CN104306333A

CN104306333A - 一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法

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Publication number: CN104306333A
Application number: CN201410508569.9A
Authority: CN
Inventors: 唐星; 张宇; 张岩; 蔡翠芳
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-09-28
Also published as: CN104306333B

Abstract

一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法属医药技术领域，该注射液各组分按重量百分比为：卡巴他赛胆固醇复合物(以卡巴他赛计)0.01％～1％；注射用油5％～30％；注射用磷脂1％～6％；辅助乳化剂0.2％～0.7％；两亲性聚氨基0.05％～1.0％；渗透压调节剂2.0％～3.5％；其余为注射用水。其制备方法以磷脂为乳化剂，以表面活性剂为辅助乳化剂，高纯度的卡巴他赛作为有效成分，并加入胆固醇、两亲性的聚氨基酸、渗透压调节剂及注射用水，采用超高压微射流纳米分散技术构建而成。本发明借助胆固醇和药物的独特相互作用，不仅提高了卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，还改善了卡巴他赛脂质微球的热力学稳定性。本发明中所述的两亲性聚氨基酸的加入进一步增加了制剂的稳定性。

Description

一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法。

背景技术

癌症严重威胁着人类的生命与健康，随着工业化程度的提高、环境污染的加重与人类寿命的普遍延长，癌症的发病率在逐年上升。据世界卫生组织(WHO)报道目前全球有2460万癌症患者；到2020年，估计将达到3000万。2005年有760万人死于癌症，占全世界5800万死亡的13％，到2020年，癌症每年可造成1000多万人死亡。如果这一趋势继续，每年新病例的估计数预期将从2002年1090万增加至2020年1600万。2005年中国癌死亡人数近190万，其中120万人寿命低于70岁。专家预计，2020年死亡人数将超过400万。这些数字表明，肿瘤无论是在国外、国内，都仍然还是一种严重威胁人们生命和生活质量的主要病种之一。也正是基于这一认识，各国政府、研究机构和制药公司均对癌症研究和抗肿瘤药物开发高度重视和巨额投资。

紫杉烷类化合物是从植物中得到的一大类天然产物，是唯一直接作用于肿瘤发生病因的药物。卡巴他赛(Cabazitaxel)是新一代的紫杉烷类化合物，其分子式为：C₄₅H₅₇NO₁₄，分子量为：835.93，结构式如下：

卡巴他赛通过与微管蛋白结合，促进微管双聚体装配成微管，同时通过防止去多聚化过程抑制微管分解而使微管稳定，阻滞细胞于G₂和M期，从而抑制细胞的有丝分裂和增值。卡巴他赛不仅对多西他赛敏感的肿瘤细胞株，包括P388、HL60、KB和Calc18具有抗癌活性，此外，对多西他赛不敏感的肿瘤细胞模型(例如P388/DOX、P388/TXT、P388/VCR和HL60/TAX等)仍有活性，这显示卡巴他赛不仅抗肿瘤活性强于多西他赛，且具有较强的抗多药耐药性。因此其在抗肿瘤方面显示出巨大的潜力。

目前上市的卡巴他赛制剂仅有由法国赛诺菲-万安特公司生产的卡巴他赛注射剂(商品名：)，于2010年6月17日被美国FDA批准上市。与泼尼松联合使用治疗既往用含多西他赛治疗方案的激素难治性转移性前列腺癌。其规格为60mg/1.5ml，即单次使用小瓶盛装60mg卡巴他赛(无水、无溶剂)和1.56g吐温80。卡巴他赛注射液在静脉滴注之前需要两种稀释剂，首先由提供的稀释剂(一种无色透明，无菌，无热原的13％乙醇水溶液，约5.7ml)稀释，随后再用生理盐水溶液或5％葡萄糖溶液稀释。因此，卡巴他赛注射液需两步稀释为临床的使用带来极大的不便，而聚山梨酯-80的应用将引发患者的严重不良反应，包括严重的过敏反应和外周神经病变，另外，卡巴他赛注射液稀释后需尽快使用，在室温最多可放置8小时，造成药物的极大浪费，这些均为卡巴他赛的临床使用带来局限。因此，急需开发一种质量可控、稳定性强、高效、低毒的卡巴他赛新剂型降低毒副作用，充分发挥其抗肿瘤活性。

静脉注射脂质微球作为抗肿瘤药物的载体，近来得到广泛的应用。其特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物，特别是抗癌药物、麻醉药物及抗炎药物的良好载体。与传统注射液相比较，脂质微球可以降低血管刺激性，并起到靶向肿瘤组织的作用。静脉注射脂肪乳剂作为肠外能量的重要补给方式应用于临床已近半个世纪，是根据乳糜微粒的组成、结构与特点而设计，主要是由甘油三酯和磷脂组成的乳剂颗粒溶液。将药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，在发挥药效的同时，为无法进食的患者提供能量供给。一般认为脂质微球是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，是脂溶性药物的良好载体。卡巴他赛水溶性较差，脂质微球是发挥卡巴他赛抗癌效果的最佳载体。考虑到卡巴他赛结构中含有大量的酯键，易水解、不稳定，本专利公开的新型卡巴他赛脂质微球注射液产品，是一种含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液，一方面，卡巴他赛胆固醇复合物的制备不仅提高了卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，还改善了卡巴他赛脂质微球的热力学稳定性；并详细阐明了其机制；另一方面，两亲性聚氨基酸具有更强的乳化能力，不仅将药物牢牢锚定于油相中，而且为乳滴提供一层空间屏障，阻止了乳滴间的合并，形成了更稳定的乳滴，提高了制剂的稳定性，另外，两亲性聚氨基酸的加入明显延长了药物的半衰期。本专利公开的含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的载药脂质微球注射液在保持卡巴他赛高效抗癌活性的同时，不含有机溶剂、能耐受高压灭菌(121℃10min灭菌后含量、粒径、pH和ζ电位等保持不变)，且具有较高的耐稀释性(5％葡萄糖注射液稀释4倍后，在24h内含量、粒径、pH和ζ电位等保持不变)。相对于卡巴他赛注射液(卡巴他赛-聚山梨酯-80混合溶液(40mg·mL^-1))，本发明公开的卡巴他赛脂质微球注射液不仅稳定性好、生物利用度高，而且降低了毒性和刺激性，成本低，适用于工业化大生产。

现有中国专利CN 103450119A(公开号)中公开了天津炜捷制药有限公司发明的“一种卡巴他赛晶型W及其制备方法”。其涉及发明了包含卡巴他赛的晶型及其制备方法，并未涉及到制剂方面。

现有中国专利CN 102895183A(公开号)中公开了江苏红豆杉生物科技股份有限公司发明的“一种注射用卡巴他赛及其制备方法”。其涉及发明了包含注射用卡巴他赛及其制备方法，并未涉及到脂质微球制剂方面。

现有中国专利CN 103054800A(公开号)中公开了无锡尔云科技有限公司发明的“氟比洛芬对乙酰氨基酚酯脂质微球注射剂、冻干脂质微球注射剂及制备方法”。其涉及发明了包含脂质微球注射液及其制备工艺，所载药物为氟比洛芬对乙酰氨基酚酯，并未涉及胆固醇的使用和药物胆固醇复合物的制备。

Ting Chu等研究的丹参酮2A静脉注射脂肪乳的制备以及体外抗癌活性的评价，详细考察了影响丹参酮2A注射脂肪乳制备的因素，但并未涉及胆固醇、两亲性聚氨基酸的使用和药物胆固醇复合物的制备。

现有中国专利CN 103006558A(公开号)中公开了苏州雷纳药物研发有限公司发明的“一种Cabazitaxel脂质微球注射液及其制备方法”。其涉及发明了包含卡巴他赛磷脂复合物的脂质微球注射液及其制备工艺，并未涉及胆固醇、两亲性聚氨基酸的使用和卡巴他赛胆固醇复合物的制备。该专利中考察了Cabazitaxel脂质微球注射液在温度6℃±2℃的加速条件下的稳定性，6个月内，其含量、粒径等未发生显著变化。

现有中国医学科学院药物研究申请的中国专利CN102048725A(公开号)、CN102048688A(公开号)中分别公开了所发明的“紫杉醇胆固醇复合物”和“以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳”，其涉及发明了紫杉醇胆固醇复合物及以此为中间载体的紫杉醇亚微乳，但并未涉及卡巴他赛和两亲性聚氨基酸的使用。在专利CN102048725A(公开号)中紫杉醇胆固醇复合物制备的主要目的在于提高药物在油中的溶解度，虽有提到以胆固醇复合物为中间载体制备的亚微乳剂有助于制剂稳定性的提高，但并未对此进行深刻探讨，且不涉及两亲性聚氨基酸的使用。

经专利和文献检索，未见报道涉及卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球制剂的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液，本脂质微球注射液可耐高压灭菌，具有高稳定性、高生物利用度、延长半衰期、提高药效、减少毒副作用的特点。

为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明一种卡巴他赛脂质微球注射液，包含卡巴他赛胆固醇复合物、注射用油、乳化剂(注射用磷脂)、两亲性聚氨基酸、辅助乳化剂、渗透压调节剂及注射用水；该注射液组成的重量百分比为：

所述的卡巴他赛胆固醇复合物由卡巴他赛和胆固醇组成；

所述的两亲性聚氨基酸为聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯两亲性嵌段共聚物；

所述的注射用油为长链甘油三酯和中链甘油三酯中的一种或几种的混合物；

所述的注射用磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物；

所述的辅助乳化剂为吐温(Tween)和普郎尼克中的一种或几种的混合物；

所述的渗透压调节剂为注射用甘油；

所述吐温选自吐温20、吐温40、吐温60或吐温80中的一种或几种按任意比混合；所述的的普郎尼克为普郎尼克188。

所述的卡巴他赛胆固醇复合物，按照以下步骤制备：

按照卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1:1～10称取卡巴他赛和胆固醇，将其加到有机溶剂中，20～80℃加热回流0.5～2小时，至溶液澄清透明，取出溶液进行旋转蒸发或真空干燥以除去有机溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

所述的卡巴他赛胆固醇复合物制备方法中所述反应溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙酸乙酯中的一种或几种。

所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法进一步优选卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1:2～8；反应溶剂为无水乙醇；反应温度为20～60℃；反应时间0.5～1.0小时。

一种卡巴他赛脂质微球注射液的制备方法，其工艺步骤如下：

(1)将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的注射用油，在60℃～80℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

(2)将两亲性聚氨基酸、水溶性乳化剂、渗透压调节剂加入到适量注射用水中，加热至60～80℃，搅拌分散均匀得水相；

(3)在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中或将水相加入到载药油相中，待完全加入后，以8000～20000转/分搅拌2～5分钟，即得初乳；

(4)将初乳冷却至室温，用氢氧化钠或盐酸溶液来调节pH值至5～7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600～1200bar，30℃～60℃条件下均质5～10次；

(5)装瓶，充氮气，轧盖密封，121℃高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。

所述处方量为：按重量百分比为：卡巴他赛胆固醇复合物(以卡巴他赛计)0.01％～1％；注射用油5％～30％；注射用磷脂1％～6％；辅助乳化剂0.2％～0.7％；两亲性聚氨基0.05％～1.0％；渗透压调节剂2.0％～3.5％；其余为注射用水。

本发明所公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型脂质微球注射液中，不含或含有较少量的聚山梨酯-80，耐稀释性好，避开了给药所带来的两次稀释的不便、聚山梨酯-80的严重过敏反应等问题，且避免了药物浪费，在降低毒性的同时提高了药效，可耐受高压灭菌、延长了药物的半衰期。

本发明通过经典恒温法测定降解动力学、冻融稳定性等试验证实：采用普通处方工艺制备的卡巴他赛脂质微球注射液在物理化学方面极其不稳定，尤其是化学稳定性；由卡巴他赛化合物的结构式可知，结构中含有大量的酯键，酯键的断裂是造成其稳定性差的原因，主要有以下两种途径：一方面，油中的卡巴他赛泄露到水相，酯键在水相中水解；另一方面，油相中含有游离脂肪酸等提供氢离子的物质，氢离子进攻卡巴他赛的酯键，导致其水解；经高效液相证实了上述降解途径。又经液相-飞行时间质谱验证，卡巴他赛结构式中C₁₃上的羟基所形成的酯键是其水解的主要位点。众所周知，胆固醇是一种优良的乳化剂或辅助乳化剂，其结构中含有羟基。借助胆固醇和药物的独特相互作用，制备了卡巴他赛胆固醇复合物，可以明显提高卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，并改善脂质微球的热力学稳定性。本发明发现，卡巴他赛与胆固醇复合物中，胆固醇与卡巴他赛通过氢键形成复合物减少其降解，有以下原因：一方面，氢键可以分散卡巴他赛氧原子电子云密度而阻止氢离子的进攻；并且碳原子有sp²杂化转换为sp³杂化，增强了空间效应的作用，二者共同作用防止了油相内卡巴他赛的降解。另一方面，磷脂分子的亲水基团可与胆固醇的亲水基团紧密结合，限制了卡巴他赛的泄露，进一步抑制了卡巴他赛的水解。另外，卡巴他赛泄露的减少也是提高其热力学稳定性的原因。本发明经傅里叶—红外波谱证实了卡巴他赛胆固醇复合物的存在，验证了上述推断的可靠性和合理性。

由于氨基酸本身即为人体必需的营养成分，所加入的两亲性聚氨基酸，具有优良的生物相容性，对人体无毒害。与小分子磷脂相比，这种两亲性聚合物具有更强的乳化能力(临界胶束浓度远小于磷脂分子)，与天然磷脂等其他表面活性剂复配更容易形成稳定的乳滴。而且，本发明中以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的微观结构不同于普通的脂质微球制剂：疏水的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能牢牢锚定于油相中；而亲水链段又要远长于磷脂分子的极性头部，故亲水链段能伸展于外周水相中，包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止了各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性，且两亲性聚氨基酸的加入明显延长了卡巴他赛的半衰期。

本发明公开的卡巴他赛胆固醇复合物，并未在专利和文献中检索到，具有创新性。

本发明所公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液，与参比制剂(卡巴他赛-聚山梨酯-80混合溶液(40mg·mL^-1))相比较，不仅生物利用度高，且在降低了毒性的同时增强了其抗肿瘤疗效。

本发明公开了一种质量可控，高稳定性，高半衰期，可耐受高压灭菌的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型载药脂质微球注射液(200nm左右)。

本发明公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液可耐受高压灭菌，在温度4℃放置1690天(约56个月)，其含量、粒径等均不会发生显著变化，药物的半衰期明显延长。

本发明公开的卡巴他赛脂质微球注射液避开了给药所带来的两次稀释的不便、聚山梨酯-80的严重过敏反应等问题，且耐稀释性高，使用方便，避免了药物浪费，并可以降低毒性提高药效，因此一定能充分发挥此药物的抗肿瘤活性，满足广大的用药需求，并有优异的市场前景。

本发明的含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液详细探讨了卡巴他赛在脂质微球中不稳定的原因以及胆固醇提高药物在脂质微球中稳定性的机制，两亲性聚氨基酸的加入更明显提高了制剂的稳定性，具有创新性。

附图说明

图1是卡巴他赛胆固醇复合物的红外波谱表征；

图2是CELs的粒径分布及zeta potential(ζ)；

图3是卡巴他赛于80℃在水溶液和脂质微球(含胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸、含胆固醇复合物和不含胆固醇复合物)中的降解动力学；

图4是卡巴他赛于不同温度下在水溶液和脂质微球(含复合物和两亲性聚氨基酸、含复合物和不含复合物)中的降解速率图；

图5是大鼠4mg·kg^-1单次静脉注射卡巴他赛脂质微球注射液和卡巴他赛注射液后平均血药浓度-时间曲线；

图6是小鼠肿瘤体积变化图；

图7是小鼠体重变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，实例仅为提供解释性说明，不意味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。

下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量；所提到的卡巴他赛脂质微球注射液如无特殊说明，均为含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液。

实施例1

制备卡巴他赛胆固醇复合物

将卡巴他赛0.1g与胆固醇0.3g置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醚，使胆固醇和药物浸没在乙醚中，在60℃条件下加热回流反应2小时，得到澄清反应溶液，减压干燥除去溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

实施例2

制备卡巴他赛胆固醇复合物

将卡巴他赛0.1g与胆固醇0.2g置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙酸乙酯，使胆固醇和药物浸没在乙酸乙酯中，在50℃条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，旋转蒸发蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

实施例3

制备卡巴他赛胆固醇复合物

将卡巴他赛0.1g与胆固醇0.25g置于圆底烧瓶中，缓慢加入氯仿，使胆固醇和药物浸没在氯仿中，在60℃条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

实施例4

制备卡巴他赛胆固醇复合物

将卡巴他赛0.1g与胆固醇0.3g置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醇，使胆固醇和药物浸没在乙醇中，在50℃条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

实施例5

制备卡巴他赛胆固醇复合物

将卡巴他赛0.1g与胆固醇0.4g置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醇，使胆固醇和药物浸没在乙醇中，在40℃条件下加热回流反应2小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。

实施例6

卡巴他赛胆固醇复合物的表征

采用红外光谱学的对卡巴他赛胆固醇复合物进行表征，证实了该复合物的形成。红外光谱学表征见图1。由红外光谱可以看出C＝O和C-O-C的伸缩振动明显向低频移动，证实了卡巴他赛胆固醇复合物的形成。

实施例7

制备方法：

①将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在70℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

②将处方量PEG-聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80℃，搅拌分散均匀得水相；

③在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600bar，40℃条件下均质10次；

⑤装瓶，充氮气，轧盖密封，121℃高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。

实施例8

制备方法：

①将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在75℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至6，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在700bar，40℃条件下均质10次；

实施例9

制备方法：

①将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在75℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

③在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以10000转/分搅拌4分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1盐酸溶液来调节pH值至7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800bar，40℃条件下均质7次；

实施例10

制备方法：同制备方法3

实施例11

制备方法：

①将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在70℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

②将处方量PEG-聚谷氨酸苄酯、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至75℃，搅拌分散均匀得水相；

③在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以10000转/分搅拌3分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至6.5，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800bar，40℃条件下均质8次；

实施例12

制备方法：

③在组织捣碎机搅拌下，将水相缓慢加入载药油相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至5.5，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600bar，40℃条件下均质10次；

实施例13

制备方法：

①将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在80℃下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；

②将处方量PEG-聚谷氨酸苄酯、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80℃，搅拌分散均匀得水相；

③在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以12000转/分搅拌4分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至6.0，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在900bar，40℃条件下均质8次；

实施例14

制备方法：

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至5.5，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在1000bar，50℃条件下均质6次；

实施例15

制备方法：

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1盐酸溶液来调节pH值至5，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800bar，40℃条件下均质9次；

实施例16

制备方法：

③在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌5分钟，即得初乳；

④将初乳冷却至室温，用1.0mol·L^-1氢氧化钠溶液来调节pH值至6.6，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800bar，35℃条件下均质8次；

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

实施例17

卡巴他赛脂质微球注射液粒径及ζ—电位的测定

粒径和粒度分布是脂质微球最重要的特性之一，乳滴的平均粒径是否随灭菌或时间的延长而增大或粒径分布发生改变，ζ—电位的大小及是否随时间而改变，均是衡量脂质微球稳定性的重要指标。对静脉注射用脂质微球的粒度要求目前尚无统一的规定，一般要求乳滴直径80％小于1μm，乳滴大小均匀，不得有大于5μm的乳滴；据文献报道，脂质微球的ζ—电位的绝对值大于20较稳定。目前，关于脂质微球的乳滴粒度测定常采用的方法有显微镜法、动态光散射法、激光散射法和Coulter计数法等。而动态光散射法是最常用的方法之一，本发明即采用动态光散射原理测定卡巴他赛脂质微球注射液的粒径、粒度分布和ζ—电位。本发明通过严格控制脂质微球的粒径(200nm左右)，基于EPR效应，导致小粒子富集在肿瘤组织内部，提高瘤内浓度，从而实现卡巴他赛脂质微球的高效抗肿瘤作用。

使用Nicomp TM PSS 380进行粒度测定的操作方法为：将样品用过0.22μm微孔滤膜的注射用水稀释约5000倍，放入样品池内，将光强度(Intensity)调节至300左右，光源为HeNe激光(λ₀＝633nm)，将操作参数中温度设为测定时室温，开始测定。实验结果见图2。

实施例18

选用优选处方及制备工艺5制备的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液、含卡巴他赛胆固醇复合物不含两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液、相同的工艺制备的不含复合物和两亲性聚氨基酸的卡巴他赛脂质微球注射液和相同含药浓度的含少量乙醇的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，采用经典恒温法测定降解动力学，评价其稳定性。

具体操作步骤如下：制备上述四种制剂或溶液各三份，分别置于60℃、80℃和100℃恒温水浴中，并于0,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,33,48,60,72和96h取出样品，稀释适当倍数后，应用HPLC测定其含量。结果见图3、图4。根据阿伦尼乌斯公式可得，含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液在4℃、25℃的货架期分别为1690.0±208.4天和269.5±33.5天，含卡巴他赛胆固醇复合物的脂质微球注射液在4℃、25℃的货架期分别为1161.5±194.4天和174.7±21.3天，与不含复合物的卡巴他赛注射液和卡巴他赛缓冲溶液相比其稳定性获得了极大的提高。试验结果表明：含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型脂质微球注射液的稳定性明显提高。

实施例19

胆固醇对卡巴他赛脂质微球注射液物理稳定性的影响

以粒度分布、离心稳定常数为指标，考察含卡巴他赛胆固醇复合物的卡巴他赛脂微球注射液、不含复合物的卡巴他赛脂质微球注射液在高压灭菌前后和冻融循环前后的物理稳定性。结果(表1)表明：卡巴他赛胆固醇复合物可以防止脂质微球注射液在高温灭菌后及冻融循环后粒度分布变宽，并可以改善脂质微球经高压灭菌过程中离心稳定常数增大的现象，有助于物理稳定性的提高。

表1卡巴他赛脂质微球注射液在高压灭菌前后和冻融循环前后的粒度分布与离心稳定常数

实施例20

卡巴他赛脂质微球注射液大鼠体内药物动力学的研究

1.测定方法

色谱条件ACQUITY BEH C₁₈色谱柱(50mm×2.1mm ID，1.7μm)(美国Waters公司)；流动相A：2mmol醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，50％～85％B；1.5～2min，85％B；2～2.3min，85％～50％B；3min，50％B；流速：0.2mL·min^-1；柱温：35℃；进样体积：5μL。

质谱条件离子源：ESI源；检测方式：正离子检测；扫描方式：多反应监测(MRM)方式，定量分析时的离子反应分别为m/z 836.36→m/z 555.26(卡巴他赛)和m/z 832.25→m/z551.08(内标拉洛他赛)；毛细管电压：3.5kV；锥孔电压：25V；离子源温度：100℃；喷雾气与反吹气：氮气；去溶剂气流速：550L·h^-1；去溶剂气温度：400℃；反吹气流速：40L·h^-1；碰撞气：氩气；碰撞气流速：0.24mL·min^-1；碰撞能量分别为：10eV(卡巴他赛)和8eV(内标拉洛他赛)。

2.实验药品及动物

实验药品采用优选处方工艺制备的卡巴他赛脂质微球注射液(规格：50mg/50mL)和卡巴他赛-聚山梨酯-80(40mg·mL^-1)溶液。

实验动物Wistar大鼠，雄性，体重(200±20)g

3.样品的处理与测定

取血浆样品100μL置EP管中，加内标溶液10μL，加甲基叔丁基醚2mL，涡旋混合10min后，13000r·min^-1离心10min，定量转移上清液1.8mL于另一EP管中，35℃下空气流吹干，残渣溶解于100μL乙腈-水(50:50)中，涡旋混匀5min，13000r·min^-1离心(4℃)5min，取上清液5μL进样分析。

4.方法学验证

经方法学验证卡巴他赛和拉洛他赛(内标)二者分离良好，内源性物质对测定无干扰，本法具有较好的专属性，分析条件可行；卡巴他赛在5～2000ng·mL^-1范围内线性关系良好，定量下限为5ng·mL^-1(S/N≥10)；准确度与精密度、提取回收率、基质效应和稀释稳定性均符合要求；卡巴他赛在血浆中室温放置6h、预处理后24h(8℃)，以及冻融3个循环后和-20℃下放置15d后均具有较好的稳定性。

5.试验方法与结果

12只大鼠随机分成2组：按4mg·kg^-1的剂量分别于尾静脉注射卡巴他赛注射液和卡巴他赛脂质微球注射液，分别于给药前(零时)，5min，10min，20min，30min，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h和24h于眼眶取血0.3mL，置预先肝素化的1.5mL尖底离心试管中，4000rpm离心10min，精密吸取上层血浆于-20℃保存待测。用时吸取血浆100μL，按“样品处理与测定”项下处理后进样，以当日的标准曲线计算各时间点样品中卡巴他赛的浓度。结果如图5。由结果可知：卡巴他赛脂质微球注射的AUC值明显高于卡巴他赛注射液，即本专利所公开的卡巴他赛脂质微球注射具有较高的生物利用度；经统计矩处理后数据表明脂质微球注射液的半衰期(9.7±2.2h)明显高于注射液(4.2±2.0h)。

实施例21

卡巴他赛脂质微球注射液的药效评价

1.实验动物：SCID小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半。

2.实验药品和试剂

采用优选处方工艺制备卡巴他赛脂质微球注射液(规格：50mg/50mL)；卡巴他赛-聚山梨酯-80(40mg·mL^-1)溶液；空白乳剂

3.实验方法及结果

首先，建立肺癌A549移植瘤荷瘤SCID鼠模型，待肿瘤生长到100mm³以上时，根据移植瘤体积大小、按照组间一致原则，将荷瘤小鼠随机分为模型组、阳性对照组、受试药，共4组，每组8只；其次，根据药物拟临床给药途径与方法，对上述各组荷瘤SCID鼠分别进行下述药物处理：

模型组：连续注射给予空白乳剂，隔日一次，给药容积为0.1mL/10g体重。

阳性对照组：静脉注射卡巴他赛-聚山梨酯-80溶液，每周一次，给药容积为0.1mL/10g体重，给药剂量5mg·kg^-1(临床等效量)。

受试药卡巴他赛衍生物组：尾静脉给予各组受试药，一周两次，连续给药，给药剂量分别10mg·kg^-1、5mg·kg^-1。

药效评价：给药期间，用游标卡尺每隔一天测量瘤径，并计算肿瘤体积(V)，同时称荷瘤SCID鼠体重，记录数据。根据测量结果计算相对肿瘤体积(RTV)。抗肿瘤的活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，评价标准：T/C(％)>60％无效；T/C(％)≤60％，并经统计学处理P<0.05为有效。比较对照组与试验组的相对肿瘤增殖率，从而判断受试药在体内是否有抗肿瘤作用。

V＝1/2×a×b²(a、b分别为肿瘤的长径和短径)

RTV＝Vt/V₀(V₀为给药前测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积)

T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)

毒性评价：动物一般状态：试验动物给药期间，观察动物一般状态，隔日称重一次。

试验结果：32只SCID鼠皮下接种人肺癌A549细胞株肿瘤潜伏期约为12-15d，2w后瘤体积逐渐增大达到给药标准，成瘤率100％。期间无动物死亡，。通过观察发现，有个别动物出现轻微胃肠道反应。

卡巴他赛脂质微球注射液从给药第5天即可明显抑制肿瘤的生长，且具有明显的剂量依赖性，给药15天后肿瘤抑制率达到83％，T/C比值为20.89％。阳性药卡巴他赛-聚山梨酯-80从给药第5天开始显著抑制肿瘤的生长，给药15天后肿瘤抑制率达到61.08％，T/C比值为58.95％(结果见表2-5，图6-7)。

表2药物对SCID鼠移植瘤RTV的影响

表3药物对SCID鼠移植瘤相对肿瘤增殖率(T/C)的影响

表4药物对荷瘤SCID小鼠体重的影响(M±S.E.)

表5药物对SCID鼠移植瘤抑瘤率的影响

Claims

1.一种卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于该注射液由卡巴他赛胆固醇复合物、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、两亲性聚氨基酸、渗透压调节剂及注射用水组成；该注射液组成的重量百分比为：

所述的卡巴他赛胆固醇复合物由卡巴他赛和胆固醇组成；所述卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1:1～10；

所述的两亲性聚氨基酸为PEG-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物；

所述乳化剂为注射用磷脂；所述的注射用磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物；

所述的渗透压调节剂为注射用甘油。

2.根据权利要求1所述卡巴他赛脂质微球注射液，特征在于其中吐温为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80中的一种或几种混合，所述的普郎尼克为普郎尼克188。

3.根据权利要求1所述卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法，按照以下步骤进行：

4.根据权利要求卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物制备方法中所述反应溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙酸乙酯中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法进一步优选卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1:2～8；反应溶剂为无水乙醇；反应温度为20～60℃；反应时间0.5～1.0小时。

6.一种权利要求1所述的卡巴他赛脂质微球注射液制备方法，其特征在于该方法按照一下步骤进行：

(2)将处方量两亲性聚氨基酸、水溶性乳化剂、渗透压调节剂加入到适量注射用水中，加热至60～80℃，搅拌分散均匀得水相；

(4)将初乳冷却至室温，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至5～7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600～1200bar，30℃～60℃条件下均质5～10次；

7.根据权利要求6所述的卡巴他赛脂质微球注射液制备方法，其特征在于所述处方量为：按重量百分比为：卡巴他赛胆固醇复合物以卡巴他赛计0.01％～1％；注射用油5％～30％；注射用磷脂1％～6％；辅助乳化剂0.2％～0.7％；两亲性聚氨基0.05％～1.0％；渗透压调节剂2.0％～3.5％；其余为注射用水。