CN106137980B - 一种罗米地辛脂微球制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种罗米地辛脂微球制剂及其制备方法。其可包含罗米地辛、注射用油、乳化剂、稳定剂、等渗调节剂、pH调节剂和注射用水。本发明的罗米地辛脂微球制剂具有良好的稳定性和缓释特性，提高了罗米地辛的靶向性，降低了其毒副作用。

Description

一种罗米地辛脂微球制剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及药物制剂领域，具体而言，涉及一种罗米地辛脂微球制剂及其制备方法。

背景技术

罗米地辛，英文名为Romidepsin，其化学名称为(1S,4S,7Z,10S,16E,21R)-7-乙叉基-4,21-二异丙基-2-氧杂-12,13-二硫-5,8,20,23-四氮杂双环[8,7,6]二十三碳-16-烯-3,6,9,19,22-五酮，分子式为C₂₄H₃₆N₄O₆S₂，是一种双环四肽，具有稳定的疏水结构，其结构中特有的二硫键是发挥活性的关键基团。罗米地辛是一种组蛋白脱乙酰化酶(HDACs)抑制剂，作为孤儿药于2009年11月5日获得美国FDA批准上市，是继皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)治疗药伏立诺他(vorinostat)之后在美国获准上市的第2个HDACs抑制剂，主要用于至少接受过1种其他类型全身性治疗的同时或之后的进行性、持续性、复发性皮肤T细胞淋巴瘤。其化学结构如下：

罗米地辛能特异性地与HDACs结合，抑制HDAC1和HDAC2的活性，且对两者的选择性相似；催化组蛋白或非组蛋白中已被乙酰化的赖氨酸残基脱乙酰基；调控肿瘤细胞基因的表达；诱导肿瘤细胞分化、阻滞肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡。罗米地辛在体内增加组蛋白H3和H4的乙酰化，抑制H-a ras激活的N H3T3的细胞生长水 平，并能有效诱导p21^{WAF1 /CIP1}的表达，阻滞肿瘤细胞周期。p21^WAF1/CIP1是细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)的天然抑制剂，能抑制CDKs的活性，导致细胞周期G1/S期的停滞。罗米地辛还诱导H sp90乙酰化，降低肿瘤蛋白水平和突变异种的表达，抑制E rbB1和E rbB2以及类风湿性因子(Raf1)，对多种血液肿瘤和实体瘤都具有明显的杀伤作用。

现已上市的注射用罗米地辛冻干药物组合物是粉针剂，商品名为Istodax，其以28天为一个疗程，在第1、8和15天分别在4小时过程中静脉输注给药，病人用药的顺应性差；容易引起心室激动总时间(Q-T间期)比基线水平值延长的风险。因此，降低罗米地辛副作用、改善病人顺应性且便于工业化生产对于罗米地辛药物的研究和开发而言具有重要意义。

脂微球，也称为亚微乳，是一种以脂肪油为软基质并被磷脂膜包封的微粒分散体系，其平均粒径为200nm左右。脂微球可以提高药物的稳定性、延长药物作用时间和降低毒副作用，并具有良好的靶向性等特点。

据检索，目前尚且没有关于罗米地辛脂微球制剂的相关报道。

发明内容

本发明一方面提供一种罗米地辛脂微球(亚微乳)制剂。其可通过注射途径给药，例如静脉注射、皮下注射或肌内注射等途径。此外，本发明的脂微球制剂可以是含水的液体制剂形式即脂微球液体制剂，例如脂微球注射液，也可以是临用前复溶为液体制剂的干燥形式，例如脂微球冻干制剂。

在一个实施方案中，本发明提供一种罗米地辛脂微球制剂，其包含罗米地辛、注射用油、乳化剂和注射用水。优选，各组分的重量百分比为：罗米地辛0.05～6.0％，注射用油2～40％，乳化剂0.2～10％。更优选，各组分的重量百分比为：罗米地辛0.1～3.0％，注射用油5～25％，乳化剂0.5～5％。

在另一实施方案中，本发明的罗米地辛脂微球制剂中还包含稳定剂。优选稳定剂的重量百分比为0.01～5％，更优选0.05～1％。

在另一实施方案中，本发明的罗米地辛脂微球制剂中还包含等渗 调节剂和/或pH调节剂。优选等渗调节剂的重量百分比为0.05～20％，更优选0.1～10％。

在另一实施方案中，本发明的罗米地辛脂微球制剂，由以下重量百分比的物质组成：罗米地辛0.05～6.0％，注射用油2～40％，乳化剂0.2～10％，稳定剂0.01～5％，等渗调节剂0.05～20％，pH调节剂，余量为注射用水。

作为优选，本发明的罗米地辛脂微球制剂，由以下重量百分比的物质组成：罗米地辛0.1～3.0％，注射用油5～25％，乳化剂0.5～5％，稳定剂0.05～1％，等渗调节剂0.1～10％，pH调节剂，余量为注射用水。

其中，所述注射用油选自矿物油、植物油、中性类脂、甾醇衍生物、动物油和合成油中的一种或多种的混合物；优选玉米油、大豆油、红花油、橄榄油、蓖麻油、棉籽油、茶油、薏苡仁油、麻油、鱼油、鸦胆子油和中链脂肪酸甘油三酯中的一种或多种的混合物；更优选大豆油、中链脂肪酸甘油三酯或者二者的混合物。

所述乳化剂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂和合成磷脂中的一种或者多种的混合物，优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或者二者的混合物。优选大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂的混合比例为1:3到3:1，更优选1:2-1:1。

所述稳定剂选自油酸或其盐如油酸钠、乙醇、丙二醇、抗坏血酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐中的一种或多种的混合物。优选乙醇、丙二醇或二者的混合物。

所述等渗调节剂选自甘油、葡萄糖、氯化钠、山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖中的一种或多种的混合物。

所述pH调节剂选自氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸、盐酸、枸橼酸、枸橼酸钠、醋酸和醋酸钠中的一种或多种的混合物，优选氢氧化钠。

本发明的罗米地辛脂微球，其粒径范围为100～300nm，pH值为5.0～8.0，Zeta电位绝对值为10～50mV。优选粒径范围为150～250nm，pH值为6.5～7.5，Zeta电位绝对值为20～30mV。

本发明另一方面提供上述罗米地辛脂微球制剂的制备方法，包括 如下步骤：

(1)油相的制备：称取处方量的罗米地辛、注射用油和乳化剂以及任选的稳定剂置于容器中，高速剪切，加热搅拌，使各组分完全溶解，制得油相；

(2)水相的制备：称取处方量的注射用水作为水相；或者将处方量的等渗调节剂加入处方量的注射用水中，使其完全溶解，制成水相；

(3)初乳的制备：在高速搅拌下，将油相和水相混合，制得初乳；并任选采用pH调节剂调节初乳的pH值；

(4)亚微乳的制备：将初乳进行高压均质，制得亚微乳；

(5)分装和灭菌：充氮气分装，热压灭菌或过滤灭菌后，得罗米地辛脂微球液体制剂；以及任选地

(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得罗米地辛脂微球制剂冷冻干燥，得到罗米地辛脂微球冻干制剂。

在一优选实施方案中，步骤(1)油相的制备具体为：称取处方量的罗米地辛、注射用油和乳化剂以及任选的稳定剂置于容器中，高速剪切1～10分钟，在30～80℃下加热搅拌，使其完全溶解，制得油相。

在一优选实施方案中，步骤(2)水相的制备具体为：称取处方量的等渗调节剂，加入处方量的注射用水，在30～80℃下加热搅拌，使其完全溶解，制得水相。

在一优选实施方案中，步骤(4)亚微乳的制备具体为：将初乳转移至高压均质机中，采用300～800bar的压力高压均质化制得亚微乳；

在一优选实施方案中，步骤(6)冷冻干燥具体为：匀速降温至-30℃至-60℃，保持该温度2-6小时，然后在15℃至30℃进行干燥，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

在另一具体实施方案中，本发明的罗米地辛脂微球制剂的制备方法，包含以下步骤：

(1)油相的制备：称取处方量的罗米地辛、注射用油、乳化剂和稳定剂置于烧杯中，采用高速剪切机进行高速剪切1～10分钟，在磁力搅拌水浴锅中在30～80℃下加热搅拌，搅拌速度为300～1000rpm，使其完全溶解，制得油相；

(2)水相的制备：称取处方量的等渗调节剂置于烧杯中，加入处 方量的注射用水，在磁力搅拌水浴锅中在30～80℃下加热搅拌，搅拌速度为300～800rpm，使其完全溶解，制得水相；

(3)初乳的制备：高速搅拌下，将油相和水相混合，采用pH调节剂调节pH值，制得初乳；

(4)亚微乳的制备：将初乳转移至高压均质机中，采用300～800bar的压力高压均质化制得亚微乳；

(5)分装和灭菌：充氮气分装，热压灭菌或过滤灭菌后，得罗米地辛脂微球液体制剂；以及任选地

(6)冷冻干燥：在0℃条件下，以≦5℃/min匀速降温至-45℃，保持该温度4小时，超真空干燥，以≦5℃/min升温至20℃进行干燥，直至冻干结束，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

在本文中，术语“重量百分比”为相对于注射用罗米地辛脂微球制剂的重量百分比。此外，如无特殊说明，本文中的各种操作以及下面的各种测定均在常温、常压下进行。

本发明的罗米地辛脂微球与注射用罗米地辛(商品名为Istodax)比较，具有如下优势：

(1)提高罗米地辛的靶向性。本发明的罗米地辛脂微球可将罗米地辛靶向于T淋巴细胞的主要定居场所——胸腺和周围淋巴结，而在其他组织分布很少。因此，一方面可以增强治疗皮肤T细胞淋巴瘤的效果，另一方可降低毒副作用，特别是对心脏的副作用，提高用药安全性。

(2)实现罗米地辛的缓释给药。本发明的罗米地辛脂微球可缓慢持续地释放罗米地辛，减少了给药次数和给药时间，提高患者的顺应性。

(3)制备工艺简单、成本低，便于实现工业化大生产。

附图说明

图1：实施例1制备的罗米地辛脂微球的体外累积释放曲线，纵坐标:累积释放百分率(％)，横坐标:时间(小时)；

图2：实施例2制备的罗米地辛脂微球的体外累积释放曲线，纵坐标:累积释放百分率(％)，横坐标:时间(小时)；

图3：实施例3制备的罗米地辛脂微球的体外累积释放曲线，纵坐标:累积释放百分率(％)，横坐标:时间(小时)；以及

图4：实施例1制备的罗米地辛脂微球制剂的粒径分布图，粒径分布曲线和累积分布曲线显示制剂的粒度D90小于1.32μm。

具体实施方式

实施例

下面的实施例仅仅是示例性的，并不意图限制本发明的范围。在不背离本发明精神的前提下，可以作出多种修改。

实施例1

(1)称取1.0g罗米地辛、5.0g大豆油和5.0g中链脂肪酸甘油三酯、1.5g大豆卵磷脂、0.4g丙二醇和0.05g乙醇置于烧杯中，采用高速剪切机进行高速剪切3分钟，在磁力搅拌水浴锅中在60℃下加热搅拌，搅拌速度为500rpm，使其完全溶解，制得油相；

(2)称取0.9g氯化钠置于烧杯中，加入86.2g注射用水，在磁力搅拌水浴锅中在60℃下加热搅拌，搅拌速度为500rpm，使其完全溶解，制得水相；

(3)高速搅拌下，将油相和水相混合，调节pH值至7.0，制得初乳；

(4)将初乳转移至高压均质机中，采用500bar压力高压均质化，制得亚微乳；

(5)充氮气分装，热压灭菌后，得罗米地辛脂微球注射液。

实施例2

(1)称取1.5g罗米地辛、6.5g大豆油和10.5g中链脂肪酸甘油三酯、2.0g蛋黄卵磷脂、0.8g丙二醇和0.2g乙醇置于烧杯中，采用高速剪切机进行高速剪切5分钟，在磁力搅拌水浴锅中在65℃下加热搅拌，搅拌速度为500rpm，使其完全溶解，制得油相；

(2)称取0.9g氯化钠置于烧杯中，加入77.4g注射用水，在磁力搅拌水浴锅中在65℃下加热搅拌，搅拌速度为400rpm，使其完全溶解，制得水相；

(3)高速搅拌下，将油相和水相混合，调节pH值至7.2，制得初乳；

(4)将初乳转移至高压均质机中，采用350bar压力高压均质化，制得亚微乳；

(5)充氮气分装，热压灭菌后，得罗米地辛脂微球注射液。

实施例3

(1)称取2.5g罗米地辛、4.5g红花油和15.5g中链脂肪酸甘油三酯、2.0g氢化蛋黄卵磷脂、1.0g丙二醇置于烧杯中，采用高速剪切机进行高速剪切8分钟，在磁力搅拌水浴锅中在45℃下加热搅拌，搅拌速度为700rpm，使其完全溶解，制得油相；

(2)称取4.5g甘露醇置于烧杯中，加入70g注射用水，在磁力搅拌水浴锅中在45℃下加热搅拌，搅拌速度为700rpm，使其完全溶解，制得水相；

(3)高速搅拌下，将油相和水相混合，调节pH值至6.7，制得初乳；

(4)将初乳转移至高压均质机中，采用650bar压力高压均质化，制得亚微乳；

(5)充氮气分装，热压灭菌后，得罗米地辛脂微球注射液。

实施例4

将实施例1所制得罗米地辛脂微球注射液分装到西林瓶中，在0℃条件下，以2℃/min匀速降温至-30℃，保持温度5小时，超真空干燥，以2℃/min升温至20℃进行干燥，直至冻干结束，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

实施例5

将实施例1所制得罗米地辛脂微球注射液分装到西林瓶中，在0℃条件下，以3℃/min匀速降温至-45℃，保持温度4小时，超真空干燥，以2℃/min升温至25℃进行干燥，直至冻干结束，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

实施例6

将实施例2所制得罗米地辛脂微球注射液分装到西林瓶中，在0℃条件下，以4℃/min匀速降温至-55℃，保持温度3小时，超真空干燥，以5℃/min升温至20℃进行干燥，直至冻干结束，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

实施例7

理化检测

(1)平均粒径

采用英国马尔文公司的Nano 90激光粒度分析仪来测定粒度和粒度分布。实施例1、2和3所得脂微球的平均粒径分别为180±20nm、191±21nm和177±13nm。

(2)Zeta电位

采用英国贝马尔文司的Nano 90激光粒度分析仪的测定Zeta电位。实施例1、2和3所得脂微球的Zeta电位分别为：-25.10mV、-26.90mV和-24.60mV。结果表明，三批样品的平均Zeta电位为-25.53mV，满足稳定的微粒液体体系对Zeta电位控制-20～-50mV范围内的要求，也表明本发明的制剂具有很好的稳定性。

(3)pH值

使用METTLE TOLEDO SK20pH计测定pH值，实施例1、2和3所得脂微球的pH值分别为7.00、7.28和6.79。

(4)包封率

精密量取实施例1制备的罗米地辛脂微球1ml于离心管中，以20000rpm超高速离心，取上清液0.1ml于50ml容量瓶中，加入甲醇破乳并稀释定容至刻度，混合均匀，精密量取20μL，注入高效液相色谱仪，记录图谱。精密量取实施例1制备的罗米地辛脂微球0.1ml于50ml容量瓶中，加入甲醇破乳并稀释定容至刻度，混合均匀，作为供试品，精密量取20μL，注入高效液相色谱仪，记录图谱。另取对照品对照瓶溶液，同法测定；外标法以峰面积计算罗米地辛脂微球含量。

根据以下公式计算罗米地辛脂微球制剂的包封率：

EN％＝(1-C_f/C_t)×100％

其中，C_f为游离药物的量，C_t为脂微球悬液中药物的总量。

实施例1的罗米地辛脂微球制剂的包封率为约84％；

实施例2的罗米地辛脂微球制剂的包封率为约82％。

(5)粒径分布

按马尔文Nano 90的设备操作规程测定样品粒径分布。

实施例8

稳定性考察

(1)离心稳定性

取罗米地辛脂微球样品，以4,000rpm离心15min后，实施例1、2和3所得脂微球仍为乳白色均匀乳状液体，未出现絮凝、分层、破乳等现象；以15,000rpm离心10min后，上述三批样品仍为乳白色均匀乳状液体，均未出现絮凝、分层、破乳等现象。可见本发明的罗米地辛脂微球具有良好的离心稳定性。

(2)冻融稳定性

冻融试验用于考察分散体系对温度变化的耐受性，其基本原理是通过改变分散体系所处环境的温度，引起自身能量的变化，观察由此产生的粒径等形态变化，以严格控制药物的储存条件。

将实施例1的罗米地辛脂微球注射液放入-20℃冰箱中冷冻12h，取出放置于室温中融化，放置12h，此为一个冻融循环。如此反复进行三次冻融循环，观察其外观并测定其粒径和粒径分布。

表1 罗米地辛脂微球注射液的冻融实验结果

经过冷冻的脂微球制剂颜色变黄，但是，融化后颜色恢复，未出现破乳、出油或絮凝的现象。由表1结果可以看出，冻融后脂微球制剂的粒径变化不大，仍然处于注射用脂微球制剂的安全范围内，而且随着冻融次数的增加，粒径基本不再变大，粒径分布也不再变宽。这说明冻融次数对罗米地辛脂微球的粒径并无显著影响，表明该制剂能经受剧烈的环境温度变化，反映了根据本发明的配方和制备方法所制备的罗米地辛脂微球具有良好的稳定性。

实施例9

释放性能

测试方法和条件

采用CE7smart全自动流池法，溶剂体积1000ml，温度范围：37.5±0.5℃，泵流速：8ml/min，闭环，取样时间1、2、3、4、5和6小时各取样1ml。

测试结果：根据图1～3的累计释放曲线可以看出，本发明的罗米地辛脂微球可基本上均匀地释放罗米地辛。

实施例10

罗米地辛体内组织分布研究

胸腺T细胞淋巴瘤动物模型的建立

实验组小鼠根据体重腹膜腔内注射N-甲基-N-亚硝基脲诱导液(50mg/kg体重)；对照组腹膜腔内注射等量生理盐水，共注射2次(分别于第0、8周)。注射开始后继续基础饮食，并观察动物体重、饮食、毛色、活动度等一般情况变化。对自由活动明显减少的濒死小鼠及自行死亡小鼠进行解剖观察。注射N-甲基-N-亚硝基脲诱导液开始后第20周，建立实验动物模型。模型小鼠尾静脉实施例2的罗米地辛脂微球，4周后将所有小鼠颈椎脱位法处死，解剖检测胸腺肿瘤及其他脏器的药 物分布。

标本采集

将胸腺、心、肺、肝、脾、肾、周围淋巴结(包括颈部、腋下、腹股沟、主动脉旁等淋巴结)组织分离，匀浆，提取罗米地辛，离心，取离心液，采用高效液相色谱法测定组织分布浓度。

血浆样品处理

精密量取血浆样品100μL，置于2ml聚乙烯离心管中，涡旋混匀10s，加入乙腈500μL，涡旋10s，高速离心(10000r·m-1)10min，吸取上清液200μL置于干净的聚乙烯管内，30℃氮气吹干，乙腈-水(25：75，v/v)200μL复溶，高速离心(10000r·m-1)5min，取上清液20μL进行高效液相色谱法分析。

罗米地辛在小鼠体内的组织分布结果在表1中给出。

表2罗米地辛的体内组织分布浓度图

由以上结果可以看出，经由本发明的罗米地辛脂微球给药后，

(1)罗米地辛主要分布于胸腺和周围淋巴结中，而这两种组织是T淋巴细胞的主要定居场所，表明本发明的罗米地辛脂微球制剂具有很好的靶向作用，有利于提高罗米地辛治疗皮肤T细胞淋巴瘤的作用；

(2)罗米地辛在心脏中几乎没有分布，因此，可大大降低其引起心室激动总时间(Q-T间期)比基线水平延长的风险，大大降低对心脏的副作用，而这是现有技术中的注射用罗米地辛粉针剂无法比拟的；以及

(3)罗米地辛在肺、肝、脾和肾几乎没有分布或分布浓度较低，这可大大降低罗米地辛全身给药引起对各脏器的毒副作用。

一方面提高疗效，另一方面降低毒副作用，因此，本发明的罗米地辛脂微球制剂可大大提高用药安全性和患者的顺应性。

Claims (5)

1.一种罗米地辛脂微球制剂，其特征在于，包含罗米地辛、注射用油、乳化剂、稳定剂、等渗调节剂、pH调节剂和注射用水；各组分的重量百分比为：罗米地辛1～2.5％，注射用油10～20％，乳化剂1.5～2％，稳定剂0.45～1％，等渗调节剂0.9～4.5％，pH调节剂，余量为注射用水；

所述注射用油选自大豆油、红花油和中链脂肪酸甘油三酯中的一种或多种的混合物；

所述乳化剂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或氢化蛋黄卵磷脂；

所述稳定剂选自乙醇、丙二醇或两者的混合物；

所述等渗调节剂选自氯化钠或甘露醇；

所述pH调节剂为氢氧化钠。

2.根据权利要求1的罗米地辛脂微球制剂，其特征在于，所述注射用油选自大豆油、中链脂肪酸甘油三酯或者二者的混合物。

3.根据权利要求1或2中任一项的罗米地辛脂微球制剂，其特征在于，所述脂微球制剂是含水的液体制剂形式，或者是临用前复溶为液体制剂的干燥形式。

4.根据权利要求3的罗米地辛脂微球制剂，其特征在于，所述含水的液体制剂形式为脂微球注射液，所述临用前复溶为液体制剂的干燥形式为脂微球冻干制剂。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的罗米地辛脂微球制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)油相的制备：称取处方量的罗米地辛、注射用油、乳化剂和稳定剂置于烧杯中，采用高速剪切机进行高速剪切1～10分钟，在30～80℃下加热搅拌，搅拌速度为300～1000rpm，使其完全溶解，制得油相；

(2)水相的制备：称取处方量的等渗调节剂置于烧杯中，加入处方量的注射用水，在30～80℃下加热搅拌，搅拌速度为300～800rpm，使其完全溶解，制得水相；

(3)初乳的制备：高速搅拌下，将油相和水相混合，采用pH调节剂调节pH值，制得初乳；

(4)亚微乳的制备：将初乳转移至高压均质机中，采用300～800bar的压力高压均质化，制得亚微乳；

(5)分装和灭菌：充氮气分装，热压灭菌或过滤灭菌后，得罗米地辛脂微球液体制剂；以及任选地

(6)冷冻干燥：在0℃条件下，以≦5℃/min匀速降温至-45℃，保持该温度4小时，超真空干燥，以≦5℃/min升温至20℃进行干燥，直至冻干结束，得罗米地辛脂微球冻干制剂。

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