CN1410058A

CN1410058A - 地非三唑在制备治疗恶性肿瘤疾病药剂中的应用

Info

Publication number: CN1410058A
Application number: CN 02145475
Authority: CN
Inventors: 何俏军; 方瑞英
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2002-11-14
Publication date: 2003-04-16
Anticipated expiration: 2022-11-14
Also published as: CN1187047C

Abstract

本发明公开了地非三唑在制备治疗恶性肿瘤疾病药剂中的应用。地非三唑，为三氮唑类化合物，化学名3－(2－乙基苯基)－5－(3－甲氧苯基)－1H－1，2，4－三氮唑。地非三唑对多种肿瘤细胞，包括对人卵巢癌HO－8910细胞、小鼠淋巴样瘤P388细胞、人口腔表皮样癌KB细胞、回盲肠腺癌HCT－116细胞、慢性髓原白血病K562细胞、人肺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人宫颈癌Hela细胞、人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞、原髓细胞白血病HL－60细胞、前列腺癌PC－3细胞、人肝癌Bel－7402细胞等12种肿瘤细胞均具有较强的体外抑制作用，可在制备多种恶性肿瘤药中应用。

Description

地非三唑在制备治疗恶性肿瘤疾病药剂中的应用

技术领域

本发明涉及地非三唑在制药领域中的新用途。

背景技术

地非三唑最早由意大利Galliani等于1978年报道其合成路线，并发现具有抗生育活性。地非三唑作为终止早孕已有报道和应用。该药在意大利无正式名称，Galliani等用代号名为DL111-IT。经检索曽有4项国外专利，即西德专利2819372(1978)，2943326(1980)；美国专利4379155(1978)，4370336(1983)。公布了3，5-双取代1H-1，2，4三氮唑衍化物的制备方法，共40多个衍化物(其中有DL111-IT)，并证明对动物具有抗生育作用和镇静作用。

地非三唑(Diphenytriazol，简称DPTZ)，化学名为3-(2-乙基苯基)-5-(3-甲氧苯基)-1H-1，2，4-三氮唑，英文化学名为3-(2-ethylphenyl)-5-(3-methoxyphenyl)-1H-1，2，4triazol。其化学结构式为：

分子式为：C₁₇H₁₇N₃O 分子量为：279.34

本品的理化性状：白色结晶性粉末。无臭，无味，在无水乙醇，氯仿中易溶，植物油中微溶，难溶于水。熔点：76～81℃。

发明内容

本发明的目的是提供地非三唑治疗恶性肿瘤疾病的新用途，即在制药中的新应用。

具体说，本发明涉及地非三唑作为制备治疗卵巢癌，宫颈癌，淋巴瘤，白血病，肺癌，肝癌，大肠癌，前列腺癌，鼻咽癌，口腔癌，恶性横纹肌瘤等多种恶性肿瘤疾病的药中应用。

制备地非三唑注射液

取注射用植物油(茶油，大豆油等)1000ml，在150℃干热灭菌1小时，放冷至50℃，取出部分油液加入1g地非三唑，搅拌使溶解，最后添加溶媒至全量。用干燥的3号垂熔漏斗过滤，灌封于1ml干燥的灭菌安瓿中，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，制成每支安瓿1ml含地非三唑1mg的注射液。

制备地非三唑纳米乳胶丸

将地非三唑溶解在非水性液体或半干固体的复合辅料，制备成软胶丸，每丸含地非三唑0.5mg

这种复合辅料一旦与水或胃肠液相混合就会迅速和自发地形成纳米大小的水包油乳液，药物就溶解在这些极小的油滴中，并迅速分散到胃肠道中的吸收部位。在整个吸收过程中由于药物始终保持分子状态，而且这些极小的含药油滴能增加其在肠道上皮细胞的吸附，延长吸收时间，增加药物通过淋巴系统的转运和通过肠道Payer’s区M细胞吞噬进入体内循环，避免了首过消除。提高了生物利用度，增加了药物的靶向性。

制备地非三唑微球注射液将生物相容性和生物降解性聚合物制备成地非三唑注射用微球，每支注射液含地非三唑2mg。

肌注后，在给药部位此聚合物将缓慢释放药物与吸收，使作用时间延长。这种聚合物释药后水解为对人体无害的降解物(水和二氧化碳)。长效地非三唑

微球注射液肌注1次，可维持药效一个月。用于恶性肿瘤术后，防止癌细胞转移复发。

为了更好地了解本发明的实质，以下将地非三唑的药理毒理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。

1.地非三唑对多种肿瘤细胞的体外抑制作用

取培养3～4天的人卵巢癌HO-8910细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶使贴壁细胞脱落，用含10％胎牛血清的RPMI1640营养液配成细胞悬液，计数后用完全培养液稀释成浓度约为4×10⁴个/ml的细胞悬液，取24孔板，每孔加细胞悬液1ml，放入培养箱48小时后，加入受试物10μl，使终浓度分别为：地非三唑40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，每个浓度4孔，加药后培养48小时，每孔加入5mg/ml MTT60μl，温育4小时吸去上清液，加入0.5mlDMSO摇匀，用酶标仪于550nm处测定每个小孔的OD值，细胞存活率的计算公式为：

细胞存活率％＝(加药细胞OD值/对照细胞OD值)×100％。

用Bliss法求出IC₅₀。重复三次。

对小鼠淋巴样瘤P388细胞、人口腔表皮样癌KB细胞、回盲肠腺癌HCT-116细胞、慢性髓原白血病K562细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人宫颈癌Hela细胞、人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞、人肺癌A549细胞、原髓细胞白血病HL-60细胞、前列腺癌PC-3细胞、人肝癌Bel-7402细胞的体外抑制作用试验方法同上。

结果表明，地非三唑对HO-8910、P388、KB、HCT-116、K562、CNE、RD、A549、Hela、HL-60、PC-3、Bel-7402等细胞共孵育48小时后，均显示较强的抑制细胞增殖作用。地非三唑40μg/ml作用于以上各肿瘤细胞48小时后，抑制率分别为94.1％、98.6％、87.1％、99.7％、96.5％、65.5％、98.0％、68.7％、92.3％、90.0％、93.9％、100.0％，其IC₅₀及95％可信限分别为15.1(12.5-18.4)、4.1(1.3～13.5)、10.7(7.4～15.6)、6.2(1.8～21.6)、9.9(5.3～18.4)、17.3(10.5～28.5)、12.6(8.0-20.2)、17.4(13.0～23.4)、9.9(4.8～19.6)、14.1(7.4-26.7)、19.7(8.6-40.5)、5.6(1.4-15.7)μg/ml。见表1。

表1.地非三唑作用48小时对多种肿瘤细胞的体外抑制作用肿瘤地非三唑(μg/ml) IC₅₀及95％可信限细胞 2.5 5.0 10 20 40 (μg/ml)HO-8910 0.7 6.1 28.9 57.6 94.1 15.1(12.5-18.4)CNE 11.3 23.4 47.7 51.7 65.5 17.3(10.5-28.5)A549 18.3 22.8 40.1 50.4 68.7 17.4(13.0-23.4)P388 42.1 60.0 68.3 78.2 98.6 4.1(1.3-13.5)K562 14.2 17.6 32.2 71.0 96.5 9.9(5.3-18.4)Hela 13.7 21.9 39.5 72.6 92.3 9.9(4.8-19.6)HL-60 - 2.4 26.9 85.5 90.0 14.1(7.4-26.7)PC-3 - - 6.6 50.6 93.9 19.7(8.6-40.5)Bel-7402 31.2 41.3 62.7 89.2 100.0 5.6(1.4-15.7)KB 15.7 28.2 49.2 57.7 87.1 10.7(7.4-15.6)RD 1.6 11.3 27.7 54.7 98.0 12.6(8.0-20.0)

2.地非三唑对人卵巢癌HO-8910细胞的体外抑制作用的时效关系

取培养4～5天的HO-8910细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶使贴壁细胞脱落，用含10％胎牛血清的RPMI1640营养液配成细胞悬液，计数后用完全培养液稀释成浓度约为4×10⁴个/ml的细胞悬液，取24孔板，每孔加细胞悬液1ml，放入培养箱48小时后，加入受试物10μl，使终浓度分别为：地非三唑40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml。每个浓度4孔。加药后培养24小时、48小时、72小时、96小时，每孔加入5mg/ml MTT60μl，温育4小时吸去上清液，加入0.5mlDMSO摇匀，每孔吸出0.1ml于96孔板，用酶标仪于550nm处测定每个小孔的OD值，细胞存活率的计算公式为：

细胞存活率％＝(加药细胞OD值/对照细胞OD值)×100％。用Bliss法求出IC₅₀。每个作用时间重复3次。

结果表明，地非三唑对人卵巢癌HO-8910细胞作用24、48、72、96小时均显示较强的抑制增殖作用。地非三唑40μg/ml对HO-8910细胞作用24、48、72、96小时的抑制率分别为79.2％、94.1％、94.2％、93.6％，上述时间点的IC₅₀及95％可信限分别为23.9(13.5～42.3)、15.1(12.5～18.4)、12.4(9.7～15.7)、9.1(6.3～13.2)μg/ml。见表2。

表2.地非三唑对人卵巢癌HO-8910细朐的体外抑制作用时效关系

作用时间 DL111-IT(μg/ml) IC₅₀及95％可信限

(h) 2.5 5.0 10 20 40 (μg/ml)

24 0.1±0.1 4.3±5.6 6.2±6.9 36.3±7.7 79.2±11.9 23.9(13.5-42.3)

48 0.7±0.6 6.1±0.9 28.9±3.2 57.6±23.4 94.1±1.5 15.1(12.5-18.4)

72 2.6±2.9 5.8±3.3 40.7±13.1 80.1±11.3 94.2±2.0 12.4(9.7-15.7)

96 7.4±8.4 14 4±11.2 59.1±13.6 90.4±6.6 93.6±5.4 9.1(6.3-13.2)

3.地非三唑对人卵巢癌HO-8910细胞生长曲线的影响

取对数生长期HO-8910细胞用完全培养液配成3×10⁴个/ml的细胞悬液，取24只25ml培养瓶，每瓶加入5ml细胞悬液，分4组，每组6瓶，分别为(1)溶剂对照组，(2)，(3)给药组：地非三唑终浓度分别为1.5μg/ml、6.0μg/ml，(4)阳性对照组：顺铂1.0μg/ml。置培养箱中，分别培育1、2、3、4、5、6天后每组各取1瓶，用胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，用0.7ml完全培养液配成细胞悬液，再加0.3ml 0.4％台盼蓝液，计数，以每毫升拒染的活细胞数的对数与时间作图，从图中读出生长饱和密度(N_S)，根据下列公式计算细胞的杀伤率和细胞倍增时。

地非三唑对细胞的杀伤率(％)＝(N₀-N₀′)/N₀×100

地非三唑对细胞倍增时(TD)的影响：TD＝0.30lt/(logNt-logN₀)各组细胞分别培养1、2、3、4、5、6天后经台盼蓝染色，计数，以每毫升拒染的活细胞数的对数与时间作生长曲线图，从图中可得出，地非三唑1.5μg/ml、6μg/ml对HO-8910细胞的杀伤率分别为14.1％和23.4％，细胞生长饱和密度(N_S)均显著下降(p＜0.05)，地非三唑6μg/ml使细胞倍增时(TD)显著延长(p＜0.05)，见表3。表中：^*P＜0.05，vs DMSO组，t检验。

表3.地非三唑对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响药物浓度细胞倍增时(TD) 杀伤百分率细胞生长饱和密度(N_S)(μg/ml) (h)^* (％) (×10⁵个/ml)DMSO 80μl 36.8±2.4 - 3.70±0.40地非三唑1.5 40.7±1.8 14.1±3.0 2.64±0.31^*地非三唑6.0 44.8±3.1^* 23.4±4.4 2.21±0.17^*

4.地非三唑对小鼠H22肝癌和小鼠S180肉瘤的治疗作用

分别将小鼠肉瘤S₁₈₀和小鼠肝癌H22肿瘤细胞悬液接种于NIH种小鼠右腋下，每种肿瘤接种60只小鼠，雌雄各半。60只小鼠随机分成五组，分别为阳性对照环磷酰胺50mg/kg组、地非三唑高剂量组(50mg/kg)、中剂量组(25mg/kg)、低剂量组(12.5mg/kg)及溶剂对照组(茶油10ml/kg)。连续给药9天，于第10

天剖杀小鼠，取出肿瘤组织称重，计算抑瘤率。结果表明，地非三唑对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌均具有较好的治疗作用，地非三唑12.5、25.0、50.0mg/kg对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别达到了33.55％、50.00％和55.92％，对小鼠H22肝癌的抑瘤率分别达到了24.50％、52.00％和56.60％。见表4、5。表中：^**P＜0.01，vs茶油组，t检验。

表4.地非三唑对小鼠S180肉瘤的治疗作用

组别剂量给药动物数肿瘤重量抑瘤率

(mg/kg) 途径 (只) (g) (％)茶油对照 10ml/kg im 12 1.52±0.57 -地非三唑 50.0 im 12 0.67±0.35^** 55.92

25.0 im 12 0.76±0.40^** 50.00

12.5 im 12 1.01±0.54 33.55环磷酰胺 50.0 im 12 0.83±0.25^** 45.39表5.地非三唑对小鼠H22肝癌的治疗作用组别剂量给药动物数肿瘤重量抑瘤率

(mg/kg) 途径 (只) (g) (％)茶油对照 10ml/kg im 12 2.00 ±0.49 -地非三唑 50.0 im 12 0.87±0.33^** 56.60

25.0 im 12 0.96±0.46^** 52.00

12.5 im 12 1.51±0.51 24.50环磷酰胺 50.0 im 12 1.06±0.50^** 47.00

5.地非三唑对人卵巢癌HO-8910裸小鼠移植瘤的治疗作用

将生长旺盛的人卵巢癌HO-8910细胞消化，制备成浓度为10⁷个/ml的细胞悬液，在无菌条件下用注射器将0.2ml细胞悬液接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，55只裸小鼠随机分成4组，分别为地非三唑50.0、25.0、12.5mg/kg/天，阳性对照环磷酰胺50mg/kg/天，及溶剂对照茶油10ml/kg/天，各组均为肌内注射(im)给药，每周给药2次，共给药4周，给药期间每周测量肿瘤直径2次，肿瘤体积(TV)按下式计算：

TV = \frac{1}{2} {ab}^{2},

其中a、b分别表示长、宽。于第28天剖杀，取肿瘤称重，计算各给药组抑瘤百分率。结果表明，地非三唑12.5、25.0、50.0mg/kg对人卵巢癌HO-8910细胞均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分别达到17.03％、43.3％和64.28％，见表6。表中：^**P＜0.01，vs茶油组，t检验表6.地非三唑对人卵巢癌HO-8910裸小鼠移植瘤的治疗作用组别剂量给药动物数肿瘤体积肿瘤重量抑瘤率

(mg/kg) 途径 (只) (g) (％)茶油对照 10ml/kg im 15 0.507±0.181 0.364±0.124 -地非三唑 50.0 im 10 0.182±0.092^** 0.130±0.054^** 64.28

25.0 im 10 0.352±0.132^** 0.207±0.075^** 43.13

12.5 im 10 0.472±0.302 0.302±0.112 17.03环磷酰胺 50.0 im 10 0.251±0.207^** 0.152±0.042^** 58.24

6.地非三唑的动物药代动力学试验

本试验选用SD大鼠进行药动学研究，采用柱切换高效液相色谱法检测地非三唑在体内的血药浓度动态变化，并以中国药理学会3P87程序在微机上拟合曲线，计算药动学参数。结果表明：大鼠iv((静脉注射)给药呈二室动力学模型，im给药均为一室动力学模型。药动学参数分别为：

大鼠iv地非三唑5、2.5、0.5mg/kg三个剂量组，每组5只的平均值，t_1/2α为0.35、0.42、0.40h，t_1/2β为2.0、2.53、2.85h，Vd为1.89、2.34、1.95 L·kg^-1，AUC为4.12、1.78、0.43μg·h·ml^-1，Cl(s)为1.22、1.42、1.17L·kg^-1·h^-1。

大鼠im地非三唑20、10、5mg/kg三个剂量组，每组5只的平均值，t_1/2ka为0.28、0.35、0.27h，t_1/2ke为2.72、2.33、2.54h，T(peak)为0.99、1.08、0.93h，Cmax为1.86、0.99、0.55μg·ml^-1，AUC为9.48、4.65、2.12μg·h·ml^-1，Cl(T)为2.20、2.25、2.78L·kg^-1·h^-1，Vd为8.44、7.66、7.68L·kg^-1。

药物的分布试验：SD大鼠，每一时间点5只，分别于im地非三唑5.0及50mg/kg后1、8、24h，2、4及6d解剖，采用柱切换高效液相色谱法检测地非三唑在主要脏器的分布。结果表明：给药1h后，药物分布高低依次为：子宫卵巢＞肺＞肌肉＞脂肪＞肾＞小肠＞骨骼＞胃＞肝＞心＞脾＞脑；48h后依次为子宫卵巢＞肺＞心＞肾＞脾＞脑＞骨骼＞肌肉＞肝＞脂肪；6d后仍以子宫卵巢的药物浓度最高。药物的排泄试验：SD大鼠6只，iv地非三唑5mg/kg，测定给药后1～7d尿、粪中原形药的排泄量，同样以柱切换HPLC法检测，结果表明：给药后7d内累积排泄量，尿中2561.7±1968.7ng，占给药量0.225±0.173％；粪中1773.2±1335.5ng，占给药量0.156±0.117％。胆汁中排泄原形药量，2h为给药量的0.66±0.13％，12h为1.60±0.29％。

药物与血浆蛋白的结合试验：选用8种不同浓度透析液测定，当原形药物浓度[D]＝2×10^-6mol/L，地非三唑与小牛血清蛋白的结合率为51.14％。

地非三唑的生物利用度：

\frac{AUC (im)}{AUC (iv)} \times 100 % = 51.5 %

7.地非三唑的急性毒性试验

1).小鼠试验：

NIH小鼠分别皮下注射(sc)与腹腔注射(ip)地非三唑茶油溶液，各设5个剂量组，每组10只(雌雄各半)，观察14天内的死亡数，按Bliss氏法计算LD₅₀及可信度。分别为：4385.92(3979.16～4845.59)mg/kg(sc)；1397.40(127.21～1514.74)mg/kg(ip)。

2)大鼠试验：

SD大鼠同上小鼠试验方法，结果LD₅₀及可信度分别为：4805.76(4377.86～5351.67)mg/kg(sc)；1213.25(971.67～1619.01)mg/kg(ip)。

8.地非三唑的长期毒性试验

1).大鼠试验：

SD大鼠分别肌内注射(im)地非三唑3，10，50mg/kg/d三个剂量组，及溶剂茶油对照组2ml/kg/d(im)，每组20只(雌雄各半)，均给药20天，结果表明：高剂量组50mg/kg/d可引起毒性反应，表现为骨髓造血抑制，胸腺萎缩，停药14天恢复，说明其毒性反应为可逆性。10mg/kg/d大鼠也有轻度骨髓毒性，地非三唑的无毒副反应的安全剂量为3mg/kg/d(im)及以下。

2).猕猴试验

猕猴(Macaca mulatta)分别肌内注射(im)地非三唑2，10，50mg/kg/d三个剂量组，及溶剂茶油对照组2ml/kg/d(im)，每组4只(雌雄各半)，均给药20天，结果同大鼠。50mg/kg/d可引起毒性反应，表现为骨髓造血抑制，胸腺萎缩，

停药14天恢复，说明其毒性反应为可逆性。10mg/kg/d也有轻度骨髓毒性，猕猴地非三唑的无毒副反应的安全剂量为2mg/kg/d(im)及以下。

3).Beagle狗试验

Beagle狗分别肌内注射(im)地非三唑0.05，0.2，0.8mg/kg/d三个剂量组，及溶剂茶油对照组2ml/kg/d(im)，每组4只(雌雄各半)，均给药三个月，试验结果表明：三个剂量组动物在给药前后，呼吸，血压，心电图，血液生化各项检测指标均在正常范围，无生理意义变化。血液学检测显示0.8mg/kg/d及0.2mg/kg/d剂量组动物红细胞系明显降低，但仍在正常偏低水平，其余血液学指标均在正常范围波动；消化道反应较为多见，0.8mg/kg/d组反应较重，主要表现为厌食，偶有呕吐，粪便带有粘液或少量鲜血，毋须停药，短期内自行消失；骨髓象检查显示，骨髓增生欠活跃，红系细胞生成受抑制；组织病理学检查显示，0.8mg/kg/d组动物骨髓造血细胞损伤，胸腺萎缩，免疫功能降低，以上毒性反应在停药一个月后均消失，恢复正常。故可认为，地非三唑0.8mg/kg/d，为Beagle犬的中毒剂量，毒性靶部位为骨髓与胸腺。0.2mg/kg/d也有轻度骨髓毒性，0.05mg/kg/d无明显消化道反应与毒性反应，为Beagle犬的基本安全剂量。

9.正常人对地非三唑的耐受量试验

I期临床试验表明，单次肌注地非三唑的最大耐受量为2mg。

试验表明，地非三唑具有显著的抗恶性肿瘤作用，而且抗瘤谱广，经各种动物安全试验及正常人体耐受性I期临床试验，表明动物种属及人对地非三唑的敏感性差异较大，人与Beagle犬对地非三唑最为敏感。该药对生命体征无明显影响，较为安全。故可认为地非三唑治疗恶性肿瘤疾病具有临床前景。

具体实施方式

下面将描述本发明的实施例，但本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

地非三唑注射液

处方：地非三唑1g，注射用植物油(茶油，大豆油等)加至1000ml。

制备：取注射用植物油，在150℃干热灭菌1小时，放冷至50℃，取出部分油液加入地非三唑，搅拌使溶解，最后添加溶媒至全量。用干燥的3号垂熔漏斗过滤，灌封于1ml干燥的灭菌安瓿中，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，每支安瓿1ml含地非三唑1mg.

用量：每次肌内注射0.5～1mg.

实施例2

三唑纳米乳胶丸

将地非三唑溶解在非水性液体或半干固体的复合辅料，按常规方法制备成软胶丸，每丸含地非三唑0.5mg。

用量：每次口服0.5-1mg

实施例3

地非三唑微球注射液

将生物相容性和生物降解性聚合物制备成地非三唑注射用微球。每支注射液含地非三唑2mg。

用量：每次肌注2mg，15天或30天给药1次。用地非三唑微球注射液肌注后，在给药部位此聚合物将缓慢释放药物与吸收，使作用时间延长。这种聚合物释药后水解为对人体无害的降解物(水和二氧化碳)。长效地非三唑微球注射液肌注1次，可维持药效一个月。用于恶性肿瘤术后，防止癌细胞转移复发。

Claims

1.地非三唑药剂在治疗卵巢癌，宫颈癌，淋巴瘤，白血病，肺癌，肝癌，大肠癌，前列腺癌，鼻咽癌，口腔癌，恶性横纹肌瘤疾病的药中的应用。

2.权利要求1所述的地非三唑的药剂包括：以植物油为溶剂的地非三唑注射液；地非三唑微球注射液；地非三唑纳米乳胶丸。