CN1397648A - 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学快速诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属传染性支气管炎病毒基因型检测方法，本发明设计2种引物：上游引物：5’－ACgTTTACTACCAAAgTgCCT－3’下游引物：5’－gACAgATTgCTTgCAACCACCTTg－3’对鸡传染性支气管炎病毒反转录(RT)产物进行快速检测，传统的检测方法如中和实验要求多种标准阳性血清、需时较长等缺点。本发明将上述2种引物进行聚合酶链反应(PCR)，以94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1.5min，33个循环；最后经过72℃ 10min这样的反应程序进行PCR后，电泳、紫外检测仪直接检测。该方法快速、简便、准确，可用于鸡传染性支气管炎的诊断与分型，整个反应可在8小时内完成，大大提高了检测效率。
Description
本发明的技术领域属鸡的传染性支气管炎病毒基因型检测方法，具体的说是采用反转录聚合酶链式反应技术对传支分离株或疑似传支的病毒进行鉴别的方法。
背景技术：鸡传染性支管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB，简称传支)是由病毒引起鸡的一种急性高度接触性的传染病，主要侵害鸡的呼吸道、泌尿生殖和消化系统等，可导致不同程度的危害。雏鸡感染除出现呼吸困难外，并可引起输卵管永久性退化，导致生产力衰竭；产蛋鸡感染则产蛋下降，蛋品质降低，饲料报酬降低，死淘率增加，严重危害养鸡生产。国内养鸡业每年因该病可导致直接经济损失达10多亿元，是目前危害我国养禽业的主要疾病之一。
本病于1930年由Schalk和Hawn在美国发现，20世纪40年代，传支主要以呼吸道症状、产蛋量下降为主(呼吸型IB)；60年代，美国报道了肾病变型IB(肾型TB)；80年代中期在摩洛哥分离出一株IBV肠型变种，除引起气管、肾脏和生殖道等病变外，对肠道有较强的亲和力，造成肠道损伤；90年代初，英国爆发了以呼吸道症状、肾脏病变和肌肉坏死为主的变异传支，主要危害肉种鸡和蛋鸡，称为：793/B或4/91。传支的发生和流行呈世界分布，几乎所有养禽国家和地区均有该病发生。我国于80年代初发现有IB存在，随后绝大多数省份都有IB发生的报道，1982年由邝荣禄首次在广东省发现肾型IB，90年代以来，肾型IB在国内相继爆发，且流行十分广泛。1994年～1995年，江苏、山东等省爆发了腺胃型传支。97年以来，我国又发生了变异传支。
IBV属冠状病毒，具有独特的转录合成机制，加上自然进化、多株免疫和高密度饲养客观因素造成野毒和疫苗毒大量长期共存，使得IBV极容易发生点突变、基因缺失、插入以及基因重组等，进而导致IBV不断产生变异，新的血清型和基因型不断出现。目前，IBV的血清型已达26种之多，而在实际生产中，免疫失败的现象时有发生，使得传支成为禽病防治中难以控制的“顽症”。因此，研究不同地区IBV的发生、进行血清学鉴定和分子病原学研究，揭示IBV分子变异机理，一直是该病研究的焦点，对于从根本上控制传支，具有重要意义。
随着分子生物学技术在兽医学领域的大量应用，国外研究表明IBV的分子变异主要发生在S1基因且集中在前300个氨基酸上。大量的实验认为，IBV的抗原变异的部位主要在S1基因。国内对于IB分子变异机制的研究也迅速展开。
目前，国内外学者常采用最多的引物是扩增整个S1基因的引物，但因其引物较长，加上S1基因易发生变异，常常会出现扩增失败现象。又大多数IBV S1基因5′端起始密码后第159～444nt处存在一个高变区(HVR)，在HVR内第330～357nt处又有一个所谓的相对保守区，因此将HVR分为上游的HVR1和下游的HVR2。那些遗传起源接近的血清型不同的毒株大多可从HVR区编码的抗原表位的差异得到反映。Calvin L.Keeler(1998)等人对来自北美、欧洲和澳大利亚的31株IBV的S1糖蛋白序列进行了比较分析，以确定保守区和特异区，并利用型特异性引物对6种血清型的病毒，近30个标准株和分离株(事先已经过血清中和实验区分)，并通过RT-PCR进行扩增得到验证。结果表明，利用血清型特异性引物对IBV进行RT-PCR扩增不失为一种快速、准确的分型方法。
发明内容：本发明采用反转录聚合酶链式反应技术对传支分离株或疑似传支的病毒进行鉴别，并结合RFLP方法进行传支病毒的血清型分型，用于指导实际生产中的防疫，另外也可探讨IBV的分子变异机制和为全国范围内IBV的分子流行病学研究提供依据。鉴于S1基因序列是国内外研究的热点，大多数人是参照已发表的IBV M41株或是Beaudette株的基因序列进行引物设计(见附表)，引物间距有的包含整个S1基因，有的是S1基因部分序列。
附 表
| 引物设计 | 引物序列 | |
| 李华(北京)[5] | 上游引物 | 5’-GCGGATCCCTGAACAAAAGACAGACT-3’ |
| 下游引物 | 5’-CCAAGCTTTTACCATAACTAACATAAGG-3’ | |
| 第三引物 | 5-GCGGATTCACAACTTGGGGTGATAAGAT-3’ | |
| 廖明、王林川、步志高、江国托 | 上游引物 | 5’-CAAAGCTTGAAAACTGAACAAAAGACA-3’ |
| 下游引物 | 5’-GCGAGCTCCTAACGTCAAAACGGAC-3’ | |
| 张玉根、H.M.Kwon磨美兰、尹燕博 | 上游引物 | 5’-CATAACTAACATAAGGGCAA-3’ |
| 下游引物 | 5’-TGAAAACTGAACAAAAGACA-3’(1720) | |
| 张桂云 | 上游引物 | 5’-CCAAGCTTTACCATAACTAACATAAGG-3 |
| 下游引物 | 5’-GCGGATCCCTGAACAAAAGACAGACT-3 | |
| 台湾Wang、磨美兰1999.8.31 | 上游引物 | 5’-TGGTTGGCATTTACACGGGG-3’(114-133) |
| 下游引物 | 5’-CAATGGGTAACAAACAC-3’(341-325) | |
| 尹燕博 | 上游引物 | 5’-CAAGGTTTTATTACTAATGT-3’ |
| 下游引物 | 5’-AGCAAACCATTATATTCACGAG-3’(880) | |
| B.F.Kingham J.Gelb(USA2000) | 上游引物 | 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATGCTAC-3’631 |
| 下游引物 | 5’-CTCGAATTCCNGTRTTRTTAYTGRCA-3’ | |
| Q.SHI，C(USA2000) | 上游引物 | 5’-TTTGTTTGCACTATGTAG-3’(33-55) |
| 下游引物 | 5’-TGGTGGACCTATAACTTA-3’(597-614) |
有鉴于此，本发明参照标准株M41 S1序列设计了新型引物：
上游引物：5’-ACgTTTACTACTACCAAAg Tg CCT-3’
下游引物：5’-gACAgATTgCTTgCAACCACCTTg-3’通过设计新型引物，扩增IBV的S1基因中的高变区，约1000bp长的核苷酸序列，引物合成的位置定在血清中和点高变区HVR之外，即包含IBV两个高变区，上游引物在60nt～120nt之间；下游引物在900nt-1100nt之间。以M41为参照，上游引物在78nt-100nt之间，与之相同；下游引物在1063nt-1086nt之间与之互补。将上述两种引物进行聚合酶链反应(PCR)，以94℃1min，54℃1min，72℃1.5min，33个循环，最后经过72℃10min这样的反应程序进行PCR后，电泳、紫外检测仪直接检测。
由于扩增的IBV的S1核苷酸碱基序列只有1000bp，因而比较简便易行，敏感性好，对所有的已知血清型不同的IBV分离株均扩增出了目的片段，且操作简单，容易推广。对现今所有的标准株和分离株均适用，并可区别于目前所有的其它家禽病毒：如新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等的核苷酸序列。如进一步优化条件，可研制成RT-PCR诊断试剂盒，进一步提高检测速度。
具体实施方式：
1.病毒的增殖
将需要鉴定的传支分离株经灭菌生理盐水加入双抗适当稀释后，感作4小时，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，37℃孵育36小时，弃24小时内的死亡胚，无菌收集尿囊液。-20℃冻存，每一毒株随机留取3枚活胚孵化至18日龄，观察病变。
2.病毒的纯化
取冻存的鸡胚尿囊液经10000r/m4℃离心20min，去除粗蛋白，上清经100000g4℃离心2小时沉淀病毒，弃上清加入适量DEPC水悬浮病毒(浓缩100倍)，分装保存备用。
3.TRIZOL法提取病毒RNA
在250ul病毒浓缩液中加入750ulTRIZOL变性液，振摇直至变粘稠。室温放置5min；使核酸和蛋白充分解离；加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，混合均匀。室温放置15min；4℃，13,000g离心15min；取上层水相于两个0.5ml离心管中，每管约250ul；加入等体积异戊醇，混匀后室温放置10～15min；4℃，13,000g离心10～15min，沉淀RNA；小心弃尽上清，用冰冷的75％乙醇1ml洗涤沉淀，混悬后，4℃，7500g离心5min。小心弃净上清；超净台内风干RNA沉淀；用无RNA的灭菌双蒸水12μl溶解沉淀，6μl/管分装，-80℃冻存。
4.RT-PCR
①RT反应
在0.5ml微量离心管中依次加入下列成分：RNA溶液，5μl；下游引物(25μM)1.5μl，瞬时离心混匀，70℃水浴10min，冰浴2min，再加入：Rnasin(30u/μl)0.5μl；5×反转录缓冲液4μl；dNTP(10mM each)2μl；M-MLV(200u/μl)1μl；双蒸水6μl，瞬时离心混匀，42℃作用1h。95℃热变性5min冻存或直接进入反应。
②PCR
总体积为50μl，在0.5ml PCR管中依次加入下列成分：cDNA溶液10ul；25mM MgCl2 2.5μl；下游引物(25μM)1.5ul；上游引物(25μM)1.5ul；Taq plus DNA(3IU)0.5ul；10×Buffer 5μl；双蒸水30μl。
将上述除Taq plus I外的溶液瞬时离心，混匀。95℃变性8min(RT产物直接进入PCR例外)，冰浴2min，小心加入0.5μl Taq plus I(3u/μl)至反应混合液，边加边混匀。然后进入PCR循环，94℃1min，54℃1min，72℃1.5min，33个循环；最后经过72℃反应10min。取5μlPCR产物用0.9％琼脂糖电泳(含0.5ug/ml EB)分析，余者保存于-80℃。
5.PCR产物酶切图谱分析
利用Ddel、Rsal和HeaIII分别对1000bp PCR产物进行酶切，反应体系为：9ul PCR产物、1ul酶、10×buffer 3、BSA 3ul，补足体系为30ul，37℃2.5h。取15ul酶切产物于2％琼脂糖凝胶中，100伏电压电泳1.5小时，紫外透射仪上检测。重复三次。
参考文献：
1.Kwon H.M.，Jackwood M.w.，Gelb J.，Differentiation of infectious bronchitis virusserotypes using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphismanalysis.Avian Dis.，1993 37：194～202
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3.步志高，江国托等，畜牧兽医学报，1999，17(6)：p530～533
4.磨美兰等，中国畜牧兽医学会禽病学分会第十次学术研讨会论文集，2000，78～81
5.李华等，农业生物技术学报，1998，6(1)：p57～59
6.常维山，中国专利申请号：98122176.9
鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学快速诊断方法，seq
<110>山东农业科学院家禽研究所
<120>鸡传染性支气管炎病毒的分子物生学快速诊断方法
<140>01135200.0
<141>2002-02-28
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<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>冠状病毒属鸡传染性支气管炎(Coronaviridae Chicken Infectious Bron-chitis Virus)
<400>1
ACgTTTACTA CTACCAAAgT gCCT
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>冠状病毒属鸡传染性支气管炎(Coronaviridae Chicken Inffectious Bron-chitis Virus)
gACAgATTgC TTgCAACCAC CTTg
Claims (1)
1.一种对鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学快速诊断方法，其特征在于设计了两种新型引物：
上游引物：5’-ACgTTTACTACCAAAgTgCCT-3’
下游引物：5’-gACAgATTgCTTgCAACCACCTTg-3’
对传染性支气管炎病毒反转录(RT)产物进行快速检测，将上述2种引物进行聚合酶链反应(PCR)，以94℃1min，54℃1min，72℃1.5min，33个循环，最后经过72℃10min这样的反应程序进行PCR后，电泳、紫外检测仪直接检测。
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| CN100374460C (zh) * | 2004-07-05 | 2008-03-12 | 华中农业大学 | 含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用 |
| CN102719567A (zh) * | 2012-07-05 | 2012-10-10 | 广东温氏食品集团有限公司 | 禽传染性支气管炎病毒h120毒株的pcr检测引物及检测方法 |
| CN103146654A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 浙江诺倍威生物技术有限公司 | 一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用 |
| CN109536641A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-29 | 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） | 一种检测禽传染性支气管炎病毒的rt-lamp可视化试剂盒 |
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