CN1398899A - 一种重组胸腺素α1及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1即Gly－Tα1及其制备方法。天然胸腺素α1都采用固相合成法全合成，不仅成本高，而且易污染环境。本发明采用基因工程方法，以5′－GGGGATCCGACGCAGCCGTAGAC－3′为上游引物、5′－GGGAATTCTTATTTTCTGCCTCTTCCAC－3′为下游引物，以人胎盘cDNA为模板进行PCR，扩增出目的基因片段，通过EcoRI/BamHI双酶切将目的基因定向克隆到质粒pGEX－4T－1上构建融合表达载体pGEX－4T－1/Tα1。制备的工程菌可表达出谷胱甘肽硫转移酶－胸腺素α1融合蛋白，亲和层析纯化融合蛋白，凝血酶酶切释放出Gly－Tα1，最后通过亲和层析和离子交换层析纯化出Gly－Tα1。经试验，Gly－Tα1的生物学活性不亚于合成的胸腺素α1。本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。

Description

一种重组胸腺素α1及其制备方法

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1及其制备方法。

背景技术：

胸腺素α1(thymosinα1，简称Tα1)是一个由28个氨基酸残基组成的多肽，具有免疫活性，临床上多用于治疗病毒性肝炎。天然Tα1的氨基酸序列为NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，N端为乙酰化[Goldstein A L，Low T L，McAdoo M，McClure J，Thurman GB，Rossio J，Lai C Y，Chang D，Wang S S，Harvey C，Ramel A H，Meienhofer.J.Thymosin alpha 1：isolation and sequence analysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)：725～729]。目前Tα1单体只有一种来源，即采用固相合成法全合成，成本高，易造成环境污染。至今国内临床所用均为国外进口合成Tα1制剂，由于制备工艺成本高，故售价昂贵，如美国Sciclone公司生产的Zadaxin(中文名为日达仙)国内零售价高达900元/1.6毫克。

发明内容：

本发明采用基因工程技术制备重组胸腺素α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点。我们采用融合表达的方法来制备重组胸腺素α1，包括：(1)融合表达载体的构建；(2)大肠杆菌工程菌的发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。在构建表达载体时，以5′-G G  G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′为上游引物(内含BamHI酶切位点/G G A T C C)、5′-G G  G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′为下游引物(内含EcoRI酶切位点/ G A A T T C)，以人胎盘cDNA为模板进行PCR，扩增出目的基因片段，随后通过EcoRI/BamHI双酶切将目的基因定向克隆到质粒pGEX-4T-1上，所构建的融合表达载体为pGEX-4T-1/Tα1。融合表达载体pGEX-4T-1/Tα1转化大肠杆菌后获得的工程菌可表达出谷胱甘肽硫转移酶(GST)与胸腺素α1(Tα1)的融合蛋白GST-Tα1，在GST与Tα1之间有凝血酶的酶切位点，融合蛋白经凝血酶酶切后，产生由羧基端29个氨基酸残基组成的多肽，即重组胸腺素α1。该重组胸腺素α1仅比由28个氨基酸残基组成的天然Tα1在N端前增加了一个甘氨酸，用Gly-Tα1表示。Gly-Tα1具有与天然Tα1相当的生物活性，由于甘氨酸是所有氨基酸中最简单、分子量最小的氨基酸，因此Gly-Tα1不易产生免疫原性。本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。

Gly-Tα1的制备方法如下：

以人胎盘cDNA为模板进行PCR，其产物经胶回收，EcoRI/BamHI双酶切，与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，经酶切、测序、鉴定后得到工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1。该工程菌采用分批补料培养技术进行发酵，以终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导3～5小时，终止发酵，收获菌体。按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清用Glutathione Sepharose 4B柱进行亲和层析纯化融合蛋白。将GST-Tα1融合蛋白对酶切缓冲液透析，按每单位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反应2～16小时。将凝血酶酶切的裂解液过GlutathioneSepharose 4B柱，收集穿过峰，对50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ阴离子交换柱，用0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集主峰。纯化出的Gly-Tα1纯度大于90％，表观分子量为3.1KD。

具体实施方式：

现结合实施例对本发明重组胸腺素α1(Gly-Tα1)的制备作详细描述：实施例1：融合表达载体pGEX-4T-1/Tα1的构建

1.试剂与材料

载体质粒pGEX-4T-1                     由美国耶鲁大学医学遗传室潘星华博士赠送

大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株       购自Stratagene公司

人胎盘Marathon-Roady^TM-cDNA          购自Clontech公司

限制性内切酶和T4DNA连接酶             购自上海华美公司

PCR引物                               由上海基康生物技术公司合成

胶回收试剂盒                          购自上海生工生物公司

2.方法

(1)寡核苷酸引物的设计与合成：根据GenBank中(登录号：S38640)设计出的

上游引物5′-G G  G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′

下游引物5′-G G  G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′

上游引物内含BamHI酶切位点/ G G A T C C，下游引物内含EcoRI酶切位点/ G A A T T C。5′端去掉了ATG起始密码，3′端加上了终止密码。

(2)PCR扩增：按照Takara生物公司Pre Mix PCR Kit说明书，取5微升人胎盘cDNA为模板，取上游引物和下游引物各100个pmol然后进行PCR反应，第一循环为94℃1分钟、42℃1分钟、72℃1分钟，然后进入94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共35个循环，再进入72℃延伸8分钟。

(3)重组质粒的构建：将PCR扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，然后用Eco RI和Bam HI分别双酶切回收的DNA片段和质粒载体pGEX-4T-1，再将两种酶切回收片段连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，通过酶切鉴定转化子。

将上述酶切鉴定的重组载体由上海基康生物公司测序，获得正确序列的重组质粒称为融合表达载体pGEX-4T-1/Tα1。重组胸腺素α1的核苷酸序列见表1，与其相应的氨基酸序列见表2。

上述含重组质粒pGEX-4T-1/Tα1的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导表达融合蛋白。实施例2：大肠杆菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1的发酵

1.取少量大肠杆菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1于20ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)37℃振荡培养过夜作为一级种子液。

2.取一级种子液，以4％接种量接种于含100μg/ml氨卞青霉素的200ml LB培养基，于三角摇瓶中37℃振荡培养6小时，作为二级种子液。

3.按发酵罐工作体积的4％接种量将二级种子液接入含半合成培养基[(每升含：胰化蛋白胨5g、酵母提取物5g、甘油10g、KH₂PO₄ 2g、K₂HPO₄ 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 7g、(NH₄)₂SO₄ 1.2g、NH₄Cl 0.2g)]和微量元素溶液(每升含：MnSO₄·5H₂O 0.001g、CoCl₂·6H₂O 0.004g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.002g、ZnCl₂ 0.002g、CuSO₄·5H₂O 0.001g、H₃BO₃ 0.0005g、FeSO₄·7H₂O 0.02g、CaCl₂·H₂O 0.02g、MgSO₄·7H₂O 0.3g)的发酵罐中，控制温度为37℃、空气流速为10L/分钟、搅拌转速为250rpm，同时自动流加30％的氨水使pH值保持在7.0左右，培养8～12小时。

4.加入补料(每升含：甘油170g、胰化蛋白胨71g、酵母提取物71g、MgSO₄·7H₂O 5.7g)，加快搅拌转速至400～700rpm，增大空气流速为12～15L/分钟，培养4小时左右。

5.继续补料，加入终浓度为1mmol/L的I PTG，诱导3～5小时，停止发酵，得发酵菌液。实施例3：Gly-Tα1蛋白的制备与纯化：

1.将发酵菌液离心收集菌体，用磷酸缓冲液(PBS：NaCl 140mmol/L KCl2.7mmol/L Na₂HPO₄ 10mmol/L KH₂PO₄ 1.8mmol/L pH7.3)离心洗涤一次，再按每克湿重菌体加入10mlPBS悬浮菌体沉淀。

2.置冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清过Glutathione Sepharose 4B柱，弃去穿过峰，用50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L还原型谷胱甘肽(pH8.0)洗脱，收集洗脱峰，得GST-Tα1融合蛋白。

3.将GST-Tα1融合蛋白对PBS或50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L CaCl₂、150mmol/L NaCl(pH8.0)透析，按每单位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反应2～16小时，融合蛋白酶切后生成Gly-Tα1。

4.酶切裂解液过Glutathione Sepharose 4B柱，收集含Gly-Tα1的穿过峰。

5.将上述Gly-Tα1收集液对50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ阴离子交换柱，用0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集主峰，即得纯Gly-Tα1。纯度为90％以上，表观分子量为3.1KD。

活性测定

1.E玖瑰花结实验：按常规方法分离健康人外周血单核细胞，小牛血清调整细胞数至2×10⁶/ml。各取200ul细胞液入试管，分别加入样品。37℃水浴90分钟。每支试管中加入200μl绵羊红细胞(2×10⁸/ml)，4℃放置2～3小时；涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玖瑰花结的细胞数(结合3个及3个以上绵羊红细胞)，计算玖瑰花形成细胞的百分数，按下述公式计算激活率。结果见表3：

表3 Gly-Tα1对E-玫瑰花结形成率的影响

                     E-玫瑰花结形成率        激活率

对照                    43.3±1.00           0

Gly-Tα1(20μg/ml)      57.6±1.00^**       33.0％

合成Tα1(20μg/ml)      60.3±2.08^**       39.3％

n＝3，^**P＜0.01，与对照相比

由表3可见：Gly-Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，且其作用与进口的合成Tα1(日达仙)相当。

2.细胞增殖实验：取小鼠脾脏，用无菌注射器芯将脾脏挤压过200目的钢丝网，得到单个细胞。用含10％小牛血清的1640培养液将脾细胞配成5×10⁶个细胞/ml，将细胞悬液以200μl/孔铺96孔板，每孔加5μl不同浓度的Gly-Tα1及合成Tα1，复3孔，并设对照。37℃，5％CO2孵箱中培养72小时，MTT法测定。结果见表4：

表4 Gly-Tα1对小鼠脾细胞增殖的作用

                                 吸收值(630nm)

浓度(mol/L)  Gly-Tα1            合成Tα1        对照

10^-7        0.185±0.021^**△△   0.153±0.012^** 0.123±0.012

10^-8        0.160±0.020^**    0.167±0.000^**

10^-9        0.177±0.019^**     0.178±0.016^**

10^-10       0.146±0.001^**     0.146±0.002^**

10^-11       0.121±0.000        0.118±0.015

10^-12       0.122±0.011        0.109±0.005

n＝6，^**P＜0.01，与对照相比；^ΔΔP＜0.01，与合成Tα1相比

由表4可见：Gly-Tα1对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，其活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。

本发明具有以下优点：

1.采用基因工程方法制备重组胸腺素α1(Gly-Tα1)，克服了化学合成成本高，且污染环境的缺点。

2.获得的Gly-Tα1经E-玫瑰花结试验及脾细胞增殖试验显示，Gly-Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，且Gly-Tα1的生物学活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。

表1：Gly-Tα1基因核苷酸序列表

5’-GGA TCC GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAGGAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT-3’

表2：Gly-Tα1氨基酸序列表

Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu IleThr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu ValVal Glu Glu Ala Glu Asn

Claims (4)

1.一种重组胸腺素α1，其特征在于氨基酸组成较天然胸腺素α1的氨基酸序列的N端前多一个甘氨酸。

2.权利要求1所述重组胸腺素α1的制备方法，包括：

(1)融合表达载体的构建；

(2)大肠杆菌工程菌的发酵；

(3)重组胸腺素α1的制备与纯化；

其特征在于所构建的融合表达载体为pGEX-4T-1/Tα1，所用的上游引物为5′-G G G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′，下游引物为5′-G G G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′，模板为人胎盘cDNA。

3.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于所用的大肠杆菌工程菌为DE3/pGEX-4T-1/Tα1。

4.权利要求1所述重组胸腺素α1用于制备免疫制剂药物的用途。