CN115247133B - 一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂，所述链霉菌为暗黑链霉菌（Streptomyces atratus），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7826，保藏日期为2013年6月28日；所述链霉菌菌剂的制备方法包括以下步骤：（1）菌种活化培养；（2）制备种子液；（3）制备暗黑链霉菌菌剂，所述链霉菌菌剂用于制备暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液，所述暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液能够有效提高砧穗的切口的PAL和POD等功能酶的活性，促进接穗的生理活性从而推进愈合进程，提高愈合率。

Description

一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂
技术领域
本发明涉及微生物菌剂，具体是涉及一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂。
背景技术
树木嫁接是一种在生产上应用很广的繁殖措施，嫁接过程中，砧木与接穗伤口表面受伤细胞形成一层褐色的隔膜，覆被着伤口，以后在薄膜下的受伤细胞受刺激，使伤口周围的细胞生长和分裂，使隔离膜破裂，形成愈伤组织，填满砧穗之间的空隙。愈伤组织进一步分化形成维管组织，将接穗与砧木连接在一起。砧木吸收土壤的水分与养分，由木质部的导管通过愈伤组织接合部，向上输送到接穗，供给接穗进行光合作用、蒸腾作用及制造营养物质；接穗接受砧木输送的矿质营养元素转化为含氮有机化合物，满足自身生长需要的同时，通过韧皮部的筛管向下输送营养供给根部的生长发育，成为连成一体的一株完整的植株。
嫁接伤口经历了五个阶段，分别为隔离层产生期、愈伤组织分化形成期、愈伤组织连接期、形成层分化形成期、维管束分化形成期。其中砧木由于营养物质供应快，其愈伤组织分化时间早于接穗，嫁接伤口的愈合速度与愈伤组织形成的快慢、分裂的速度与隔膜的厚薄，砧穗形成层分裂活动状况及输导组织的分化和高接成活力高低有关。苯丙氨酸酶(PAL)和过氧化物酶(POD)等功能酶在植物色素形成、植物细胞分化和木质化过程、参与植物抗逆作用方面具有重要作用，而研究表明嫁接伤口处PAL和POD等酶的活性、纤维素含量的增加对愈伤组织的形成具有显著的影响，活性提高总酚和木质素，能够推进愈伤进程，有助于愈伤组织木质化的形成。
目前的树木嫁接愈合剂以防止接穗与砧木伤口水分、养分流失并增加营养，提高消毒、抗病、抗腐能力为主，对于砧穗的亲和力差、接穗愈伤组织不易产生的苗木还缺少从生理过程、发育角度解决伤口愈合的具体方法。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂，能够有效提高接穗的切口的苯丙氨酸酶(PAL)和过氧化物酶(POD)等功能酶的活性，促进接穗的生理活性从而推进愈合进程，提高愈合率。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂，其技术要点是：所述链霉菌为暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7826，保藏日期为2013年6月28日；
所述链霉菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化培养
对暗黑链霉菌进行平板培养，得到活化的暗黑链霉菌；
(2)制备种子液
挑取活化的暗黑链霉菌接入种子培养基中，28℃条件下200r/min摇床培养2d，获得种子液并调节孢子浓度，所述种子液孢子浓度为1×107CFU·ml-1-1×108CFU·ml-1；
(3)制备暗黑链霉菌菌剂
把种子液接入发酵培养基中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20，在8℃条件下200r/min摇床培养6d，获得发酵液，将发酵液3000-5000r/min离心5-10min，获得发酵沉淀物和上清液，所述上清液即为暗黑链霉菌菌剂；
进一步的，所述发酵培养基为改良ISP1培养基，所述改良ISP1培养基配方为：胰酪蛋白胨4g/L，酵母浸粉2g/L，淀粉2g/L，KCl 0.01g/L，K2HPO4 0.01g/L，KH2PO4 0.01g/L，CaCO3 0.01g/L，MgSO4·7H2O0.01 g/L。
进一步的，所述链霉菌菌剂用于制备暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液，所述混合液的制备方法为：
将步骤(3)所述发酵沉淀物用无水乙醇浸泡12-14h，所述无水乙醇使用量为0.1-0.5ml/g(湿重)，8000-10000r/min离心10min，上清液即为发酵物提取液，将步骤(3)中暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合，获得混合液；所述暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的体积比为10:0.1-1。
进一步的，所述链霉菌菌剂用于促进接穗切口部位PAL、PPO、SOD、POD活性。
进一步的，所述链霉菌菌剂用于促进接穗切口部位纤维素含量。
进一步的，所述暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液用于促进接穗切口部位PAL、PPO、SOD、POD活性。
进一步的，所述暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液用于促进接穗切口部位纤维素含量。
本发明的有益效果：
(1)本方法采用的链霉菌菌剂可以用于缩短接穗与砧木在产生愈伤组织时间上的差距，将愈伤组织分化形成期提前，从而加快愈合进程。
(2)本方法的链霉菌菌剂能够有效提高砧穗的切口的苯丙氨酸酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性，增加纤维素含量，从嫁接发育生理机理角度解决愈伤组织形成的问题。
附图说明
图1为实施例3中链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄接穗切口部位PAL的影响；
图2为实施例3中链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄接穗切口部位PPO的影响；
图3为实施例3中链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄接穗切口部位纤维素含量的影响。
具体实施方式
实施例1促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂及相关活性物的制备
1.1促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂的配制
所述链霉菌为暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.7826，保藏日期为2013年6月28日；
所述链霉菌菌剂制备方法为：
(1)菌种活化培养
采用高氏一号培养基对暗黑链霉菌进行平板培养，得到活化单菌株；
所述高氏一号培养基配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾0.1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，水1L，调整pH值到7.2-7.4；
(2)制备种子液
用接种环挑取活化的暗黑链霉菌接入装有种子培养基中，28℃条件下200r/min摇床培养2d，调节孢子浓度，获得孢子浓度为1×107CFU·ml-1-1×108CFU·ml-1的种子液；
种子培养基为ISP1培养基，配方为酪蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，pH调至7.2-7.4；
(3)制备暗黑链霉菌菌剂
把种子液直接接入发酵培养基中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20，在28℃条件下200r/min摇床培养6d，获得发酵液，将发酵液3000-5000r/min离心5-10min，获得发酵沉淀物和上清液，所述上清液即为暗黑链霉菌菌剂；
发酵培养基为改良ISP1培养基，配方为：胰酪蛋白胨4g/L，酵母浸粉2g/L，淀粉2g/L，KCl 0.01g/L，K2HPO4 0.01g/L，KH2PO4 0.01g/L，CaCO3 0.01g/L，MgSO4·7H2O0.01 g/L，pH调至7.2-7.4；
1.2制备暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液
将步骤(3)所述发酵沉淀物用无水乙醇浸泡12-14h，所述无水乙醇使用量为0.1-0.5ml/g(湿重)，8000-10000r/min离心10min，得上清液，即为发酵物提取液，将步骤(3)中暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合，获得混合液；所述暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的体积比为10:0.1-1。
实施例2链霉菌菌剂及其发酵物提取液对接穗切口的促进作用
2.1试验材料
试验时间为2021年6月初，试验地点为辽宁沈阳，选取榆树、五味子、山楂、苹果、樱桃树新生枝条，将上述枝条基部切口，每个树木品种的处理1、处理2、处理3均30株。
2.2试验处理
处理1：上述枝条切口后，采用暗黑链霉菌菌剂浸泡基部2min～5min，用塑料薄膜包扎枝条基部，置于20℃下放置4天。
处理2：上述枝条切口后，采用暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液浸泡基部2min～5min，用塑料薄膜包扎枝条基部，置于20℃下放置4天。
处理3：上述枝条分别设置对照处理，切口后直接用塑料薄膜包扎枝条基部，置于20℃下放置4天。
各处理切口直接用塑料薄膜包扎枝条基部4天后，切取各处理枝条基部组织样品，调查各处理样品PAL(苯丙氨酸解氨酶)、PPO(多酚氧化酶)、纤维素含量、SOD(超氧化物岐化酶)、POD(过氧化物酶)，计算处理1、处理2相对于处理3的增长倍数。
所述PAL测定采用苯丙氨酸解氨酶检测试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)，PPO测定参照Coseteng速率法、纤维素含量测定采用酸性洗涤剂法、SOD测定采用SOD活性检测试剂盒(WST-8法)(上海碧云天生物技术有限公司)、POD测定采用愈创木酚法。
2.3链霉菌菌剂及其发酵物提取液对枝条伤口愈合的影响
在嫁接过程中接穗伤口和砧木伤口的愈合进程并不一致，原因是砧木由根部提供足够的营养进行伤口修复与伤口愈合，而接穗前期是依赖枝条内部本身的营养进行修复，等到二者结合才能从砧木获取营养，因此前期PAL、PPO、纤维素含量、SOD、POD等活性的增加有助于接穗枝条更快进行细胞分裂，从而加快与砧木结合的进程，达到缩短愈合进程的效果。
调查结果表明，处理1和处理2与处理3(对照)相比，各供试植物品种枝条样品切口部位的上述活性均高于对照处理，表明链霉菌菌剂及其发酵物提取液对苗木切口的生理活性具有促进作用，具有促进愈伤组织形成的功能，其中处理2暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液的促进作用高于链霉菌菌剂单剂，可见发酵物提取液中暗黑链霉菌菌剂代谢产物对树木枝条伤口部位生理活性的促进作用更强。
表1链霉菌菌剂及其发酵物提取液对枝条接穗样品切口部位的影响
样品 处理 PAL PPO 纤维素含量 SOD POD
榆树 处理1 1.22 1.35 1.42 1.12 1.24
榆树 处理2 1.45 1.51 1.63 1.35 1.42
五味子 处理1 1.25 1.46 1.33 1.25 1.09
五味子 处理2 1.47 1.64 1.49 1.41 1.35
山楂 处理1 1.20 1.31 1.27 1.17 1.21
山楂 处理2 1.36 1.47 1.35 1.30 1.44
苹果 处理1 1.07 1.21 1.04 1.22 1.11
苹果 处理2 1.34 1.46 1.32 1.45 1.38
樱桃 处理1 1.16 1.19 1.24 1.06 1.22
樱桃 处理2 1.33 1.42 1.45 1.25 1.41
*表中数值为处理1或处理2相对于处理3(对照)的增长倍数
实施例3链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄嫁接苗木的影响
3.1试验材料
试验时间为2021年6月初，试验地点为辽宁省沈阳市新民葡萄试验区，砧木为1年生‘贝达’，接穗品种为4年生“玫瑰香”，嫁接方法为绿枝劈接法和硬枝劈接法；其中绿枝劈接法每个处理120株，嫁接后用薄膜密封保湿，硬枝劈接法每个处理60株。
3.2试验处理
处理1：嫁接时接穗切口后，采用暗黑链霉菌菌剂浸泡接穗基部2min～5min，采用绿枝劈接法和硬枝劈接法进行嫁接。
处理2：嫁接时接穗切口后，采用暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液浸泡接穗基部2min～5min，采用绿枝劈接法和硬枝劈接法进行嫁接。
处理3：对照处理，嫁接时接穗切口后直接按照传统绿枝劈接法和硬枝劈接法进行嫁接。
愈合情况测定：
每个处理绿枝劈接法和硬枝劈接法各60株，调查嫁接平均愈合率和愈合时间。
活性测定：
PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性测定：测定方法见2.2，测定日期在嫁接后的0、2、4、6、8天分别取15株接穗样品切口部位进行活性测定，并计算平均值。
PPO(多酚氧化酶)活性测定：测定方法见2.2，测定日期在嫁接后的0、3、6、9、12天分别取15株接穗样品切口部位进行活性测定，并计算平均值。
纤维素含量测定：测定方法见2.2，测定日期在嫁接后的0、1、3、5、7天分别取15株接穗样品切口部位进行活性测定，并计算平均值。
3.3链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄嫁接伤口愈合的影响
调查结果表明：与对照(处理3)相比，采用处理1和处理2能够明显缩短葡萄嫁接的愈合过程，完成葡萄嫁接种愈伤组织的形成和对接过程，平均愈合率明显提高，其中暗黑链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液对嫁接伤口的愈合促进作用高于暗黑链霉菌菌剂单剂。
表2链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄嫁接伤口愈合的影响
处理 嫁接方法 平均愈合率(％) 愈合时间(d)
处理1 绿枝劈接繁殖 94.5 34-36
处理1 硬枝劈接繁殖 90.3 36-38
处理2 绿枝劈接繁殖 97.6 32-34
处理2 硬枝劈接繁殖 93.2 33-36
处理3 绿枝劈接繁殖 87.5 37-40
处理3 硬枝劈接繁殖 80.3 39-43
实施例3链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄接穗切口生理活性的影响
PAL是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，在植物细胞分化和木质化过程、参与植物抗病和抗虫、抗逆过程具有重要意义；PPO在当植物遭到创伤时能够催化多酚类物质氧化形成醌，该产物能够参与保护植物免受其他的伤害，而在嫁接过程中，导致嫁接愈伤组织慢的重要因素为外界真菌或细菌的感染降低愈合进程，即PPO活性的增加可以使接穗和砧木接口处降低外界菌的危害，从而加快愈合进程；纤维素在植物细胞分裂、初生细胞壁形成、次生细胞壁加厚过程中，纤维素的合成和沉积具有非常重要的作用。在本实施例调查结果中(见图1-图3)，不同取样日期，处理1和处理2样品的PAL活性、PPO活性、纤维素含量均高于处理3(对照)在相应时间段的活性，可见，在接穗与砧木的结合过程中，链霉菌菌剂及其发酵物提取液对葡萄接穗切口的生理活性的具有明显的促进作用，从而缩短了接穗和砧木切口的愈合过程，并提高了平均愈合率。

Claims (2)

1. 一种促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂，其特征是：所述链霉菌为暗黑链霉菌（Streptomyces atratus），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 7826，保藏日期为2013年6月28日；
所述链霉菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化培养
采用高氏一号培养基对暗黑链霉菌进行平板培养，得到活化的暗黑链霉菌；
（2）制备种子液
接种环挑取活化的暗黑链霉菌接入种子培养基中，28℃条件下200 r/min 摇床培养2d，获得孢子浓度为1×107 CFU·ml-1-1×108CFU·ml-1的种子液，所述种子培养基为ISP1培养基；
（3）制备链霉菌菌剂
把种子液接入发酵培养基中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20，在28 ℃条件下200 r /min 摇床培养6 d，获得发酵液，将发酵液3000-5000r /min 离心5-10 min，获得发酵沉淀物和上清液，所述上清液为链霉菌菌剂；
所述发酵培养基为改良ISP1培养基，所述改良ISP1培养基配方为：胰酪蛋白胨4g/L，酵母浸粉2 g/L，淀粉2g/L，KCl 0.01 g/L，K2HPO4 0.01 g/L，KH2PO4 0.01 g/L，CaCO3 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，pH调至7.2-7.4；
所述链霉菌菌剂用于促进树木接穗切口部位苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、超氧化物岐化酶活性、过氧化物酶活性以及纤维素含量增加。
2. 一种权利要求1所述的促进嫁接树木伤口愈合的链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液，其特征是：所述链霉菌菌剂与发酵物提取液的混合液制备方法为：将权利要求1步骤（3）中所述发酵沉淀物用无水乙醇浸泡12-14 h，所述无水乙醇使用量为每克发酵沉淀物加入0.1-0.5ml无水乙醇；8000-10000 r /min 离心10 min后的上清液即为发酵物提取液，将权利要求1步骤（3）中所述链霉菌菌剂与发酵物提取液混合，获得混合液，所述链霉菌菌剂与发酵物提取液的体积比为10:0.1-1。
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