CN1420144A

CN1420144A - 酶法合成天然黑色素

Info

Publication number: CN1420144A
Application number: CN 01140572
Authority: CN
Inventors: 王敬文
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2001-11-19
Filing date: 2001-11-19
Publication date: 2003-05-28

Abstract

本发明为酶法合成天然产物黑色素(Melanins)新技术。1.从植物或真菌中制取酪氨酸氧化酶；2.以酪氨酸等一元酚衍生物为底物；3.控制酶促合成反应条件合成黑色素；4.加入乙酸铅等试剂，黑色素随蛋白质析出；5.用蛋白酶消化法精制纯化黑色素，用酶法合成天然产物黑色素。用酶法合成黑色素具有投资少、产率高、低成本、易精制纯化等特点，适合规模化生产。

Description

酶法合成天然黑色素

本发明属于生物化学制品范围，用酶促反应法生产黑色素(Melanins)。

黑色素(Melanins)是人体、动物、植物和微生物体内普遍存在的天然色素，在生物体内它是由苯丙氨酸在苯丙氨酸氧化酶的作用下被氧化成酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸酶(酚氧化酶类的一种)的作用下进一步氧化为二羟基苯丙氨酸，继而再环化为吲哚醌，最后聚合为黑色素，黑色素是一种带有醌基的大分子天然色素。苯丙氨酸→酪氨酸→多巴胺→→→吲哚醌→→黑色素

黑色素是一种天然色素，在轻工、化工、食品、化妆品等方面有重要的用途。目前制取黑色素有两种方法，一是从粮食如黑豆、黑芝麻、高粱等种皮经酸洗法制取的，产量小，成本高；二是发酵黑酵母(Saccharomyces niger Marpm)从酵母菌体分离制取的，菌种分离困难，设备复杂，投资巨大。本发明用酶促反应法生产黑色素简便易行、生产成本低、投资小、设备简单、产品纯度高。

酪氨酸酶的制备：将250g新鲜马铃薯洗净，切成小块，加入少量石英砂和PH7.8的磷酸缓冲液1000ml，在高速捣碎机中匀浆2分钟，80～120目尼龙布过滤，滤液4～6℃静置0.5～2小时，待淀粉沉淀到底部后，倾出上清夜，加入达到70％饱和度的硫酸铵，离心收集沉淀，得酪氨酸酶抽提物，置冰箱中保存备用。酪氨酸酶活性测定：0.05g酪氨酸加热溶解于100ml0.04％NaHCO₃溶液中，从中取出10ml加入30ml水于40℃水浴中保温。将酶粗提物溶于PH7.8磷酸缓冲液250ml。取5～25ml酶液加入到酪氨酸溶液中，40℃保温20～40分钟，并不停地振摇以保证供氧，反应液的颜色由红褐色变成黑色。反应结束时，向反应混合液中加入1ml 10％硫酸至酸性，终止试验。然后用0.1～0.01NKMnO₄进行滴定至无色为止。同时做对照试验，将酶与酪氨酸混合，并随即酸化后，立即滴定混合物。从试验中将新得到的消耗KMnO₄ml数减去对照样品消耗的ml数，以此计算酪氨酸酶活性。黑色素制备：0.1g酪氨酸溶于200ml 0.05％碳酸氢钠溶液中，在水浴上加热溶解，冷却至40℃，加入新鲜的酪氨酸酶制剂。在38～40℃保温40～60分钟进行酶促反应，期间快速搅拌或用气泵不停地冲气。反应混合液逐渐由红褐色变成黑色。待反应结束后，滴加10％三氯醋酸，酶蛋白和黑色素一起沉降到瓶底，过滤收集沉淀，得黑色素粗产物。再经稀酸、稀碱洗涤后，再用水洗至中性。将洗至中性的黑色素粗制品置于烧瓶中，加适量6N HCL回流8～20小时，水解其中的蛋白质，放置冷却，过滤出黑色素，用稀碱洗涤，最后水洗至中性，60℃烘干，即得黑色素。

实例1 500g真菌培养物加入500ml甘油，用高速捣碎机(10000rpm)匀桨1分钟，200目尼龙布挤滤，弃去滤渣。滤液置于5℃冰箱中保存备用。

0.1g酪氨酸溶于200ml硼酸缓冲液PH8.0中，在水浴中加温至38～40℃，加入真菌甘油匀浆液5～15ml，快速搅拌，反应混合液很快变成红色，随时间延长，由红色变成褐色，最后为黑色，继续保温40～60分钟，滴加10％三氯乙酸停止反应，黑色素随酶蛋白沉淀下来。经抽滤，沉淀于60℃烘干得黑色素粗制品0.125克。实例2 500g新鲜马铃薯洗净，切成碎块，加入少量石英砂和磷酸缓冲液PH8.0 1000ml，匀浆，80～120目尼龙布过滤，滤液于4～6℃静置2小时，倾出上清夜，加入硫酸铵使达到70％饱和度，离心收集蛋白质沉淀，得酪氨酸氧化酶粗提物。

0.1g酪氨酸和0.5g碳酸氢钠加入1000ml水中，加热至溶解，冷却至40℃，加入酪氨酸氧化酶粗制品250～300mg，边保温边搅拌，40℃保温1小时后，滴加5～10％醋酸铅，出现黑色絮状沉淀，抽滤，水洗3～5次，60℃烘干，得黑色素1.132g。实例3 0.5g酪胺溶于1000ml 0.05％碳酸氢钠中，于水浴中加热至40℃，加入实例1中所制备的真菌甘油匀浆液30ml，加数滴甲苯，快速搅拌，40℃保温40～60分钟，取出放置室温，滴加5％醋酸铅至出现絮状沉淀，过滤收集沉淀，60℃烘干，得黑色素粗制品0.513g。实例4 0.5g邻苯二酚溶于1000ml硼酸缓冲液PH8.0中，于水浴中加热至40℃，加入实例1中所制备的甘油酶液30ml，加数滴甲苯，快速搅拌，40℃保温40～60分钟，取出放置至室温，滴加10％三氯乙酸至出现絮状沉淀，过滤收集沉淀，60℃烘干，得黑色素粗制品0.128g。实例5 将按实例1，2，3等所获得的黑色素粗制品研磨或粉碎成细粉末，过240目筛，每g黑色素粗制品悬浮于100ml柠檬酸缓冲液PH5.4中，加入蛋白酶制剂100mg，35℃保温30分钟，5000rpm离心收集黑色素，用水洗涤3次，经检测无蛋白反应，黑色素纯度达95～98％。

Claims

1、一种合成天然黑色素的方法，其特征在于该方法利用酪氨酸氧化酶的酶促合成反应将酪氨酸及一元酚衍生物合成为黑色素。

2、根据权利1要求所述的酶促合成黑色素法，其特征在于从植物和真菌中制取酪氨酸氧化酶。

3、根据权利要求2所述的酶，其特征在于用甘油浸提或保存在甘油中能长期保持其活力。

4、根据权利要求1所述的一元酚衍生物，其特征在于所说的一元酚衍生物是酪胺、邻苯二酚、邻苯甲酚之一种或共存混合物。

5、根据权利要求1所述的酶促合成反应，其特征在于反应条件是：1)温度34～42℃2)PH值7.2～8.63)酶浓度＞10mg/升4)底物(酪氨酸及其衍生物)＞10mg/升5)充足供氧6)反应时间30～60分钟

6、根据权利要求1所述的酶促合成黑色素，其特征在于酶促反应结束后，滴加三氯乙酸溶液或醋酸铅溶液，使黑色素随酶蛋白絮状析出。

7、根据权利要求1所述酶促合成黑色素，其特征在于用蛋白酶消化与黑色素一起沉淀的变性酶蛋白，进行黑色素精制纯化。