CN1403081A - 他汀类抑制破骨细胞形成的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制破骨细胞形成的方法，包括向需要的哺乳动物施用治疗有效量的他汀，以及含有他汀的药物组合物和药盒，或者通过抑制破骨细胞形成而治疗或预防疾病状态的方法，包括向需要的哺乳动物施用治疗有效量的他汀，所述疾病选自骨质疏松、佩吉特氏病、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治疗的副作用，以及长期应用糖皮质激素的副作用。

Description

他汀类抑制破骨细胞形成的用途
                          发明领域
本发明涉及他汀(statins)类抑制破骨细胞形成的用途，更具体而言，本发明涉及阿伐他汀(atorvastatin)抑制破骨细胞形成的用途和药物组合物，盛有含他汀的组合物的药盒，和通过抑制破骨细胞形成治疗或预防疾病的方法，所述疾病例如骨质疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治疗以及长期应用糖皮质激素的副作用。
                          发明背景
维持骨密度是一动态的过程，其中破骨细胞吸收骨而成骨细胞再造骨骼，Parfitt Am，Riggs BL，Melton LJ，Osteoporosis：etiology，diagnosis andmanagement，New York：Raven Press，1988；13：501。在如骨质疏松和佩吉特氏病病症中，骨吸收和骨形成之间的失衡导致骨损失。受失衡影响的其它病症和疾病包括：骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失或免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的副作用。骨损失部分是破骨发生(osteoclastogenesis)增强的结果，所述破骨发生是一系列事件，包括破骨细胞分化、迁移、融合和存活。破骨细胞，一种多核巨细胞，它是由巨噬细胞系造血细胞发育而来的，是成骨细胞/间质细胞产生的破骨细胞生成细胞因子增加的结果，Suda T，Takahashi N，Martin TJ，Modulation ofosteoclast differentiation，Endocr.Rev.，1992；13；66-80；Chambers TJ，Revell PA，Fuller K，Athanasou NA，Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts，J.Cell Sci.，1984；66：384-399；Takahashi N，Udagawa N，Suda T，A new member ofTNF ligand family，ODF/OPGL/TRANCE/RANKL，regulates osteoclastdifferentiation and function，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1999；256：449-455；和Suda T，Takahashi N，Udagawa N，Jimi E，Gillespie MT，Martin TJ，Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of theTNF receptor and ligand families.Endocr.Rev.，1999；20：345-357。各种破骨细胞生成细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-kB配体的受体活化剂(RANKL)，被认为对于破骨发展是必要的，Jimi E等人，Osteoclast functionis activated by osteoblastic cells through a mechanism involving cell-to-cellcontact，Endocrinology，1996；137：2187-2190；和Lacey D等人，Osteoprotegerin ligand murine osteoclast survival in vitro and in vivo，Am.J.Pathol.2000；157：435-448。
已有数种不同治疗剂用于治疗与骨质疏松有关的骨损失；然而，很少知道它们的作用机制。最近的研究表明，胆固醇生物合成通路的紊乱对于破骨细胞具有直接作用。譬如，据报道，含氮二膦酸盐通过阻止蛋白异戊烯化而抑制破骨细胞的形成和促进其凋亡，所述蛋白异戊烯化是胆固醇生物合成通路上的一个限速步骤，Cummings S，Bauer DC，Do Statins prevent bothcardiovascular disease and fracture？，J.Am.Med.Assoc.，2000；283：3255-3257；Wang PS，Solomon DH，Mogun H，Avorn J，HMG-CoA reductase inhibitors andthe risk of hip fractures in elderly patients，J.Am.Med.Assoc.，2000；283：3211-3216；Meier CR，Schlienger RG，Kraenzlin ME，Schlegel B，Hershel J，HMG-CoA reductase inhibitors and the risk of fractures，J.Am，Med.Assoc.，2000；283：3205-3210；Russell RG，Rogers MJ，Frith JC等人，The pharmacology ofbispholsphanates and new insights into their mechanisms of action，J.BoneMiner Res.，1999；14：53-65；Reszka AA，Halasy-Nagy JM，Masarachia PJ，Rodan GA，Bisphosphanates act directly on the osteoclast to induce caspasecleavage of mstl kinase during apoptosis：a link between inhibition of themevalonate pathway and regulation of apoptosis-promoting kinase.J.Biol.Chem.，1999；274：34967-34973。用他汀类抑制HMG-CoA还原酶-胆固醇生物合成中的早期步骤，预期对破骨细胞具有类似作用。相反，Mundy G等人，Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins，Science，1999；286：1946-49，已证明体内施用他汀类提高骨形成蛋白-2(BMP-2)水平，后者反过来导致骨形成增加。类似地，据报道，无论是在正常大鼠还是在切除卵巢的(OVX)大鼠，与已确定的生长因子如BMP-2或基底成纤维细胞生长因子(b-FGF)相比，斯伐他汀和洛伐他汀均刺激整个骨区域(totalbone area)更大程度的剂量依赖性增加(见美国专利6022887)。
因此，尽管已经证明二膦酸盐是抗吸收剂，但是得到的数据似乎提示他汀类起着合成代谢剂的作用。有极少一点数据，如果有的话，提示他汀类的抗吸收作用。Mundy G等人，出处同上，暗示斯伐他汀具有抗吸收性能的可能性，但是仅仅证明了在啮齿动物破骨细胞数量上的少量的减少(25％)。国际公布的专利申请WO99/45923公开了洛伐他汀于10μM浓度时显著抑制成骨细胞-破骨细胞共培养物中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。
但是，上述公开物中无一证明阿伐他汀，或者就此而言他汀在破骨细胞生成及相关疾病调节中的治疗作用。
和上面提到的研究所不同的是，我们采用了从机制上讲适宜检测化合物对破骨细胞生成直接作用、不依赖于成骨/间质细胞通路的方案。更具体而言，我们发现阿伐他汀能够用于抑制体内和体外的破骨细胞形成。
美国专利5273995(此专利文献在此引入作为参考)公开的阿伐他汀钙，目前正以商品名Lipitor出售，其化学名称为[R-(R*，R*)]-2-(4-氟苯基)-β，δ-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-庚酸钙盐(2∶1)三水合物(trihydrate)，具有下式结构：
Figure A0213214600051
阿伐他汀钙是HMG-CoA还原酶的选择竞争性抑制剂。照此，阿伐他汀钙是强力降脂化合物，因而作为降血脂和/或降胆固醇剂是非常有用的。
美国专利4681893(该专利引入本文作为参考)公开了包括反式(±)-5-(4-氟苯基)-2-(1-甲基乙基)-N，4-二苯基-1-[(2-四氢-4-羟基-6-酮基-2H-吡喃-2-基)乙基]-1H-吡咯-3-羧酰胺(carboxamide)的特定反式-6-[2-(3-或4-酰胺-取代的-吡咯-1-基)烷基]-4-羟基-吡喃-2-酮。
美国专利5273995(该专利引入本文作为参考)公开了反式-5-(4-氟苯基)-2-(1-甲基乙基)-N，4-二苯基-1-[(2-四氢-4-羟基-6-酮基-2H-吡喃-2-基)乙基]-1H-吡咯-3-羧酰胺(carboxamide)的R型开环酸，即[R-(R*，R*)]-2-(4-氟苯基)-β，δ-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺)-羰基]-1H-吡咯-1-庚酸，这就是阿伐他汀。
美国专利5003080、5097045、5103024、5124482、5149837、5111251、5216174、5245047、5248793、5280126、5397792、5342952、5298627、5446054、5470981、5489690、5489691、5510488、5998633和6087511公开了制备非晶形阿伐他汀的各种方法和关键中间体，所有这些专利文献在此引入作为参考。对于大规模生产来说，非晶形阿伐他汀不适宜过滤和干燥，而是必须避热、避光、避氧和防潮。
美国专利5969156和6121461公开了晶形阿伐他汀钙，这两篇专利文献在此引入作为参考。
国际公开专利申请WO01/36348旨在公开多晶型阿伐他汀钙。
美国专利5686104和6126971公开了阿伐他汀钙的稳定的口服制剂。
令人惊奇和意想不到的是，我们发现：阿伐他汀在相对低浓度(0.01nM～1μM)时显著降低小鼠原骨髓细胞培养物(IC50＝0.43nM)和RAW细胞(IC50＝0.17μM)中TRAP-阳性多核细胞细胞的数量。而且，使用切除卵巢的大鼠骨损失模型进行的体内研究表明，每日给大鼠口服阿伐他汀(2.5-10mg/kg体重)服药5周，显著降低破骨细胞形成的数量，所述破骨细胞形成是用组织形态学分析测定的。因此，我们发现阿伐他汀在生理浓度即具有对体内和体外破骨细胞的直接作用。
                           发明概述
第一方面，本发明是抑制破骨细胞形成的方法，包括向需要治疗的哺乳动物施用治疗有效量的他汀。
第二方面，本发明是含有治疗有效量他汀和载体的药物组合物。
第三方面，本发明是通过抑制破骨细胞形成而治疗或预防疾病状态的方法，方法包括向需要治疗的哺乳动物施用治疗有效量的他汀，所述疾病状态例如骨质疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治疗的副作用，以及长期应用糖皮质激素的副作用。
第四方面，本发明是适宜商业销售的治疗包装盒或药盒，包括容器和药物组合物。
                           附图简述
参照图1至4，通过下面的非限定性实施例进一步描述本发明，现对各附图作如下简述。
图1，阿伐他汀和阿伐他汀的S，S-对映异构体对RANKL-诱导的破骨细胞生成的作用。
骨髓细胞与100ng/mL M-CSF一起培养3天。在RANKL和M-CSF存在下，细胞与阿伐他汀、其S，S-对映异构体或保骨素(osteoprotegerin)(OPG)再培养5天。然后，固定细胞并进行TRAP染色。计数超过3个核的细胞，数据用抑制RANKL单独处理的培养物中TRAP-阳性细胞的％表示。数据显示为均数±SD(n＝4孔/处理)。在5种不同试验中得到类似的结果。
图2，阿伐他汀对破骨细胞生成的时效图。
用RANKL以及阿伐他汀(0.01nM，10nM和1μM)、其S，S-对映异构体或者OPG刺激已经与M-CSF一起培养3天的骨髓细胞。在一些试验中，在RANKL刺激2天后(分离后5天)加入阿伐他汀。在分离后第8天，固定细胞并进行TRAP染色。计数TRAP-阳性细胞数并记录。数据用均数±SD(n＝4孔/处理)表示。3种不同试验得到类似结果。
图3，阿伐他汀处理减少切除卵巢大鼠的破骨细胞数量。
按照标准方案切除大鼠卵巢，给大鼠口服不同剂量的阿伐他汀(2.5、5和10mg/kg体重)，服药5周。用组织形态学测定法分析胫骨破骨细胞数量。炔雌醇(EE)(0.4mg/kg)，一种已知的骨保护剂，用作阳性对照。
图4，阿伐他汀和其S，S-对映异构体对RAW细胞中RANKL-诱导的破骨细胞生成的作用。
用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀和阿伐他汀的S，S-对映异构体刺激RAW细胞(2000/孔)5天，在第5天末进行TRAP染色，数据用与对照相比抑制TRAP-阳性细胞数量的％来表示。
                           发明详述
本发明涉及抑制破骨细胞形成的方法，包括向需要的哺乳动物施用治疗有效量的他汀。本发明治疗药物施用至取得所需治疗效果为止。
本发明中有用的治疗剂是他汀。
本文中有用的他汀的实例包括但不限于，洛伐他汀(lovastatin)(MEVACOR；见美国专利4231938，该专利文献在此引入作为参考)；斯伐他汀(simvastatin)(ZOCOR；见美国专利4444784，该专利文献在此引入作为参考)；普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOL；见美国专利4346227，该专利文献在此引入作为参考)；氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOL；见美国专利5354772，该专利文献在此引入作为参考)；阿伐他汀(LIPITOR；见美国专利5273995，该专利文献在此引入作为参考)；西立伐他汀(cerivastatin)(也称为rivastatin；见美国专利5177080，该专利文献在此引入作为参考)；美伐他汀(mevastatin)(康帕丁，参见美国专利3983140，该专利文献在此引入作为参考)；罗伐他汀(rosuvastatin)(Crestor，见美国专利5260440，；国际公开专利申请WO00/42024和Watanabe M等人，Biorg.Med.Chem.，1997；5：437-447，这些文献在此引入作为参考)；以及伊伐他汀(itavastatin)(见美国专利5753675，该文献在此引入作为参考)。优选地，他汀选自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗伐他汀、伊伐他汀，和它们的可药用盐、酯和内酯，以及它们的混合物。最优选地，他汀是阿伐他汀钙。
术语“阿伐他汀的S，S-对映异构体”，是指(3S，5S)-7-[2-(4-氟苯基)-5-异丙基-3-苯基-4-苯氨基甲酰基-吡咯-1-基]-3，5-二羟基-庚酸钙盐(2∶1)，它是阿伐他汀的非活性对映异构体。
本文涉及他汀所用术语“酯”，是其标准含义，指羧酸与醇的缩聚产物。所述化合物的酯衍生物可用作药物前体，后者在吸收进入温血动物的血流后可以裂解释放出药物并使得药物具有更好的治疗效力。
本文所用术语“内酯”，是其标准含义，指羧酸和醇产生的环状缩聚产物，即环酯。
本文所用术语“治疗有效量”，是指按照所需治疗方案临床医师、内科医师、兽医、科研工作者或其它适宜从业者所想要达到的引发所需生物或医学效果或响应的他汀的量。优选的治疗有效量使抑制破骨细胞的量。术语“治疗有效量”也旨在涵盖预防有效量，即适宜预防疾病状态或病症的量，如果预防或防止的效果是所需要的话。
本文所用术语“直至取得所需治疗效果”，是指按照选用的给药方案施用他汀，直至临床医师或者研究工作者观察到所追求的对被治疗或预防疾病或病症的临床或医学效果时。对于本发明的治疗方法而言，连续施用他汀直至在骨质或结构观察到所需的变化为止。此种情况下，达到骨质增加或异常骨结构被正常骨结构所取代，则是所需目标。对于本发明的预防方法而言，尽所需长时间连续施用他汀以防止所不希望的病症或疾病状态。此种情况下，常常以保持骨质密度为目标。治疗和预防给药期间的非限定性实例，可由约2周至维持到哺乳动物终生。对于人，给药期间可以为约2周至人的终生，优选约2周至约20年，更优选约1个月至约20年，更优选约6个月至约10年，最优选约1年至约10年。
术语“哺乳动物”包括人。
阿伐他汀对体内破骨细胞形成的影响
分离后，在含有100ng/mL重组鼠M-CSF的条件下培养骨髓细胞3天。然后，在存在不同剂量阿伐他汀(0.01nM，1nM和1μM)、阿伐他汀的S，S-对映异构体或保骨素(OPG)条件下，用鼠RANKL(100ng/mL)刺激细胞并再培养5天，染色检测TRAP活性(见图1)。由RANKL形成的TRAP-阳性多核细胞数量被同时加向得自骨髓的破骨细胞的50ng/mL OPG完全抑制。
阿伐他汀对RAW 264.7细胞的破骨细胞生成的影响
将RAW细胞按照2000细胞/孔的密度在48孔培养板上铺板，并在含有抗生素的α-MEM培养基中过夜培养。用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀或阿伐他汀的S，S-对映异构体(10、1和0.01μM)处理细胞5天，进行TRAP酶染色。在显微镜下，计数有3个或更多细胞核的染成紫色的细胞，用相对于对照细胞而言破骨细胞生成抑制％表示。因此，在图4中，柱1代表几乎100％抑制，不含任何TRAP细胞形成的对照细胞；柱2、3和4表明，即使用0.01微摩尔的阿伐他汀处理，对RANKL-诱导的多核细胞形成的抑制几乎达到80％，而S，S-对映异构体(柱4、6和7)显示显著微小的抑制％。
阿伐他汀抑制RANKL-诱导的破骨细胞生成的时效图
破骨细胞生成涉及一系列事件，其包括分化、增殖、活化和融合从而形成能够吸收骨的多核细胞。为检验阿伐他汀在哪个阶段抑制破骨细胞生成，将阿伐他汀在不同时间加入到存在有M-CSF和RANKL的小鼠骨髓细胞中。图2表明，RANKL刺激2天后(分离后5天)加入阿伐他汀能够阻断TRAP-阳性细胞形成的数量。另一方面，向细胞培养物中加入阿伐他汀的S，S-对映异构体则未观察到差异。有趣的是，当在分离后第5天加入时，阿伐他汀的作用较第3天加入时更为突出。这可能是由于在第3天加入的阿伐他汀较第5天加入的阿伐他汀或许在某种程度上被灭活的缘故，在第5天加入时，该时段正在发生融合和活化过程。这些结果提示，阿伐他汀通过直接作用于破骨细胞而能够调节对于多核细胞形成来说至关重要的最后融合/活化步骤。
阿伐他汀对切除卵巢大鼠破骨细胞数量的影响
切除大鼠卵巢-诱导的骨损失是已建立的骨质疏松模型，其中雌激素不足而导致破骨细胞生成增加，可能是由于增加了细胞因子产生的结果。为检测他汀是否能够减少体内的骨吸收，故而，给切除卵巢大鼠口服不同剂量的阿伐他汀(2.5、5或10mg/mg体重)，服药5周。试验末，处死动物，对取自动物的胫骨进行组织形态学检测分析。数据揭示，去卵巢大鼠动物中存在的破骨细胞数量(图3)显著多于模拟的对照动物。给去卵巢大鼠施用5或10mg/kg阿伐他汀，显著减少了破骨细胞数量。在降低破骨细胞形成方面，5或10mg/kg阿伐他汀的施用剂量较本试验中使用的阳性对照药物-炔雌醇更为有效。因此，这些数据清楚地证明他汀具有对破骨细胞形成的直接抑制作用。
可以各种口服和非胃肠剂型制备本发明化合物并给药。因此，本发明化合物可以注射给药，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射。本发明化合物也可吸入给药，譬如经鼻内吸入。另外，本发明化合物还可以经皮给药。对于本领域技术人员而言显而易见的是，下述剂型含有作为活性成分的本发明化合物或其相应的可药用盐。
为配制本发明化合物的药物组合物，可药用载体可以是固体，也可以是液体。固体制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种同时作为稀释剂、矫味剂、助溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的物质。
粉剂时，载体是微细的固体，它可与微细的活性成分混合。
片剂时，活性成分与具有必需粘合性能、适宜于按比例掺入的载体混合并压制成所需形状和大小。
粉剂和片剂优选含有2％或10％至约70％的活性化合物。适宜载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、椰子油等。术语“制备”，旨在包括活性化合物与作为载体的包封材料一起制成胶囊，其中活性成分(与或不与其它载体一起)被载体包围着，活性成分与载体就是以这种方式联系共存。类似地，扁胶囊和锭剂也如此制备。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁胶囊和锭剂可用作适宜口服给药的固体剂型。
为了制备栓剂，首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯的混合物或者椰子油融化，然后通过搅拌方式把活性成分均质地分散到其中。接着，把融化的均质混合物倾入常用大小的模子中，使之冷却，由此而固化。
液体制剂包括溶液、悬浮液、保留灌肠剂和乳剂，例如水或聚乙二醇水溶液。对于非胃肠注射，液体制剂可用聚乙二醇水溶液配制而成。
适宜于口服的水溶液可如下制备：在水中溶解活性成分，加入适宜的着色剂、调味香料和稳定剂与所需的增稠剂。
适宜口服的含水悬浮液可如下制备：将微细活性成分与粘性物质一起分散到水中，所述粘性物质如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它众所周知的试剂。
也在考虑之中的固体制剂包括在使用前不久将其转变为口服给药的液体剂型的那些固体制剂。这些液体形式包括溶液，悬浮液，和乳液。这些制剂除含有活性成分外，还含有着色剂、调味香料、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、助溶剂等。
药物制剂优选呈单位剂量形式。以这种形式，制剂再分为含有适合量活性成分的单位剂量。该单位剂量形式可以是包装的制剂，包装盒盛有可分隔剂量的制剂，如包装的片剂、胶囊和装在小瓶或安瓿中的粉剂。单位剂量形式也可以本身就是胶囊、片剂、扁胶囊或锭剂，或者它是适宜数量的这些包装形式中的任何形式。
单位剂量制剂中活性成分的量，可以根据特定用途和活性成分的效力而在0.5mg到100mg范围内不等或予以调整，优选为2.5mg～80mg。如果需要，组合物也可含有其它可配伍的的治疗剂。
在作为抑制破骨细胞形成的治疗剂应用和作为治疗或预防选自下组的疾病状态的药物应用时，更具体而言，阿伐他汀在本发明药物方法中的每日初始给药量为约2.5mg～约80mg，优选每日给药剂量范围为约2.5mg～约20mg，所述疾病状态为骨质疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治疗的副作用，以及长期应用糖皮质激素的副作用。然而，剂量将依患者的需要情况、受治疗病症的严重程度以及所使用的化合物不同而异。对特定情况时适宜剂量的确定，是本领域技术人员的常识。通常，开始时用小于化合物最适剂量的小剂量进行治疗，此后，小幅度增加剂量直至取得最佳疗效。为了方便，如果需要的话，将每日总剂量在一日内按份分次施用。
另外，本发明涉及通过施用盛在治疗包装盒或药盒中的剂量形式药物而治疗个体的上述疾病和病症。药盒包括剂型和容器。通常，药盒包括指导剂型施用的说明书。容器可呈任何常用形状或本领域已知的形式，譬如纸盒、玻璃或塑料瓶、或者按照治疗程序表贴在背面的独立剂量的发泡包装。
下面的非限定实施例描述本发明者实现本发明的优选的方法。
                           实施例1
骨髓细胞培养
如前所述，从6至8周龄的C57B1/6小鼠的骨髓细胞中得到破骨细胞，Kobayashi K等人，Tumor Necrosis Factorαstimulates osterclast differentiationby a mnechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction，J.Exp.Med.，2000；191：275-285。简要讲，经无菌操作取下股骨后，从骨头上剥离掉粘附的软组织。使用注射器和针头，用α极限必需培养基(alpha minimumessential medium)(α-MEM)引流骨髓。在48孔培养板上，在含有10％胎牛血清(FBS)、100IU盘尼西林、100μg/mL链霉素和100ng/mL重组鼠M-CSF的α-MEM中，培养骨髓细胞(0.15×106细胞/孔)3天。由此得到的破骨细胞再与RANKL±阿伐他汀、阿伐他汀的S，S-对映异构体或者保骨素(OPG)一起培养5天。OPG是RANKL的溶解诱骗受体(decoy receptor)，已被证明在数种体内和体外模型中能有效阻断RANKL-诱导的破骨细胞生成。在一些试验中，化合物在分离后第5天加入。在第5天末，使用购自Sigma化学品公司的白细胞酸性磷酸酶试剂盒进行细胞染色以检测TRAP活性，Goldberg AF和Barka T，Acid phosphatase activity in human blood cells，Nature，1962；189：297。
                           实施例2
RAW 264.7细胞培养物
在含有10％FBS、100IU盘尼西林、100μg/mL链霉素的α-MEM中培养RAW细胞。以2000细胞/孔的密度在48孔培养板上铺板。过夜孵育后，用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀、阿伐他汀的S，S-对映异构体或者保骨素(OPG)刺激5天，于5天末染色检测TRAP。
                           实施例3
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
用1×PBS初步洗涤后，用含有丙酮、柠檬酸和37％甲醛的丙酮基固定溶液细固定细胞30秒钟。用预热到37℃的蒸馏水洗涤2遍后，于37℃在含有萘酚AS-B1和Fast Garnet GBC溶液的醋酸缓冲液中温育细胞45分钟。显微镜下查看，TRAP-阳性细胞通常呈棕色。计数每个孔中有3个或更多核的TRP-阳性细胞的总数量。TRAP活性是成熟破骨细胞的显型标志。
                           实施例4
切除卵巢和组织形态学分析
按照标准操作程序，切除大鼠的卵巢。简言之，麻醉大鼠后，用无菌溶液擦洗干净。在动物背部拉一小切口，在脂肪组织下仔细找到卵巢，经过适当钳夹止血，用解剖刀刀刃切下卵巢。而且，使用电烙术用子宫角封闭输卵管。然后，用伤口回形针关闭皮肤切口。手术康复之后，动物被随机分为6组(模拟手术组，OVX组，OVX+阿伐他汀2.5、5、10mg/kg体重组和OVX+炔雌酚组)，每组8只动物，每日施用不同浓度的阿伐他汀和载体对照品，给药5周。
使用近心端胫骨的脱钙切片对松质骨进行组织形态学分析，使用未脱钙的切片对骨密质进行组织形态学分析。简要讲，用10％乙二胺四乙酸(EDTA)给胫骨脱钙，随后在递增浓度的乙醇中再脱水，并包埋于甲基丙烯酸乙二醇酯(GMA)树脂中。切出5～10μm的切片，用TARP染色，计数被甲基绿染色的细胞用于细胞参数测定。使用带有连在适宜光学显微镜上的可视电视系统的OsterMeasure成像分析系统，进行骨组织形态学分析。

Claims (15)

1.抑制破骨细胞形成的方法，包括向需要的哺乳动物施用治疗有效量的他汀。
2.根据权利要求1的方法，其中他汀选自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗伐他汀和伊伐他汀。
3.根据权利要求2的方法，其中他汀是阿伐他汀钙。
4.含有治疗有效量他汀和载体的药物组合物。
5.根据权利要求4的药物组合物，其中他汀选自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗伐他汀和伊伐他汀。
6.根据权利要求5的药物组合物，其中他汀是阿伐他汀钙。
7.通过抑制破骨细胞形成而治疗或预防疾病状态的方法，包括向需要的哺乳动物施用治疗有效量的他汀。
8.根据权利要求7的方法，其中疾病状态选自：骨质疏松、佩吉特氏病、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失、和免疫抑制治疗的副作用，以及长期应用糖皮质激素的副作用。
9.根据权利要求8的方法，其中疾病状态是骨质疏松。
10.根据权利要求9的方法，其中他汀选自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗伐他汀和伊伐他汀。
11.根据权利要求10的方法，其中他汀是阿伐他汀钙。
12.在哺乳动物中达到治疗效果的药盒，包括装在单位剂量形式中的治疗有效量的他汀和载体以及盛装所述剂量形式的容器。
13.根据权利要求12的药盒，其中他汀是阿伐他汀。
14.根据权利要求12的药盒，其中治疗效果是对选自下列的疾病或病症的治疗效果：骨质疏松、佩吉特氏病、骨质溶解、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、骨关节炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治疗的副作用，以及长期应用糖皮质激素的副作用。
15.根据权利要求14的药盒，其中治疗效果是对骨质疏松的治疗效果。
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