CN1352687A - C6β－趋化因子白细胞趋向因子－1的一个增强了生物活性的变体(shLkn－1) - Google Patents

C6β－趋化因子白细胞趋向因子－1的一个增强了生物活性的变体(shLkn－1) Download PDF

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Abstract

本发明涉及Lkn－1的一个增强了生物活性的变体(shLkn－1),其是Lkn－1的截短形式,利用其表达载体产生重组shLkn－1的方法和所述蛋白质的药物应用。shLkn－1由Lkn－1氨基末端丢失26个氨基酸产生,含有66个氨基酸。重组shLkn－1在体内抑制集落形成和细胞增殖,暗示其可作为潜在药物用于抗体产生、HIV－1感染的治疗、化学或放射疗法中骨髓干细胞的保护,以及抑制白血病。

Description

C6 β-趋化因子白细胞趋向因子-1的 一个增强了生物活性的变体(shLkn-1)
发明背景
发明领域
本发明涉及C6β-趋化因子的一个增强了生物活性的变体(shLkn-1)，更具体的，涉及属于C6 β-趋化因子的Lkn-1的一个变体，利用其表达载体产生重组shLkn-1的方法和所述蛋白质的药物应用。
现有技术描述
趋化因子是由低分子量的碱性蛋白质组成的小细胞因子的家族，通常具有四个半胱氨酸，根据第一和第二个半胱氨酸的位置，即两个半胱氨酸是否邻接或两个半胱氨酸之间是否间隔有氨基酸，可以将它分成四个亚家族CXC(α)，CC(β)，C(γ)和CX3C(参见，Baggiolini，M.和Dahinden，C.A.，今日免疫学(Immunol.Today)，15：127(1994)；Kelner，S.G.等人，科学(Science)，266；1395(1994)；Bazan，J.F.等人，自然(Nature)，385：640(1997))。趋化因子亚家族的基因成簇定位于相同的染色体上，例如α趋化因子基因定位于人染色体4q12-21，β-趋化因子基因定位于人染色体17q11-32和小鼠染色体11上。
趋化因子具有生物活性如HIV-1的抑制作用，免疫调节作用，白细胞迁移，和抗造血干细胞分裂的抑制作用(参见，Cocchi，F.等人，科学(Science)，270：1811(1995)；Wolpe，S.D.等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，167：570(1988)；Graham，G.J.等人，自然(Nature)，344：442(1990)；Broxmeyer，H.E.等人，血液(Blood)，76：1110(1990)；Youn，B.-S.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，155：2661-2667(1995))。
趋化因子还与偶联跨膜区G蛋白质的受体结合以活化白细胞，并且一些受体也可以在HIV-1感染过程中用作协同受体(参见：Oh，K.-O.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，147：2978(1991)；Alkabatih，G.等人，科学(Science)，272：1955(1996))。例如，在β-趋化因子(CC趋化因子)受体的8个亚型，即CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8中有4个亚型：CCR4、CCR6、CCR7、CCR8显示对一种物质有高亲和力，而CCR1、CCR2、CCR3、和CCR5具有结合各种趋化因子的亲和力。
迄今，本领域已知属于β-趋化因子亚家族的9个以上的趋化因子(参见，Wilson，S.D.等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，171：1301(1990)；Modi，W.S.等人，人类遗传学(Hum.Genet.)，84：185(1990))。在它们中间，小鼠MRP-1(“mMRP-1”，MIP(巨噬细胞炎症蛋白质)-相关蛋白质-1或C10)(参见，Orlofsky，A.等人，细胞调节(Cell Regul.)，2：403(1991))、小鼠MRP-2(“mMRP-2”)(参见：Youn，B.-S.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，155：2661(1995))和人Lkn-1(白细胞趋向因子(leukotactin)-1)(参见，：Youn，B.-S.等人，J.Immunol.，159：5201(1997))与其它β-趋化因子的区别在于它们具有两个额外的半胱氨酸残基，从而形成第三个二硫键，并且它们的N末端区非常长。根据以前的发现，将它们划分为C6 β-趋化因子。
同时，也观察到Lkn-1在重组酵母细胞如毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达产生了一种比预期完整Lkn-1的92个氨基酸残基小的蛋白质。这种更小形式的N末端氨基酸序列与Lkn-1缺失了N末端26个氨基酸的截短形式一致。相似的N末端截短在MPIF-1(骨髓前体抑制因子-1)中也有报道，MPIF-1与Lkn-1紧密相关，同样有额外的一对半胱氨基酸残基和不寻常的长N-末端(参见Macphee C.H.等，J.Immunol.，161：6273(1998))。此种联系暗示这种截短与生物学活性的增加相关。
在上述情况下，有重要的原因需开发和研制Lkn-1的截短变体，因为如MPIF-1的情形一样，较短的形式可具有更强的生物活性并具有大量生产的优势。当与天然分子Lkn-1比较时，Lkn-1的截短变体可具有更强的潜在的用做药物的生物活性，用作治疗HIV-1感染或在化学治疗或放射性治疗过程中保护骨髓干细胞的潜在药物。
发明概述
本发明者从具有Lkn-1基因的毕赤酵母(P.pastoris)的培养基中分离了Lkn-1的一种截短形式，并发现与天然Lkn-1相比，这种截短的Lkn-1蛋白确实具有增强了的生物学活性。发明者进一步构建了这种截短形式的cDNA，在重组毕赤酵母(P.pastoris)中表达所述的突变cDNA，显示表达的重组蛋白在体内抑制骨髓干细胞及前体细胞的集落形成和增殖。在此及以后，将该截短形式的蛋白及其重组蛋白分别称为“shLkn-1”(人白细胞趋向因子-1的短型)及“重组shLkn-1”。
因此，本发明的第一个目的是提供具有比完整Lkn-1的生物活性更强的生物活性的shLkn-1。
本发明的第二个目的是提供含有所述shLkn-1 cDNA的表达载体和用该载体转化的重组微生物。
本发明的第三个目的是提供从所述微生物中获取重组shLkn-1的方法。
本发明的第四个目的是提供用于产生抗体、治疗HIV-1感染、化疗或放射疗法中保护骨髓干细胞、以及抑制白血病的药物组合物。
附图简述
与附图共同给出的以下描述将使本发明的以上及其它的目的和特点显而易见。其中
图1是用于在毕赤酵母(P.pastoris)中制备重组Lkn-1的表达载体pPM2的示意图示。
图2显示重组毕赤酵母(P.pastoris)产生的Lkn-1截短形式的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图像。
图3(A)显示表达CCR1的HEK293细胞系经重组shLkn-1刺激所测得的荧光激发。
图3(B)显示表达CCR1的HEK293细胞系经重组Lkn-1刺激所测得的荧光激发。
图4说明用于在毕赤酵母(P.pastoris)中制备shLkn-1的表达质粒pPM2-HF的构建方案。
图5纯化自毕赤酵母(P.pastoris)的重组shLkn-1的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图像。
图6是依赖于重组shLkn-1和Lkn-1浓度的钙应答的峰幅。
图7(A)显示Lkn-1对骨髓干细胞或骨髓中前体细胞集落形成能力的影响。
图7(B)显示Lkn-1对骨髓干细胞或骨髓中前体细胞增殖速率的影响。
发明详述
发明者从cDNA文库(从白介素-4(IL-4)激活的人单核THP-1细胞系中获得)中分离了Lkn-1的cDNA。将克隆的Lkn-1 cDNA插入载体pPIC9中构建Lkn-1的表达载体pPM2，并将之引入到毕赤酵母(P.pastoris)以表达重组Lkn-1。
甲醇诱导后重组Lkn-1表达并从宿主细胞中分泌到生长培养基中。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明重组蛋白质小于所预期的成熟Lkn-1。这种明显的截短形式用SP-琼脂糖柱进行两步离子交换柱层析纯化。对N末端的测序证明该蛋白由成熟Lkn-1的N末端删减掉26个氨基酸残基所产生，因此这种截短形式称为shLkn-1。与重组Lkn-1相比，这种重组shLkn-1是CCR1更强的拮抗剂。
为了构建在毕赤酵母(P.pastoris)中高效、稳定表达重组shLkn-1的表达系统，发明者首先通过聚合酶链式反应(PCR)获得编码shLkn-1的DNA片段，接着将该DNA片段插入表达载体pPIC9中。用由此构建的表达载体pPM2-HF转化宿主细胞毕赤酵母(P.pastoris)，选择高水平表达shLkn-1的重组菌株。甲醇诱导使重组shLkn-1得以表达并从宿主细胞分泌到培养基中。
从培养基中纯化的重组shLkn-1与重组Lkn-1相比，是CCR1更强的拮抗剂，并在体内可以抑制粒细胞-巨噬细胞前体的集落形成和细胞增殖。
显示以上所述特性的本发明重组shLkn-1可以用于产生抗体、治疗HIV-1感染、在化疗或放疗中保护骨髓干细胞，以及抑制白血病。
本发明在以下实施例中进行进一步的阐释，但这些实施例并非用以限制本发明范围。实施例1：Lkn-1截短形式的鉴定
为了在毕赤酵母(P.pastoris)中表达Lkn-1，用限制性内切酶StuI线性化图1中所示的表达载体pPM2，利用电穿孔法转化毕赤酵母(P.pastoris)宿主细胞GS115。将生长在选择性琼脂平板上的毕赤酵母(P.pastoris)转化子接种于50ml极限右旋糖(MD)培养基中，30℃过夜培养。离心种培养物，将收集的细胞接种于极限甲醇(MM)培养基中。细胞在30℃剧烈震摇培养至OD600＝1，重组Lkn-1在毕赤酵母中的表达和分泌是通过每24小时向培养基中加入100％甲醇并使其终浓度为0.5％来诱导的。通过对CCR1受体转染的HEK293细胞系进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和钙质动用分析，选择出一个Lkn-1表达水平最高的重组毕赤酵母(P.pastoris)/pPM2克隆。
Lkn-1的高水平表达可通过使用BioFloIII发酵罐(New BrunswickScientific，U.S.A.)和DO-STAT控制法对重组毕赤酵母(P.pastoris)/pPM2高密度培养实现。发酵培养物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示92个氨基酸残基的成熟型Lkn-1似乎转化为图2所示的小分子量形式。图2中Lkn-1、SM、shLkn-1分别代表Lkn-1的成熟型、分子量标准和小分子量Lkn-1。
用SP-琼脂糖柱进行连续的离子交换柱层析，从培养液中纯化所述分子量明显小的重组蛋白。培养液用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)稀释3倍，上SP-琼脂糖柱。用含有0.1M NaCl的相同缓冲液洗柱，Lkn-1的截短形式从柱中随含有0.3M NaCl的磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗脱出来。含有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的所述蛋白的级分用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)稀释4倍，上SP-琼脂糖柱。含有0.1M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)将未结合的部分从柱中洗脱除去。利用相同缓冲液中从0.25到0.3M NaCl的线性梯度，从柱中洗脱Lkn-1的截短形式。反向HPLC分析表明，所述蛋白纯度高于95％。
Edman降解氨基酸测序法表明纯化的重组蛋白的第一个氨基酸是组氨酸，证实了从Lkn-1 N末端有26个氨基酸残基的删减。质谱分析测定的所述蛋白分子量与成熟Lkn-1的26个氨基酸截短形式一致。因此该截短型Lkn-1被命名为shLkn-1(人白细胞趋向因子-1的短型)。
对表达CCR1的HEK293细胞系进行钙质动用分析，以比较shLkn-1和成熟Lkn-1的生物学活性。胰蛋白酶消化以收集细胞，用HBBS(10mM HEPES(pH7.4)，0.8mM MgCl2，1.8mM CaCl2)洗两次，负载于含有2μM FURA-2/AM的HBSS，黑暗中37℃放置45分钟。细胞用HBSS洗两次以1×106/ml浓度重悬于HBSS(pH7.4)中。2ml细胞悬液放置于37℃搅动的水夹套小杯中，在340nm激发。监测拮抗剂加入之前和之后510nm的荧光激发，数据作为相对荧光水平。如图3(A)和3(B)中所示，10ng/ml shLkn-1激发的荧光变化幅度甚至大于100ng/ml的成熟Lkn-1所激发的荧光变化幅度，显示对于通过CCR1刺激细胞内钙质动用，shLkn-1远比Lkn-1活性强。实施例2：shLkn-1表达载体pPM2-HF的构建
用于在毕赤酵母(P.pastoris)中生产shLkn-1的表达载体pPM2-HF的构建相应于图4所示方案。构建了在酵母菌株Saccharomycescerevisiae中表达shLkn-1的质粒，定命为pSCM2-HF，其图谱显示于图4中。聚合酶链式反应扩增酵母α-因子的分泌信号序列与shLkn-1融合蛋白的相应DNA片段，使用pSCM2-HF质粒为模板、一系列正向和反向引物以及Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa，Japan)。
正向引物：
5′-GCGCGCTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3′
(SEQ IDNO：3)
反向引物
 5′-GCGCGCGAATTCCTATTATATTGAGTAGGGCTTCAG-3′
(SEQ ID NO：4)
将如此扩增的DNA片段连接进pGEM-T Easy载体(Promega，U.S.A.)构建pGEM-HF质粒。为了构建质粒pPM2-HF，进行了三片段连接。用PstI/EcoRI消化质粒pGEM-HF，产生shLkn-1编码区与部分信号序列融合的shLkn-1片段，分离该片段。质粒pPIC9(Invirogen，U.S.A.)用SacI/EcoRI或SacI/PstI分别消化，分离分别产生的一个7009碱基对片段和一个767碱基对片段。由此构建的重组质粒进行限制性酶解图谱和DNA测序确认，定名为pPM2-HF。在序列表中提供了shLkn-1编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和从该核苷酸序列推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。表达载体pPM2-HF用Stu I线性化并导入毕赤酵母(P.pastoris)。重组质粒pPM2-HF允许重组shLkn-1在毕赤酵母(P.pastoris)中表达和分泌。如实施例1所述，筛选能高水平表达shLkn-1的转化子。这种转化子被定名为GS115：pPM2-HF，1999年5月13日被存放于一个国际保藏单位--韩国微生物保藏中心(KCCM，361-221，Hongie-l-dong，Seodaemun-gu，汉城120-091，韩国)，保藏号KCCM-10159。实施例3：毕赤酵母(P.pastoris)中重组shLkn-1的表达和纯化
重组shLkn-1在毕赤酵母(P.pastoris)中表达和从培养基中纯化的方法与实施例1中类似。图5显示SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的重组shLkn-1，第一泳道是发酵培养物；第二泳道是第一级SP-琼脂糖柱收集物；第三泳道是第二级SP-琼脂糖柱收集物；第四泳道是分子量标准。实施例4：表达CCR1趋化因子受体的HEK293细胞系的钙质流分析
已知Lkn-1可以激活表达CCR1或CCR3趋化因子受体的细胞系。为了比较shLkn-1和成熟Lkn-1的生物学活性，在表达CCR1趋化因子受体的HEK293细胞系中，对这两种蛋白不同的浓度时的剂量依赖性钙质动用进行分析，该分析采用与实施例1所述的类似方法进行。图6中可见，依赖shLkn-1(-o-)和Lkn-1(-·-)浓度的相对钙质应答表明，与重组Lkn-1相比，重组shLkn-1是CCR1的更强拮抗剂。实施例5：重组shLkn-1在体内抑制骨髓细胞的增殖
对shLkn-1在体内生物学活性进行了评价。即，将纯化的shLkn-1静脉注射入C3H/HeJ小鼠，确定骨髓中粒细胞-巨噬细胞(“CFU-GM”)、类红细胞(“BFU-E”)、多潜能前体细胞(“CFU-GEMM”)的绝对数量和增殖率，方法如下：对C3H/HeJ小鼠尾静脉注射0.1ml无菌无热源的盐水溶液或10μg稀释于无菌无热源盐溶液中的纯化shLkn-1。同时，对C3H/HeJ小鼠不同组注射10μg MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白质-1α)或10μg MIP-1β(巨噬细胞炎症蛋白质-1β)分别作为正负对照，测定髓细胞抑制活性。注射24小时后，从小鼠股骨骨髓中获取低密度的骨髓细胞。接着，铺板CFU-GM于0.3％的琼脂培养基上并用10％PWM鼠脾细胞条件培养基刺激。同样的，分别铺板BFU-E和CFU-GEMM于0.9％的甲基纤维素培养基上，并用1单位的rhEPO、0.1毫摩尔的氯高铁血红素和1％PWM鼠脾细胞条件培养基刺激。此处骨髓细胞以7.5×104细胞/ml铺板。刺激后，细胞培养于BNP-20孵育仪中(Tabai ESPEC Corp.，U.S.A.)，环境条件为5％CO2和5％O2。5-7天培养后计算集落数(参见图7(A))。另一方面，增殖率(即CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的循环率)以细胞周期S-期的细胞百分率来确定，通过含氚胸苷(50μCi/ml、20Ci/mmol)杀灭技术测定前体在DNA合成(即细胞周期S-期)中的比例。该技术基于在体外测定将细胞脉冲暴露于热的含氚胸苷20分钟后细胞形成的集落数，与暴露于相应量的冷胸苷后细胞集落数相比的减少(参见图7(B))。图7(A)和图7(B)显示shLkn-1快速降低骨髓干细胞或前体细胞的集落数和其增殖速率(即骨髓中细胞循环率)。shLkn-1完全消除了全部的细胞循环率。另一方面，分析了骨髓中的有核细胞脾细胞和血细胞，与对照相比，表明没有被显著的影响。
shLkn-1对干细胞或前体细胞的影响强烈地暗示：shLkn-1对于保护正常造血细胞免受具有细胞毒性的抗癌药物和辐射的影响有潜在的临床应用。急性毒理学测验
急性毒理学检测使用6周大的SD大鼠(Sprague-Dawley)。含有shLkn-1(剂量60mg/kg)的1ml PBS(磷酸盐缓冲液)静脉注射入10只大鼠并对其进行观察。结果是，所有的受测试动物均存活，没有显著的症状或其它毒性效应。shLkn-1在60mg/kg的剂量范围内注射大鼠不诱导任何毒性效应，因此证明是一种肠胃外给药的安全材料。
shLkn-1可用作药物组合物的活性成分用于抗体产生、HIV-1感染的治疗、化学或放射疗法中保护骨髓干细胞，以及抑制白血病，可以自由形式或与药物可接受载体配制进行口服、静脉注射或皮下给药。口服时，药物组合物可以配置成药片、胶囊、粒状、粉剂或其它类似形式。此外，药物组合物还可以含有添加剂，如表面活性剂、透明质、着色剂、稳定剂、缓冲液、悬液、等渗液或其它传统添加剂，以及具有无机或有机载体以形成固相、半固相或液相制剂。
本发明提供的药物组合物的有效剂量根据治疗方式、给药方式或疾病类型、患者年龄和给药期长短是可变的。通过静脉和肌肉的给药，有效剂量的范围是0.1-5mg/kg，而口服给药时，剂量范围为1.0-30mg/kg。
以上所述内容清楚地阐明，本发明提供了比亲本分子有更强生物活性的一个Lkn-1变体。氨基酸测序表明：该变体是Lkn-1的截短形式，丢失了Lkn-1 N末端的26个氨基酸残基；因此shLkn-1具有66个氨基酸，其分子量据估计约为7,200道尔顿。毕赤酵母(P.pastoris)中表达和分泌并纯化至几乎同质的重组shLkn-1显示出比成熟Lkn-1更强的活性。重组shLkn-1在体内抑制集落形成和细胞增殖，暗示其是一种潜在的药物，可被用于抗体产生、HIV-1感染的治疗、化学或放射疗法中保护骨髓干细胞，以及抑制白血病。进一步的，也发现与亲本分子Lkn-1相比，重组shLkn-1简化了所述蛋白的产生和储存。
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保藏单位的地位(包括邮编和国别)361-221，Yurim Bldg.，Hongje-l-dong，Seodaemun-gu，汉城120-091，韩国
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D.所做说明针对的指定国(如果所做的说明并不是针对所有指定国的话)
E.说明的另外附送(如不适用，则为空白)
下列说明将随后提交给国际局(请具体指出所述说明的一般性质，例如，“保藏编号”)
表PCT/PO/134(1998年7月)
  根据布达佩斯条约用于专利程序的微生物保藏国际识别
                    国  际  表  格
                   原 始 保 藏 收 据
   由该页底部标明的国际保藏单位根据第7.1条作出
收件人：财团法人 牧岩生命工学研究所
    韩国京畿道龙仁市驹城面宝亭里341番地
  I.微生物的识别
  保藏者给出的识别号：CS115：pPM2-HF   国际保藏单位给出的登记号：KCCM-10159
  II.科学描述和/或建议的分类名称
  有关I识别的微生物：()科学描述()建议的分类名称(×表示适用)
  III.接收
  国际保藏单位已接收I识别的微生物，收到日：1999年5月13日(原始保藏日)
  IV.国际保藏单位
  名称：韩国微生物保藏中心地址：361-221，Yurim B/D，Hongje-l-dong，Seodaemun-gu，汉城120-091，韩国     有权代表该国际保藏单位的人员或官员签名：日期：1999年5月19日
1.当第6.4(d)条适用时，这种日期是国际保藏单位获得其状态时的日期：根据布达佩斯条约当保
藏是在国际保藏单位的状态获得之后将在布达佩斯条约之外的保藏转为根据布达佩斯条约的保藏的，
该日期是国际保藏单位收到所述微生物的日期
BP/4表(只有一页)
                      序列表<110>  株式会社 绿十字
   牧岩生命工学研究所<120>  C6 β-趋化因子白细胞趋向因子-1的一个增强了生物活性的变体(shLkn-1)<160>  4<170>  KopatentIn 1.71<210>  1<211>  201<212>  DNA<213>  智人<400>  1cactttgctg ctgactgctg cacctcctac atctcacaaa gcatcccgtg ttcactcatg  60aaaagttatt ttgaaacgag cagcgagtgc tccaagccag gtgtcatatt cctcaccaag  120aaggggcggc aagtctgtgc caaacccagt ggtccgggag ttcaggattg catgaaaaag  180ctgaagccct actcaatata a 201<210>  2<211>  66<212>  PRT<213>  智人<400>  2His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro1             5                10                15Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys
       20                25               30Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys
   35                40                45Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr50                 55                60Ser Ile65<210>  3<211>  31<212>  DNA<213>  人工序列<220><223>  正向引物<400>  3gcgcgctcat gagatttcct tcaattttta c 31<210>  4<211>  36<212>  DNA<213>  人工序列<220><223>  反向引物<400>  4gcgcgcgaat tcctattata ttgagtaggg cttcag  36

Claims (9)

1.C6 β-趋化因子白细胞趋向因子-1的变体(shLkn-1)(SEQ.ID.NO.：2)。
2.编码C6 β-趋化因子白细胞趋向因子-1的变体(shLkn-1)的cDNA(SEQ.ID.NO.：1)。
3.含有权利要求2所述的cDNA的表达载体pPM2-HF。
4.GS115：pPM2-HF(KCCM-10159)，其是用权利要求3的表达载体pPM2-HF转化的毕赤酵母(Pichia pastoris)。
5.制备重组shLkn-1的方法，该方法包括以下步骤：培养用含有权利要求2所述cDNA的表达载体转化的重组微生物，并从培养物中获得shLkn-1。
6.权利要求5的制备重组shLkn-1的方法，其中所述重组微生物是GS115：pPH2-HF(KCCM-10159)。
7.由权利要求5的方法制备的重组shLkn-1。
8.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求7所述的重组shLkn-1和选自表面活性剂、透明质、着色剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮液、等渗剂、其它传统添加剂和无机或有机载体的可药用载体。
9.权利要求8的药物组合物，其可有效地用于抗体生产、HIV-1感染的治疗、在化疗或放疗期间对骨髓干细胞进行保护以及抑制白血病。
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