b表达载体(Novagen，参见图4，反应C)的NcoI/BamHI位点。所得的质粒称为pET20LCasp3。消化小亚基的亚基因PCR产物并连接于pET20LCasp3质粒的BamHI/SalI位点，形成质粒pET20LSCasp3(图4，反应C)。这种构建体可用于在大肠杆菌中表达单独的活化caspase-3，用于检测该重组酶的活性和并对其进行鉴定。
4.包含MFE-23 scFv的载体pUC119MFE(R.Begent，Royal FreeHospital，London)用来提供scFv。该scFv作为NcoI表达盒用引物MFENCOFOR和MFENCOBAC(参见表5)扩增(图4，反应D)。将该scFv基因连接于pET20LSCasp3的NcoI位点，形成表达scFv-重排caspase3融合基因的载体pET20 scFv Casp3(图4，反应E)。完整scFv-重排caspase3基因融合体的DNA序列见于图5。
                                    表5
                用于构建ScFv-重排的caspase3融合蛋白的引物
MFENCOFOR
5’TATTGTTATCCATGGGGCAGGTGAAACTGCAGCAG3’
MFENCOBAC
5’TATTGTTACTCATGGAACCTCCAGAACCTCCCTGTTGCAGCTCCAGCTT3’
5.替代的，该融合蛋白可根据同样的流程(步骤1到4)构建，但使用载体pET21d进行胞质表达。所用的大肠杆菌菌株是BL21trxb(Novagen)，表达如下所述并且如Linardou等所述(2000，Int.J.Cancer 86，561-569)进行了修改。
(F) scFv-重排的caspase3融合蛋白的表达和纯化
1.用氯化钙化学法(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2nd ed.)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)将质粒pET20scFvCasp3转化至大肠杆菌BL21(λDE3)pLysE(Novagen)。将转化子铺在包含100μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的2TY琼脂平板上(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)，在37℃生长过夜。挑取菌落，重新划板于另一新鲜平板。
2.挑取一个新鲜的单菌落，37℃于5ml的包含100μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的2TY培养基中振荡培养16小时。用该5ml的起始培养物接种于1升的同样培养基中(30℃)，直到经600nm吸光度检测的培养物密度为0.8-1.0。在该培养物中加入10ml 100mM IPTG(已过滤除菌，Sigma)，诱导融合蛋白的表达。该培养物在相同条件下继续生长16小时。图6显示scFv-caspase融合蛋白表达的western印迹(用抗组氨酸标签的抗体，Qiagen检测)。4小时后其产生于细胞沉淀(P)和上清(SN)中，16小时后产量很明显(约1mg/L)。其具有正确的分子量(根据氨基酸序列推测的约62KDa)。
3.10000g 4℃离心收集细胞。保留上清，在Amicon小室中用30kDa的截留膜超滤浓缩至终体积为10ml。浓缩的上清用含2mM MgCl2和1M NaCl的磷酸盐缓冲液透析。透析包括5升溶液的5-6次更换，各在4℃进行3-4小时。
4.从培养物上清中纯化scFv-caspase融合蛋白，即在铜(II)螯合Sepharose柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上通过金属亲和层析纯化。汇集样品，配制在PBS/1M NaCl(柱缓冲液)中，加到约5ml带电荷的树脂中。用100ml的柱缓冲液洗该柱。然后，用总体积200ml分布一个0-200mM的咪唑梯度。融合蛋白被50-100mM的咪唑洗脱。
(G) scFv-重排的caspase3融合蛋白的鉴定
1.将经过以上纯化的纯融合蛋白形式(F)超滤浓缩到1mg/ml，如上法透析并用特异于caspase-3的肽底物检测其活性。肽，如基于产荧光性-DEVD的肽(Calibiochem)，可用于pH7.4的磷酸盐缓冲液中。通过跟踪荧光的增加以及与如上制备的或购自Calbiochem的纯重组人caspase-3进行比较，监测其活性。用Bradford试验(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2nd ed.)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)计算总蛋白浓度。
2.融合蛋白的抗原结合活性通过ELISA检测(Harlow和Lane，1988，Antibodies.1st ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)，使用固定在ELISA平板上的纯CEA。图7显示两种1μg/ml蛋白的样品的一些ELISA结果。它们显示scFv-caspase融合蛋白以及单独的scFv都结合CEA。
3.细菌表达的重排caspase3和scFv-重排的caspase3融合蛋白不剪切肽底物的类似物(Ac-DEVD-AMC，Calbiochem)，正如野生型caspase3一样。其他人(Prof.N.Lemoine，ICRF，未发表的工作)也提出了这一点。这可能因为该重排的caspase的底物特异性有微小的改变。这种重排的caspase-3当通过基因送递而过表达时对哺乳动物有细胞毒活效应(Prof.N.Lemoine，ICRF，未发表的工作)，暗示其体内底物特异性未被影响。事实上，当scFv-重排的caspase3融合蛋白与包含聚-ADP核糖结合蛋白(PARP，caspase3的一种天然底物)的人细胞裂解物孵育时也证明这一点的正确。图8显示PARP由scFv-重排的caspase3融合蛋白剪切(泳道2)，正如纯caspase3(泳道4)一样。
(H) scFv-重排的caspase3融合蛋白的细胞毒活性
将含有10％血清的DMEM培养基中104的CEA表达细胞(LS174T)接种于96孔平板，使其在5％CO2的湿润培养箱中37℃生长。用CEA阴性细胞系(KB)接种一相似的平板，在同样条件下生长。用细菌上清处理各孔，一式4份，该上清已在表达了单独的scFv或scFv-caspase融合蛋白后浓缩了5倍。挑取7个scFv-caspase克隆，它们的重组蛋白表达水平各有不同。只检测了一个scFv克隆，因其已充分鉴定并且已知对这些细胞系无细胞毒效应。将50或10μl的样品加入包含靶细胞的200μl完全培养基的各孔。scFv和scFv-caspase融合蛋白与这些细胞孵育48小时，用cytotox-96试剂盒(Promega)检测细胞的死亡。使用的对照是未处理的细胞以及经历总的细胞裂解的未处理细胞。
观察到(图9)单独的scFv的2个浓度对CEA阳性细胞无细胞毒活性。所检测的所有7个scFv-caspase克隆在低浓度(10μl)和高浓度(50μl)时对于LS174T细胞都有细胞毒活性。克隆6的细胞毒活性特别强，在48小时约杀灭75％的细胞。对于阴性细胞系(KB)没有效果，所有的标准误差均低于1.5％。
尽管CEA未有效内化，这些结果显示该重排的活性caspase3当与一种重组抗体一同靶向肿瘤细胞时是有细胞毒活性的。因此，技术人员应理解，使用能结合更容易内化的靶(如HMFG-1融合蛋白)的重排活性caspase3融合蛋白，将具有更大的细胞毒活性。

Claims (27)

1.包含靶细胞特异性部分和细胞毒活性部分的化合物，其特征在于该细胞毒活性第二部分是一种组成型活化的caspase或者与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
2.包含可识别靶细胞特异性分子的介体部分和细胞毒活性第二部分的化合物，其特征在于该细胞毒活性第二部分是一种组成型活化的caspase或者与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
3.权利要求1的化合物，其中该靶细胞特异性部分识别并选择性地结合肿瘤细胞抗原。
4.权利要求2的化合物，其中该介体部分识别权利要求1的化合物。
5.权利要求2或4的化合物，其中该介体部分识别的靶细胞特异性分子是衍生化的。
6.前述权利要求中任一项的化合物，其中该靶细胞特异性部分或该介体部分是抗体或其抗原结合片段。
7.前述权利要求中任一项的化合物，其中该靶细胞特异性部分通过与该靶细胞接触而内化。
8.前述权利要求中任一项的化合物，其中该靶细胞特异性部分或介体部分是HMFG-1抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求6到8中任一项的化合物，其中该抗体或其抗原结合片段是人源化的。
10.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分至少是组成型活化的caspase的催化活性部分。
11.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分是组成型活化的效应caspase，或与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
12.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分是组成型活化的caspase-3，caspase-6或caspase-7，或与所述caspase具有基本相同的凋亡诱导活性。
13.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分是哺乳动物来源的。
14.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分是天然产生的caspase的组成型活化的变体。
15.前述权利要求中任一项的化合物，其中该细胞毒活性部分能寡聚化。
16.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述化合物是融合的化合物。
17.分离的核酸分子，其编码权利要求1到16中任一项的化合物，或其靶细胞特异性部分，介体部分或细胞毒活性部分。
18.制备权利要求1到16中任一项的化合物的方法，所述方法包含在宿主细胞中表达一种或多种如权利要求17所述的核酸分子，并从该宿主细胞中分离该化合物。
19.在宿主细胞中表达权利要求1到16中任一项的化合物或其部分的载体，所述载体包含一种或多种如权利要求17所述的核酸分子。
20.由权利要求19的载体转化的宿主细胞。
21.药物组合物，其包含可药用载体或赋形剂和权利要求1到16中任一项的化合物。
22.权利要求1到16中任一项的化合物，用于医药。
23.权利要求1到16中任一项的化合物的用途，其用于制备药物，该药物用于治疗与细胞群功能紊乱相关的疾病。
24.权利要求23的用途，用于治疗癌症。
25.治疗含有待破坏的靶细胞的患者的方法，该方法包含给予患者有效治疗剂量的权利要求1到16中任一项的化合物。
26.权利要求25的方法，其中该患者是人。
27.权利要求25或26的方法，其中该患者患有癌症。
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