CN1343259A - 在糖尿病性肾病的发生中起作用的基因的鉴定 - Google Patents

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芬南·玛丽·马丁
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Abstract

一种鉴定在糖尿病性肾病的发生中起作用的基因的方法,包括在一定浓度的葡萄糖存在下培养肾小球膜细胞,其中葡萄糖的浓度足够诱导对差异表达易感的基因的差异表达,尤其是正调节;以及鉴定如此被诱导的基因。还使细胞选择性地经受机械拉力,和/或将TGF－β1添加到培养基中。这些差异表达的基因可通过抑制性减数杂交进行鉴定。本方法可用来鉴定在糖尿病性肾病中起作用的新基因。这些基因可被用来作为糖尿病性肾病的诊断标记,并可作为开发药物的基础。

Description

在糖尿病性肾病的发生中起作用的基因的鉴定
技术领域
本发明涉及在糖尿病中起作用的基因的鉴别和鉴定，特别是，在糖尿病性肾病的起始和进展中起作用的基因的鉴别和鉴定；涉及由此被鉴别和/鉴定的基因的应用，以作为糖尿病性肾病的诊断标记和开发药物的基础。
技术背景
有2-5％的人群发生糖尿病，20-30％的糖尿病人发生糖尿病性肾病。在西方，后者造成超过30％的末期肾衰竭〔E.S.R.F.〕，这要求透析或移植。糖尿病性肾病的病理标记是肾小球硬化，这是由于细胞外基质蛋白质在肾小球的肾小球膜中积聚引起的。肾小球膜基质的积聚，反映了细胞外基质(ECM)组份合成的增加和降解的减少，并与蛋白尿、高血压和进行性肾衰竭的临床发作有关。高血糖是在糖尿病性肾病的肾小球膜细胞基质产生中的一个主要刺激因子。高血糖扰乱肾小球膜细胞功能的机制尚不确知，它包括产生高水平细胞外葡萄糖的直接效果和通过肾小球血液动力学和高级糖基化终产品的作用导致的间接效果。
在高环境葡萄糖的条件下肾小球膜细胞的繁殖已被证明是一个有用的体外模型，以探测在糖尿病中由于高血糖造成的肾小球膜基质积聚的分子基础。具体地讲，把培养的肾小球膜细胞暴露于高葡萄糖中，刺激ECM组份的重新合成，如IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和在体内积聚的其他产品(Ayo，S.H.等，(1990)Am.J.Pathol.136，1339-1348；Wahab，N.A.等，(1996)Biochem.J.316，985-992；和Ayo，S.H.等，(1991)Am.J.Physiol.260，F185-F191)。
考虑到在糖尿病中，糖尿病性肾病的高发病率和高死亡率，因此需要鉴定影响糖尿病性肾病发生和进展的刺激物，目标是阻止这种疾病的发生，或抑制或限制它的发展。
本发明的公开
本发明提供一种在鉴定糖尿病性肾病的发生中起作用的基因的方法，该方法包括在一定浓度的葡萄糖存在下培养肾小球膜细胞，其中葡萄糖的浓度足够诱导对差异表达易感的基因的差异表达，还包括鉴定如此被诱导的基因。
优选地，在一定浓度的葡萄糖存在下培养肾小球膜细胞，其中葡萄糖的浓度足够诱导对正调节易感的基因的正调节。
进一步地，优选葡萄糖的浓度高于5mM。
5mM的浓度落在健康人个体的血浆葡萄糖水平的正常范围(4.2-6.4mmol/l)之内。
应用的葡萄糖浓度在5-30mM范围之内是适宜的。30mM的浓度被选择用来作为糖尿病性肾病的典型“体外”模型，它诱导模拟人疾病的肾小球膜功能的改变。这一浓度在很多体内糖尿病中也已遇到。
在一个实施方案中，使肾小球膜细胞经受机械拉力。
在进一步的实施方案中，转化生长因子β1(TGF-β1)被加到培养基中。
优选地，通过抑制性减数杂交鉴定差异表达的基因。
抑制性减数杂交(SSH)是一种基于容许产生扣除cDNA文库的抑制性PCR方法，其中该文库可用于鉴定对实验刺激物响应而差异表达的基因(Gurskaya，N.G.等，(1996)Anal.Biochem.240，90-97)。SSH与以前的减数杂交方法不同的地方是，它包括一个在靶种群中补偿相对丰富的cDNA的校准步骤。此改变应该提高鉴定出低丰度转录物增加的表达的概率，比差异调控的基因的其他鉴定方法具有潜在的优点，例如差异展示-PCR(DD-PCR)(Liang，P.和Pardee，A.B.(1992)Science257，967-97)和cDNA-representation difference analysis(Hubank，M.和Schatz，D.G.，(1994)Nucleic Acid Res.22，5640-5648)。
到今天，我们已经使用SSH鉴定了在体外当人肾小球膜细胞被暴露于高浓度的细胞外葡萄糖(在此定义为30mM对5mM)时150种差异诱导的基因。这些基因包括：
(a)在糖尿病性肾病中的已知的肾小球膜细胞活化调节基因，即，纤连蛋白、钙调结合蛋白和血小板反应蛋白和纤溶酶原激活物抑制剂-1；
(b)新的基因；和
(c)如下文所述的，其被高葡萄糖所诱导尚未被报道的基因。
在后者中，突出的是编码细胞骨架-相关蛋白和结缔组织生长因子(CTGF)的基因，后者是成纤维细胞基质产生的调节物。我们也展示，在患有链脲菌素诱导的糖尿病性肾病的大鼠的肾小球中增加的CTGF mRNA水平。
在本发明的一个方面，因为容积渗克分子浓度过高引起的差异表达的可能性被排除。
然而，容积渗克分子浓度过高是糖尿病性肾病的一个组份，因而容积渗克分子浓度过高可能代表着高葡萄糖诱导一定基因差异表达的一种机制，此基因在该疾病的发生中具有一定作用。
例如，我们展示甘露醇在体外比高葡萄糖激起较低的肾小球膜细胞CTGF表达，排除了容积渗克分子浓度过高作为关键的刺激物。
高葡萄糖也刺激转化生长因子β1(TGF-β1)的表达，把TGF-β1加入到肾小球膜细胞中激发CTGF表达。抗TGF-β1抗体削弱由高葡萄糖诱导的CTGF表达。同时，这些数据表明：(1)高葡萄糖刺激通过TGF-β1依赖和非依赖途径的肾小球膜CTGF表达，和(2)CTGF可以是在糖尿病的环境中由TGF-β1驱动的基质产生的中介体。
CTGF因而可以是用于设计新的针对糖尿病性肾小球硬化症的抗硬化治疗的一个有吸引力的靶子。
在糖尿病性肾病中，从肾小球膜细胞中得到的CTGF是增加ECM蛋白质合成和肾小球膜扩展的一个潜在刺激物。高葡萄糖激发肾小球膜细胞CTGF和(实际上是)TGF-β、mRNA表达的机制仍需定义。针对高葡萄糖响应的CTGF转录的可能的上游激发物，包括二酰基甘油(DAG)的从头合成和其后蛋白激酶C(PKC)的活化(DeRubertis，F.R.和Craven，P.，(1994)Diabetes 43，1-8和Fumo，P.等(1994)Am.J.Physiol.267，F632-F638)、非酶促糖化终产品(Brownlee，M.等，(1984)Ann.Intern.Med101，527-537和Cohen，M.P.和Ziyadeh，F.N.(1994)Kidney Int.45，475-484)活跃的多元醇途径和紊乱的肌醇代谢(Goldfarb，S.等，(1991)Diabetes40，465-471)或者通过补充局部产生的生长因子例如TGF-β1和其他中介体(Sharma，K.和Ziyadeh，F.N.，(1995)Diabetes 44，1139-1146)。
TGF-β1已被暗示它作为在糖尿病性肾病和其他慢性肾病中细胞外基质积聚的关键中介体。几项研究已经报道在患有糖尿病的人体和实验模型中，TGF-β1在肾小球中的表达增加(Park，I.等，(1997)Diabetes46，473-480；Sharma，k.，(1996)Diabetes45，522-530)。短期施用TGF-β1中和性抗体减低在患糖尿病的STZ小鼠模型中编码基质组份的mRNA的过度表达和肾小球硬化(Park，I.等，(1997)Diabetes46，473-480)。CTGF与TGF-β1有一些共同的生物学行为，例如，对成纤维细胞中细胞增殖和细胞外基质蛋白质合成的刺激。当在本文中考虑时，在此描述的结果提示，TGF-β1可能促进肾小球膜基质的产生，部分地通过诱导CTGF合成来进行。TGF-β1有复杂的生物学活性，包括促炎、促纤维变性和抗炎效果。通过靶向CTGF，可能降低TGF-β1诱导硬化的效果，同时保存它更被期望的抗发炎活性。
通过依据本发明的方法鉴定的新基因在此被鉴定为IHG(Increased in High Glucose)和DHG(Down in High Glucose)，并被包括下列序列1、3、4的基因所代表：1)TTGGAATAGTTCTTGCTTTATAAAAATAGTACTGCGATTAAAAAAAAAGCACTTCTGCCAAAGGAACCATGTTCCAACACCGCAAACAAGGTGTTCTGCTTAAACAGAGTAAGATACACCACCCCCATCCATCCCTTCCTTCCCTGTTCCCCTCCCAACTTGAGTTGTGTCATTCGCACCAGTGTCCTGGGTGGTAGGGATGCTACAGCCACCTAAGGCAAGGAGCCCTGGGAGGTGGGAGGGCTTGCATGGTTAAGCACACCAGAACTGAAGCGCAAAAGGGTCAGCTGTCTTCATCTAGAATCTCTGGATGTTCCTTCCAGAAAGCATCCCCGATGATATCGCAGTGCAAGGGCACTGGCTTTGTCCTGGTCCGGGTCACTGCCATCTTTTTTCCTTCCATTTCTGTTGGCAGCTTAATTTCTTTTGTCATCACTTCATCCACCTTCTGCCATATCAACACAGTCCCTTTCCTATACATCGGCAGCTCATTATTATAGTTGATGTTGAATTCAGAAAACAAAATCTCATTCTTGTCTGCTGNAAGAGTTCCCTGTAATCTCCCTTGGGCTTGTACTGGTGTTAGTCCAGATTGTTG(SEQ ID NO：1).............................................................................GGTCCTTTAAAGTCTGGTTGCTGGGATACACCACGACTCTTCCGGTCAAAGCCTGGGGGATACAGAAGGGGCTRGTCCTCAAAGTAATCCCGCCAATAAAACAYATAGCTGGAGGCAAACTGGGAGGYCACGTGAGTCATGAACTTTACTGGCTCTTCTTTTAAACCAATTGGTTTTCCGCTTGWACACAAAGCTGTACTCATCACTCTGTCCATAACGCGATCACAATATCCTCTAGTTCTTCCATCACAGTCTGCGCACATTTGGTCATCAGCTGGAGAGCACGGCTGTCATTGGGTTTTGCAAAGTTGTGCTTCTCAGCAAACCGATGGAAATTCCGGCCGTCCAGCCGNACTACCACCCAGCAGTGTGCCAGGCAGGTGTCGTCAGCCTCGAAGTCCCTCACGTACTCGAACTTGCTTTTTGCCATGGTCGCCCCCAATCTCAGGTACCGTCTCAGAGTGATGGAAATGGTGGCCAAGGAATCGTGAACCTTAACTTTACAGGCGCCCCACATTCTACACGCGGAAAGGAAAGGGCCAGATAGCCCCGCCCCGGAAGTGTTCTCTTCGTGGCTACTCTAGCCGTAGGGCGGTCATAGTCTCTCTCGSCTCTCCCTGKAGTTCTTAAMCYYCCAGGGAAARAGGATGGAGGTTTAGGTTCCTCCGTTAGCACCTTCCACGCTTGCTTCTTCCTCCTCCCGGTCTGCGGCAAATCAGTCTCACGAGGTTTTTAAAAATTATTTTTTATCTGCTGGCCTT(SEQ ID NO：2)............................ATGACACAAATATTAGGATTTTATTTTTACTATTATCCACCAGCAACAAGATATCAAACACTGGTTCTGTGATTATTTAATGGTGAAAAAGTTGAATAAATCAATTTAGTATACCCATATGTTGGAATATTGAGTCCATTTTTCTTTTAAAAATCACACTTTGGAATAATTGATGATACTGGCAAATGCTCAAGCTGAGTGGAAAAATATATAAACATTGTATAGGCGAATAATTCCAATCTTGTGCATTCCCTGTGTAAACCTACATACACAAAAAGAAAAAAGACTGAAAGGAACCATCCACAATGCTTTGATCGGGAAAGACGGAGAAACAAAGTGTTAATTTTCTTAACTATAGTTTTNGGTGTATTCCAGATTTTCTACAAGTTAATA(IHG-1)(SEQID NO：3)；GTACTTTGGATTTGGTTAACCTGTTTTCTTCAAGCCTGAGGTTTTATATACAAACTCCCTGAATACTCTTTTTGCCTTGTATCTTCTCAGCCTCCTAGCCAAGTCCTATGTAATATGGAAAACAAACACTGCAGACTTGAGATTCAGTTGCCGATCAAGGCTCTGGCATTCAGAGAACCCTTGCAACTCGAGAAGCTGTTTTTATTTCGTTTTTGTTTTGATCCAGTGCTCTCCCATCTAACAACTAAACAGGAGCCATTTCAAGGCGGGAGATATTTTAAACACCCAAAATGGTTGGGTCTGATTTTCAAACTTTTAAAACTTCACTACTGATGATTCTGCACGCTAAGGCGAATTTGGTCCAAACACATAAGTGTGTGTGTTTTGTATACACTGTATGACCCCACCCCAAATCTTTGTATTGTCCACATTCTCC(SEQ ID NO：4)；3)AGAAGCAATTTAGGAANCCNACAGNAAANAAATGCTGTTTTATAGGAGAGAAAACACGGCACACCAAGGTTAAGTAGTTTGTAGACGATGTTGAATAGGTTCAGGTACAGGTCAATGCAGTGATGAGGAAAGCACCTANGTATACTTGACAGATAGTCCCCTTTGCTTAACACCCAACTCCTCCACCCTGTGCAGTTTNNCTTGTGCCAGTGATCACAGGATTCGCTGAGTGAATTACCATAATTGGATTTAATTCACGAAGGGGATGTTTTC(IHG-3)(SEQ ID NO：5)；and4)ATTGATAGAGGCCCTGTTTCATGACATTTCATGAGTTTCAATATGTTGTTCAGCATGTTGTGAGGTGACTCTCAGCCCCTTTCCCACTGAGATGGACTGTGGTGATGCTGTGAGGGTGTGACTGACACACCTTCATGTGCCCAAGCATGGGTTTGATCACAGGTCACATGCAGTTTTTGGCATAGTAAATGTATCATTGTTCTTTTCCTCCCTCCTAAAGGAAACAGAGGAATCCACCTGTATGAGAGTGCCATGTAGGGATAAACTTAAAGGACAGATGACACATTGGTCATGTTCGTGATAAGGAAA(DHG-1)(SEQ ID NO：6)
本发明也提供含有如上列出的序列1-3、5和6的基因。
在起始的研究中，IHG-2基因被认为是新的。然而，正如下面将要展示的，IHG-2被鉴定为是gremlin基因行先前未知的一部分。我们发现，肾小球膜细胞的gremlin mRNA水平在体外被高葡萄糖、环形机械拉力和TGF-β1诱导，在体内，gremlin mRNA水平在患有链脲菌素诱导的糖尿病性肾病的大鼠肾皮质中被升高。观察到gremlin的表达与骨形态发生蛋白质-2(BMP-2)的诱导平行，BMP-2是细胞分化模型中gremlin的靶子。
gremlin，与DAN和cerberus一起，是蛋白质的半胱氨酸结节超级家族的成员，近来的研究显示，这些蛋白在肢发育和神经嵴细胞分化中扮演重要的角色(Hsu，D.R.等(1998)Mol.Cell.1，673-83；Zuniga，A等(1999)Nature401，598-602)。在神经嵴细胞分化的模型中，gremlin是BMP-2一个公认的抑制剂，对于糖尿病性肾病具有潜在的影响。近来报道，BMP-2对于肾小球膜细胞具有抗增殖效果。
下面的实施例表明，(a)IHG-2是gremlin的一部分，(b)在体内的糖尿病性肾病中，gremlin被表达，(c)血糖过多和机械拉力都刺激体外肾小球膜细胞的gremlin表达，(d)高葡萄糖诱导gremlin，部分是通过TGFβ-介导途径，和(e)在患糖尿病的肾小球环境中，gremlin是BMP潜在的内源拮抗剂。
本发明也提供依据本发明的方法鉴定的基因的应用：
1)作为糖尿病性肾病发展和存在的诊断标记；
2)作为糖尿病性肾病活性和进展速度的指标；
3)作为鉴定用来阻止和/或治疗糖尿病性肾病的药物的基础。
因而，如此将是被期望的：能够依据本发明鉴定的诊断标记进行糖尿病性肾病的早期诊断，并可与主动治疗一起，阻止糖尿病性肾病的完全发展。
依据本发明鉴定的基因的表达水平，可以与疾病进展的程度相关。
进一步，依据本发明鉴定的基因可以代表药物开发项目的新治疗靶。一旦确立一个给定的基因在糖尿病性肾病的病理生理学中起着指定的作用，新治疗剂的开发(例如，小分子、重组抑制剂和受体拮抗剂)就可被设计来抑制这些基因的表达并因而阻止糖尿病性肾病的发展。
依据本发明鉴定的基因也可以用来作为进行性肾硬化和结疤的临床指标，作为进行性糖尿病性肾病对治疗响应的指导，也可作为它的预防或发展的标记。
对于依据本发明鉴定的基因，可能产生小鼠剔除(k/o)模型，也能产生糖尿病的k/o小鼠模型，(例如通过用链脲菌素处理)，并有可能确定糖尿病性肾病的发作是否被抑制了、降低了或延迟了。因而，可以确定一个给定的剔除基因是否在糖尿病性肾病的进展和发展中充当一个确定的角色。
附图的简要描述
图1是在实施例2中描述的通过Northern Blot分析得出的CTGF水平的放射自显影图；
图2是如在实施例2中描述的通过Phosphor Imager定量估测的CTGF mRNA相对量的图示；
图3是如在实施例2中描述的表现乙啶-染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶；
图4是如在实施例3中描述的大鼠CTGF转录物和小鼠CTGF同源体fisp12的核苷酸序列对比；
图5是如在实施例3中描述的大鼠CTGF转录物和小鼠CTGF同源体fisp12的氨基酸序列对比；
图6是如在实施例3中描述的表现乙啶-染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶；
图7是如在实施例4中描述的通过Northern Blot分析得出的CTGF水平的放射自显影图，这是在TGF-β1和TGF-β1中和性抗体存在的情况下得出的；
图8是如在实施例4中描述的通过Phosphor Imager定量估测的CTGF mRNA相对量的图示；
图9是如在实施例4中描述的通过Northern Blot分析得出的CTGF水平的放射自显影图，这是在变化量的葡萄糖和TGF-β1中和性抗体存在的情况下得出的；
图10是如在实施例4中描述的通过Phosphor Imager定量估测的CTGF mRNA相对量的图示；
图11是如在实施例4中描述的通过Northern Blot分析得出的CTGF水平的放射自显影图，这是在变化量的葡萄糖和PKC抑制剂GF102903X存在的情况下得出的；
图12是如在实施例4中描述的通过Phosphor Imager定量估测的CTGF mRNA相对量的图示；
图13是如在实施例6中描述的从EST数据库中得出的BLAST结果的图示；
图14是如在实施例6中描述的当应用BLAST算法进行比较时得到的人gremlin和大鼠drm比较结果的图示；
图15是肾小球膜细胞gremlin cDNA序列；
图16是如在实施例7中描述的通过Northern Blot分析得出的IHG-2、gremlin、纤连蛋白和GAPDH mRNA水平的放射自显影图；
图17是如在实施例7中描述的通过Phosphor Imager定量估测的mRNA相对量的图示；
图18是如在实施例7中描述的通过Northern Blot分析得出的gremlin、纤连蛋白和GAPDH mRNA水平的放射自显影图；
图19是如在实施例7中描述的通过Phosphor Imager定量估测的mRNA相对量的进一步图示；
图20是如在实施例7中描述的通过Northern Blot分析得出的在STZ-糖尿病大鼠和年龄匹配的对照的肾皮质中的gremlin mRNA水平的放射自显影；
图21是如在实施例7中描述的通过Phosphor Imager定量估测的mRNA相对量的进一步图示；
图22是如在实施例8中描述的通过Northern Blot分析得出的gremlin、纤连蛋白和GDAPH mRNA水平的放射自显影图；
图23是通过Phosphor Imager定量估测的mRNA相对量的图示；和
图24是如在实施例9中所描述的四个独立实验的代表性反应的图示。
本发明将由下列实施例得到进一步的说明：实现本发明的模式实施例1鉴定由高葡萄糖差异诱导的肾小球膜细胞基因a)细胞培养和链脲菌素诱导的糖尿病大鼠
如先前报道的那样培养初级人肾小球膜细胞(Brandy，H.R.等(1992)Kidney Int.42，480-487和Denton，M.D.等(1991)Am.J.Physiol.261，F1071-F1079)。细胞(传了7-11代)在含有5mM或者30mM D-葡萄糖的培养基(Clonetics)中维持7天。在此过程中，补充三次培养基以维持葡萄糖水平在期望的范围。为控制容积渗克分子浓度过高的效果，在含有5mM葡萄糖、补充有25mM甘露醇的培养基中培养肾小球膜细胞。
如先前描述的一样(Zatz，R.等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，5963-5967)，通过静脉内注射50g/kg链脲菌素(STZ；Sigma)让雄性Munich-Wistar大鼠(260-290g，Simonsen Laboratories)患有糖尿病。在诱导糖尿病性肾病(DN)之后2到4个月，用在腹膜内注射戊巴比妥(50mg/kg)的方法麻醉大鼠，切除右侧的肾脏并马上称重。应用标准的筛滤方法(Brady，H.R.等(1992)和Denton，M.D.等(1991)同上)从肾皮质中分离肾小球。在去除肾脏后20分钟之内完成肾小球的分离。其后立即进行RNA提取。b)RNA分离
用Microfast Track(Microfast Track是商标)试剂盒(Invitrogen)从肾小球膜细胞中分离聚腺苷酰化RNA。应用RNAzol溶液(TEL-testInc.)从肾小球中分离总RNA。c)抑制性减数杂交(SSH)
依据制造商的指示，应用PCR-SELECT cDNA减数试剂盒(Clonetics)进行SSH，其中的一个改变是，在第二次杂交中加入比推荐的要多四倍的量的驱动者cDNA。起始材料由作为“测验者”的在30mM D-葡萄糖中培养7天的2μg肾小球膜细胞m RNA，和作为“驱动者”的在5mM D-葡萄糖中培养7天的2μg肾小球膜细胞mRNA组成。进行30个初级PCR循环和12个二级PCR循环。d)cDNA克隆和测序
用原始TA克隆试剂盒(Invitrogen)把通过SSH得到的PCR产物被亚克隆到PCR2.1载体中。亚克隆的cDNA用群落PCR扩增进行分离。用自动ABI370ADNA测序系统进行测序。用ABI棱柱染料终止循环测序反应试剂盒(ABI prism dye terminator cycle sequencing readreaction kit，Perkin Elmer)进行测序反应。得到的序列用BLAST搜索与GenBank/EMBL和表达序列标签(EST)数据库相比。
SSH分析提示，在30mM葡萄糖中培养7天得到的人肾小球膜细胞的原代培养物中16种mRNA的差异诱导。按照标准操作用甲醛变性进行Northern Blot，并应用Phosphor Imager(Biorad)进行定量，证实在16个亚克隆片断中有15个差异表达，如表1所示。
在表1中，a是指基于与Genbank/EMBL数据库比较的序列同一性；
b是指对通过Northern Blot分析鉴定的mRNA的大小(kb)的估计；和
c是指相对于在5mM葡萄糖中培养的细胞中的表达，基于对在指定条件下培养的初级人肾小球膜细胞进行Northern Blot分析得到的每个基因的差异表达。数值通过Phosphor Imaging得到，并通过与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比较进行校准(*，在培养于5mM葡萄糖+25mM甘露醇和30mM的葡萄糖中的肾小球膜细胞中检测到，而在5mM葡萄糖中没有检测到，倍数是相对于在5mM葡萄糖中发现的表达程度)。
                       表1如在高葡萄糖中培养的肾小球膜细胞中诱导的通过SSH鉴定的cDNA
                      概要
    基因a  mRNAkbb            差异表达c
 30mM葡萄糖 25mM甘露醇+5mM葡萄糖
细胞外基质蛋白
    纤连蛋白     7.0     2.1倍     1.5倍
血小板反应蛋白     6.0     7.0倍     8.0倍
肌动蛋白-结合蛋白
    MRLC     0.9     3.9倍     1.6倍
  T-丝束蛋白     1.2     4.2倍     1.8倍
  钙调结合蛋白     3.6     3.3倍     2.8倍
    抑制蛋白     1.0     2.2倍     2.3倍
    CAP     2.6     1.5倍     1.7倍
    ARP3     2.5     2.0倍     1.0倍
    生长因子
    CTGF     2.4     3.0倍     1.5倍
    其他
    PAI-1     2.0     1.2倍     1.0倍
    3.0     3.9倍     2.0倍
    RBM3     1.5     1.8倍     1.4倍
    遍在蛋白     3.0     2.3倍     1.7倍
    TCTP     0.8     4.3倍     2.5倍
    IHG-1     3.4     *     *
    IHG-2     2.5     2.0倍     2.0倍
序列分析揭示了对先前在糖尿病性肾病的发病机理中涉及的四个基因：纤连蛋白、钙调结合蛋白、PAI-1和血小板反应蛋白的诱导。关于其他11个cDNA片断，其中一个编码新的基因，如在此制定为IHG-1，10个编码已知基因，包括如下高葡萄糖对其的诱导尚未被描述的IHG-2基因。在后面的基因中，著名的是结缔组织生长因子(CTGF)和几个细胞骨架关联蛋白，即抑制蛋白、钙调结合蛋白、腺苷酸环化酶关联蛋白(CAP)、肌动蛋白相关蛋白-3(ARP-3)、T-丝束蛋白和肌球蛋白调节轻链(MRLC)。后来的研究集中在CTGF的诱导，它是如在实施例2和3中描述的几个模型系统中基质产生的调节物。编码多肌动蛋白结合蛋白的基因的重要性也值得注意，近来的报道暗示，在糖尿病性肾病中，在肾小球膜细胞功能障碍和肾小球高血压的发病机理中存在F-肌动蛋白解聚(Zhou，X.等(1995)Lab.Invest.73，372-383和Zhou，X.Lai等(1997)Kidney Int.51，1797-1808)。对抑制蛋白表达的诱导是特别地令人感兴趣，它在细胞应激的条件下扮演肌动蛋白聚合调节物的角色(Sohn，R.H.和Goldschmidt-Clermont，P.J.(1994)Bioessays16，465-472)。
在糖尿病环境中，高水平的葡萄糖可能通过葡萄糖特异性作用或通过升高细胞外液体的容积渗克分子浓度，来扰乱细胞功能。容积渗克分子浓度过高作为由高葡萄糖诱导基因的中介体的角色，可以在培养在30mM葡萄糖或在5mM葡萄糖并辅以25mM甘露醇中的细胞中，如Northern Blot测定那样通过比较mRNA水平测定出来。在诱导CTGF、肌球蛋白调节轻链(MRLC)、肌动蛋白相关蛋白3(ARP3)、T-丝束蛋白和可被翻译控制的肿瘤蛋白(TCTP)的表达中，高葡萄糖比高容积渗克分子浓度更加有效。高葡萄糖和甘露醇诱导的容积渗克分子浓度过高，可等价地诱导其他产物。实施例2培养在高葡萄糖中的肾小球膜细胞中的CTGF表达a)高环境葡萄糖对人肾小球膜细胞中的CTGF mRNA水平的影响
CTGF，38kD的富含半胱氨酸的分泌型肽，已知在某些肾脏外细胞类型中调节ECM的产生。在实施例1中，SSH分析鉴定了一个250bp的cDNA片断，它与人CTGF cDNA的814-1061碱基是相同的。通过Northern Blot研究了培养在高葡萄糖中的初级人肾小球膜细胞中的CTGF mRNA表达的诱导，结果示于图1。
图1中的各道代表如下：
道1：从暴露于5mM葡萄糖的肾小球膜细胞中得到的RNA；
道2：从暴露于5mM葡萄糖和25mM甘露醇的肾小球膜细胞中得到的RNA
道3：从暴露于30mM葡萄糖7天的肾小球膜细胞中得到的RNA。
在用CTGF探针杂交后侦察到一个2.4kb的条带。通过PhosperImager定量估测的CTGF mRNA相对量，如图2所示。所有的值都用GAPDH水平进行校准，结果是三次独立实验的代表。
结果表明，与5mM葡萄糖相比，培养在30mM葡萄糖中的肾小球膜细胞中的CTGF mRNA的表达要高2.5-3.3倍。b)CTGF对肾小球膜细胞基质产生的效果
为调查CTGF对基质产物正调节的直接效果，特别是对I型和IV型胶原蛋白和纤连蛋白的作用，肾小球膜细胞与重组CTGF蛋白质温育。
肾小球膜细胞在辅有0.5％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中饥饿培养24小时，然后暴露在rhCTGF(8ng/ml)(Gary Grotendorst博士慷慨馈赠)中24小时(Kreisberg，J.I.和Ayo，S.H.(1993)，Kidney Int.43，109-113)。提取总RNA，并用DNase I(Gibco-BRL)去除染色体DNA。把等量cDNA依次进行PCR扩增，使用特定引物，
GAPDH(Ger/EMBL登录号：AJ005371)：
正义：ACCACAGTCCATGCCATCAC(SEQ ID NO：7)；
反义：TCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO：8)；
胶原蛋白I(Gen/EMBL登录号：X55525)：
正义：GGTCTTCCTGGCTTAAAGGG(SEQ ID NO：9)；
反义：GCTGGTCAGCCCTGTAGAAG(SEQ ID NO：10)；
胶原蛋白IV(Gen/EMBL登录号：M11315)
正义：CCAGGAGTTCCAGGATTTCA(SEQ ID NO：11)；
反义：TTTTGGTCCCAGAAGGACAC(SEQ ID NO：12)；和
纤连蛋白(Gen/EMBL登录号：X02761)：
正义：CGAAATCACAGCCAGTAG(SEQ ID NO：13)；
反义：ATCACATCCACACGGTAG(SEQ ID NO：14)。
图3描述在电泳后用乙啶(ethidium)染色的含有每个PCR反应产物10μl的2％(w/v)琼脂糖凝胶板。
图3中的各道代表如下：
道1：从在RPMI1640和0.5％FBS中培养的肾小球膜细胞中得到的RT-PCR产物；
道2：从暴露于rhCTGF(8ng/ml)24小时的肾小球膜细胞中得到的RT-PCR产物。
这些结果表示，rhCTGF正调节肾小球膜细胞的I型和IV型胶原蛋白和纤连蛋白。这些蛋白质代表在糖尿病性肾病中观察到的基质积聚。
CTGF是一个名为CCN家族的高度同源的蛋白质的小家族的成员(对于CTGF/fisp-12、cef10/cyr61和Nov)(Bork，P.(1993)，FEBS Letts.327，125-130)。这些肽的特征是它们有38个保守的半胱氨酸残基，这超过其氨基酸成分中的10％。所有成员都有信号肽，都象是通过正统分泌途径被分泌出来(Bradham，D.M.，(1991)J.Cell.Biol.114，1285-1294)。在糖尿病性肾病环境中，有趣的是，在环境葡萄糖存在的情况下CTGF被正调节，反过来，CTGF也正调节细胞外基质(ECM)的产生。这些数据显示，在糖尿病性肾病中，CTGF作为增加ECM合成和肾小球膜扩展的刺激物的可能性。实施例3在患有用STZ诱导的糖尿病性肾病的大鼠的肾皮质和分离的肾小球中增强的CTGF表达
为测定在体内CTGF在糖尿病性肾病中的表达，以从患有STZ诱导的糖尿病的大鼠的皮质中分离的RNA来测量CTGF mRNA的水平。为达此目的，以小鼠CTGF同源体即fisp12(Genbank/EMBL登录号：M70642，正义：CTAAGACCTGTGGAATGGGC(SEQ ID NO：15)；反义：CTCAAAGATGTCATTGTCCCC(SEQ ID NO：16))(Ryseck，R.P.，(1991)Cell Growth Differ.2，225-233)的序列来设计针对大鼠CTGF的PCR引物。
对从STZ-糖尿病大鼠和年龄匹配对照组的肾皮质中提取的总RNA进行RT-PCR。大鼠CTGF转录物的序列，与小鼠CTGF同源体fisp12(碱基783-1123，登录号为M70642)相比，在核苷酸水平上有94％是相同的(图4)，在氨基酸水平上有99％是相同的(图5)。在两个种之间不同的核苷酸在上面给出，单一的不同的氨基酸用黑字体表示。
CTGF mRNA的诱导，可在施用STZ四个月后，在患有STZ诱导的糖尿病性肾病的大鼠的肾皮质中观察到，这与图6表示的肾小球扩张和蛋白尿是一致的，数据没有给出。
图6描述在电泳后用乙啶染色的含每个PCR反应产物10μl的2％(w/v)琼脂糖凝胶板。以在患有糖尿病四个月后从患有建立的肾病的2只糖尿病动物中纯化得到的总RNA(道1和2)和从两只年龄匹配对照动物中纯化出的总RNA(道3和4)，分析CTGF和GAPDHmRNA水平。
通过RT-PCR分析从肾小球提取得到的RNA，可进一步把CTGF表达定位于肾小球，该肾小球是从患有STZ诱导的糖尿病性肾病的大鼠的肾皮质通过差别筛选而分离得到的。与年龄和性别匹配对照组相比，在患有糖尿病2个月和4个月后，CTGF mRNA的肾小球水平分别增长2.5倍和1.6倍。这些观察结果的显著性被近来的一个报道进一步支持，该报道显示，在筛选包括糖尿病性肾病在内的人类肾疾病中CTGF表达的作用(Ito，Y.等(1998)Kidney Int.53，853-861)。实施例4涉及TGF-β1依赖和非依赖途径的对由高葡萄糖对肾小球膜细胞CTGF表达的诱导
已经显示TGF-β1是针对在糖尿病性肾病中肾小球基质积聚的刺激物。在如实施例1中描述的实验模型中，在与CTGF表达相同的时间段内，高浓度的葡萄糖激发TGF-β1 mRNA在培养的人肾小球膜细胞中的表达诱导(数据没有显示)。
为测定TGF-β1作为针对高葡萄糖响应的CTGF表达的刺激物的角色，细胞与5mM葡萄糖或30mM葡萄糖加上1μl/ml抗TGF-β1抗体温育7天，换三次培养基。细胞在0.5％FBS和RPMI1640中培养基中血清饥饿培养24小时。在24小时内，先后加入10ng/ml TGF-β1(Calbiochem)或经过用1μg/ml抗TGF-β1的中和性多克隆抗体预吸附的10ng/ml TGF-β1。
PKC在对高葡萄糖响应的CTGF表达中的角色，通过把肾小球膜细胞培养在5mM、30mM葡萄糖或30mM葡萄糖和PKC抑制剂GF102903X中进行研究。
图7是通过Northern Blot分析的CTGF mRNA的放射自显影图，它描述了当把肾小球膜细胞暴露于TGF-β1(10ng/ml)24小时得到的结果，实验分别是在抗TGF-β1中和性抗体(1μg/ml)存在(道3)和不存在(道2)的情况下进行的。培养在RPMI1640和0.5％FBS中24小时的细胞作为对照(道1)。在与CTGF探针杂交后，侦察到一个2.4kb的条带。剥下印迹，用GAPDH重新探测。用Phospher Imager定量估测CTGF mRNA的相对量(图8)。数值依据GAPDH水平进行校准，结果是两次独立实验的代表。
这些结果表明TGF-β1是在这些条件下增加CTGF mRNA水平的有力的诱导剂。此作用经加入中和性抗TGF-β1抗体而抑制，如图7所描述。
图9是通过Northern Blot分析的CTGF mRNA水平的放射自显影图，它描述了当把肾小球膜细胞暴露于5mM葡萄糖(道1)、30mM葡萄糖(道2)以及30mM葡萄糖和抗-TGF-β1中和性抗体(1μg/ml)(道3)下7天得到的结果。在与CTGF探针杂交后，侦察到一个2.4kb的条带。剥下印迹，用GAPDH探测。用Phospher Imager定量估测CTGFmRNA的相对量(图10)。数值依据GAPDH水平进行校准。
中和性抗TGF-β1抗体部分地减弱在30mM葡萄糖中成长7天的肾小球膜细胞中的由葡萄糖诱导的CTGF转录物水平的升高(图9)，表示高葡萄糖通过TGF-β1依赖和非依赖途径激发肾小球膜细胞的CTGF表达。
图11是通过Northern Blot分析的CTGF mRNA水平的放射自显影图，它描述了当把肾小球膜细胞暴露于5mM葡萄糖(道1)、30mM葡萄糖(道2)以及30mM葡萄糖和PKC抑制剂GF102903X(10μM)(道3)下4天得到的结果。在与CTGF探针杂交后，侦察到一个2.4kb的条带。剥下印迹，用GAPDH探测。用Phospher Imager定量估测CTGFmRNA的相对量(图12)。数值依据GAPDH水平进行校准。
尽管PKC抑制剂GF102903X在我们的系统中对于TGF-β1诱导的CTGF表达没有作用(数据没有显示)，但此化合物提供了对高葡萄糖诱导的CTGF表达的部分抑制(图11)。
CTGF具有TGF-β1的一些生物学行为，例如在成纤维细胞中刺激细胞增殖和细胞外基质蛋白质合成。在本文中，我们的结果表明，TGF-β1可能部分通过诱导CTGF合成来促进肾小球膜基质的产生。TGF-β1具有一些复杂的生物学活性，包括促炎、促纤维变性和抗炎效果。通过靶向CTGF，可能减弱TGF-β1诱导的硬化效果，而同时保留它的更被期望的抗炎活性。实施例5IHG-2的进一步表征
IHG-2是一个肾小球膜细胞基因，如我们已经鉴定的那样，它可被高浓度的细胞外葡萄糖在肾小球膜细胞中诱导，如在实施例1中描述的那样。为进一步表征此基因，在dbEST中用BLAST算法搜索IHG-2。此搜索得到一个与ESTAA071138有94％相同的克隆，克隆号：530117 3’。此克隆的5’末端序列也在数据库中，它也鉴定多个EST。这些EST与已知为drm/gremlin的大鼠eDNA克隆的3’非翻译区(UTR)同源。如上所述，gremlin/drm与DAN和cerbems一起，都是包括TGFβ和骨形态发生蛋白(BMP)在内的半胱氨酸结节超级家族的成员。第二个EST W48852，克隆号：324951 3’，由IHG-2 BLAST鉴定。此克隆的5’末端，EST W48619，也在此数据库中搜索到，从中得到EST AA373348。此克隆表现出与来自读码框(ORF)大约500bp的drm3’UTR的同源性。因此，可能在IHG-2和drm/gremlin的500bp的ORF之内建立起直接联系。因而，通过在EST AA37348和drm/gremlin的ORF之间建立联系，可以证实IHG-2是本基因3’UTR的一部分。设计引物来识别ORF、IHG-2和EST克隆AA373348。起始PCR，应用对应于gremlin/drm基因的起点的引物和在IHG-2克隆中的引物，将要给出大约2.5kb的预测产物。此产物用对应于gremlin的ORF的3’末端和EST克隆AA373348的引物嵌套，得到一个大约500bp的产物，因而证实此EST是位于人drm/gremlin基因的UTR中。因此，发现IHG-2是drm/gremlin基因的一部分，这在先前是未知的(图13)。实施例6应用克隆in-silico并与PCR偶联以展示IHG-2是gremlin 3’非翻译区的一部分
在实施例5中，我们描述了对转录物IHG-2的鉴定，用BLAST算法，其序列与被鉴定的序列的积累数据库没有表现出同源性。
如下进行生物信息分析：
数据库搜索和序列对比在位于美国马里兰Bethesda的国家生物工程信息中心(NCBI)进行，应用Basic Local Alignment Search ToolAlgorithm(BLAST)(Altschul，S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402)。应用非丰余(nr)和表达序列标签(EST)数据库作为资源。邻接序列用片断集结(Fragment Assembly)产生，这是在GeneticsComputer Group Inc.软件包中的一个程序。应用UbiBlast(Guffanti，A.和Simon，G.，Trends in Genetics，14，293)以鉴定在UniGene数据库中的同源簇，并证实从EST中得到的共有序列。从UniGene和OnlineMendelian Inheritance in Man(OMIM)数据库中得到染色体定位数据。
为进一步表征序列，在EST数据库中搜索IHG序列，得到一些匹配物。反过来，每个这样的匹配物，都在NCBI在nr数据库中搜索。四个EST，名为W52686、N28395、H80042和W47324，表现出与实施例5中的大鼠drm基因的3’UT区域的低同源性。此基因的人同源体gremlin的ORF，也在此数据库之中。
为在gremlin的ORF和IHG-2之间建立联系，应用连续BLAST搜索以鉴定在EST数据库中的重叠序列。
然而，不可能用EST数据库中的序列将IHG-2和gremlin的ORF直接联系起来。因此，从人肾小球膜细胞中分离的RNA被用一个识别IHG-2的引物反转录。在如图13所示的区域上进行PCR分析。
在此从EST数据库中得到的BLAST结果的图示中，4kb的粗条代表gremlin基因的最终复合序列。每个其他条代表在EST数据库中的一个单个序列，在可能的位置上，集结成为连续的序列，并展示克隆in-silico如何被用来产生邻接序列。通过用一个与IHG-2互补的引物进行人肾小球膜细胞mRNA的反向转录，产生没有EST重叠的区域。在指定(用箭头表示)的区域进行PCR，得到的产物被测序，得到一个4049bp的邻接cDNA，包括gremlin和IHG-2的读码框。
比较人gremlin和大鼠drm的cDNA，图14表示应用BLAST算法在带有对应IHG-2的区域的大鼠drm和人gremlin之间进行序列对比。在cDNA的编码区发现高的序列同源性；然而，在3’UT区域内，仅有小的同源性区域。这解释了为什么IHG-2在BLAST搜索中不识别drm而识别drm的配对物，因此通过进一步检查EST序列，得到gremlin。在大鼠drm和人gremlin之间同源性的缺失，可能是因为目标是保持种间相同的对于基因同源体3’UT区域的选择性压力降低。
图15表示人肾小球膜细胞gremlin的最终序列，指示ORF和对应IHG-2(GenBank登录号：AF110137)的区域。表示的是5’和3’UT序列和读码框(与翻译)。划框内的区域对应IHG-2的区域。在提交时，本序列与EST数据库中的136个独立的EST实体相匹配。在这些实体中，23.5％来自成纤维细胞文库；30％来自骨组织文库；34％来自肿瘤相关文库。此序列也应用UniBlast程序在UniGene数据库中进行搜索。这次鉴定出四个UniGene簇，Hs.214148、Hs40098、Hs.114330和Hs.239507。两个这样的簇，Hs40098和Hs239507，分别被定位(map)于染色体15的D15S118-144和D15S144-165间隙。分泌型颗粒神经内分泌蛋白质1和烟碱胆碱能受体的d多肽，已被定位于这些簇的任意一边，也被更特异地定位于15q11-15间隙。对OMIM数据库的分析揭示，近来被显示在发育的肢芽中诱导gremlin表达的formin基因(Zuniga，A.等(1999)同上)，也定位于此间隙。具有多发性骺发育不良或Wolcott-Rallison综合症的糖尿病被定位于15q11-12间隙(Stewart，F.J.等，(1996)Clin.Genet.49，152-5)。在骺生长板中，免疫组化研究揭示BMP-2和4在正在增殖和成熟的chrondocyte中表达，指示BMP和它的受体在软骨内骨化的多步级联中具有一定的作用(Yazaki，Y.等(1998)Anticancer Res.18，2339-44)。gremlin表达的调控可能在与Wolcott-Rallison综合症相关的两种疾病状态下都有所涉及。实施例7在体外由高葡萄糖和环机械拉力诱导对肾小球膜细胞gremlin表达的诱导
A)如实施例1描述的繁殖人肾小球膜细胞的原代培养物，除了培养基补充有5％的FBS之外。如实施例1描述用葡萄糖处理培养物。肾小球膜细胞暴露于5mM或者30mM的葡萄糖7天。
如下面将要进一步描述的那样，应用gremlin的ORF和IHG-2探针对从在5mM(“正常”)或者30mM(“高”)葡萄糖中生长的肾小球膜细胞中提取的RNA进行Northern Blot分析。如图16中描述的，两个探针都侦察到，在高葡萄糖条件下，基因表达增加两倍。
所有下面的Northern分析都是应用gremlin的ORF作为探针进行的。
按照标准程序利用甲醛变性进行Northern Blot，应用phosphorimager(Biorad)进行定量。扩增用来产生Northern分析的探针的PCR产物，使用针对gremlin的读码框(ORF)的引物(正义：ATGAGCCGCACAGCCTACAC(SEQ ID NO：17)；反义：TTAATCCAAATCGATGGATATGC(SEQ ID NO：18))，和针对IHG-2的引物(正义：CTCAGCCTCCTAGCCAAGTCC(SEQ ID NO：19)；反义：GTATTGTCCACATTCTCCAAC(SEQ ID NO：20))。如实施例2中描述的那样生成纤连蛋白和GAPDH探针。用特定探针来扩增gremlin/IHG-2(外部正义：ATGAGCCGCACAGCCTACAC(SEQ IDNO：21)；外部反义：GTATTGTCCACATTCTCCAAC(SEQ ID NO：22)；内部正义：GAGAGTCACACGTGTGAAGC(SEQ ID NO：23)；内部反义：AGGAGGATGCAAGCACAGG(SEQ ID NO：24))，BMP-2(外部正义：CGCGGATCCTGCTTCTTAGACGGACTGCG(SEQ IDNO：25)；外部反义：TTTGCTGTACTAGCGACACC(SEQ ID NO：26)；内部正义：CAAGATGAACACAGCTGG(SEQ ID NO：27)；和GCTCAGGATACTCAAGAC(SEQ ID NO：28))。如实施例3中报告的那样进行RT-PCR。
结果示于图16和17。
在图16和17，道1对应暴露于5mM葡萄糖的肾小球膜细胞，道2对应暴露于30mM葡萄糖的肾小球膜细胞。
图16是通过Northem Blot分析的IHG-2(1)、gremlin(2)、纤连蛋白(3)和GAPDH(4)的mRNA水平的放射自显影图。在与gremlin和IHG-2探针杂交后，侦察到约4.4kb和4.6kb的两个条带。
图17描述通过Phospher Imager定量估测的相对mRNA水平。数值依据GAPDH水平进行校准。每个结果都是三次独立实验的代表。
B)肾小球高血压是针对在糖尿病中形成肾小球硬化症的一个独立的危险因子(Brenner，B.M.等(1982)N.Engl.J.Med.307，652-9)。为在本研究中把肾小球高血压对肾小球膜细胞gremlin表达的效果模型化，在FlexercellTM System中在环形机械拉力的条件下繁殖肾小球膜细胞24和48小时。
为了应用环形机械拉力，初级人肾小球膜细胞被种植在弹性的或坚硬的用elastin包被的六孔板上(Flex I和Flex II培养板，Flex cellTM Int，Hillsborough，NH，USA)。细胞生长到90％的汇合度，然后在辅以0.5％胎牛血清的CloneticsTM Mesangial Basal培养基中进行血清限制。培养在弹性培养板上的细胞用Flexercell Strain Unit FX-2000(FlexercellTM)进行重复的由计算机控制的、真空驱动的机械拉伸和回复的循环。以0.5秒的间隙(60循环/分钟)交替拉伸和回复细胞共24或48小时。所应用的真空把培养板的外孔环拉长17％。所有的实验都在37C和5％CO2的湿润的温育箱中进行。
从糖尿病开始后14个星期的三只糖尿病大鼠和从三只年龄匹配对照中得到结果。
应用的模型以与在体内观察到的在糖尿病性肾小球硬化症中相似的方式扰乱肾小球膜细胞基质的产生和代谢。肾小球膜细胞gremlinmRNA水平在机械拉力的条件下被显著地提高，与在图18和19中显示的增加的纤连蛋白mRNA表达相似。
参见图18和19，培养物中的肾小球膜细胞在静止条件下(道1)或应用FlexercellTM System在暴露于环形拉力24小时(道2)或48小时(道3)下生长。
图18是通过Northern Blot分析的gremlin(1)、纤连蛋白(2)和GAPDH(3)mRNA的放射自显影图。
在图18中，各道代表如下：
道1：在静止条件下培养物中的肾小球膜细胞的生长；
道2：在处于环形拉力下24小时培养物中的肾小球膜细胞生长；
道3：在处于环形拉力下48小时培养物中的肾小球膜细胞生长。
图19描述通过Phospher Imager定量估测的相对mRNA水平。数值依据GAPDH水平进行了校准。
为测定在体内在糖尿病性肾病中的gremlin的表达，gremlin mRNA水平通过Northern Blot分析进行测量，其中RNA是从对照大鼠的肾皮质和在用链脲菌素(STZ)诱导糖尿病后14星期的糖尿病大鼠中分离而来。与上面报道的体外实验相一致，gremlin mRNA水平在糖尿病大鼠的肾脏中升高，这与糖尿病性肾病的蛋白尿和组织学证据是一致的(数据没有显示)。
用链脲菌素使九只已单肾切除的雄性Munich-Wistar大鼠患糖尿病，如实施例3所述提取RNA。
结果示于图20和21，它们表示在STZ-糖尿病大鼠的肾皮质中的gremlin mRNA水平。
图20是通过Northern Blot分析的STZ-糖尿病大鼠(道2)和年龄匹配对照(道1)的肾皮质中的gremlin mRNA水平的放射自显影图。在与gremlin探针杂交后，侦察到大约4.4kb的一个条带。
图21描述通过Phospher Imager定量估测的相对mRNA水平。数值依据GAPDH水平进行校准。实施例8通过高葡萄糖调控肾小球膜细胞的gremlin表达：涉及TG-β1的证据
如上所述，高环境葡萄糖浓度和环形机械拉力均能激发体外肾小球膜细胞产生TGF-β1，并且TGF-β1看起来是在体内在患糖尿病的肾小球中肾小球基质积聚的主要刺激物。为探究高葡萄糖激发gremlin表达的机制，初级人肾小球膜细胞在抗TGF-β1中和性抗体(1μg/ml)存在或不存在的情况下在5mM或30mM葡萄糖中培养繁殖。如实施例1和实施例4描述的那样分别用葡萄糖和抗TGF-β1抗体处理培养物。为检测TGF-β1作为gremlin表达的刺激物的作用，细胞在MCDB131和0.5％FBS中被血清限制24小时，接着用10ng/ml TGF-β1处理。MCDB131是为肾小球膜细胞生长特制的培养基，得自Clonetics。
开始的研究表明，TGF-β1中和性抗体(数据没有显示)削弱由葡萄糖激发的gremin表达，因而TGF-β1改变gremlin表达的能力被查明。结果示于图22和23。
将外源人重组TGF-β1加入(10ng/ml，24小时)到血清限制(24小时)的肾小球膜细胞中，也可提高gremlin mRNA水平，这提示高葡萄糖促进gremlin mRNA的表达，至少部分地，通过它刺激TGF-β1表达的能力进行。总计起来，这些观察结果表明存在一个新的自分泌环，TGF-β1通过它来诱导gremlin基因表达，并因而可调节来自肾小球膜的BMP的活性，如下所述。
发现对高葡萄糖(30mM，7天)响应的gremlin表达在抗TBF-β1抗体存在下被减低了(数据没有显示)。为进一步探究作为gremlin表达调节基因的TGB-β1的作用，肾小球膜细胞被暴露于TGF-β1(10ng/ml)24小时(道2)。培养在MCDB131和0.5％FBS中24小时的细胞作为对照(道1)。
图22是通过Northern Blot分析的gremlin(1)、纤连蛋白(2)和GAPDH(3)mRNA水平的放射自显影图。
图23显示通过Phospher Imager定量估测的相对mRNA水平。数值依据GAPDH水平进行校准。实施例9在肾小球膜细胞中高葡萄糖压力诱导BMP-2而不是BMP-4的表达
如上所述，gremlin是BMP-2和BMP-4的公认拮抗剂。具体而言，gremlin近来被报道与BMP形成异二聚体，因而拮抗BMP的信号传导(Hsu，D.R.等(1998)同上)。在本发明中，用RT-PCR进行肾小球膜细胞BMP表达的初步测定。
作为对gremlin表达和BMP表达之间的关系的初步测定，从在5mM或30mM葡萄糖中生长7天的肾小球膜细胞中分离RNA。用随机引物进行反转录，然后进行对BMP-2的ORF的初级PCR。在30个循环之后，此产物在乙啶染色的琼脂糖凝胶中测不出来，它被嵌套而给出一个446bp的预测产物。用BMP-4和GAPDH特异性引物进行的PCR分析分别给出378bp和452bp的预测产物。
图24描述了4个独立实验的代表性反应。PCR反应物过1％溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶，每种10μL。
尽管在培养在5mM葡萄糖中的肾小球膜细胞中很少或不能测出BMP-2 mRNA，但在30mM葡萄糖中培养的肾小球膜细胞中却观察到显著的对BMP-2表达的诱导，如图24所示。
与之相比较，BMP-4的表达水平是相对未变的。令人感兴趣的是，鉴于BMP-2在体外在肾小球膜细胞中不刺激纤连蛋白表达，BMP-2近来被显示，它阻碍由表皮生长因子和来自血小板的生长因子激发的肾小球膜细胞的增殖(Ghosh Choundhury，G.等，(1999)J.Biol.Chem.274，10897-902；Ghosh Choundhury，G.等，(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258，490-6)。我们的结果提供了以下可能性，即TGF-β1刺激的gremlin表达可能有助于在此环境中肾小球膜细胞的增殖反应。Gremlin对细胞增殖的影响看起来是复杂的，然而，它可能因细胞类型和增殖刺激物而有大幅度的变化。与前述的可能的促增殖作用相反，gremlin的同源体drm的超量表达，通过ERK介导的途径，在成纤维细胞中引起编程性细胞死亡，而用癌基因如v-mos转化的细胞表现出受抑制的drm表达(Topol，L.Z.等，(1997)Mol.Cell.Biol.17，4801-10)。相似地，另一个半胱氨酸结节超级家族成员，与drm/gremlin同源的DAN的超量表达，延迟了成纤维细胞进入S期(Ozaki，T.等，(1995)Cancer Res.55，895-900)。
总结一下，我们的结果证明，DAN家族成员gremlin在体内在糖尿病性肾病中被诱导，表明代谢和血液动力学压力都是gremlin表达的刺激物。
高葡萄糖激发的gremlin表达可通过加入外源TGF-β1进行模拟，用抗TGF-β1中和性抗体削弱，并与肾小球膜细胞BMP-2的诱导相伴地发生。这样的发现表明，在糖尿病的肾小球膜中存在一种新型自分泌环，它可能限制TGF-β1超级家族成员的生物活性，并调控肾小球膜细胞的增殖。对分泌蛋白的DAN家族如gremlin与TGF-β1超级家族成员的功能性相互作用的进一步阐释，可能使在糖尿病性肾小球硬化症中扰乱细胞增殖和基质产生的复杂多叉的分子事件清楚明白地显示出来。

Claims (12)

1.一种鉴定在糖尿病性肾病的发生中起作用的基因的方法，其特征是该方法包括在一定浓度的葡萄糖存在下培养肾小球膜细胞，其中葡萄糖的浓度足以诱导对差异表达易感的基因的差异表达，和鉴定如此被诱导的基因。
2.权利要求1的方法，其中将肾小球膜细胞在足以诱导对正调节易感的基因产生正调节的葡萄糖浓度下进行培养。
3.权利要求1或2的方法，其中葡萄糖的浓度高于5mM。
4.根据上述任意一项权利要求的方法，其中使肾小球膜细胞经受机械拉力。
5.上述任意一项权利要求的方法，其中将转化生长因子β1(TGF-β1)加到培养基中。
6.上述任意一项权利要求的方法，其中差异表达基因是通过抑制性减数杂交鉴定的。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中因为容积渗克分子浓度过高引起的差异表达的可能性被排除。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述差异表达的基因是包括从下列序列中选择出的序列的基因：
1)SEQ ID NO：1-3；
2)SEQ ID NO：4；
3)SEQ ID NO：5；和
4)SEQ ID NO：6。
9.依据权利要求1-8中任一项的方法鉴定的基因的用途，其用作糖尿病性肾病的疾病发生和进展的诊断标志；
10.依据权利要求1-8中任一项的方法鉴定的基因的用途，其用作糖尿病性肾病的疾病活性指数和进展速率。
11.权利要求1-8中任一项的方法鉴定的基因的用途，其用作鉴定用来阻止和/或治疗糖尿病性肾病的药物的基础。
12.一种基因，其含有依据权利要求8选自序列1-3、5和6中的任何一个序列。
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