CN101336372A - 监测、诊断和鉴定精神障碍的生物标记的方法 - Google Patents

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Abstract

一种刺激的或未刺激的T－细胞样品可以用于诊断或监测一种精神障碍，用于鉴定一种生物标记，或者用于测试一个候选试剂作为潜在治疗剂。

Description

监测、诊断和鉴定精神障碍的生物标记的方法
技术领域
本发明涉及使用基于T-细胞的测定和生物标记诊断或监测精神障碍(特别是精神分裂性障碍)的方法。本发明还涉及包括T细胞刺激测定的生物标记鉴定方法。而且，本发明还涉及鉴定在精神障碍治疗中有用的试剂的方法。
背景技术
精神病是一种重度精神疾病的症状。虽然它并不专门地和任何特定的心理或生理状态相关，但是它特别与精神分裂症、双相型障碍(躁狂抑郁)和重度临床抑郁症相关。这些病症、其表征和分类(包括DSM IV诊断标准)在PCT/GB2006/003870中记载，其内容通过引用的方式纳入本文。
WO01/63295描述的方法和组合物用于神经精神疾病或神经病症(包括双相型情感障碍、精神分裂症和血管性痴呆)的筛选、诊断和预后评定，以及用于监测对这些疾病的治疗有效性和用于药物开发。
基于额叶、颞叶和基底神经节的细微改变的其他技术例如磁共振成像或正电子发射断层成像对于个体患者的精神分裂性障碍的诊断、治疗或预后价值不大，这是因为报道的精神分裂症个体和正常对照受试者之间这些差异的绝对大小通常很小，在两组之间有明显的重叠。这些神经成像技术主要局限于排除可能伴随于精神分裂性症状的其他病症，例如脑部肿瘤或出血。
验证可以检测与精神障碍反转或发展特别相关的早期变化的生物标记，对于干预措施的监测和优化是必要的。作为预测物使用的这些生物标记可以帮助鉴别高危个体和疾病亚群，他们可以作为化学干预试验的靶向群体；作为替代端点的生物标记潜在地可用于评估预防性干预的效果和成本效益，其评估速度是现在以明显精神障碍的发病作为端点所无法达到的。
WO2005/020784公开了替代细胞基因表达标记，通过一种最低侵入的技术用于确定受试者的预后，或者确定对一种疾病、障碍或身体状态敏感的受试者。已显示有许多基因被调节，尤其是在精神病中(在实施例2中)。
因此，需要鉴定灵敏和特异的方法和生物标记以用于诊断并监测例如精神分裂性障碍或双相型障碍等精神障碍。此外，显然需要一些方法、模型、测试和工具来鉴定和评估用于治疗这些障碍的已有治疗剂和新治疗剂，并用来鉴定和评估用于诊断精神疾病的方法。
T-细胞是在胸腺中发育并且在免疫系统中起重要作用的淋巴细胞。有两种T-细胞亚群：有CD4标记的细胞被称为辅助T-细胞，CD8+细胞是细胞毒性T-细胞。两种T-细胞类型都具有用于抗原识别的T-细胞受体(TCR)。静息T-细胞的刺激或激活的起始是通过TCR-CD3复合体与抗原呈递细胞表面的抗原——II型MHC分子相互作用。该相互作用在T-细胞中启动包括基因转录激活在内的级联生物学事件，这最终导致T-细胞的生长、增殖和分化。
发明内容
本发明至少部分地基于以下的发现，即在刺激或未刺激的T-细胞上进行的测定可以提供关于受试者病症的有价值的信息。T-细胞提供了研究细胞功能的一个好的模型，这是因为分离它们相对容易(例如从外周血中分离)，纯度高并且可以以最低侵入的方式获得。
本发明的一个方面是一种诊断或监测受试者的精神障碍的方法，包括：
a.提供一个来自所述受试者的测试T-细胞样品；
b.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；以及
c.评估对所述刺激的反应。
该方法可以用于精神障碍的预后评估。它还可以用于监测治疗物质在患有、疑似患有或者不易患有精神障碍的患者中的效果的方法中。
本发明的第二方面是一种鉴定精神障碍的生物标记的方法，包括：
a.提供来自患有精神障碍的受试者的测试T-细胞样品；
b.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；
c.评估对所述刺激的反应；
d.将所述反应与对照T-细胞样品对刺激的反应相比较；以及
e.检测所述反应之间的任何差异，从而鉴定一种生物标记。
本发明的第三方面是一种测试用于治疗精神障碍的潜在试剂的方法，所述方法包括：
a.提供来自患有精神障碍的受试者的测试T-细胞样品；
b.将所述测试T-细胞样品与一种候选试剂相接触；
c.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；以及
d.评估对所述刺激的反应。
本发明的第四方面是一种诊断或监测受试者的精神障碍的方法，包括：
a.提供一个来自所述受试者的测试T-细胞样品；以及
b.比较所述测试样品与一个对照样品中的基因和/或蛋白表达。
本发明的另一方面是一种传感器，例如一种如下文所述的生物传感器。在一种本发明的方法中，生物标记的检测可以使用包含以下组件的传感器：一种或多种酶、结合受体或转运蛋白、抗体、抗体片段、合成受体或适例如体和肽等其他选择性的结合配体，以用于直接或间接地检测生物标记。所述传感器的识别元件可以偶联至电的、光的、声的、磁的或热的换能器，或者偶联至与所述换能器连接的微型系统，或者偶联至例如量子点或表面等离子颗粒等纳米颗粒系统。
具体实施方式
为了避免争议，本文使用的例如“反应”、“对照”和“样品”等术语分别包括不只一个该反应、一个该对照或一个该样品的可能性。
本文使用的术语“诊断”包括鉴定、证实和/或表征一种精神障碍，特别是一种精神分裂性障碍、双相型障碍、相关的精神障碍或者是易患这些障碍的倾向。易患是指一个受试者现在没有出现，所述障碍但在某个时间容易患有所述障碍。
本发明的监测方法可以被应用于监测一种精神障碍的发病、发展、稳定、改善和/或减轻。
本文使用的术语“精神障碍”是指精神病是可辨认的症状的障碍，它包括神经精神障碍(精神病性抑郁症和其他精神病性发作)和神经发育障碍(特别是泛自闭症障碍(autistic spectrum disorder))、神经退行性障碍、抑郁、躁狂症，并且特别是精神分裂性障碍(偏执型、紧张型、错乱型、混合型和残留型精神分裂症)和双相型障碍。优选地，本发明涉及精神分裂性障碍。
T-细胞样品优选从取自受试者的外周血中获得。优选地，T-细胞样品是新分离的，即样品在收集之后立即使用。
本文中描述了T-细胞分离方法的一个实例(实施例1)。然而，技术人员应了解也可以使用本领域中从例如外周血等生物样品中获得或分离T-细胞的其他已知方法。
本文使用的术语“刺激”是指能够诱导一种反应的刺激，所述反应优选是与T-细胞受体-触发相关的T-细胞增殖和应答。
体外T-细胞刺激可以被用作一种比较患者和对照细胞的功能反应的方法，首先是用于研究精神分裂症中的疾病过程的外周证据，并且还用于研究所述障碍的病理生理学中是否存在例如细胞信号传导、基因转录、蛋白合成和运输等细胞过程中的全局性异常或缺陷。体内T-细胞激活涉及T-细胞受体(TCR)通过相互作用与呈递的MHC相关的特异性抗原的结合。所述TCR信号传导复合体由大量的分子组成，包括CD3，它提供所述复合体的细胞质信号传导功能；CD45，它参与抑制性磷酸化酪氨酸基序的脱磷酸化；以及CD4或CD8，它们被认为可以稳定所述信号传导复合体。为了获得最佳的T-细胞反应，优选将共刺激用于初始信号的放大和调节。这由例如CD28、CD40、CD80/CD86和OX40L等分子提供。
优选地，利用单克隆抗体(抗CD3)，通过交联细胞表面CD3来模拟一种TCR信号以在体外进行对T-细胞的刺激。这最终导致进入细胞周期，并且由于对T-细胞的刺激诱导转录因子的激活、基因转录、蛋白合成和蛋白运输，因此，本发明的方法是为了鉴定并跟踪这些生理学过程中的任何异常和任何结果(例如，对刺激的反应差异可以体现于mRNA、蛋白、脂质或其他代谢物水平的差异或者与这些异常相关的比例差异)。
优选地，所述刺激是抗CD3抗体。还可以单独使用其他试剂或将它们与CD3结合使用进行T-细胞的刺激，所述其他试剂例如伊屋诺霉素(ionomycin)和PMA。
本文使用的术语“反应”因此可以指静息T-细胞对所述刺激/激活应答中诱发的反应。这种反应包括增殖、转录因子激活或失活，以及对以下的一种或多种的调节：基因表达、蛋白合成、信号转导、细胞因子合成、蛋白运输和蛋白转换、代谢物或脂质谱。优选地，所述反应包括增殖、对基因表达、蛋白合成和/或蛋白转换的调节。
因此，鉴定取自患有或易患精神障碍的患者的T-细胞样品的反应和未患或不易患精神障碍的正常受试者的刺激反应之间的差异可以用于诊断或监测精神疾病。本发明的方法可以包括比较来自受试者的测试T-细胞样品中的反应和对照中的刺激反应。合适的对照包括源自未患或不易患精神障碍的个体的正常对照，以及源自患有精神障碍(优选精神分裂性障碍)的个体的障碍对照。
本发明的方法可以包括检测所述测试样品和对照样品之间的反应的差异。
因此，本发明的方法可以包括比较测试T-细胞样品的反应和正常对照T-细胞样品的反应，其中反应的差异表明患有或易患精神障碍例如精神分裂性障碍。反应的差异可以被检测为对于刺激的具体反应的存在、不存在、增加或减少。
另外或此外，本发明的方法可以包括比较测试T-细胞样品的反应与精神障碍对照T-细胞样品的反应，以使得所述测试T-细胞的反应匹配于一种特定精神障碍的反应特征的反应；这种比较可用于具有相似或重叠临床症状的精神障碍之间的鉴别诊断。
如实施例2中所示，来自精神分裂症患者的T-细胞与健康对照相比，在刺激后发现有显著较低的增殖。因此，在这些所述反应为增殖反应的实施方案中，来自受试者的T-细胞样品的增殖比正常对照T-细胞样品的增殖低，则表明存在一种精神障碍特别是精神分裂症。如实施例1中所示，增殖的评估可以通过将3[H]-脱氧胸腺嘧啶苷掺入子代细胞DNA来实现。
来自患有或易患精神障碍个体的T-细胞和来自正常个体的T-细胞的反应的差异还可以通过以下方式检测：评估对刺激暴露反应中——优选用于T-细胞增殖的刺激暴露反应中——的基因表达的调节。反应差异的评估还可以通过考虑患有或易患精神障碍的受试者与未患有或不易患精神障碍的正常个体相比的差异基因表达的下游效应而实现，例如代谢谱、脂质谱的差异，或者生物标记水平或比率的差异。
本文使用的术语“调节的”和“调节”的含义是基因表达的上调或下调，或者例如蛋白水平的增加或降低等蛋白质组的差异。基因表达的调节可以通过检测mRNA或蛋白水平的变化测定。蛋白水平的增加或降低可以通过简单地确定蛋白是否存在或者通过使用定量的方法评估。
确定基因表达水平的方法是本领域公知的。根据本发明的方法，表达调节的鉴定可以通过评估mRNA、衍生自mRNA的核酸和从所述mRNA翻译的蛋白的量或浓度来实现。基因表达可以通过评估mRNA水平进行测定，使用的方法包括反转录和聚合酶链式反应(“RT-PCR”)例如定量PCR(特别是实时定量PCR)，以及Northern印迹。在一种适宜于确定mRNA表达水平的方法中，从所述细胞获得总RNA样品，从一个或多个目的基因的mRNA合成cDNA，并且将所述cDNA用于实时定量PCR分析，从而确定目的mRNA在所述样品中的水平。用于实施这些方法的系统和试剂盒可通过市售的途径获得。
阵列可用于评估多个基因或蛋白的表达，例如使用可用于蛋白的SELDI分析的弱阳离子交换(CM10)芯片，或者用于基因表达的CodelinkBioarrays。实施例3中显示了用于评估基因表达的方法的一个实例。
适合于确定蛋白表达水平或者鉴定蛋白生物标记的方法的实例包括免疫学方法，它使用了能够特异性结合目的蛋白的抗体或抗体片段。合适的免疫学方法包括夹心免疫测定，例如，使用两种识别不同表位的抗体检测所述肽的夹心ELISA；放射免疫测定(RIA)、直接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、Western印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(如使用金、银或胶乳颗粒；或磁性颗粒；或Q点(Q-dot))。免疫学方法可以在例如微量滴定板或条状板上进行。
可以用于本发明方法中的、例如用于检测、鉴定和/或定量测定生物标记(如对存在的核酸、蛋白、脂质或代谢物的水平定量)的其他技术包括：谱分析法，例如NMR谱法或高分辨NMR谱法(1H NMR)、质谱例如表面增强激光/解吸电离(SELDI)(-TOF)和/或MALDI(-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、基于LC-MS的技术和iTRAQTM。实施例4中显示了用于蛋白分析的一个实例。
iTRAQTM技术涉及对胰蛋白酶蛋白消化产生的N-端肽进行化学标记。混合最多至4种的标记样品，用纳升-LC(nano-LC)分级分离并通过串联质谱法分析。然后通过片段化数据的数据库搜索完成蛋白鉴定。肽的相对量化通过所述化学标签的片段化实现，这会产生低分子量的报告离子。因为是在胰蛋白酶消化之后标记样品，所以可以分析例如跨膜受体等高分子量蛋白，而且片段化标签的定量可以提供更加可信的蛋白鉴定和定量。
根据本发明，适宜的患者和对照的群组可以选自于初发和/或经最低限度治疗的个体，并且将将他们与有更加确定临床史的慢性疾病患者比较。这使得可以比较疾病发展和药物治疗的效果。膜结合蛋白和可溶蛋白可以从刺激的T-细胞中制备。因此，可以进行来自精神病患者和对照的T-细胞的蛋白组作谱，提供在刺激后关于大分子量和小分子量蛋白(如磷蛋白)差异表达的信息。
本发明的方法可以包括通过评估所述样品的刺激反应中一种或多种生物标记的变化而比较样品。所述术语“生物标记”的含义是一个过程、事件或状态的明显的生物学指示物或生物学衍生指示物。生物标记可以用于诊断(如临床筛选)、预后评估的方法中；用于监测治疗的效果、鉴定最可能对具体疗法有应答的患者、药物筛选和开发中。优选地，所述生物标记是基因、mRNA、蛋白或肽、脂质或者代谢物。所述术语蛋白和肽在本文中可以互换使用。可以对所述生物标记定量。生物标记及其用途对新药物治疗的鉴定以及对于药物治疗的新靶点的发现是有价值的。样品中的生物标记的定量可以包括确定所述肽生物标记在所述样品中的浓度。检测和/或定量测定可以在所述样品上直接进行，或者在其提取物或稀释物上间接进行。检测和/或定量测定可以通过任何适于鉴定具体蛋白在生物样品中的存在和/或在生物样品中的量的方法来进行。
在一个实施方案中，所述对照样品包括一个正常对照样品。在另一个实施方案中，所述对照样品包括一个精神障碍对照样品。在另一个实施方案中，所述方法还可以包括将一个样品增殖反应分类为具有正常谱、精神障碍谱或者易患精神障碍谱。
在本发明的方法中，特别是用于诊断和监测的方法中，T-细胞样品可以在两个或多个时机取自于一个测试受试者。可以比较在两个或多个时机取自一个测试受试者的样品之间的刺激反应以鉴定在不同时机获取的样品的刺激反应之间的差异。方法可以包括分析在两个或多个时机取自一个测试受试者的样品的刺激反应，以对一种或多种生物标记在所述生物样品中的水平定量，以及比较所述一种或多种生物标记在取自两个或多个时期的样品中的水平。
本发明的诊断和监测方法在以下方法中是有用的：精神障碍的预后评估的方法；监测一种给予的治疗物质在患有、疑似患有或易患精神障碍的受试者中的效果的方法；以及鉴定抗精神病或促精神病(pro-psychotic)的物质的方法。这类方法可以包括比较一种或多种生物标记在一个测试受试者的测试生物样品中的水平与在给予所述物质前取自所述测试受试者的一个或多个样品中的水平，以及/或者与在所述物质治疗的早期阶段取自所述测试受试者的一个或多个样品中的水平。另外，这些方法可以包括检测所述一种或多种生物标记在于两个或多个时机取自受试者的生物样品中的水平的变化。
根据本发明的诊断或监测方法可以包括在取自一个测试受试者的测试生物样品中对所述一种或多种生物标记定量，并且比较所述一种或多种生物标记在所述测试样品与在一个或多个对照中的水平。所述对照可以选自正常对照和/或精神障碍对照。本发明的方法中使用的对照可以选自于：来自于正常受试者的正常对照样品中的生物标记水平，即正常生物标记水平；正常生物标记范围，即来自患有精神分裂性障碍、双相型障碍、相关精神障碍或者确诊的易患这些障碍的受试者的样品中的水平；精神分裂性障碍标记水平、双相型障碍标记水平、相关精神障碍标记水平、精神分裂性障碍标记范围、双相型障碍标记范围和相关精神障碍标记范围。
反应差异的检测使得可以鉴定精神障碍的生物标记。所述反应的评估可以通过任何适宜的方法或方法组合来进行，例如通过考虑mRNA和/或蛋白水平的基因表达，来检测障碍和对照样品之间的差异基因表达，可考虑蛋白水平(如在细胞裂解物中)、脂质谱和/或代谢物谱。所述差异可以体现于是否存在一种生物标记，或者生物标记水平或一种或多种生物标记比例的变化(增加或降低)。
基因表达的差异可以通过mRNA或蛋白水平的调节来检测。当所述生物标记为基因时，所述基因在所述障碍样品中的表达与其在所述对照中的表达相比可能是被调节的，因此就可以检测所述基因转录的mRNA的不同水平。例如，所述表达可以增加或降低，或者可以检测所述mRNA的不同剪接变体或者剪接变体的比例。在另一个实施方案中，所述生物标记是一种蛋白，并且所述蛋白在所述样品中的水平不同于其在所述对照样品中的水平。例如，所述水平可以被调节从而增加或降低，或者可以发现蛋白切割产物的差异；这可以通过定量的方法评估或者通过所述蛋白是否存在而确定。
在一个实施方案中检测了一种或多种生物标记的水平或比例。这可以使用传感器例如生物传感器进行，所述生物传感器包含一种或多种酶、结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白、抗体、合成受体或其他选择性结合分子，以用于直接或间接检测所述生物标记。所述传感器为了检测可以偶联至电的、光的、声的、磁的或热的换能器。
在该实施方案中使用的术语“抗体”包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab’)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体，以及上述任何一种的表位结合片段。本文所使用的术语“抗体”还指免疫球蛋白分子(即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。本发明的免疫球蛋白分子可为免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类。
使用本发明的方法鉴定的生物标记可以用作精神障碍或易患精神障碍的生物标记。因此它们在监测或诊断精神疾病的方法中是有用的。
本发明可以用于鉴定用于预防、治疗或改善精神障碍的潜在治疗剂。在一个实施方案中，本发明包括比较刺激反应与对照样品的反应。具体地，可以比较暴露于候选治疗剂的测试T-细胞样品和正常对照的T-细胞样品的反应；如果一种或多种反应在所述测试T-细胞样品中被调节从而恢复正常的反应，那么所述候选试剂就被鉴定为潜在治疗剂。
根据该方面，如果一种候选治疗剂能够调节患有精神障碍受试者T-细胞的反应，特别是使得一种或多种反应恢复为正常个体T-细胞的反应特征，那么就鉴定出该候选治疗剂。优选地，所述反应是增殖或基因表达的调节，后者即mRNA或蛋白水平的变化。所述反应可以使用本文描述的方法评估，具体是通过评估如本文描述的所鉴定的反应的生物标记。增殖的变化可以通过比较存在和不存在所述候选治疗剂时的T-细胞的增殖来评估。一个或多个基因的表达调节可以通过比较存在和不存在所述候选治疗剂时所述一个或多个基因的表达水平(在mRNA水平或蛋白水平)来评估。蛋白水平的调节可以通过比较存在和不存在所述候选治疗剂时所述一种或多种蛋白的水平来评估。其他合适的反应生物标记包括在障碍和正常对照样品中发现不同的水平的脂质和代谢物。
如实施例5所示，通过使用CD28的共刺激可以恢复增殖反应。因此，使用CD28的共刺激可以用作一个恢复增殖反应的对照。使用CD28的共刺激还是一种用于分析精神障碍的病理生理学的有用方法。
上文的详细论述主要是关于T-细胞对刺激的反应。在本发明的第四方面中，刺激不是必需的。相反，用一个对照通过例如鉴定基因表达调节和/或是否存在一种或多种蛋白可以诊断或监测精神障碍。用于该目的的示例方法在上文中有描述。
已经发现的一种改变的转录物是与细胞周期相关的STAT 1，它在精神分裂症患者中是增加的。STAT 1参与细胞因子信号传导并且与转录因子NF κB相互作用。在患者样品中发现RBL2增加和RBL1表达降低，这些样品中的增殖反应显著低。这些基因产物的功能受GSK3B催化的磷酸化的控制，GSK3B也被发现是上调的。
肌动蛋白结合蛋白(dystonin)和异连蛋白(dystrobrevin)基因在精神分裂症患者中的表达有所改变。dystonin作为细胞骨架连接蛋白与肌动蛋白和微管相互作用并且功能是稳定染色体。
还发现CDCL5和NLK在精神分裂症中也有所改变。虽然它们被归为信号转导的类别，但是它们还参与细胞周期的调节。
涉及信号转导的功能通路也是显著改变的。谷胱甘肽过氧化物酶7、硫氧还蛋白2和铁氧还蛋白还原酶出现差异表达，以下蛋白在精神分裂症中的表达有所改变：细胞色素c氧化酶Va亚基(在精神分裂症中上调)、细胞色素b-5(下调)、特定是ACADVL(上调)和ACAD9(下调)。它们是涉及脂肪酸β-氧化的酰基辅酶A脱氢酶，而脂肪酸是在葡萄糖供给不足时被用作替代能量源。通常与红细胞球形细胞增多症相关的细胞骨架元件锚蛋白1和锚蛋白2都是下调的。GADD45A在精神分裂症中被发现是上调的，它与延伸因子1a相互作用并且实际上破坏细胞骨架的稳定性。
在另一方面，本发明涉及一种适合于实施本文所述方法的诊断试剂盒或监测试剂盒。根据本发明的试剂盒可以包含选自于以下的一项或多项组件：该试剂盒的使用说明书，一个或多个正常的和/或精神障碍的对照，一种适宜于和/或适合于检测根据本发明的生物标记的传感器或生物传感器，以及一种配体例如核酸、抗体、适体等，所述配体能够特异性结合根据本发明的生物标记或者特异性结合由所述生物标记衍生或由其作用衍生的物质。所述配体可以通过如下的方式被提供：以例如适合于在本发明方法中使用的阵列形式固定于例如珠粒和表面等固体载体上。
通过以下的实施例举例说明本发明。
实施例1T-细胞的分离
涉及的所有实验在CD3+T-细胞(包括CD4+和CD8+细胞，激活状态都是异质的)上进行。从精神分裂症患者以及年龄、性别和人种匹配的对照的外周血中分离T-细胞。
采用菲科帕克(Ficoll-paque)(Amersham)在50ml管中以750×g离心外周血20分钟以分离外周血单核细胞(PBMC)。使用无菌巴斯德吸管从血浆/Ficoll界面取出PBMC并转移至一个含有PBS的清洁的50ml管中。用PBS将这些细胞洗涤三次，然后用血细胞计数器计数。使用MACS人T-细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)，依照厂商提供的方案从PBMC中纯化T-细胞。然后用RPMI培养基(Sigma)将CD3+T-细胞洗涤两次、计数并以2.5×106细胞/ml的浓度培养于完全T-细胞培养基(RPMI、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺)中。
实施例2T-细胞的体外刺激
仅使用抗CD3(克隆OKT3)进行体外T-细胞刺激。这是最简单的体外刺激方法，由于该抗体的作用是集合TCR的所有组分以产生一个信号。进行了用共刺激进一步探究T-细胞反应的后续实验，其中使用抗CD3+抗CD28、抗CD3+IL-2、抗CD3+PBMC，并且使用了PMA和伊屋诺霉素。
在96-孔圆底组织培养板(Nunc)上用抗CD3体外刺激T-细胞，该培养板用含0、0.01、0.1和1μg/ml OKT3的PBS在37℃包被1小时。用PBS洗涤培养板，然后加入含有0.2×106T-细胞的200μl完全T-细胞培养基。
通过将3[H]-脱氧胸腺嘧啶苷掺入子代细胞DNA中来测定针对刺激的增殖反应。简言之，在CO2培养箱中将T-细胞在37℃下培养48小时，并且用每孔1μCi的3[H]-脱氧胸腺嘧啶苷施予脉冲24小时。将细胞收集到96孔滤板上以获取标记的DNA，并且将荧光闪烁液用于测定3[H]-脱氧胸腺嘧啶苷的掺入。
从精神分裂症患者获取T-细胞。所述患者包括慢性的氯氮平治疗的患者，即已经接受氯氮平治疗数年的患者；最低限度治疗的患者，即接受非氯氮平治疗不足2个月或者未接受治疗的患者；以及未治疗的、近期确诊的精神分裂症患者。所有患者的增殖反应在每种抗CD3浓度下都显著低于对照。这不仅提供了可以在外周组织中观察到精神分裂症患者和对照之间的外周差异的证据，而且还给出一个用于动态研究细胞机能障碍在该障碍中的作用的模型。
实施例3Codelink基因阵列分析
从3×106个新分离的T-细胞和在1μg/ml的抗CD3的存在下培养24小时的细胞制备患者和对照样品。
使用QIAamp RNA血液小量试剂盒(Qiagen)从这些样品中提取总RNA。使用Agilent芯片实验室(lab-on-a-chip)纳米芯片检查RNA质量，并且使用Nanodrop系统定量。
使用Codelink表达生物阵列系统(Codelink Expression BioarraySystem)，依照厂商提供的说明并使用推荐的试剂处理RNA，以用于与Codelink基因阵列芯片杂交。简言之，将1μg总RNA用于第一链合成，并且在第二条链合成之后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化双链cDNA。使用所述试剂盒中提供的体外转录试剂进行生物素标记的cRNA的合成，然后用RNeasy小量试剂盒(Qiagen)纯化。使用Nanodrop系统测定cRNA浓度并且使用Agilent芯片实验室检查cRNA的质量。依照厂商提供的方案将10μg生物素标记的cRNA杂交于Codelink阵列芯片。洗涤芯片并使用GenePix Personal 4100A微阵列扫描仪扫描。
实施例4差异蛋白表达
在24孔组织培养板(Nunc)中以2.5×106细胞/ml的密度培养细胞48小时。然后将细胞转移至1.5ml的Microfuge管中并在用PBS洗涤一次后保存于-80℃。将5×106细胞/样品裂解于250μl包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏完全抑制剂混合液(Roche complete inhibitor cocktail)、原钒酸盐、焦磷酸盐、磷酸甘油、NaF)的结合缓冲液(9M尿素、50mM HEPES、2％CHAPS，pH7)中。将样品涡旋5秒钟，然后置于冰上裂解10分钟。再次涡旋样品并且在4℃下以13,000rpm离心5分钟以去除细胞碎片。使用上文描述的pH7结合缓冲液，依照厂商提供的方案将40μl等份的每个样品加到Ciphergen CM10弱阳离子交换芯片上。使芯片风干并且在每个点加入1.2ml芥子酸(SPA)，然后用ProteinChip Reader分析。
为了鉴定在组之间有差异的峰进行了特征提取和分类过程。所述特征提取由4步组成：峰鉴定、峰对齐、开窗口和定量。峰鉴定涉及确定出现衍生物变化的位点。峰对齐需要鉴定在所有谱中都存在的最大峰。使所述谱整体移位使得这个峰在所有谱出现在相同的位点上。这解释为由校准移位产生的整体移位。
开窗口的进行是通过在每个峰周围居中定制一个窗口。重叠误差通过以下途径解释：考虑重叠窗口的组，然后鉴定该区域内的最大峰，在该峰周围居中定制一个窗口，然后在两个方向上放置其他的窗口直至覆盖原来区域。最后，对每个窗口进行梯形积分并且这些值的集合被作为特征集。分类可以通过多种标准技术例如线性判别分析、判别树、boosting算法、支持向量机或人工神经网络进行。在本实例中进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)以鉴定那些在组之间显著不同的峰。PLS-DA分析使患者和对照组完全分开。
使用该方法鉴定了几个在患者和对照组之间以及在患者和对照反应之间差异表达的峰。使用两种方法进行蛋白的鉴定。对于4kDa和小于4kDa的峰，使用SELDI MS MS直接进行测序。大于4Kda的蛋白的鉴定通过凝胶电泳和LC MS MS测序进行。对细胞裂解物进行初始的疏水性蛋白或阳离子蛋白的分级分离以简化蛋白组成。
用10％ACN/0.1％TFA平衡50μl PLRP-S反相珠粒(Polymer实验室)，离心并去除上清，同时将按上述制备的T-细胞裂解物调节为在400μl体积中含有浓度为10％ACN、0.1％TFA，并将其加至PLRP-S珠粒。在室温下置于旋转器上使蛋白与珠子结合30分钟。然后将样品以5000rpm离心1分钟并去除上清，然后在10％ACN、0.1％TFA中洗涤3次。去除上清并且用400μl含20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％ACN的0.1％TFA连续洗脱蛋白级分。将每个级分收集至1.5ml的Microfuge管中并且使用NP20芯片依照厂商提供的方案取2μl作谱以得到需要的峰。
根据所需峰的表达选择级分，并且收集这些级分并在30℃下用Speedvac中浓缩2个小时直至完全干透。对组分进行非变性凝胶电泳；将所需分子量的条带切下、经胰蛋白酶消化过夜并进行LC MS MS测序。
通过在4℃下将T-细胞裂解液(如前述)加到CM10柱(Ciphergen)上过柱2个小时将阳离子蛋白分级。这样可以特异性结合使用CM10芯片(Ciphergen)初始作谱的蛋白。使用裂解缓冲液洗涤柱两次以去除未结合的蛋白，同时使用pH11的裂解缓冲液洗脱所需蛋白。使用截留分子量为5KDa的离心柱(spin column)将缓冲液更换成50mM的Tris pH7。在30℃下用Speed vaG浓缩洗脱液2个小时直至完全干透，并且在非变性SDS-PAGE凝胶上根据分子量分离所需蛋白。将所需分子量的条带切下、经胰蛋白酶消化过夜并进行LC MS MS测序。
实施例5共刺激
还通过加入10ng/ml IL-2、抗CD28和PBMC对T-细胞进行共刺激，目的是为了确定使用更加复杂的刺激方法能否恢复增殖反应。将它们直接加入到上文所述的在经抗CD3包被的板中培养的T-细胞中。考虑到PBMC中有70％CD3+T-细胞，通过将PBMC(通过上文所述的采用菲科帕克的离心法分离)以0.2×106细胞/ml的浓度孵育在抗CD3包被的孔中，测试在存在B细胞和单核细胞抗原呈递细胞上的所有共刺激分子时T-细胞的抗-CD3刺激。还测试了T-细胞激活的下游通路，该测试是通过用分别直接激活PKC和钙流的50ng/ml乙酰肉豆蔻酸佛波酯(phorbol myristateacetate，PMA)和500ng/ml伊屋诺霉素刺激培养物进行。这也是在96孔板上以200μl的体积进行的。在体外共刺激之后测定了如上文所述的T-细胞增殖。
用抗CD3和抗CD28共刺激的患者的T-细胞反应与健康对照的反应相比没有发现显著的不同，这说明通过CD28的共刺激可以恢复患者的反应。实施例6
样品收集
外周血取自氯氮平治疗的、满足精神分裂症诊断的DSM-IV标准的慢性疾病患者和确诊为精神分裂症的、以最低限度治疗的患者(经过少于4周的治疗或者没有接受药物治疗)。血液还取自初次精神病发作的未用药的患者，其表现出符合精神分裂症最终诊断的临床症状。同步处理取自与每个患者的年龄、性别和人种匹配的对照的血液。人口统计学详细信息示于表1中。
表1
Figure A20068005180200201
T-细胞分离
从精神分裂症患者以及年龄、性别和人种匹配的对照的外周血中分离CD3+T-细胞。简言之，使用含有EDTA的S-monovette血液收集系统(Sarstedt)取外周血。采用菲科帕克(Amersham Biosciences，Amersham，UK)通过离心分离单核细胞(PBMC)，然后使用MACS人全T细胞(pan T-cell)分离试剂盒结合LS分离柱(Miltenyi Biotech，UK)通过负选择从中纯化CD3+全T-细胞。通过流式细胞术(FACS Calibur，Becton Dickinson)分析CD3-ε的表达时T-细胞的纯度通常在99％以上。需要指出，在37℃下在含10％的胎牛血清和1％的青霉素、链霉素和谷氨酰胺(Sigma，UK)的RPMI培养基中培养细胞。
T-细胞增殖
通过将3H-脱氧胸腺嘧啶苷掺入子代细胞DNA中测定对刺激的增殖反应。在包被有0、0.01、0.1和1μg/ml抗CD3(克隆OKT3)的96孔板中以2×105细胞/ml的接种密度培养T-细胞48小时，以刺激其进入细胞周期。用每孔0.037MBq(1μCi)的3H-脱氧胸腺嘧啶苷(AmershamBiosciences，UK)对细胞施予脉冲继续24小时使之掺入DNA中，将细胞收集到96孔滤板(Perkin Elmer)上以获取标记的DNA。使用闪烁计数器(Top Count，Packard)测定标记的DNA，从而测定增殖。使用非参数曼-惠特尼U检验确定统计显著性，P-值小于0.05被认为具有显著性。
CD3在患者和对照T-细胞上的表达分析
在存在或不存在1μg/ml的板结合的抗CD3时培养患者和对照T-细胞72小时。对细胞计数并且用FACS缓冲液洗涤5×105细胞/样品3次(PBS，2％的胎牛血清，Sigma，UK)，并重新悬浮于100μl的含有缀合有Cy5的抗CD3的FACS缓冲液中。在4℃孵育细胞20分钟后再用FACS缓冲液洗涤。使用FACS Caliber and Cell Quest软件(BD Bioscinces，UK)进行细胞计数。使用WinMDI(Purdue University，Indiana)和Flowio(Treestar)分析数据。使用曼-惠特尼U检验确定统计显著性。
T-细胞基因表达的微阵列分析
使用CodeLinkTM人全基因组生物阵列(GE Healthcare，UK)研究了来自6个最低限度治疗的精神分裂症患者和6个年龄、性别和人种相匹配的对照的T-细胞之间的差异基因表达。使用QIAamp RNA血液小量试剂盒(Qiagen，UK)从新分离的T-细胞中提取总RNA并且用高分辨率电泳系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)评估其质量。依照厂商提供的方案从每个样品生成生物素标记的cRNA。使cRNA杂交至CodeLink全基因组微阵列芯片上，洗涤并且使用Cy5-链霉亲和素(Ameraham，UK)检测已杂交的cRNA种类。使用GenePix Personal 4100A微阵列扫描仪(Axon Instruments)扫描芯片并且用CodeLink表达分析软件分析芯片。
微阵列数据的预处理和标准化
首先过滤探针组以仅包括那些信号强于背景噪声水平的探针组，使用的严格标准是探针必须在所述实验的所有芯片上都被Codelink软件标记为“好(good)”。这将分析中包括的探针数量从54000减少到12416。这些探针的点平均信号强度被读入R统计程序(http://www.r-project.org/)中进行进一步的分析，如果适合则使用Bioconductor(1)软件包。使用“分位数(quantile)”方法(2)将数据标准化并且进行质量控制(QC)流程以鉴定异常值的芯片。它们包括：所有芯片标准化表达值的两两相关性的分析、所有芯片标准化表达值的盒形图和每个芯片与一个伪中值芯片的比较。一个异常值被鉴定并在以后的分析中被去除。然后重新将剩余的样品标准化。
新分离的T-细胞中的差异表达基因的检测
使用Limma软件包(对微阵列数据用线性模型)在患者和对照之间进行成对t-检验以鉴定差异表达(2，3)。用“q值(qvalue)”软件包(4)对多次测试进行校正，q小于0.05的探针被认为是差异表达的。
显著改变的转录物的功能作谱
使用Onto-Express进行通路分析以表征与对照相比精神分裂症患者的新分离T-细胞中显著改变的基因。首先使用Onto-Translate(5)将显著的探针组对映到相应的Entez ID，并且将该输出提交到Onto-Express。以Codelink人全基因组作为参照阵列使用缺省设置。选择校正的p小于0.05并且含有多于2个基因的生物过程类别作为所述疾病状态中受影响的最重要的通路。
染色体作图
使用一种内部的算法进行染色体作图和分析，该算法最初是为在Affymetrix数据上使用而设计的。因此首先使用Onto-Translate(5)将Codelink探针ID对映到Affymetrix探针ID。该分析的主要步骤是：(i)为每个基因选择一个代表性的探针组，将探针组对映到其对齐区域并且如果该区域与该靶基因的位置不符就去掉该探针组；(ii)使用滑动窗口在基因组上评估差异表达的基因的分布；(iii)根据二项式分布为每个窗口赋一个分值，从而使高分值对应于包含过多差异表达基因的区域；(iv)鉴定具有高比例差异表达基因的染色体区域，这些区域可能具有生物学显著性。
对抗CD3刺激的增殖反应在精神分裂症患者中显著较低
采用3H-脱氧胸腺嘧啶苷掺入法测定来自39个患者和32个对照的、用0、0.01、0.1和1μg/ml抗CD3处理的外周血T-细胞的增殖。使用非参数曼-惠特尼U检验分析时，发现精神分裂症患者对于所有浓度抗CD3的刺激都具有显著更低的反应(0.01μg/ml CD3抗体p＝0.0007、0.1μg/ml CD3抗体p＝0.001、1μg/ml抗CD3p＝0.001)。这些样品取自于抗精神药物治疗的慢性患者、最低限度治疗的患者、未接受药物治疗的个体和初次精神病发作的未用药的患者的组合。为了排除增殖反应的降低是药物效应的可能性，分别测试了未用药的和最低限度治疗的个体中的变化。以相同的方法对11个未治疗/最低限度治疗的患者和12个匹配的对照进行刺激，并测定3H-脱氧胸腺嘧啶苷的掺入，以下两个浓度的抗CD3的刺激也显示了较低的增殖反应：0.1μg/ml(p＝0.034)和1μg/ml(p＝0.034)。
精神分裂症T-细胞中较低的增殖反应不是较低CD3表达的结果
使用缀合有Cy5的抗CD3ε抗体在刺激之前和之后测定来自患者和对照的T-细胞中的CD3表达。未刺激的T-细胞和用抗CD3处理的T-细胞上的CD3表达在患者和对照之间都没有显著差异，这说明患者较低的增殖反应不是较低CD3表达的结果。
来自精神分裂症患者和匹配对照的新分离T-细胞中差异表达基因的分析
抗CD3刺激的T-细胞增殖反应可以受多种因素的影响。T-细胞激活中涉及的过程包括细胞信号传导、基因转录、蛋白合成和运输、细胞周期进入和细胞因子分泌。它们中任一种的功能障碍都可能导致观察到的患者较低的增殖反应。最初进行了初步研究以考察上游信号传递，即用抗CD3刺激T-细胞后的5分钟。该研究是通过使用针对总磷酸酪氨酸而产生的抗体对T-细胞裂解液进行Western印迹分析。酪氨酸磷酸化模式在患者和对照之间没有出现明显差异，说明产生低增殖反应的缺陷存在于T-细胞刺激之后的下游事件。在T-细胞刺激后也研究了细胞因子——具体而言，是驱动T-细胞增殖的IL-2——的产生，它在患者和对照之间没有显示出显著的差异(文稿准备中)。将CodeLinkTM人全基因组微阵列用于对来自患者和对照的外周血T-细胞中的基因表达作谱，目的是鉴定可能导致患者中较低增殖反应的改变的基因表达。
在杂交和扫描后过滤数据集以使其仅包括那些在所有为阵列芯片上都被标记为“好”或都存在的基因。然后将成对t-检验用于鉴定显著性差异表达的基因，在多重检验校正后得到399个q小于0.05的显著的探针。在精神分裂症中320个(80％)探针降低，79个增加。
显著改变的转录物的功能作谱
将OntoExpress用于对被显著改变的基因指定功能类，并且用于鉴定在显著的基因的列表中过表达的通路。该项分析发现5个与细胞周期相关的显著的类，包括细胞周期(p＝0.0005)、细胞周期阻滞(p＝0.0007)、细胞周期负调控(p＝0.001)、有丝分裂(p＝0.005)和细胞周期调控(p＝0.039)(表2)。
与细胞周期相关的类在新分离的未刺激T-细胞中是显著改变的。许多涉及细胞周期进程控制的转录物被发现是失调的；它们包括STAT1、RBL1(p107)、RBL2(p130)、Cu12和GADD45A，其在本研究中被发现是上调的，它是细胞周期检查点基因，在UV损伤(6)后负责G2/M进程的停滞。
通过功能作谱鉴定了涉及胞内信号传导的4个类，它们可能通过影响上游通路干扰抗CD3的增殖反应。胞内信号传导是细胞的最基本的功能，对包括能量利用、生长因子响应和神经递质信号传导在内的大部分细胞过程是至关重要的。与细胞信号传导相关的4个通路是信号转导(p＝0.0009)、细胞-细胞信号传导(p＝0.012)、蛋白氨基酸磷酸化(p＝0.015)、胞内信号传导级联(p＝0.050)。见表3。
其他显著改变的信号传导转录物为CDC2L5和NLK(分别下调1.42倍和1.54倍)。它们也都与细胞周期相关。
MAP2K1的转录物在精神分裂症患者中下调1.37倍。在T-细胞刺激中，通过T-细胞受体(TCR)的激活最终导致基因转录和增殖，涉及MAPK等许多信号传导通路的交互联络并激活IL-2基因转录和蛋白激酶C家族(PKC)的成员。新PKC家族的两个成员PKCθ和PKCε的激活需要DAG而非钙，它们在精神分裂症中分别上调1.24倍和下调1.47倍。
OntoExpress显示被显著改变的其他类包括：对氧化应激的反应(p＝0.0003)、电子传递(p＝0.001)和代谢(p＝0.013)。见图4。这些功能类的成员显示了在精神分裂症患者T-细胞中表达下调的倾向。总的来说，80％的转录物被下调，这影射出来自前额皮质死后脑研究的蛋白表达中的变化，显示了与线粒体和氧化应激(9)相关的蛋白主要是下调的。
抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶7、硫氧还蛋白2和铁氧还蛋白还原酶的表达增加。硫氧还蛋白还原酶2被观察到下调。蛋氨酸亚砜还原酶的下调也被鉴定。它是一种蛋白修复酶，负责还原蛋白中氧化的蛋氨酸侧链，这可能损害正常功能。抗氧化剂和自由基捕获剂表达的改变可以作为氧化应激的指示。
被显著改变的转录物的染色体位置
为了进一步了解精神分裂症患者和对照之间基因表达的差异，生成了一个热图，显示出了差异表达基因的染色体位置。在患者和对照的新分离的T-细胞中显著变化的基因簇被鉴定在染色体区域1p36、1q42、4q12、6p22、9q22和10q26。1p36、1q42和6p22是精神分裂症(OMIM)的强敏感位点。
实施例7
在本实施例中，在15个精神分裂症患者和15个匹配的健康对照上进行了T-细胞的SELDI蛋白质组作谱。从未刺激的T-细胞制备裂解液并且将抗CD3刺激的T-细胞培养48小时，以比较各自的反应。
使用具有弱阳离子交换表面的CM10芯片对裂解液作谱。使用很严格的结合条件(9M尿素、50mM HEPES、2％CHAPS，pH7)。这确保了在pH7下仅结合强阳离子的蛋白(在较低pH下严格度降低)。这仅能够研究一小部分的蛋白质组但是会增加蛋白鉴定的可能性。
PCA分析显示了能够将对照组和患者组区分开的差异表达的峰。它们包括(括号内显示可能的产物)：3242Da(＝组蛋白1.4)、3450Da(＝α防卫素1)、3374Da(＝α防卫素1)、10918Da、13791Da和6700Da。
按如下进行峰鉴定：
·＜4KDa，直接进行芯片测序SELDI TOF TOF(Ciphergen CA)
·＞4KDa，用LC MS MS测序
为了进行LC MS MS鉴定，大的蛋白必须进行蛋白水解处理。因为这会生成每种蛋白的肽混合物，所以为了将肽关联回原来的蛋白，需要很简单的蛋白混合物。
已知防卫素含有3个二硫键。使用10mM DTT可以观察到几乎完全还原以及一个6KDa的移位证实了这一点。
表2
细胞周期
GO ID/基因缩写         功能名称/基因名                           变化倍数      校正的P-值/Q值
GO：0007049            细胞周期                                                4.88E-04
CNAP1                  染色体凝聚相关SMC关联蛋白1                1.37          0.04325882
RBL2                   视网膜母细胞瘤样2(p130)                   1.30          0.047737
CUL2                   清选蛋白2(cullin 2)                       1.22          0.04954768
FHIT                   脆性三联组氨酸基因                        -1.40         0.0195903
RAD21                  RAS21同源物(裂殖酵母(S.prombe))           -1.40         0.02232591
RFP2                   RET指蛋白2                                -1.27         0.03579506
HDAC4                  组蛋白脱乙酰酶4                           -129          0.04053407
STAG1                  基质抗原1                                 -1.38         0.04954768
GO：0007050            细胞周期阻滞                                            7.35E-04
GADD45A                生长抑制和DNA损伤诱导基因，α             1.24          0.03725377
CUL2                   清选蛋白2                                 1.22          0.04954768
DST                    肌动蛋白结合蛋白                          -1.43         0.02410388
NOTCH2                 Notch蛋白同源物2(果蝇(Drosophila))        -1.35         0.03160771
GO：0045786            细胞周期负调控                                          0.001112006
RBL2                   视网膜母细胞瘤样2(p130)                   1.30          0.047737
RBL1                   视网膜母细胞瘤样1(p107)                   -1.51         0.01947636
FHIT                   脆性三联组氨酸基因                        -1.40         0.0195903
RFP2                   RET指蛋白2                                -1.27         0.03579506
GO：0007067            有丝分裂                                                0.005256724
CNAP1                  染色体凝聚相关SMC关联蛋白1                1.37          0.04325882
RAD21                  RAD21同源物(裂殖酵母)                     -1.40         0.02232591
STAG1                  基质抗原1                                 -1.38         0.04954768
GO：0000074            细胞周期调控                                            0.038588133
STAT1                  信号转导子与转录激活因子1，91kDa          1.33          0.02410388
MPHOSPH9               M期磷蛋白9                                1.26          0.04843986
PGF                    胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关蛋白    1.28          0.02723825
表3
胞内信号传导
GO ID/基因缩写        功能名称/基因名                                  变化倍数         校正的P-值/Q值
GO：0007165           信号转导                                         1503             9.13E-04
OR7E35P               嗅觉受体，家族7，亚家族E，成员35假基因           1.28             0.02272425
BRE                   脑和生殖器官表达(TNFRSF1A调制因子)               122              0.03893557
FEZ2                  成束和延伸蛋白ζ2(椎骨蛋白(zygin)II)             1.35             0.03933328
MGST2                 微粒体谷胱甘肽S-转移酶2                          1.36             0.04987676
SAMHD1                SAM结构域和HD结构域1                             -1.36            0.01947636
DTNA                  异连蛋白，α                                     -1.42            0.02225044
NPAS2                 神经元PAS结构域蛋白2                             -1.28            0.02232591
MRGPRX3               MAS相关的GPR，成员X3                             -1.33            0.02272425
GNAQ                  鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，q多肽               -1.41            0.02353237
ALCAM                 活化白细胞粘附分子                               -1.52            0.02465963
PGF                   胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关蛋白           -1.28            0.02723825
ANK1                  锚蛋白1，红细胞///锚蛋白1，红细胞                -1.26            0.03052377
CCL5                  趋化因子(C-C基序)配体5                           -1.38            0.03579506
ITPR1                 肌醇-1，4，5-三磷酸受体，I型                     -1.27            0.03893557
ANK2                  锚蛋白2，神经元                                  -3.03            0.04325882
GNB1                  鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，β多肽1             -1.26            0.04325882
CARD4                 半胱天冬酶募集域家族，成员4                      -1.35            0.04551593
MAP2K1                丝裂原活化蛋白激酶激酶1                          -1.37            0.04880499
GO：0007267           细胞-细胞信号传导                                331              0.011641152
MGST2                 微粒体谷胱甘肽S-转移酶2                          1.36             0.04987676
DLGAP1                Discs，大(果蝇)同源物关联蛋白1                   -1.42            0.019476
DHH                   沙漠猬(desert hedgehog)同源物(果蝇)              -1.43            0.02030222
PGF                   胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关蛋白           -1.28            0.02723825
CCL5                  趋化因子(C-C基序)配体5                           -1.38            0.03579506
GO：0006468           蛋白氨基酸磷酸化                                 628              0.015267307
PRKCQ                 蛋白激酶C，θ                                    1.24             0.03933328
GSK3B                 糖原合酶激酶3β                                  1.22             0.04116277
PTK2                  PTK2蛋白酪氨酸激酶2                              -1.46            0.01947636
NLK                   nemo样激酶                                       -1.54            0.02232591
PRKCE                 蛋白激酶C，ε                                    -1.47            0.02710819
CDC2L5                细胞分裂周期2样5(胆碱脂酶相关细胞分裂调控因子)   -1.42            0.03124629
MAP2K1                丝裂原活化蛋白激酶激酶1                          -1.37            0.04880499
GO：0007242           胞内信号传导级联                                 451              0.049500096
STAT1                 信号转导子与转录活化因子1，91kDa                 1.33             0.02410388
PRKCQ                 蛋白激酶C，θ                                    1.24             0.03933328
PRKCE                 蛋白激酶C，ε                                    -1.47            0.02710819
USH1C                 乌谢尔综合症1C(常染色体隐性，重度)               -1.20            0.04752731
表4
氧化应激
GO ID/基因缩写           功能名称/基因名                                变化倍数          校正的P-值/Q值
GO：0006979              对氧化应激的响应                                                 2.73E-04
GPX7                     谷胱甘肽过氧化物酶7                            1.31              0.03486197
MSRA                     蛋氨酸亚碉还原酶A                              -1.31             0.02934341
CCL5                     趋化因子(C-C基序)配体5                         -1.38             0.03579506
C10ori120                染色体10开放阅读框120                          -1.30             0.03803029
GO：0006118              电子传递                                                         9.89E-04
TXN2                     硫氧还蛋白2                                    1.29              0.02465963
FDXR                     铁氧还蛋白还原酶                               1.26              0.0319924
COX5A                    细胞色素C氧化酶亚基Va                          1.23              0.03933328
ACADVL                   酰基辅酶A脱氢酶，极长链                        1.20              0.04953246
ACAD9                    酰基辅酶A脱氢酶家族，成员9                     -1.41             0.01947636
CYB5                     细胞色素b-5                                    -1.22             0.03586909
TXNRD2                   硫氧还蛋白还原酶2                              -1.39             0.03799082
ERO1LB                   ERO1样β(酿酒酵母)                             -1.35             0.04342341
GO：0008152              代谢                                                             0.013130081
QDPR                     醌式二氢喋啶还原酶                             1.25              0.03339055
HSDL2                    羟基类固醇脱氢酶样2                            1.25              0.03636975
CBR1                     碳酰还原酶1                                    1.28              0.047737
CDYL                     染色质域(chromodomain)蛋白，Y样                1.24              0.04979975
ATP8A1                   ATP酶，氨磷脂转运体(APLT)，1类，8A型，成员1    -1.37             0.02232591
ANK2                     锚蛋白2，神经元                                -3.03             0.04325882
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Claims (63)

1.一种诊断或监测一个受试者的精神障碍的方法，包括：
a.提供一个来自所述受试者的测试T-细胞样品；
b.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；以及
c.评估对所述刺激的反应。
2.根据权利要求1的方法，还包括比较所述反应与一个对照样品中的刺激反应。
3.根据权利要求2的方法，其中所述对照样品包括精神障碍对照T-细胞样品。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述对照样品包括正常T-细胞对照样品。
5.根据权利要求4的方法，包括检测所述测试T-细胞样品和所述正常对照T-细胞样品之间的反应的差异。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析T-细胞增殖。
7.根据权利要求4-6的方法，其中所述测试T-细胞样品与一个正常对照T-细胞样品相比具有较低的增殖时，指示存在或易患一种精神障碍。
8.根据权利要求2-7任一项的方法，还包括将一个测试样品反应分类成具有正常谱、精神障碍谱或者易患精神障碍谱。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析基因表达。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析mRNA和/或蛋白和/或酶活性。
11.根据权利要求10的方法，其中通过RT-PCR或QRT-PCR分析mRNA。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析脂质和/或代谢物谱。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括通过一种选自于以下的方法的分析：iTRAQ、质谱、SELDI(-TOF)和/或MALDI(-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、基于LC-MS的技术、无标记定量LC-MS/MS、一种免疫学技术和NMR。
14.根据权利要求6-13任一项的方法，其中所述分析是定量的。
15.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述刺激是对T-细胞增殖的刺激。
16.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述刺激是一种抗CD3抗体。
17.一种精神障碍的预后评估或诊断的方法，包括一种根据前述权利要求任一项的方法。
18.一种监测一种治疗物质在患有、疑似患有或者易患精神障碍的受试者中的效果的方法，包括一种根据前述权利要求任一项的方法。
19.一种鉴定精神障碍的生物标记的方法，包括：
a.提供来自一个患有精神障碍的受试者的一个测试T-细胞样品；
b.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；
c.评估对所述刺激的反应；
d.将所述反应与一个对照T-细胞样品对刺激的反应相比较；以及
e.检测所述反应之间任何的差异从而鉴定一种生物标记。
20.根据权利要求19的方法，其中所述刺激是一种对T-细胞增殖的刺激。
21.根据权利要求19或权利要求20的方法，其中所述刺激是抗CD3抗体。
22.根据权利要求19-21任一项的方法，其中所述测试T-细胞样品来自于患有一种第一精神障碍的受试者，所述对照T-细胞样品来自于患有一种第二精神障碍的受试者。
23.根据权利要求19-22任一项的方法，其中所述对照T-细胞样品来自于一个正常受试者。
24.根据权利要求19-23任一项的方法，其中所述评估包括分析基因表达。
25.根据权利要求24的方法，其中基因表达差异的检测是通过鉴定所述测试样品与所述对照样品之间的差异基因表达来进行。
26.根据权利要求24或权利要求25的方法，其中所述差异是一个基因在所述测试样品中的表达比所述基因在所述对照样品中的表达低。
27.根据权利要求24-26任一项的方法，其中所述差异是一个基因在所述测试样品中的表达比所述基因在所述对照样品中的表达高。
28.根据权利要求24-27任一项的方法，其中所述差异被检测为mRNA和/或蛋白和/或酶活性水平的调节。
29.根据权利要求19-28任一项的方法，其中所述评估包括基因表达或蛋白水平的定量分析。
30.根据权利要求24-29任一项的方法，其中通过RT-PCR或QRT-PCR分析所述基因表达。
31.根据权利要求24-30任一项的方法，其中使用一个阵列评估基因表达。
32.根据权利要求19-31任一项的方法，其中所述评估包括通过一种选自于以下的方法的分析：iTRAQ或质谱、NMR、SELDI(-TOF)和/或MALDI(-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、基于LC-MS的技术、无标记定量LC-MS/MS、一种免疫学技术和NMR。
33.一种测试一种用于治疗精神障碍的潜在试剂的方法，所述方法包括：
a.提供来自一个患有精神障碍的受试者的一个测试T-细胞样品；
b.将所述测试T-细胞样品与一种候选试剂相接触；
c.给予所述测试T-细胞样品一种刺激；以及
d.评估对所述刺激的反应。
34.根据权利要求33的方法，还包括比较所述反应与一个对照样品中的刺激反应，并且如果在所述测试样品中的反应被调节，那么所述候选试剂被鉴定为潜在治疗剂。
35.根据权利要求34的方法，其中所述对照样品包括精神障碍样品。
36.根据权利要求34或权利要求35的方法，其中所述对照样品包括正常对照样品。
37.根据权利要求33-36任一项的方法，其中所述刺激是对T-细胞分化的刺激。
38.根据权利要求33-37任一项的方法，其中所述刺激是抗CD3抗体。
39.根据权利要求33-38任一项的方法，其中所述反应包括T-细胞增殖。
40.根据权利要求39的方法，其中所述T-细胞增殖的评估是通过将3[H]-脱氧胸腺嘧啶苷掺入子代细胞DNA中来实现。
41.根据权利要求39或权利要求40的方法，其中所述评估包括分析一种或多种蛋白的水平。
42.根据权利要求33-41任一项的方法，其中所述反应包括基因表达的调节。
43.根据权利要求42的方法，其中所述评估包括RT-PCR或QT-PCR。
44.根据权利要求33-43任一项的方法，其中所述评估包括分析是否存在一种或多种蛋白或酶活性。
45.根据权利要求33-44任一项的方法，其中所述反应响应于所述候选剂处理而恢复至正常。
46.一种诊断或监测一个受试者中的精神障碍的方法，包括：
a.提供一个来自所述受试者的测试T-细胞样品；以及
b.比较所述测试样品与一个对照样品中的基因和/或蛋白表达。
47.根据权利要求46的方法，其中所述对照样品包括精神障碍对照T-细胞样品。
48.根据权利要求46或权利要求47的方法，其中所述对照样品包括正常T-细胞对照样品。
49.根据权利要求46-48任一项的方法，包括检测所述测试T-细胞样品和所述正常对照T-细胞样品之间的反应的差异。
50.根据权利要求46-49任一项的方法，还包括将一个测试样品的反应分类为具有正常谱、精神障碍谱或者易患精神障碍谱。
51.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析基因表达。
52.根据权利要求51的方法，其中所述基因如表2-4的任一个中所示。
53.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述评估包括分析mRNA和/或蛋白和/或酶活性。
54.根据权利要求53的方法，其中通过RT-PCR或QRT-PCR分析mRNA。
55.根据权利要求53的方法，其中所述蛋白是在以下处显示出峰的一种或多种蛋白：3242、3450、3374、10918、13791和6700Da。
56.根据权利要求46-55任一项的方法，其中所述评估包括分析脂质和/或代谢物谱。
57.根据权利要求46-56任一项的方法，其中所述评估包括通过一种选自于以下的方法的分析：iTRAQ、质谱、SELDI(-TOF)和/或MALDI(-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、基于LC-MS的技术、无标记定量LC-MS/MS、一种免疫学技术和NMR。
58.根据权利要求51-57任一项的方法，其中所述分析是定量的。
59.一种精神障碍的预后评估的方法，包括一种根据权利要求46-58任一项的方法。
60.一种监测一种治疗物质在患有、疑似患有或者易患精神障碍的受试者中的效果的方法，包括一种根据权利要求46-58任一项的方法。
61.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述精神障碍是精神分裂性障碍。
62.根据权利要求61的方法，其中所述精神分裂性障碍选自于：偏执型、紧张型、错乱型、混合型和残留型精神分裂症。
63.根据权利要求1-60任一项的方法，其中所述精神障碍是双相型障碍。
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