TWI226238B - Use of statins to inhibit formation of osteoclasts - Google Patents

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1226238 Α7 Β7 五、發明説明（1 ) 本發明之領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明關於思達汀類（statins)在抑制鈾骨細胞生成上之 用途，阿托瓦思達汀（atorvastatin )在抑制鈾骨細胞生成 上的用途，以及製藥組成物，包含這類含有思達汀之組成 物的套組，和治療或預防如下述之疾病的方法：骨質疏鬆 症、潘吉德氏症、骨質溶解、惡性腫瘤之高鈣血症、骨生 成不完全、骨關節炎、蜂窩狀骨質流失、及免疫抑制治療 之副作用、和因抑制鈾骨細胞生成而長期使用腎上腺促糖 皮質激素的副作用。 本發明之背景 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 骨質密度之維持係一種動力學方法，其中蝕骨細胞再 吸收骨髂，而成骨細胞再合成骨髂、巴非特A Μ、里格斯 BL、米爾頓LJ、骨質疏鬆症：病原學、診斷和處理、 紐約：雷文出版公司，1988 ; 13 : 501。在如： 骨質疏鬆症和潘吉德氏症的情況中，再吸收和生成間發生 不平衡，因而導致骨質流失，其它受此不平衡影響的情況 和疾病包括：骨質溶解、惡性腫瘤之高鈣血症、骨生成不 完全、骨關節炎、蜂窩性骨質流失或免疫抑制治療之副作 用、及長期使用腎上腺促糖皮質激素之副作用。骨質流失 爲蝕骨細胞生成（包括蝕骨細胞之分化、移行融合、及存 活等一系列情況）增加所造成的部分結果。蝕骨細胞（其 爲多核之巨細胞）係因成骨細胞/基質細胞所產生之蝕骨 細胞的生成細胞素增加’而從巨細胞系之造血細胞發展 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐1 ^ 1226238 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 而來，見：蘇達T. Takahashi N·，馬汀T J，蝕骨細胞分化 之調節，內分泌回顧，1992;13:66—80;錢 伯斯T J ，雷維爾P A，富勒K，安沙納蘇N A，分離出 之兔子鈾骨細胞對骨頭的再吸收，】.〇0113(：丨，1 984;66:3 83-3 99; Takahashi N.，烏達嘉瓦N，蘇達T，TNF配合體一族 的新成員’〇DF/〇PGL/TRANCE/RANKL ’調節鈾骨糸田胞分化 及功會b ，Biochem. Biophys. Res· Commun·， 1999; 256:449-455 ;及蘇達T，Takahashi N，烏達嘉瓦N，吉米E，吉來斯 比MT，馬丁 T J ，TNF受體及配合體一族之新成員對 蝕骨細胞分化和功能的調節，Endocr. Rev·，1999; 20:345-3 57。在不同的蝕骨細胞生成細胞素中，巨細胞群落刺激因 子（M — C S F )和NF - k B配合體之受體活化因子（ R A N K L )被認爲是發展鈾骨細胞的必要條件，見：吉 米E，等，v'透過與細胞-至-細胞之接觸相關的機制， 藉由成骨細胞來活化鈾骨細胞之功能"，內分泌學， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1996 ; 137 : 2187 — 2190 ;及來西 D，等 ，”在玻管內和活體內，促骨生成蛋白受體配合體老鼠蝕 骨細胞的存活〃，Am. J. Pathol.，2000; 1 57:435-448。 許多不同之治療劑曾被用來治療與骨質疏鬆症相關之 骨質流失；然而，所知之與其作用機制相關的資訊非常少 。最近的硏究顯示出：膽固醇之生物合成路徑的混亂對蝕 骨細胞有直接的作用。例如：有報告指出含氮之雙磷奈酸 鹽類（Bisphosphanates)可抑制蝕骨細胞之生成，並促進其 脫噬作用，此係經由阻止蛋白質之異戊二烯基化作用（其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1226238 A7 _B7_ 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

爲膽固醇之生物合成途徑中的速率限制步驟）來進行，康 明斯S，鮑爾D C， A思達汀類是否能同時預防心血管疾 病和骨折？〃 J. Am. Med· Assoc·，2000; 283:325 5- 3257 ;王 PS，所羅門DH，莫根Η，艾佛J ， νν Η M G - C o A 還原酶抑制劑及年老病人之髖部骨折的的風險〃，〗· Am. Med. Assoc·，2000; 283:3211-3216;梅爾 CR，席林格 RG 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，克倫林ME，席杰B，赫要爾J ，；i，HMG-CoA ''還原酶 抑制劑及骨折之風險〃 ，J. Am· Med· Assoc·，2000; 283:3 205-32 10 ;羅塞RG，羅傑MJ ，富利斯J C，等， a雙磷奈酸鹽之藥理學及其作用機制之新了解〃，J. Bone Miner Res·，1 999; 1 4:5 3-65 ;利卡 A A，海利西—納吉 J Μ ，馬沙如其亞P J ，羅丹G A， a雙磷奈酸鹽直接作用在 蝕骨細胞上，以在脫噬作用期間誘導m s 1激酶之硫胱胺 酸蛋白酶的分裂：抑制羥基戊酸鹽途徑和調節脫噬作用促 進激酶間的連接〃，J· Biol·，Chem·，1 999; 274:34967-34973 。藉由思達汀來抑制Η M G - C ο A還原酶（在膽固醇生 物合成中的早期步驟）被認爲可對蝕骨細胞具相同之效果 。相反的，慕廸G，等之 > 藉由思達汀來刺激玻管中及齧 齒動物體中之骨頭生成〃，科學，1999; 286: 1 9 4 6 - 4 9中已顯示出在活體內投予思達汀類可增加 骨頭之形態發育蛋白質一 2 ( Β Μ P - 2 )的量，此物質 可造成骨頭生成增加。類似地，已有報告提出辛瓦思達汀 (simvastatin)及洛瓦思達汀（lovastatin)在正常及經切除 卵巢（〇VX)之大鼠中，均可較已建立模型之生長因子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（4 ) (如：Β Μ P - 2或基礎纖維母細胞生長因子（1)一 F G F ))具有較多之劑量-倚賴性全部骨骼面積增加量 (見美國專利號6，022，887)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，當bisphosphanates顯示出其具抗再吸收能力時， 有效數據顯示出思達汀可做爲代謝促進劑。僅有很少的數 據（若有任何數據時）提出思達汀具抗再吸收能力。慕廸 ，等（如上述）略曾提及辛瓦思達汀可能具抗再吸收之能 力，但僅證明出其僅接近最低限度地減少齧齒動物體內之 鈾骨細胞數（2 5 % )。國際出版專利申請案W 0 99 /4 5 9 2 3中揭示了濃度爲1 0 //M之洛瓦思達汀可在 成骨細胞-蝕骨細胞培養中顯著抑制具酒石酸鹽抗性的酸 性磷酸酶（T R A P )活性。 然而，上述之揭示內容沒有一項證明出阿托瓦思達汀 的治療效果，或者，證明出思達汀對調節鈾骨細胞生成及 與其相關之狀況和疾病的效果。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 不像上述之硏究，我們使用在機制作用上適合用來檢 查化合物在蝕骨細胞生成上之直接作用，而與成骨細胞/ 基質細胞的途徑無關的實驗方案。尤其是，我們已發現阿 托瓦思達汀可用來抑制玻管中及活體內之鈾骨細胞生成。 在美國專利第5，273，995 (其倂爲本文之參 考資料）中揭示的阿托瓦思達汀鈣目前係以利比特® ( Lipotor® )商品名來出售，且其具化學名稱〔R —（R*， R*) 〕一 2 — (4 —氟苯基）—/3，5 —二羥基一5 —（ 1 一甲乙基）一 3 —苯基一 4 一〔（苯胺基）羰基〕一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1226238 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) 1 Η -吡略—1 —庚酸鈣鹽（2 : 1 )三水合物及如下化 學式

阿托瓦思達汀鈣係H M G 一 c 0 Α還原酶之選擇性’ 競爭性抑制劑。因此，阿托瓦思達汀係一有效之降脂化合 物且可做爲低血脂肪劑及/或低固膽醇劑。 美國專利號4，68 1，893 (其倂爲本文之參考 資料）中揭示某些反式一 6 -〔 2 -（經3 -或4 一羧醯 胺基取代之吡咯一 1 一基）烷基〕一 4 一羥基—吡喃一 2 一酮類，其包括：反式（±) — 5 — （4 一氟苯基）一2 —(1 一甲基乙基）一N，4一 —^苯基一 1 一 〔 （2 —四 氫一 4 —羥基一 6 —酮基一 2H —吡喃—2 —基）乙基〕 一 1 Η -吡略一 3 -羧醯胺。 美國專利號5，273， 995 (其倂爲本文之參考 資料）中揭示了反式一 5— (4 -氟苯基）—2 — (1〜 甲基乙基）—Ν，4 —二苯基—1—〔 2 —四氫—4 —羥 基—6 —酮基—2Η —吡喃—2 —基〕乙基〕一 1Η — ti比 咯一 3 -羧醯胺之開環酸的r型對映異構體，也就是，〔 R — (R*，R*) 〕一 2_ (4 —氟苯基）一/5 ，5 —二 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) M規格（2lGx297公釐）-8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C· 訂 !226238 Α7 Β7 五、發明説明（6 ) 羥基—5 -（1—甲基乙基）一 3 -苯基一 4 一〔（苯胺 基）羰基〕一 1 Η -吡咯一 1 一庚酸，此即爲阿托瓦思達 汀。 美國專利號5，0 〇 3，0 8 0 ; 5，097，045;5，103，024; 5，124，482;5，149，837; 5，155，251;5，216，174; 5，245，047;5，248，793; 5，280，126;5，3 9 7, 7 9 2； 5，3 42，952;5，298，627; 5，446，054;5，470，981; 5，489，6 9 0 ； 5 , 4 8 9, 691; 5，510，4 88;5，998，633;及 6，087， 511 (其倂爲本文之參考資料）中揭示了 非結晶型阿托瓦思達汀之不同製備方法及關鍵中間體。非 結晶型阿托瓦思達汀具不適合大規模製造之過濾及乾燥特 性，且必須避免熱、光、氧氣和濕氣。 美國專利號5，9 6 9，1 5 6和 6 , 12 1, 461 (其倂爲本文之參考資料）中揭示了 結晶型阿托瓦思達汀鈣。 國際發行專利申請案W〇 0 1 / 3 6 3 8 4主要揭 示一種多形型阿托瓦思達汀鈣。 美國專利號5，6 8 6，1 0 4和 6， 1 2 6, 9 7 1中揭示合適之阿托瓦思達汀鈣的口月g 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9 - I--------^^裝-- J- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226238 A7 B7 五、發明説明（7 ) 配方。 令人驚訝且意外地，我們發現濃度相當低（〇 . 0 1 η Μ至1 η Μ )之阿托瓦思達汀可顯著降低初期老鼠骨髓 細胞培養（I C 5 〇 = 0 · 4 3 η Μ )及R A W細胞培養（ I C 5 ◦ = 〇 _ 1 7 // m )中之T R A P —陽性，多核細胞 的數目。再者，利用切除卵巢之大鼠的骨質流失模型來進 行的活體內硏究表示出在5星期內，每日經口服途徑投予 大鼠阿托瓦思達汀（2 . 5 - 1 0毫克/公斤體重）可顯 著減少蝕骨細胞之生成數目（此係藉組織形態計量分析來 測量）。因此，我們已發現生理學濃度之阿托瓦思達汀在 活體內及玻管內均對蝕骨細胞具直接效果。 本發明之摘述 因此，本發明第一項爲抑制鈾骨細胞生成的方法，其 包含投予治療上有效量之思達汀給需要該思達汀之哺乳動 物。 本發明第二項爲包含治療上有效量之思達汀及載體的 製藥組成物。 本發明第三項爲治療或預防疾病狀態（如：骨質疏鬆 症、潘吉德氏症、骨質溶解、惡性腫瘤之高鈣血症、骨生 成不完全、骨關節炎、蜂窩狀骨質流失、及免疫抑制治療 之副作用、和因抑制鈾骨細胞生成而長期使用腎上腺促糖 皮質激素的副作用）的方法，其包含投予有效量之思達汀 給需要該思達汀之哺乳動物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 - ---------_裝-- ·- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226238 A7 B7 五、發明説明（8 ) 本發明第四項係適合商業銷售之治療包裝或套組，g 包含一容器及製藥組成物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 圖式之簡單說明 本發明藉下列非限制性實施例做進一步說明，其係相 關於附隨之第1至4圖，這些圖式之簡單特點列於下。 第1圖。阿托瓦思達汀及阿托瓦思達汀之S，S〜對 映異構體對經R A N K L誘導之蝕骨細胞生成的效果。 將骨髓細胞與1 0 0毫微克/毫升Μ - C S F培養3 天。將細胞與阿托瓦思達汀，其S，S -對映異構體，或 促骨生成蛋白受體（〇PG)在RANKL和Μ — CSF 之存在下繼續培養5天。然後，固定細胞並對T R A Ρ染 色。計算具超過3個細胞核之細胞數，且其數據之表示方 法爲：在以RANKL單獨處理之培養中，TRAP —陽 性細胞的％抑制。顯示之數據爲平均値± S D ( η = 4槽 /處理）。在5個不同實驗中均可取得類似之結果。 第2圖。阿托瓦思達汀對蝕骨細胞生成之時程的效果 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將以Μ - C S F處理3天之骨髓細胞以R A N K L和 阿托瓦思達汀（0 · ΟΙηΜ，1〇ηΜ，和1//M)， 其S，S -對映異構體或〇P G刺激。在某些實驗中，阿 托瓦思達汀係在以R A N K L刺激（分離後5天）後2天 再加入。在分離後之第8天，固定細胞並對T R A P進行 染色。計算T R A P -陽性之多核細胞數且並表示出。顯 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1226238 A7 B7 五、發明説明（9 ) 示出之數據爲平均値土SD(n=4凹槽/處理）。類似 結果可在3個不同實驗中取得。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第3圖：阿托瓦思達汀處理可降低經切除巢除之大鼠 體內的蝕骨細胞數目。 根據標準的實驗計劃將大鼠卵巢切除’並且經口服投 予不同劑量之阿托瓦思達汀（2 . 5，5和1 0毫克/公 斤體重）5星期。藉由組織形態學計數法來分析脛骨之蝕 骨細胞數目。使用乙炔雌二醇（E E ) ( 0 · 4毫克/公 斤）（其爲一種已知之骨骼保護劑）做爲陽性對照組。 第4圖。阿托瓦思達汀及其S，S -對映異構體對 R A W細胞中，經R A N K L誘導之蝕骨細胞生成的效果 〇 以R A N K L ( 5 0毫微克/毫升）土阿托瓦思達汀 及阿托瓦思達汀之S，S -對映異構體刺激R A W細胞（ 2000/槽）5天，並在第5天結束時進行TRAP染 色，其數據係以〜與對照組相較下，T R A P -陽性之細 胞數目的％抑制來表示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之詳細說明 本發明關於抑制鈾骨細胞生成之方法，其包含投予需 要該思達汀之哺乳動物-治療上有效量之思達汀。本發明 之治療法係投予藥物直到取得所需之療效。 可用於本發明之治療劑爲思達汀類。 可用於本發明中之思達汀類實例包括，但不限於：洛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -12 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（) 瓦思達汀（lovastatin ) ( MEVACOR® ;見美國專利號4， — _裝-- "- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 3 1，9 3 8，其倂爲本文之參考資料），辛瓦思達汀 (simvastatin ) ( Z〇C〇R® ;見美國專罕tJ號 4，444，784，其倂爲本文之參考資料）；普羅瓦 思達汀（pravastatin ) ( PR A V ACHOL® ;見美國專禾lj號 4，346，227，其倂爲本文之參考資料）；氟瓦思 達汀（Fluvastatin) ( LESCOL® ;見美國專利號 5，354，772，其倂爲本文之參考資料）；阿托瓦 思達汀（LIPITOR® ;見美國專利號5， 273， 995, 其倂爲本文之參考資料）；塞利瓦思達汀（cerivastatin)( 亦稱爲利瓦思達汀（r i v a s t a t i η );見美國專利號 5， 17 7，0 8 0，其倂爲本文之參考資料）；梅瓦思 達汀（mevastatin )(康百汀（compectin )，見美國專利號 3，983， 140，其倂爲本文之參考資料）；洛舒瓦 加 思達汀（CREST0R® ;見美國專利號5， 260，440, 國際出版專利申請號W ◦ 0 0 / 4 2 0 2 4，及汪達納 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 見Μ .等之 Biorg. Med. Chem·，1997; 5:437-447，其倂爲本 文之參考資料）；和伊他瓦思達汀（見，美國專利號 5， 753, 675，其倂爲本文之參考資料）。較合適 的爲，該思達汀係選自如下群體：洛瓦思達汀、辛瓦思達 汀、普羅瓦思達汀、氟瓦思達汀、阿托瓦思達汀、塞利瓦 思達汀、梅瓦思達汀、洛舒瓦思達汀、伊他瓦思達汀、和 其製藥上可接受之鹽類、酯類和內酯類，以及其混合物。 最合適的爲’該思達汀爲阿托瓦思達汀錦。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐] -13- ' 1226238 A7 B7 五、發明説明（11 ) 阿托瓦思達汀之S ’ S -對映異構體〃 一^詞係指（ 3S ’ 5S) — 7 —〔2 — (4 —氟苯基）—5 —異丙基 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 3 -苯基一 4 一苯胺甲醯基一吡咯一 1 一基〕一 3，5 一二羥基一庚酸鈣鹽（2 : 1)，其爲阿托瓦思達汀之不 旋光性對映異構體。 在思達汀方面，本文所使用之、酯類〃一詞係具標準 意義，其代表竣酸及醇之縮合產物。該記述之化合物的酯 衍生物可做爲前驅藥物，當其被吸收入溫血動之血流中時 ，可以能釋出藥型的方式分裂，讓藥物提供改良之療效。 在思達汀方面，本文所使用之、內酯類〃一詞係具標 準意義，其代表羧酸及醇之環形縮合產物，也就是：環酯 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文所使用之A治療上有效量〃一詞係指當將思達汀 根據所需之治療法投遞時，可引出醫師、臨床醫師、獸醫 、硏究員或其它合適之專家所需要之生物學效果或醫療效 果或反應的思達汀量。較佳之治療上有效量爲鈾骨細胞抑 制量。若需要預防性或阻止之效果時，、、治療上有效量" 一詞亦包含預防上之有效量，也就是適合預防疾病狀態或 狀況的量。 本文所使用之A達到所需之治療效果〃一詞意指根據 所選擇之給藥計劃表來投予思達汀直到臨床醫師或硏究員 可觀察到該疾病或狀況受到治療或預防的臨床或醫療效果 時。本發明之治療方法，係持續投予思達汀直到可觀察到 所需之骨質量或構造的改變。在這類情況中，取得增加之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 1226238 A7 _ B7 五、發明説明（12 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 骨質量，或不正常之骨髂構造被正常之骨骼構造所取代爲 所需之目的。在本發明之預防方法方面，只要有需要預防 不利之狀況或疾病狀態時，便持續投予思達汀。在這類狀 況中，其目的通常係維持骨質密度。非限制性之治療及預 防性投藥的時間期之實例可爲從2週至該哺乳動物之餘生 。在人類方面，投藥時間期可爲從2週至該人類之餘生， 宜爲從2週至約2 0年，更合適的爲從約1個月至約2 0 年，更佳者爲從約6個月至約1 0年，而最佳者爲從約1 年至約1 0年。 v'哺乳動物〃一詞包括人類。 玻管中，阿托瓦思達汀對鈾骨細胞生成之效果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將骨髓細胞分離出後，於1 0 0毫微克/毫升重組之 老鼠Μ - C S F的存在下將細胞培養3天。然後，在不同 劑量之阿托瓦思達汀（0 · 0 1 η Μ，1 η Μ和1 // Μ ) ，阿托瓦思達汀之S，S -對映異構體，或促骨生成蛋白 受體（OPG)之存在下，以老鼠RANKL (1〇〇毫 微克/毫升）刺激細胞，並繼續培養5天，再做T R A P 活性之染色（見第1圖）。由R A N K L刺激所生成之 T R A P -陽性多核細胞數目可藉由同時將5 0毫微克/ 毫升Ο P G加至該由骨髓衍生之蝕骨細胞中而完全受到抑 制。 阿托瓦思達汀對R A W 2 6 4 . 7細胞中之蝕骨細胞生成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 15 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（13) 的效果 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將R A W細胞接種在一 4 8槽的盤內，密度爲 2 〇 0 0細胞/槽，並將其在含抗生素之α - MEM中培 養一整夜。以RANKL (50毫微克/毫升）±阿托瓦 思達汀，或阿托瓦思達汀之S，S -對映異構體（ 1 〇 · 1和0 · 0 1 // Μ )處理細胞5天，並對T R A P 酶染色。在顯微鏡下計算具3或多個細胞核之紫色染色的 細胞數目，並以鈾骨細胞生成之％抑制（此係與對照組相 比較）來表示。因此，在第4圖中，第1欄指出對照組細 胞幾乎無任何T R A P細胞生成，因該抑制率幾乎爲 1 0 0 %。第2，3和4欄指出即使僅以0 · 0 1微莫耳 之阿托瓦思達汀處理，也可對經R A N K L誘導之多核細 胞生成造成接近8 0 %抑制，然而，其S，S -對映異構 體（第4，6和7欄）則顯示出明顯較低之％抑制。 阿托瓦思達汀對經R A N K L誘導之鈾骨細胞生成的抑制 時程 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 鈾骨細胞生成牽涉到一系列作用，包括：分化、增生 、活化及融合，以形成可吸收骨髓之多核細胞。爲了檢查 阿托瓦思達汀抑制蝕骨細胞生成的階段，在Μ - C S F和 R A N K L之存在下，將阿托瓦思達汀在不同時間加至老 鼠骨髓細胞中。第2圖表示在以R A N K L刺激（分離後 5天）後的二天加入阿托瓦思達汀可阻止T R A P —陽性 細胞生成。另一方面，若將阿托瓦思達汀之S，S —對映 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（14) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 異構體加至細胞培養中則無法觀察到任何差異。有趣的是 ’在分離後之第5天加入阿托瓦思達汀的效果比在第3天 加入更明確。這可能是因爲在第3天加入之阿托瓦思達汀 可能會比在第5天（此時爲融合及活化過程發生的時候） 加入者易受到某種程度之鈍化。這些結果表示出阿托瓦思 達汀可直接作用在蝕骨細胞上來調節對多核細胞之生成而 言爲關鍵的最後融合/活化步驟。 經卵巢切除之大鼠體內，阿托瓦思達汀對蝕骨細胞數目之 效果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 大鼠體內由卵巢切除術所誘導之骨質流失爲一種已建 立好之骨質疏鬆症的模型，其中雌激素不足會導致蝕骨細 胞的生成增加，而這可能是由於細胞活素製造增加所造成 的。爲了測試思達汀是否能在活體中降低骨質之再吸收， 經口服給予其卵巢已遭切除之大鼠不同劑量的阿托瓦思達 汀（2 . 5，5或10毫克/公斤體重）5週。在硏究終 了時，殺死動物，並在自動物取得之脛骨上進行組織形態 計數分析。數據顯示出：與假手術之對照組相比較時，經 切除卵巢之動物體內有明顯較多之蝕骨細胞存在（第3圖 )。將5或1 0毫克/公斤之阿托瓦思達汀投予至經切除 卵巢之大鼠可顯著降低蝕骨細胞的數目。劑量爲5和1 0 毫克/公斤之阿托瓦思達汀可較乙炔雌二醇本硏究之陽性 對照組更能減少蝕骨細胞之生成。因此，這些數據可淸楚 地證明思達汀對蝕骨細胞生成具有直接之抑制效果。 -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1226238 A7 B7 五、發明説明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之化合物可製成多種不同的口服及非經腸胃道 的劑型，並以這些劑型投予。因此，本發明之化合物可藉 注射來投予，也就是經靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、十 二指腸內或腹膜內途徑。還有，本發明之化合物可藉吸入 來投予，例如：經鼻內途徑。另外，本發明之化合物可穿 皮投予。本領域之技術熟習人士會明白下列劑型可包含本 發明之化合物，或其相對應之製藥上可接受的鹽來做爲活 性成分。 爲了從本發明之化合物製備製藥組成物，可使用固體 或液體型式之製藥上可接受的載體。固體型式之製品包括 粉末、錠劑、藥九、膠束、扁束劑、栓劑、及可分散之顆 粒。固體載體可爲一或多種亦可做爲下列用途之物質：稀 釋劑、調味劑、溶解劑、潤滑劑、懸浮劑、連接劑、保存 劑、錠劑崩解劑、或包來用之物質。 在粉末中，該載體係經精細分割之固體，其與經精細 分割之活性成分混合在一起。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在錠劑中，該活性成分係，以合適比例與該具有必須 之連接性質的載體混合在一起，並壓製成所需之形狀和大 小。 該粉末和錠劑宜含有從2 %或1 0 %至約7 0 %之活 性化合物。合適之載體爲碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、糖 、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維 素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠛、可可奶油、等。a製品 〃一詞係包括該活性化合物加上做爲提供膠束之載體的包 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（16) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 束物質的配方，其中該具有或不具有其它載體之活性成分 係被一由此與其聯結之載體所包圍。類似地，亦包括扁束 劑及喉片。錠劑、粉末、膠束、藥九、扁束劑及喉片可做 爲適合口服之固體劑型。 在製備栓劑方面，首先，將如：脂肪酸甘油酯或可可 奶油與低熔點蠟之混合物熔解，並將活性成分藉由攪拌均 勻地分散於其中。然後，將熔解之均勻混合物倒入合適大 小之模型中，使之冷卻後再藉此固化。 液態型式之製品包括溶液、懸浮液、持留灌腸劑、及 乳液，如：水或水丙二醇溶液。在非經腸胃道之注射方面 ，液態製品可製劑成在水性聚乙二醇溶液中之溶液。 適合口服之水溶液可藉由將活性成分溶於水中，並依 需要加入適合之染色劑、調味劑、及安定劑和增稠劑來製 備。 適合口服用之水性懸浮液可藉由將經精細分割之活性 成分分散於水中加上黏性物質來製備，該黏性物質有，如 :天然或合成的膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉 、及其它爲人熟知之試劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 另外亦包括該種在使用前才轉變成供口服投予之液態 型式製品的固態型式製品。這類液態型式包括：溶液、懸 浮液和乳液。這些製品中，除了活性成分外，還可包含染 色劑、調味劑、安定劑、緩衝劑、人工及天然甘味劑、分 散劑、增稠劑、溶解劑、等。 該製藥之製品宜爲單位劑型。在這類型式中，該製品 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19 - 1226238 A7 ___B7 五、發明説明（17 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 被次分爲含合適量之活性成分的單位劑型。該單位劑可爲 經包裝之製品，該包裝含有不連續量之製品，如：小包之 錠劑、膠束及在玻璃瓶或注射瓶中之粉末。還有，該單位 劑型可爲膠束、錠劑、扁束劑、或喉片本身、或其可爲合 適數目之任一種這類包裝型式。 在單位劑量製品中的活性成分量可根據特殊應用及該 活性成分之效力而爲或調整爲從0 . 5毫克至1 0 〇毫克 ’宜爲2·5毫克至80毫克。若需要時，該組成物亦可 包含其它可相容之治療劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在做爲抑制蝕骨細胞生成之試劑，及做爲治療或預防 選自下列群體之疾病狀態的試劑的治療用途中，用於本發 明之製藥方法中的阿托瓦思達汀的起始劑量宜爲約每曰 2 · 5毫克至約8 0毫克，該疾病狀態包括：骨質疏鬆症 、潘吉德氏症、骨質溶解、惡性腫瘤之高鈣血症、骨生成 不完全、骨關節炎、蜂窩狀骨質流失、及因抑制蝕骨細胞 生成長期使用腎上腺促糖皮質素及免疫抑制治療所造成之 副作用。每日劑量範圍宜在約2 · 5毫克至約2 0毫克間 。然而，該劑量可根據病人之需要，欲治療之狀況的嚴重 性，及所使用之化合物而有所不同。決定特殊情況之正確 劑量係在領域之技術範圍內。一般而言，治療開始時係使 用較該化合物之理想劑量來得低的較小劑量。然後，可小 量增加劑量直到達到該環境下之理想效果。爲了方便起見 ，若需要時可將全部之每日劑量分開，並在當日中一部分 一部分地投予。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 1226238 A7 __B7_ 五、發明説明（18 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 再者，本發明係關於依上述方法來治療個體中之疾病 和狀況，這些個體可接受包含在治療包裝或套組中的劑型 。該套組包含劑型和容器。通常，該套組包括投予該劑型 之指示。該容器可爲任何本領域所已知之方便的形狀或型 式，如：紙盒、玻璃或塑膠瓶，或爲具個別劑量之泡形罩 包裝，以使個體可根據治療計劃表來將劑型從包裝背後壓 出。 下列非限制性實施例說明本發明者用來進行本發明的 較佳方法。 實施例1 骨髓細胞培養 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依前述方法，自6至8週大之C 5 7 B 1 / 6小鼠體 內，從骨髓細胞中取得鈾骨細胞（Kobayashi K，等，腫瘤壞 死因子α藉由與ODF/RANKL-RANK交互作用無關之機制來 刺激蝕骨細胞之分化，Exp. Med.，2000; 1 9 1:275-285 )。 簡單地說，在將股骨以無菌方法移出後，將其上所黏附之 軟組織從骨頭分開。利用針筒及針頭，以α -最低必須介 質（α - MEM)來沖洗骨髓。藉由將在48 -槽盤中之 骨髓細胞（0 . 1 5 X 1 0 6細胞/槽）培養於含下列群體 之α - Μ E Μ中三天來取得蝕骨細胞：1 0 %胎牛血淸（ FBS) ，100IU青黴素，1〇〇微克/毫升鏈黴素 及1 0 0毫微克/毫升重組之老鼠Μ - C S F。將由此所 得之蝕骨細胞再與R A N K L ±阿托瓦思達汀，阿托瓦思 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 一 ' 1226238 A7 B7 五、發明説明（19) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 達汀之S，S -對映異構體或促骨生成蛋白受體（0PG )一起培養5天。OPG爲一種RANKL的可溶性誘補 受體，其已在數種活體內和玻管內模型中顯示出可有效阻 斷經R A N K L誘導之蝕骨細胞生成，這些化合物係在細 胞分離出後的第5天加入培養中。在第5天終了時，利用 來自史格馬（Sigma)化學公司之白血球酸性磷酸酶套組對 具T R A P活性之細胞進行染色，高伯A F及巴卡T，人 類血液細胞中之酸性磷酸酶活性，自然，1 9 6 2 ; 1 8 9:2 9 7° 實施例2 R A W 2 6 4 . 7細胞培養

將R A W細胞培養於含1 〇 % F B S，Γ 〇 〇 I U 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 青黴素，100微克/毫升鏈黴素之α-MEM中。將細 胞以2 0 0 0細胞/槽之密度接種於一 4 8槽盤內。在培 養一整夜後，以RANKL (50毫微克/毫升）±阿托 瓦思達汀，阿托瓦思達汀之S，S -對映異構體或〇p G 刺激細胞5天，並在第5天終了時對T R A P染色。 實施例3 具酒石酸鹽抗性之酸性磷酸酶（T R A P )的染色 先以lx P B S淸洗後，再利用含丙酮、檸檬酸及 3 7 %甲醛之以丙酮爲基礎的固定液將細胞固定3 〇秒。 以預暖至3 7 °C之蒸餾水將細胞淸洗二次後，將其在3 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） -22 - 1226238 A7 B7_____ 五、發明説明（20 ) 它下，溫育於含有萘酚AS — B 1和Fast Garnet GBC溶液 的醋酸鹽緩衝液中4 5分鐘。當在顯微鏡下觀察時’ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) T R A P -陽性之細胞通常爲棕色。計算各槽中具3或多 個細胞核之全部T R A P -陽性細胞數。T R A P活性爲 成熟蝕骨細胞之表型記號。 實施例4 卵巢切除術及組織形態計數分析 根據標準之實驗計劃將大鼠切除卵巢。簡單地說’在 麻醉後，以消毒液將大鼠加以淸潔。在動物背部切出一個 小切口，在脂肪組織下小心地定位卵巢位置。還有，以電 烙器將輸卵管和子宮角密封。稍後，利用傷口夾將皮膚切 口閉合。當動物從手術中恢復後，將其任意分成6組，每 組各8隻（假手術組，Ο V X組，〇V X +阿托瓦思達汀 2 . 5、5，10毫克/公斤體重及〇VX +乙炔雌二醇 組），並每天給予不同濃度之阿托瓦思達汀及對照之賦形 劑，共5週。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用近側脛骨之脫鈣切片進行網狀骨質骨之組織形態 計數分析，而利用未脫鈣切片進行皮質骨之組織形態計數 分析。簡單地說，利用1 0 %乙二胺四醋酸（E D T A ) 將脛骨脫鈣，再將其於上升濃度之乙醇中再水化，並包埋 於乙二醇甲基丙烯酸（GMA)樹脂中。將樣本切片成5 至1 0微米厚，並以TRAP染色，且以甲基綠進行對比 染色以決定細胞參數。利用骨測量（Osteo Measure )影像 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 - 1226238 A7 B7 五、發明説明（21 ) 分析系統進行骨組織形態計數，而該分析系統係經由一攝 影系統連接至合適之光學顯微鏡上。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 I2|«H8 丨補充綠 六、申請專利範圍 附件2A: 第9 1 1 20 1 88號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國93年1〇月4日修正 1 · 一種用於抑制蝕骨細胞生成的醫藥組成物，其包 含對哺乳動物治療上有效量之阿托瓦思達汀鈣（atorvastatin calcium) ° 2 · —種藉由抑制鈾骨細胞生成來治療骨質疏鬆症的 醫藥組成物，其包含對哺乳動物治療上有效量之阿托瓦思 達汀鈣。 3 · —種藉由抑制鈾骨細胞生成來預防骨質疏鬆症的 醫藥組成物，其包含對哺乳動物治療上有效量之阿托瓦思 達汀鈣。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）