CN1407110A - β－二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物合成新方法 - Google Patents
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Abstract
β－二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物合成新方法，包括苦皮藤接种C58农杆菌、取接种后形成的冠瘿组织于培养基上进行培养、目标产物萃取步骤。接种步骤可采用叶盘法或直接穿刺法，组织培养过程避光进行，培养基采用无激素培养基。本发明不受自然资源限制，组织培养条件温和，设备投资少，成本低，合成周期短，易于工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因培养合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法。
背景技术
β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物是一类具有杀虫活性和昆虫拒食性物质，该类化合物具有杀虫效果好，对天敌杀伤力小、对人畜低毒等特性，可作为高效低毒无公害杀虫剂。但是此类化合物仅存在于天然植物苦皮藤中，且含量很低。由于其结构复杂，化学合成非常困难，很不经济，严重限制了其进一步开发应用。
农杆菌是一种植物病原菌，主要有根癌农杆菌和发根农杆菌，能浸染植物受伤部位，导致受伤部位长瘤或长根。C58农杆菌是一种含有Ti质粒的根癌农杆菌。农杆菌转化植物细胞是通过将体内质粒的一段DNA(T-DNA)转移到被浸染的植物细胞而实现的。参与该过程的遗传物质基础主要有三个方面：(1)被转移的T-DNA，该DNA片段位于农杆菌内一个大质粒上(Ti或Ri)；(2)位于同一质粒上，用于编码FDNA加工、转移及整合等功能蛋白的致毒区(Vir区)，该致毒区至少包括6个位点，分别为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE和VirG，每位点包括1-11个开放阅读框。有些菌种还有VirF和VirH位点；(3)位于细菌染色体上的与农杆菌吸附植物细胞壁有关的基因(Chv)。已有研究表明，农杆菌浸染植物细胞时，首先是吸附到植物细胞壁(与Chv)有关，随后VirA的蛋白感受植物受伤细胞产生的信号(酚类化合物、糖类等)，自身发生磷酸化。磷酸化的VirA蛋白进而将其磷酸基转移到VirG蛋白保守的天冬氨酸残基上，使VirG蛋白活化，活化的VirG蛋白以二体或多体的形式结合到其它Vir基因启动的特定区域，从而激活其它Vir基因的转录，产生T-DNA。T-DNA具有编码生长素合成酶基因iaaM(tmsll)、iaaH(tms2)及编码细胞分裂素合成酶基因ipt(tmr)，当农杆菌浸染植物时可以将T-DNA整合到植物细胞的基因组，在植物细胞内iaaM和iaaH基因分别表达编码色氨酸单加氧酶及吲哚乙酸酰胺水解酶，这两个酶共同作用合成吲哚乙酸(1AA)，而ipt基因表达编码异戊烯基转移酶，该酶催化合成细胞分裂素一异戊烯腺嘌呤(ipA)。T-DNA指导的生长素及细胞分裂素的合成导致了转化植物组织出现冠瘿组织的形态。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用C58农杆菌接种苦皮藤合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物合成新方法，包括苦皮藤接种C58农杆菌、组织培养和目标产物萃取步骤；在接种步骤，用经活化的C58农杆菌对苦皮藤根、茎、叶进行接种；在组织培养步骤，取接种后形成的冠瘿组织接种于固体培养基A上，于16-32℃培养2-4周；在目标产物萃取步骤，在提取器中用有机溶剂回流萃取愈伤组织4-6小时，蒸去有机溶剂得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
在组织培养步骤，把固体培养基A培养后的冠瘿组织移入液体培养基B于16-32℃培养2-4周。
苦皮藤接种C58农杆菌可在无菌条件下采用叶盘法或直接穿刺法进行或在自然生长条件下用直接穿刺法进行；组织培养过程避光进行，培养基采用无激素培养基。
C58农杆菌活化过程为：先将冻干保存的C58农杆菌接种于PH7.0-7.5的无菌斜面固体培养基A’上进行培养，每100ml固体培养基A’含蛋白胨0.2-1.0g、牛肉浸膏0.3-1.5g、蔗糖0.5-3g、硫酸镁20-30mg、琼脂1-5g，培养条件为20-28℃、约2天转接一次、转接2-4次；再接种于PH7.0-7.5的无菌液体培养基B’上进行培养，每100ml液体培养基B’含蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏0.2-0.8g、蔗糖0.5-1.5g，培养条件20-28℃、120-160rpm摇床培养1-2天，对照无菌液体培养液OD56nm＝1.58时，按菌液：无菌液体培养液体积比1∶200把菌液加入培养液于120-160rpm摇床继续培养至OD560nm＝1.5-1.6时止，该培养液稀释5倍至OD560nm＝0.7-0.8。
固体培养基A含有硫酸镁185-740mg/l、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l、硝酸钾950-3800mg/l、硝酸铵825-3300mg/l、氯化钙220-880mg/l、蔗糖1 5000-60000mg/l、琼脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、烟酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸锰7.8-31.2mg/l、硫酸锌4.3-17.2mg/l、钼酸钠0.125-0.50mg/l、硫酸铜0.0125-0.050mg/l、氯化钴0.0125-0.050mg/l、碘化钾0.415-1.66mg/l、硫酸亚铁13.9-55.6mg/l、EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l，逐一称取除蔗糖、琼脂外培养基成分，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，再加入配方量蔗糖和琼脂使溶化，调PH＝5.5-6.5灭菌。
液体培养基B中含有：硫酸镁185-740mg/l、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l、硝酸钾950-3800mg/l、硝酸铵825-3300mg/l、氯化钙220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、烟酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸锰7.8-31.2mg/l；硫酸锌4.3-17.2mg/l、钼酸钠0.125-0.50mg/l、硫酸铜0.0.125-0.050mg/l、EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l，逐一称取除蔗糖外培养基成分，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，再加入蔗糖溶解，调PH＝5.5-6.5灭菌得液体培养基B。
本发明方法中，C58农杆菌接种后1-15分钟即可形成冠瘿组织或冠瘿瘤。本发明利用生物学的转基因培养方法合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，不受自然资源限制；方法中组织培养用培养基为组织培养中广泛应用的培养基，成份易得；培养基中含有氮、磷、钾等大量元素，硼、锌、锰、钼、钴、碘、铁、钠等微量元素，硫胺、吡多醇、烟酸、肌醇等维生素。能够提供组织培养所需各种营养成份。组织培养条件温和，萃取方法简便易行，整个方法易于工业化应用。除具有上述优点外，与常规组织培养方法相比较，本发明采用转基因培养法，不需要添加外源植物激素，成本大幅度降低；组织生长迅速，一般2-4周即可完成，而常规组织培养法则需近3个月；无需照明，常规组织培养一般在光照下效果好，而本发明采用转基因培养法则无需光照，培养过程避光进行，既减少了生产设备，又降低了投资额及生产成本，维护费用也得以降低。
附图说明
图1为目标产物代表物苦皮素A结构式。
具体实施方式
实施例1、β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物合成新方法，包括苦皮藤接种C58农杆菌、组织培养和目标产物萃取步骤，
接种步骤：首先对C58农杆菌进行活化，将冻干保存的C58农杆菌接种于斜面固体培养基A’上。固体培养基A’成分为：每100ml固体培养基含0.5g蛋白胨、0.5g牛肉浸膏、0.5g蔗糖、24mg硫酸镁、2g琼脂，用1N NaOH水溶液调PH7.2，于0.1-0.15MPa、12l℃消毒30min。培养条件为25℃、每48hrs转接一次，转接三次。然后接种于液体培养基B’上。每100ml液体培养基含1g蛋白胨、0.5g酵母膏、1g蔗糖，用1NNaOH水溶液调PH＝7.2，于0.1-0.15MPa、121℃消毒30min。培养条件25℃摇床(120-160rpm)培养36小时，以无菌液体培养液为空白对照，分光光度计测其OD560nm＝1.58时，将0.1ml菌液转入20ml液体培养基继续于25℃振荡培养(120-160rpm)，当测得其OD560nm＝1.5-1.6时，培养液稀释5倍，其OD560nm＝0.7-0.8，备用。再对苦皮藤叶片进行消毒处理，选取生长良好、健壮的苦皮藤叶片，自来水冲洗4小时后加1％氯化汞溶液浸泡10分钟，无菌水漂洗8-10次，无菌滤纸吸干水分。用无菌微型注射器或手术刀取活化后的C58农杆菌液，直接在上述叶片(外植体)叶脉、叶柄进行多次穿刺接种。
组织培养及目标产物萃取：把接种后形成的冠瘿组织转接于固体培养基A上，在25℃无光条件下培养2周，把愈伤组织置于索氏提取器中加石油醚萃取4小时，再蒸除石油醚，即得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，其代表物为苦皮素A。
本实施例中，固体培养基A制法为：硫酸镁370mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、氯化钙440mg、硼酸6.2mg、硫酸锰15.6mg；硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钴0.025mg、碘化钾0.83mg、硫酸亚铁27.8mg、EDTA钠盐37.3mg、硫胺0.5mgl、吡多醇0.5mg、烟酸0.05mg、肌醇120mg，用水溶解、混合，加水稀释至1000ml，再称取蔗糖36000mg、琼脂14000mg加入上述溶液中加热使溶化，用0.1mol/1NaoH调PH＝5.8，121℃灭菌20分钟，冷却得固体培养基1。
实施例2，本实施例中，固体培养基A配方为：硫酸镁444mg/l、磷酸二氢钾204mg/l、硝酸钾2800mg/l、硝酸铵1980mg/l、氯化钙528mg/l、硼酸7.4mg/l、硫酸锰18.8mg/l；硫酸锌10.3mg/l、钼酸钠0.30mg/l、硫酸铜0.03mg/1、氯化钴0.03mgl、碘化钾0.99mg/l、硫酸亚铁33.2mg/l、EDTA钠盐44.5mg/l、硫胺0.6mgl/l、吡多醇0.6mg/l、烟酸0.06mg/l、肌醇120mg/l。蔗糖30000mg/l、琼脂12000mg/l。其它同实施例1。
实施例3，本实施例中，C58农杆菌活化及苦皮藤叶片消毒处理同实施例1。固体培养基A配方及制法同实施例1。液体培养基B配方为：硫酸镁296mg/l、磷酸二氢钾136mg/l、硝酸钾1520mg/l、硝酸铵1320mg/l、氯化钙328mg/l、硼酸5.0mg/l、硫酸锰12.4mg/l；硫酸锌6.9mg/l、钼酸钠0.20mg/l、硫酸铜0.02mg/l、氯化钴0.02mg/l、碘化钾0.66mg/l、硫酸亚铁22.3mg/l、EDTA钠盐29.4mg/l、硫胺0.4mgl/l、吡多醇0.4mg/l、烟酸0.04mg/l、肌醇80mg/l。蔗糖30000mg/l。制法为：取上述除蔗糖外成份水溶、混合并加水稀释至所需浓度，加入蔗糖溶解，调PH＝6.0，121℃灭菌30min得液体培养基A。
取消毒处理后叶片用备用打孔器打成小圆片，放入灭菌培养箱中，灭菌后加入活化后的C58农杆菌液接种，浸泡5分钟，用无菌滤纸吸干多余菌液。转接于固体培养基A上，在25℃无光条件下培养2周，再取出愈伤组织移入液体培养基B中于振荡培养箱中25℃120rpm(转/分)条件下避光培养2周，过滤分开培养物和培养液，分别于索氏提取器中用甲醇提取4小时，蒸去甲醇得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，其代表物为苦皮素A。
实施例1、2、3中目标产物代表物苦皮素A1H和13CNMR普数据见表，结构式见图1。用RP-HPLC法(反相高压液相色谱，流动相：甲醇∶水＝9∶1，流速1ml/min，C-18柱)测定目标产物代表苦皮素A含量，实施例1、2、3所得目标产物中苦皮素A含量分别为0.26％、0.26％、0.22％。
表1 苦皮素A 1H和13C NMR谱图数据
C δC H δH
1 75.0 1 5.49d
2 67.3 2 5.39dd
3 41.1 3 2.02dd 2.12d
4 72.1 4
5 91.5 5
6 76.8 6 5.22s
7 53.5 7 2.58d
8 73.8 8 5.62dd
9 75.3 9 6.06d
10 50.5 10
11 84.5 11
12 61.7 12 4.87d 4.65d
13 24.2 13 1.78s
14 26.3 14 1.61s
15 30.0 15 1.72s
乙酰基
a 169.5 169.6
b 20.5 21.1 1.55s 2.11s
异丁酰基
a 175.8 176.7
b 34.1 34.3 2.38sept 2.85sept
c 18.4 18.6 19.0 19.1 0.92d 0.95d 1.353d 1.348d苯甲酰基
a 165.7
b 129.4
c 129.2 7.85m
d 128.6 7.42m
e 133.4 7.55m
Claims (6)
1、β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物合成新方法，本发明特征在于，包括苦皮藤接种C58农杆菌、组织培养和目标产物萃取步骤；在接种步骤，用经活化的C58农杆菌对苦皮藤根、茎、叶进行接种；在组织培养步骤，取接种后形成的冠瘿组织接种于固体培养基A上，于16--32℃培养2-4周；在目标产物萃取步骤，在提取器中用有机溶剂回流萃取愈伤组织4-6小时，蒸去有机溶剂得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在组织培养步骤，把固体培养基A培养后的冠瘿组织移入液体培养基B于16-32℃培养2-4周。
3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，苦皮藤接种C58农杆菌可在无菌条件下采用叶盘法或直接穿刺法进行或在自然生长条件下用直接穿刺法进行；组织培养过程避光进行，培养基采用无激素培养基。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，C58农杆菌活化过程为：先将冻干保存的C58农杆菌接种于PH7.0-7.5的无菌斜面固体培养基A’上进行培养，每100ml固体培养基A’含蛋白胨0.2-1.0g、牛肉浸膏0.3-1.5g、蔗糖0.5-3g、硫酸镁20-30mg、琼脂1-5g，培养条件为20-28℃、约2天转接一次、转接2-4次；再接种于PH7.0-7.5的无菌液体培养基B’上进行培养，每100ml液体培养基B’含蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏0.2-0.8g、蔗糖0.5-1.5g，培养条件20-28℃、120-160rpm摇床培养1-2天，对照无菌液体培养液OD56nm＝1.58时，按菌液：无菌液体培养液体积比1∶200把菌液加入培养液于120-160rpm摇床继续培养至OD560nm＝1.5-1.6时止，该培养液稀释5倍至OD560nm＝0.7-0.8。
5、如权利要求3所述的方法，其特征在于，固体培养基A含有硫酸镁185-740mg/l、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l、硝酸钾950-3800mg/l、硝酸铵825-3300mg/l、氯化钙220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l、琼脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/1、烟酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸锰7.8-31.2mg/l、硫酸锌4.3-17.2mg/l、钼酸钠0.125-0.50mg/l、硫酸铜0.0125-0.050mg/l、氯化钴0.0125-0.050mg/l、碘化钾0.415-1.66mg/l、硫酸亚铁13.9-55.6mg/l、EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l，逐一称取除蔗糖、琼脂外培养基成分，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，再加入配方量蔗糖和琼脂使溶化，调PH＝5.5-6.5灭菌。
6、如权利要求3所述的方法，其特征在于，液体培养基B中含有：硫酸镁185-740mg/l、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l、硝酸钾950-3800mg/l、硝酸铵825-3300mg/l、氯化钙220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、烟酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸锰7.8-31.2mg/l；硫酸锌4.3-17.2mg/l、钼酸钠0.125-0.50mg/l、硫酸铜0.0125-0.050mg/l、EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l，逐一称取除蔗糖外培养基成分，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，再加入蔗糖溶解，调PH＝5.5-6.5灭菌得液体培养基B。
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| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |