CN103602649B - 一种木瓜蛋白酶的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木瓜蛋白酶的提纯方法,包括如下步骤：1）往木瓜浆中加入水，得到木瓜浆溶液;2）添加复合酶Extyme-A;3）板框过滤：将经过步骤2）处理后的木瓜浆溶液进行板框过滤；4）离心：滤液进行沉降离心，收集离心液；5）添加复合酶Extyme-B;6）粗滤:将离心液采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤；7）精滤:将粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩得到木瓜蛋白酶浓缩液；8）真空干燥，得到木瓜蛋白酶。本发明能够明显改善过滤效果，使得粗滤和超滤变得流畅，缩短过滤时间，提高工作效率和提高酶活收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种木瓜蛋白酶的提纯方法。
背景技术
木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶。未成熟青木瓜果实内含量丰富，该酶活力高，热稳定性好，具有天然、卫生、安全等特点，在食品、医药、化妆品、皮革和纺织等领域广泛运用，需求量和价格逐年上升。
目前，生产木瓜蛋白酶常用提取方法包括：1、烘干或喷雾干燥法，2、絮凝法、3、盐析法、4、超滤精制法。
方法1所述的工艺较为简单和原始，缺点是温度高对酶活性破坏大，酶活收率低，杂质多，得到酶活约100万/克左右。
方法2所述的絮凝法一般采用丹宁和多糖类物质等将蛋白酶等物质沉淀下来，该方法对蛋白酶沉淀专一性不强，沉淀物含杂质多，酶活收率也只有70%，酶活力为100-150万/克。
方法3是用50%以上硫酸铵盐析，得到的酶纯度较高，但高浓度的盐对酶活破坏也较大，产品酶活为200万U/左右，由于产品含盐分较多，灰分增加，生产中脱盐需要较大量水，对环境保护不利。
方法4是一种较先进的提取技术，国内生产精制木瓜酶主要采用超滤精制法。该方法提取木瓜蛋白酶纯度高，酶活达250万以上，收率达到90%以上，得到酶活较高，是木瓜蛋白酶精制提取方向。该方法存在问题是，由于木瓜浆含有胶质、脂质、淀粉类物质较多，搅拌提取工序木瓜酶溶解释放不完全，后续板框过滤渣较多，滤液不清；膜分离过滤阶段由于滤膜孔径非常小，易造成过滤膜堵塞，过滤速度慢，影响木瓜蛋白酶的滤过和分离，生产过程要停机对滤膜进行清洗，导致一定数量的木瓜酶损失，降低酶活收率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种木瓜蛋白酶的提纯方法，能够明显改善过滤效果，使得粗滤和超滤变得流畅，缩短过滤时间，提高工作效率和提高酶活收率。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种木瓜蛋白酶的提纯方法,其特征在于包括如下步骤：
1）往木瓜浆中加入水，搅拌均匀，得到木瓜浆溶液，然后调节木瓜浆溶液的pH值为6-7;
2）添加复合酶Extyme-A：按木瓜浆重量的0.2-0.6%添加复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中，搅拌反应5小时；所述复合酶Extyme-A由按酶活力计的以下原料混合制备而成：果胶酶8000U/g、α-淀粉酶2000U/g、β-葡聚糖酶25000U/g;
3）板框过滤：将经过步骤2）处理后的木瓜浆溶液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液；所述的板框过滤采用市售产品，佛山金凯地过滤设备有限公司生产的820型板框压滤机。
4）离心：将步骤3）收集到的滤液进行沉降离心，收集离心液；
5）添加复合酶Extyme-B：按离心液重量的0.1%-0.2%添加复合酶Extyme-B到离心液中;搅拌至酶完全溶解，混合均匀;所述复合酶Extyme-B由按酶活力计的以下原料混合制备而成：碱性蛋白酶50000U/g、果胶酶6000U/g;
6）粗滤:将经过步骤5）处理后的离心液采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号MFOc），聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um，操作压力0.1MPa；
7）精滤:将经过步骤6）粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号USIb1），聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到木瓜蛋白酶浓缩液；
8）真空干燥：将步骤7）得到的木瓜蛋白酶浓缩液进行抽真空干燥，得到木瓜蛋白酶。
实现本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：
实现本发明的一种实施方式是：在步骤1）中，所述木瓜浆与水的重量比为1：5，水温控制在25-35℃。
实现本发明的一种实施方式是：在步骤2）中，按木瓜浆重量的0.4-0.6%添加复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中。
实现本发明的一种实施方式是：在步骤2）中，按木瓜浆重量的0.5%添加复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中。
实现本发明的一种实施方式是：在步骤4）中，控制转速为1500rpm，离心时间为25-30分钟。
本发明的有益效果在于：
本发明生产工艺操作，与现有技术中的超滤精制法生产工艺比较，具有以下优势：缩短生产时间，工作效率提高，生产过程操作工艺稳定、易控制，沉降离心液清澈透明，木瓜酶纯度高，成品酶活最高达到350万U/g，提取总收率平均达95%。具体的比较结果可参照表1。
表1 现有常规生产工艺与实施例1所述的生产工艺比较
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1：
一种木瓜蛋白酶的提纯方法,包括如下步骤：
1）取新鲜木瓜浆100kg,木瓜浆的蛋白酶活力为15.0万U/g，投入搅拌罐，加500kg水，测量水温为30℃，搅拌均匀，调节PH值为6.5。
2）添加复合酶Extyme-A：按木瓜浆重量的0.5%添加500g复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中，为确保复合酶溶解均匀，添加前先用少量水溶解再倒入提取罐。搅拌反应5小时；所述复合酶Extyme-A由按酶活力计的以下原料混合制备而成：果胶酶8000U/g、α-淀粉酶2000U/g、β-葡聚糖酶25000U/g;复合酶Extyme-A可分解木瓜浆含有胶质等不溶物质，在提取过程溶解木瓜浆阶段，加入该酶能明显提高酶的溶出率，提高提取率，在板框压滤和沉降离心收集的酶液多，透光率高，渣少。
3）板框过滤：将经过步骤2）处理后的木瓜浆溶液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液574kg；压榨液酶活2.58万U/g，酶活提取收率98.7%。渣的重量为12.9kg。所述的板框过滤采用市售产品，佛山金凯地过滤设备有限公司生产的820型板框压滤机。
4）离心：将步骤3）收集到的滤液进行沉降离心，转速为1500rpm，离心时间为30分钟，收集离心液，共568kg，检测透光率：83%。
5）添加复合酶Extyme-B：按离心液重量的0.1%添加575g复合酶Extyme-B到离心液中;搅拌至酶完全溶解，混合均匀;所述复合酶Extyme-B由按酶活力计的以下原料混合制备而成：碱性蛋白酶50000U/g、果胶酶6000U/g;过滤阶段添加复合酶Extyme-B助滤，能够明显改善过滤效果，粗滤和超滤流畅，缩短过滤时间，提高工作效率和提高酶活收率。
6）粗滤:将经过步骤5）处理后的离心液采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号MFOc），操作压力0.1MPa；
7）精滤:将经过步骤6）粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，聚砜超滤膜的截留分子量为10K（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号USIb1），操作压力0.1MPa；得到木瓜蛋白酶浓缩液28.2kg；
其中，粗滤和精滤共耗时3.5小时。
8）真空干燥：将步骤7）得到的木瓜蛋白酶浓缩液进行抽真空干燥，得到木瓜蛋白酶干品：4.13kg，酶活力:349.0万U/g，总酶活收率:96.1%。
测试实施例2：添加复合酶Extyme-A提取木瓜蛋白酶试验。
取木瓜浆1000g，活力为15.0万U/g，加水5000g搅拌提取，提取步骤添加复合酶Extyme-A，按实施例1之步骤（1）操作，搅拌5小时后离心，分别称量液重和渣重，检测离心液木瓜酶活力。
表2
如表2所示，添加复合酶Extyme-A可提高木瓜蛋白酶的溶出率，与不添加Extyme-A空白对照相比，添加0.4-0.6%的复合酶Extyme-A，可提高16%的木瓜蛋白酶的酶活收率，提取液离心分析，残渣重量与空白比减少接近40%；其中，添加0.5%的复合酶Extyme-A的综合效果最经济，继续提高添加量对酶活收率提高效果不显著，因此没必要增加复合酶Extyme-A的量。
木瓜蛋白酶活力检测方法：参照国家药品标准WS1-XG-(HD-0796)-2002木瓜蛋白酶活力测定。木瓜蛋白酶活力定义：在测定条件下，每分钟水解酪蛋白释放出1ug酪氨酸所需要酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种木瓜蛋白酶的提纯方法, 其特征在于包括如下步骤：
1）往木瓜浆中加入水，搅拌均匀，得到木瓜浆溶液，然后调节木瓜浆溶液的pH值为6-7;
2）添加复合酶Extyme-A：按木瓜浆重量的0.4-0.6%添加复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中，搅拌反应5小时；所述复合酶Extyme-A由按酶活力计的以下原料混合制备而成：果胶酶8000U/g、α-淀粉酶2000U/g、β-葡聚糖酶25000U/g;
3）板框过滤：将经过步骤2）处理后的木瓜浆溶液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液；
4）离心：将步骤3）收集到的滤液进行沉降离心，收集离心液；
5）添加复合酶Extyme-B：按离心液重量的0.1%-0.2%添加复合酶Extyme-B到离心液中;搅拌至酶完全溶解，混合均匀;所述复合酶Extyme-B由按酶活力计的以下原料混合制备而成：碱性蛋白酶50000U/g、果胶酶6000U/g;
6）粗滤: 将经过步骤5）处理后的离心液采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um，操作压力0.1MPa；
7）精滤: 将经过步骤6）粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到木瓜蛋白酶浓缩液；
8）真空干燥：将步骤7）得到的木瓜蛋白酶浓缩液进行抽真空干燥，得到木瓜蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提纯方法，其特征在于: 在步骤1）中，所述木瓜浆与水的重量比为1：5，水温控制在25-35℃。
3.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤2）中，按木瓜浆重量的0.5%添加复合酶Extyme-A到木瓜浆溶液中。
4.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤4）中，控制转速为1500rpm，离心时间为25-30分钟。
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