CN1571848A - 2型糖尿病蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然存在的化合物及其衍生物作为糖尿病相关疾病易感性的标记物的应用。本发明也涉及用于糖尿病相关疾病治疗的一种药物组合物。

Description

2型糖尿病蛋白质
发明领域
本发明涉及用于诊断和预测糖尿病相关疾病易感性的方法以及用于治疗这些疾病的药物组合物。
发明背景
临床上糖尿病分为胰岛素依赖型和胰岛素非依赖型糖尿病[分别为IDDM(1型)和NIDDM(2型)]。这两类疾病具有许多不同的特征。
1型糖尿患者有很严重的胰岛素缺陷，以至于不能维持很低水平的胰岛素以正常防止脂肪分解和细胞生成。因此1型糖尿患者一般显示出高水平的葡萄糖和低水平的胰岛素。随着该疾病的发展，胰岛受损或被破坏，而胰岛素生成越来越少。
2型糖尿病是一种常见并复杂的病症，其源于胰岛素分泌缺陷以及在周围组织，例如骨骼肌肉(1)中胰岛素敏感性受损(胰岛素抗性)的联合作用。2型糖尿病表现为在空腹和饱食后的高血糖症，不同程度的高血胰岛素症和肥胖症。尽管在过去的十年中对胰岛素信号传导通路上的蛋白质进行了彻底的研究，但是原代细胞的原因仍然不明。最近的研究报告显示：2型糖尿患者肌肉具有降低的氧化酶活性(2)，线粒体DNA的突变通过损伤氧化磷酸化导致2型糖尿病(3，4)，加剧了该疾病在分子水平上的复杂性。
现行的治疗方法包括食物控制、服用磺酰脲以提高胰岛素分泌、服用胰岛素本身以及服用缩二胍以降低胰岛素抗性。由于缩二胍有毒、而磺酰脲对那些胰岛功能严重受损的患者没有效果，而且治疗十年后50％的患者产生抗性，因此，有必要研制一种新型的抗糖尿病药物。
为了确定糖尿病的易感性，已经采用许多策略。在专利WO 00/66762中(在此引为参考文献)，其中糖尿病可能涉及线粒体ATP合酶基因8/6序列中的特异性突变。另外，专利WO 00/66782和WO 98/17862描述了一种通过在ATP合酶基因序列中寻找突变来诊断糖尿病的方法。
尽管已有人提出了几种策略来确定糖尿病的易感性，但是没有一种被证明是成功的。本发明旨在提供一种方法来确定糖尿病的易感性。
发明概述
本发明发明了一种通过测量样品中蛋白质的水平来诊断和确定至少一种与糖尿病相关的疾病的方法。本发明基于这样的意外的实验事实：在2型糖尿病中有15种蛋白质被上调或下调。这些蛋白质中(作为2型糖尿病的标记)有11种已被质谱鉴定。在这11种蛋白质的表达中所观察到的变化与在胰岛素抗性个体中出现的细胞压力和骨骼肌线粒体的代谢中干扰的增长是一致的(2)。被鉴定的大部分蛋白质是磷蛋白或涉及细胞中磷酸代谢的蛋白质。最有趣的是，本发明人表明：ATP合酶的β亚基是磷酸化的，并且发现β亚基的磷酸化同工型的表达量减少并同空腹糖尿患者肌肉血浆中的葡萄糖水平负相关。这些数据表明ATP合酶的β亚基的磷酸化在调节ATP的合成中起作用，该蛋白质以及细胞压力蛋白质的调节的变化可能有助于2型糖尿病的发病。
关于治疗糖尿病的方法，单个蛋白质或一组蛋白质均可作为治疗的靶点。根据本发明可以改变作为靶点的蛋白质表达水平(如上升或下降)或干涉这些蛋白质本身而防止或延迟人的糖尿病相关疾病的发作。这可通过施用如，蛋白质标记物、编码标记蛋白质的核酸序列(或互补序列或其部分)、标记蛋白质的抗体、能与蛋白质标记物结合的核酸片段，和/或能与标记蛋白质结合的化合物而得以实现。影响标记物转录或影响标记物的转录后修饰的化合物，尤其是影响标记物活性(磷酸化状态)的化合物应该也是明显的药物备选物。
本发明的详细公开
本发明涉及基本纯的多肽，其包含至少一种选自下列的氨基酸序列：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3所公布的特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中的任何一种多肽或其部分有优选至少70％同源性(如至少80％、至少90％、至少95％)的类似物；和
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)中的氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物。
ATP合酶β亚基是核编码蛋白质，该亚基位于ATP合酶的催化部分(在F1部分内)，与ATP合酶的6/8亚基相反，后者为线粒体编码蛋白质，位于ATP合酶无催化活性的跨膜部分(在F0部分内)。
这些多肽(包括它们的磷酸化同工型)可用作药物治疗如至少一种糖尿病相关疾病，优选2型糖尿病。
本发明还涉及用于治疗至少一种糖尿病相关疾病(优选为2型糖尿病)的药物组合物，其含有至少一种根据本发明的多肽或其模拟物(mimetic)或抗模拟物(antimimetic)。根据本发明，其它的药物组合物含有：
(a)至少一种物质，其能够调节编码至少部分根据本发明的多肽的核酸片段的表达；和/或
(b)至少一种所述多肽；和/或
(c)所述多肽或其修饰产物的至少一种抗体；和/或
(d)至少一种核酸序列，能杂交编码所述多肽的核苷酸序列(包括其调节元件)或其互补链；和/或
(e)至少一种化合物，如，核酸片段，能与所述多肽结合的；和/或
(f)至少一种化合物，能修饰与该疾病相关的蛋白质的形式而使得其相对表达、活性和/或浓度向健康人的方向改变；和/或
(g)至少一种能够标记至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中对于更快的更新或降解表达量相对太高；和/或
(h)至少一种能够标记至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中相对表达量太低使得它们更新或降解得更慢。
(i)一种适体(aptamer)，能与所述蛋白质或其结合位点结合；和/或
(j)一种适体，能够优先与所述蛋白质的结合位点或活性位点结合。
该药物组合物至少含有一种活性化合物，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的不同的化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗糖尿病相关疾病的方法，防止所述疾病和/或延迟其在人体中的发作，该方法包含施用至少一种化合物，其选自：
(a)根据本发明的多肽；
(b)编码(a)中多肽的核苷酸序列；
(c)能与(a)中多肽结合的抗体；
(d)能与编码至少部分(a)中多肽的核酸或其互补链(包括其调节元件)杂交的核酸片段；
(e)能与(a)中多肽结合的化合物；
(f)能上调、下调根据本发明的至少一种多肽的表达、活性和/或浓度的化合物；
(g)一种能修饰与该疾病相关的蛋白质的形式的化合物，使得其相对表达、活性和/或浓度向健康人中可见的方向改变；
(h)至少一种能够标记(如用泛醌)至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中对于更快的更新或降解其表达量相对太高；
(i)至少一种能够标记至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中对于更慢的更新或降解其表达量相对太低；
对于所述人群，该治疗应优选具有将标记蛋白质的水平恢复到在健康人群中可见的水平的效果。
在目前优选的方案中，ATP合酶β亚基的磷酸化可调，如上调，因为人们相信ATP合酶β亚基的磷酸化可改变该酶的此种功能。这种磷酸化也可通过调节该激酶或调节使ATP合酶β亚基磷酸化或去磷酸化的磷酸酶而得以调节。
ATP合酶β亚基的表达由称作PPARγ共活化物-1(PGC-1)的转录功能的“PPARγ的共活化因子”所调节。该活化因子因此可用作一种手段来上调ATP合酶β亚基。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种方法，来诊断或确定人的至少一种糖尿病相关疾病(优选2型糖尿病)的易感性，该方法包括确定取自于该人的生物学样品中至少一种标记蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平，而该标记蛋白质选自：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布的特性定义的一种标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任何一种多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物。
随意地将所述蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平同取自于至少一位正常人(也就是不患有所讨论的该疾病)生物学样品的所述蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平进行比较。
该方法优选地包含：
(A)确定取自该人的生物学样品中至少一种标记蛋白质增高的表达、修饰、活性和/或浓度，该标记蛋白质选自：
(a)磷酸葡萄糖变位酶1；
(b)热休克蛋白90β；
(c)肌球蛋白调节轻链2上调同工型；
(d)胶原蛋白α1(VI)链；
(e)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(f)由表3公布特性定义的一种标记蛋白质(匹配号：303或511)；
(g)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任何一种多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(h)(a)到(f)中氨基酸序列的衍生物、类似物或修饰物；
和/或
(B)确定取自该人的一种生物学样品中至少一种标记蛋白质(一种下调的标记蛋白质)降低的表达、修饰、活性和/或浓度，该标记蛋白质选自：
(a)ATP合酶β亚基或其磷酸化同工型；
(b)肌酸激酶β亚基；
(c)肌球蛋白调节轻链2下调同工型；
(d)由表3公布特性定义的一种标记蛋白质(匹配号：199或391)；
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)中任何一种多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；
(f)(a)、(b)、(c)或(d)中氨基酸序列的衍生物、类似物或修饰物。
增高或降低的表达、修饰、活性和/或浓度相对于取自于正常人的生物学样品可得值。该生物学样品选自尿、血液、淋巴液、唾液和组织，优选肌肉组织，如股外侧肌。由于确定一种蛋白质是上调或下调是糖尿病相关疾病易感性的有效标记，本发明也涉及一种方法用于诊断或确定人的至少一种糖尿病相关疾病(优选2型糖尿病)的易感性，该方法包含确定患有糖尿病相关疾病个体的样品中至少一种标记蛋白质(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的存在、活性、修饰、浓度和/或表达水平，其以比正常人更低或更高的量存在。可以理解为：这样的标记蛋白质可选自，由其肽段和/或凝胶位置(亦即，无特异基因与其相关联的位置，可能由于该基因还未被鉴定)鉴定出的标记蛋白质。本领域的技术人员使用实施例公开的方法能鉴定出其它的标记蛋白质。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种方法，确定试剂在治疗糖尿病相关疾病中具有治疗功效的可能性，其包含确定将测试模型暴露于所述试剂之前和之后根据本发明的一种或更多多肽的表达水平以及比较所述水平。
另外，本发明涉及一种方法以确定化合物在治疗糖尿病相关疾病中的作用，其中包含确定根据本发明的一种或更多多肽(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的表达水平。特别是，这种方法可用来评价化合物在治疗糖尿病相关疾病中的作用，其中包括确定将测试模型暴露于所述试剂接之前和之后，一种或更多标记蛋白质的表达水平。
一种目前优选的用于确定物质在治疗糖尿病相关疾病中的作用的方法，包括使用经确定(例如通过使用根据本发明的方法)对患该病有很大(如遗传学上的)可能性或易感性的哺乳动物或该动物的一部分，该方法包括对所述哺乳动物或其部分施用该物质并确定该物质的作用，优先通过确定对所述哺乳动物或其部分施用该物质前后，根据本发明的一种或更多标记蛋白质的水平。
本发明还涉及一种方法来确定患有或易于患有所述疾病的人的糖尿病相关疾病的性质或原因，其中包括确定根据本发明的标记蛋白质关于某种模型的表达水平。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种核酸片段，其中包括：
(A)编码一种多肽的核酸序列或其调节元件，该多肽包含至少一种氨基酸序列，其选自：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的一种标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任何一种多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物；或
(B)能与(A)中核酸序列、该核酸序列的调节元件或其互补链杂交的核酸片段。
这样的一种核酸片段可用来检测糖尿病相关疾病相关的标记蛋白质的存在或水平；用于检测编码所述标记蛋白质的核酸序列，例如作为一种探针或PCR的引物，或作为调节标记蛋白质表达或水平的药物，例如在反义治疗或基因治疗。并且，利用本领域技术人员熟知的方法可将这样一种序列整合到载体中并用于产生该多肽。当然，这些蛋白质可由其它方法生产，例如利用固相合成或从自然资源如组织中纯化获得。
在另外的实施方案中，本发明涉及能与根据本发明的标记蛋白质(或它的修饰产物)结合的抗体。该抗体可为多克隆或单克隆。获得这样抗体的方法为本领域的技术人员所熟知。一种根据本发明的抗体可用于检测与糖尿病相关疾病相关的标记蛋白质的存在或水平，它也可作为一种治疗手段。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于在哺乳动物中诊断糖尿病相关疾病或其对所述疾病(例如在遗传学上)的易感性的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
(A)至少一种结合手段，其特异性地结合至少一种根据本发明的标记蛋白质，例如i)所述标记蛋白质的抗体；ii)能与所述标记蛋白质结合的核酸片段；和/或iii)能与所述标记蛋白质结合的化合物(如抗模拟物)；
(B)至少一种用于检测所述手段与至少一种标记蛋白质结合，如果有的话，或结合水平；并且，如果必要的话，
(C)至少一种将与所述结合手段的结合或结合水平(若有的话)是否标记个体哺乳动物具有患该病的高度可能性或(遗传学上)易感性相关联的手段。
同时，本发明涉及用于确定物质在治疗糖尿病相关疾病中的作用的方法，该方法包含使用经确定很大可能性患该病或有(如遗传学上的)易感性的哺乳动物或该动物的一部分(例如使用权利要求1中的方法)，该方法还包括对所述哺乳动物或其部分施用该物质并确定该物质的作用，优先通过确定对所述哺乳动物或其部分施用该物质前后，根据本发明的一种或更多标记蛋白质(例如1、2、3、4、5、6或更多)的水平。
值得注意的是，确定不止一种标记物的任何组合将使得这种分析结果成为糖尿病相关疾病的更可信的指标。因此，一种用于诊断或确定至少一种糖尿病相关疾病易感性的方法包括：优选确定两种标记物组合的存在、活性、修饰、浓度和/或表达水平，而更优选确定三种或更多标记物(例如4、5、6或更多标记物)。与此类似，我们建议采用多于一种的根据本发明的化合物(2、3、4、5、6或更多化合物)进行治疗(例如，超过一种化合物选自：根据本发明的多肽、核酸片段或抗体)，所述组合的化合物能够超过一种标记蛋白质水平而将对于该疾病的治疗更为有效。
术语“糖尿病相关疾病”被理解成最广义范围内的任何与糖尿病相关的疾病，包括糖尿病并发症以及该代谢性综合病症(在糖尿病发作前)。与2型糖尿病相关的并发症病例为视网膜病、神经病、肾病、大血管病变、胰岛素抗性、高脂血、高血压以及肥胖症。这种代谢性综合病症的病例包括肥胖症、dyslipidemia、葡萄糖不耐受高血压以及其它心血管性疾病。
术语“多肽”在本发明中有其通常的含义。那就是任何长度的一条氨基酸链，包括全长蛋白质、寡肽、短肽及其片段，其中这些氨基酸残基由共价肽键连接在一起。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”以及“蛋白质”可交替使用。
该多肽可通过磷酸化、硫酸化、糖基化或任何其它形式的修饰，或通过添加任意形式的脂类或脂肪酸、泛素或任何其它的大型侧链基团或通过含有额外的氨基酸如一种信号肽来进行化学或生物化学修饰。并且，该多肽可被切割(如通过处理其N末端或C末端或者剪切以除去其内部序列)。
每个多肽因此可被特异性氨基酸序列所表征并被特异性核酸序列所编码。应当理解，这样的序列包括由重组或合成方法所生产的类似物和突变体，其中这样的多肽序列通过取代、插入、添加或删除一种或更多重组多肽中的氨基酸残基而被修饰并且这些多肽在本文描述的任何生物测定中仍具有免疫原性。取代物优选为保守的。保守取代物为本领域技术人员所熟知。优选，属于同种类型[非极性氨基酸(G、A、P、I、L和V)，极性不带电荷氨基酸(C、S、T、M、N和Q)，极性带电荷氨基酸(D、E、K和R)和芳香族氨基酸(H、F、W和Y)。在每一类型中，氨基酸可互相替代，但是其它取代当然是可能的。
每个多肽被特定的核酸序列所编码。应当理解，这样的序列包括其类似物及突变体，其中这样的核酸序列通过取代、插入、添加或删除一种或更多核酸残基[包括插入一种或更多内含子(小的或大的)]而得到修饰。取代物优选为编码子使用中的沉默取代物，其不会导致氨基酸序列的任何改变，但可被引入以提高该蛋白质的表达。
在本文中，术语“基本纯的多肽片段”指的是一种质量上至多含有5％其它与其天然相关的多肽物质的多肽制剂(优选其它多肽的低百分含量，例如：至多4％，至多3％，至多2％，至多1％，至多0.5％)。优选至少96％纯度的基本纯的多肽，也就是说，该多肽至少占制剂中总蛋白质的96％，并且优选该多肽的高百分含量，如至少97％，至少98％，至少99％，至少99.25％，至少99.5％，至少99.75％。尤其优选“基本纯”的多肽片段，也就是该多肽片段基本上不含有其它任何与其天然相关的蛋白质，即不含有来自一种哺乳动物的任何其它蛋白质。本发明多肽的制备可以借助本领域技术人员熟知的在宿主细胞中重组的方法得以实现，或者通过众所周知的固相或液相多肽合成法合成，例如通过Merrifield描述的方法(Merrifield，R.B.Fed.Proc.am.Soc.Ex.Biol.21：412，确良1962和J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963)或者其衍生方法或从电泳凝胶中回收。
本发明也包含所述多肽的同工型、衍生物、前体、截短物(如成熟型)、类似物以及模拟物。优选的这样同工型、衍生物、前体、类似物以及模拟物具有相同的活性，例如与其前体多肽相同的酶活性。这种同工型、衍生物、前体、类似物或模拟物可能比其前体多肽具有较低水平活性、相同水平或优选具有更高水平的活性。
术语“同工型”指相关联的蛋白质的家族(亦即同种蛋白质的多种形式)，这些蛋白质在氨基酸序列上略有不同。它们能由不同基因产生或由相同基因RNA转录产物经不同剪切所产生。因此，术语“同工型”包含由可变序列间隔的同源的氨基酸残基序列。另外，术语“同工型”包含一种经翻译后修饰处理的蛋白质形式，如磷酸化(磷酸-同工型)。
“多肽模拟物”是一种能够模拟多肽生物活性的分子但其在化学本质上不再是肽。严格的定义是：多肽模拟物是不含有任何肽键(即氨基酸残基之间的酰胺键)的分子。然而，术语“多肽模拟物”有时也被用于描述在本质上不完全是肽的分子，如假肽，半肽和肽类似物。无论是完全或部分非多肽分子，本发明的多肽模拟物提供了有反应活性的空间排列，其同多肽的活性基团的三维排列极其相似(多肽模拟物构建的基础)。由于具有这种相似的活性位点立体结构，多肽模拟物对生物系统的作用同多肽的生物活性很相似。
本发明包括多肽模拟物成分——具有同本发明多肽类似的有生物活性的类似物，即多肽模拟物可被用于治疗糖尿病相关疾病。本发明优选的多肽模拟物本质上同多肽在三维结构和生物活性上相似，或同上文提及的活性位点相似。
或者，多肽模拟物也可以是“抗模拟物”，换句话说，它适合并能够封阻蛋白质的活性，或者与结合位点或同其它生物分子相互作用的位点结合并以此来干扰该蛋白的功能。当前大多数的药物都属于这种类型。本发明包括这种能够与本发明的多肽相互作用的抗模拟物。
“适体”是一种在体外被选择用于优先与另外一种化合物(这种情况下指的是被识别的蛋白质)结合的化合物。经常，适体是核酸或肽，因为从核酸或氨基酸中(包括天然存在或合成的)可立即产生很大数量的随机序列，当然并不限于此。
使用给定肽的模拟物而非该肽本身具有很明显的优势，因为肽通常呈现出两种不符合要求的特点：(1)生物利用度很低；并且(2)作用持续时间短。肽模拟物提供一种明显的绕过这两种主要缺陷的路径，因为这些相关分子足够小以至于既有口服活性又有很长的持续作用时间。这种做法还能够节约开支并改善患者对肽模拟物的顺应性，因为它们能够口服而不是肠胃外或跨粘膜给药。另外，生产肽模拟物要比肽便宜得多。最后，与肽相关的稳定性、贮存及免疫反应方面的问题在肽模拟物中尚未见到。
因此，所述肽可以用来研制具有相似生物活性并因此具有相似治疗功效的所述小化合物。这些研制肽模拟物的技术是传统技术。因此，肽键可被非肽键所取代进而使得肽模拟物具有一种与原初肽相似的结构并因此具有其生物活性。另外，也可以通过用其它具有相似结构的化学基团来取代氨基酸的化学基团对其进行修饰。通过NMR波谱学、结晶学和/或计算机辅助分子建模方法确定原初肽的三维结构可以帮助研制肽模拟物。这些新技术帮助研制比原初肽更高效和/或更高生物利用度和/或更稳定的新成分[Dean(1994)，BioEssays，16：683-687；Cohenand Shatzmiller(1993)，J.Mol.Graph.11：166-173；Wiley and Rich(1993)，Med.Res.Rev.，13：327-384；Moore(1994)，TrendsPharmacol.Sci.，15：124-129；Hruby(1993)，Biopolymers，33：1073-1082；Bugg et al.(1993)，Sci.Am.，269：92-98，在此均被引为参考文献]。一旦一种潜在的肽模拟化合物鉴定出来，即可将其合成并使用本文所描述的诊断分析法或适合的抑制剂分析法来评定其活性[见Finlay et al.(1983)，Cell，57：1083-1093 and Fujiwara etal.(1993)，Cancer Res.，53：4129-4133，在此均被引为参考文献]。
因此，利用上述方法，本发明提供了比上述多肽治疗活性更高的化合物。本发明包括利用上述方法获得的肽模拟化合物，其具有上述指定肽的生物活性及其相似的三维结构。以下事实为本领域技术人员所熟知：肽模拟物可以产自前述修饰过的任何一种肽或者产自具有超过一种修饰位点的肽。除了其治疗功效外，本发明的肽模拟物还可用来研制更有效的非肽化合物。
术语“核酸片段”和“核酸序列”指的是包括DNA、RNA、LNA(锁定的核酸分子)、PNA、dsRNA和RNA-DNA杂合子的任何核酸分子。另外还包括含有非天然核苷的核酸分子。该术语包括任意长度的核酸分子(根据用途不同，长度为10-10000核苷酸)。当该核酸分子用作药物如DNA治疗或用于生产根据本发明的多肽的方法中时，优选使用一种编码至少该多肽部分的分子(长度约为18-1000核苷酸)，该分子可选地插入一种载体中。当所述核酸分子作为一种探针、引物或在反义治疗中使用时，优选使用一种长度为10-100个核苷酸的分子。根据本发明，其它长度的分子也可以使用，例如一种具有至少12、15、21、25、27、30、33、36、39、42、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子，或一种至多具有10000、5000、4000、3000、2000、1000、700、500、400、300、200、100、50、40、30或20核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子。应该清楚，这些数字可以任意组合以产生范围。
作为本领域的定义，术语“严紧”与杂交条件联合使用，也就是杂交是在不超过核酸片段熔点(Tm)以下15-20℃进行的，参照Samrooket al Molecular Cloning；A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratories，NY，1989，pages 11.45-11.49.优选条件为高度严紧的，也就是核酸片段熔点(Tm)以下5-10℃。
在该说明书中除非另外要求，术语“包含”或它的时态、语态变指是包括所述元件或整体或者是一组元件或整体但并不排除任何其它元件或整体或者元件组或整体组。
术语“序列同一性”意指相同长度的两个氨基酸序列或者核酸序列之间同源程度的定量测量。如果要比较的两个序列长度不同，它们一定以带有缺口的插入或者切断蛋白质序列末端的方式排列成最可能的匹配。序列同一性可用公式----计算，其中Ndif为两个序列比对时其中非同一残基的总数，而Nref为其中一种序列的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC之间有着75％的序列同一性(Ndif＝2，而Nref＝8)。缺口被当作特异性序列中的非同一残基，也就是DNA序列AGTGTC与序列AGTCAGTC之间有着75％的序列同一性(Ndif＝2，而Nref＝8)。序列同一性也可利用BLAST程序如BLASTP程序(Person W.R和D.J.Lipman(1988)PNAS USA 85：2444-2448)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)进行计算。本发明的一方面，可用带有设定参数的序列比对方法ClustalW进行比对，参见Thompson J.，等人Necleic Acids Res 1994 22：4673-4680，http：//www2.ebi.ac.uk/Clustalw。
优选序列同一性的最小百分率是至少70％，如是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％。
本发明也涉及使用本发明的多肽或核酸作为治疗疫苗，参见文献Lowry，D.B.等人1999，Nature 400：269-71。
在免疫效价评定中能够同本发明的一种多肽特异性相互作用的单克隆或多克隆抗体，或者所述抗体的特异性结合片段也是本发明的一部分。可通过本领域技术人员所熟知的方法来生产抗体。例如，多克隆抗体可以在哺乳动物中制备，通过注射一次或多次根据本发明的一种多肽，并且如果需要，还应注射佐剂。根据本发明的单克隆抗体可以利用Kohler和Milstein在Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法或美国专利NO.4,816,567中描述的重组DNA方法生产。例如，利用McCafferty等人在Nature，348：552-554(1990)中描述的技术也可以从噬菌体文库中分离出单克隆抗体。文献中描述了生产抗体的方法，例如美国专利6136958。
在诊断学上，抗体、核酸片段和/或本发明的多肽可单独使用，亦可作为组合物中的成分。这样的组合物为本领域的技术人员所熟知，并且其组分中抗体、核酸片段或本发明的多肽能与至少一种其它的分子如一种标记物(例如放射性或荧光标记)或一种载体分子结合，优选共价连接。
本发明还提供方法来利用所述化合物治疗和/或预防患有糖尿病相关疾病的患者。
本发明的方法包括下列步骤：a)在适合的药物载体中整合一种或更多本发明的化合物；b)以治疗有效量或预防有效量对患者施用该化合物或整合进载体的该化合物。
术语“适合的药物载体”指的是为制药领域所熟知、用于将化合物给患者施用的任意载体。根据本发明，只要不产生相容性问题，任何适合的药物载体都可使用。
可通过胃肠外注射施用有效剂量给患者，例如静脉内、鞘内、肌肉内或动脉内注射。这些化合物也可口服或皮下给药，或者利用为本领域技术人员所熟知的任何其它手段如借助于吸入器或鼻腔喷雾器。口服是当前优选的给药方式。
就像这里所使用的一样，术语“治疗有效量”指的是治疗患者所需的一种或更多本发明中化合物的数量。这样的治疗适于被诊断为患有糖尿病相关疾病的患者。同样地，术语“预防有效量”指的是预防性处理患者所需的一种或更多本发明中化合物的数量。例如，这样的治疗适于还没有被确诊具有糖尿病相关疾病任何临床症状的对象。早日确定受试者有患上糖尿病相关疾病的危险可能有利于尽快开始预防治疗，例如，通过改变标记物的水平来确定糖尿病易感性。
本领域的技术人员将会了解，一种给定化合物的剂量，给药路径及治疗持续时间不仅依赖于化合物类型及其在治疗该疾病中的效果，还依赖于被治疗个体的情况，患者体重、用于治疗患者的其它治疗方法和患者的情况、临床反应和耐受力等这些因素都要考虑进去。本领域技术人员通过评定这些和其它相关因素可确定治疗剂量、给药以及持续时间。
确定肌肉组织切片样品(取自易患遗传性2型糖尿病的受试者)中2型糖尿病基本标记物的水平可用于确定是否需要干涉，以通过医学治疗、节食指导、身体锻炼等形式来防止2型糖尿病或治疗前糖尿病状态。如果所述ATP合酶β亚基磷酸化同工型下调的水平低于二维电泳图(pH范围4-7的IPG胶，其制备如上所述)上蛋白质相关的IOD总量的0.5％，则患2型糖尿病或前糖尿病状态的可能性高于85％。与此类似，如果肌酸激酶β亚基的水平低于二维电泳图上0.25％IOD，则患2型糖尿病或前糖尿病状态的可能性高于80％。而如果2型糖尿病的标记物表达水平均低于这些水平，则患2型糖尿病或前糖尿病状态的可能性甚至更高。
能够调节ATP合酶β亚基磷酸化和/或表达的物质(激素、激酶、磷酸酶、小分子等)正在调查研究中。能够以提高2型糖尿病相关生理参数如胰岛素敏感性、葡萄糖吸收和血糖的方式调节ATP合酶β亚基磷酸化和/或表达的物质可直接使用，然而具有相反效果的物质可用于研制其抑制剂。我们的研究表明，磷酸化ATP合酶的激酶的治疗性活化将改善ATP的合成，随后改善胰岛素敏感性、葡萄糖吸收和血糖水平。
图表图例
图1：2型糖尿病骨骼肌中的标记蛋白质
糖尿病人典型的骨骼肌二维电泳图。利用IPG胶在一维分离蛋白质斑点(pI4-7)并用银染法显色。其数量与2型糖尿病人肌肉中显著上调(下面划线的)或下调的蛋白质斑点相符。这15个蛋白质中有7个用MALDI-MS鉴定(表2)。
图2：人骨骼肌中ATP合酶β亚基(ATPsyn-β)的磷酸化。
图2A：骨骼肌二维电泳(银染)和人骨骼肌细胞(成肌细胞)[32P]标记的二维电泳的放大区比较显示出全部4个同工型均为ATPsyn-β的磷酸化同工型。
图2B：在银染胶上定位于ATPsyn-β(斑点180)右侧的大斑点也被MALDI-TOF质谱分析鉴定为ATPsyn-β的一种同工型。该ATPsyn-β同工型的MALDI肽质谱图显示出了具有最可能的磷酸化位点在该肽的N末端为苏氨酸的磷酸化肽的存在(具有80Da分子量差异的两个峰)。
图2C：这个丰度更高的ATPsyn-β同工型序列覆盖率为59％，并且在被测的45个肽中有29个与该蛋白质(粗体字)相匹配。这个磷酸化肽的潜在磷酸化位点(用框标记)是核苷酸结合区域内的Thr213(下面划线的)。
图3：所观察到的2型糖尿病标记蛋白质在骨骼肌代谢中的潜在作用
图3A-3B：ATP合酶β亚基(ATPsyn-β)同工型表达的下调和DM2受试者空腹血糖水平的相关性(r＝-0.75；P＝0.020)，以及同对照受试者的空腹血浆FFA水平之间的相关性(r＝-0.81；P＝0.049)。
图3C-3D：DM2患者中肌酸激酶β的表达和空腹血糖水平(r＝-0.82；P＝0.007)以及下调的ATP合酶β亚基(ATPsyn-β)同工型的表达(r＝-0.71；P＝0.033)之间的相关性。
图3E：研究2型糖尿病标记蛋白质(灰色标记)在骨骼肌代谢中推定的作用的建议方案。ATP合酶的F1部分含有3个催化功能的β亚基，并且呼吸链上的复合物IV等同于细胞色素C氧化酶。ROS，活性氧类；PKB，蛋白激酶B；eNOS，内皮硝酸氧化物合酶；AMPK，AMP-活化的蛋白激酶；TCA循环，三羧酸循环；mtCK，线粒体肌酸激酶；GLUT4，葡萄糖转输蛋白4；GS，糖原合酶；IR，胰岛素受体；G-6-P，葡萄糖-6-磷酸和G-1-P，葡萄糖-1-磷酸。余下的缩写在下文中解释。
图4：在糖尿病患者肌肉中差异表达的2种不同的MRLC2同工型
在DM2患者中斑点A是下调的，而斑点I是上调的。斑点A、B和C均被MALDI-MS鉴定为MRLC2的心室/心肌同工型(数据库登录号：P10916)并可能代表不同的磷酸-同工型。斑点I、II和III均被鉴定为另一种MRLC2同工型(数据库登录号：AAK52797)，并且它们可能也代表不同的磷酸-同工型。在这2种不同的MRLC2同工型之间只有72％同源性。
实验
蛋白组(proteome)分析为研究成千上万种蛋白质以及它们的翻译后修饰物提供了可能性，是2型糖尿病系统疾病研究中一种很有前途的技术(5)，高分辨率的蛋白组技术能够有效地分离并能够高成功率的鉴定蛋白质。同mRNA表达分析相比，蛋白组分析为蛋白质表达改变的量化以及翻译后蛋白质修饰(如磷酸化、甲基化和切割)的鉴定和定量提供了可能性。翻译后修饰为蛋白质的功能活化所必需，因此它可能具有致病研究方面的重要性。
本发明利用蛋白组分析选择并鉴定糖尿病相关蛋白质。这些蛋白质就其本身而言，无论上调还是下调都是患有糖尿病的标记。这些蛋白质的调控方式也是糖尿病的标记。这些蛋白质可作为治疗糖尿病的靶点或者用于治疗该疾病。
因此，确定一种蛋白质是否上调或下调是糖尿病易感性的有效指标。上调及下调模式也是一种指标。也就是说确定超过一种蛋白质的表达水平，并且将一组蛋白质的表达方式作为一种指标。很明显，鉴定的可信度随着这组蛋白质的数量增加而上升。
肌肉样品
肌肉样品取自10个2型糖尿患者(糖尿病组)及10个健康受试者(对照组)。2型糖尿病患者(空腹C-肽600pmol/l，同时GAD65抗体阴性)仅仅通过饮食治疗或联合使用口服抗糖尿病药物，这些措施在研究前2周停用。研究前要求受试者在48小时内不进行过度的体育锻炼并空腹10个小时(过夜)。确定非糖尿患者的正常葡萄糖耐受，并利用所述方法确定血糖、FFA、血清胰岛素及C-肽的浓度(26)。股外侧肌的皮下针活组织检查用一种活组织检查枪来进行，而肌肉样品(～25mg)被立即吸去血液、脂肪和结缔组织，并冻存于液氮中。该研究流程依照Helsinki说明进行。
样品制备
冻存肌肉样品在100μl冰冷的DNase/RNase缓冲液(含有20mmol/l Tris-HCl缓冲液pH7.5，含30mmol/lNaCl，5mmol/lCaCl2，5mmol/l MgCl2和25μg/ml RNaseA/DNase I(Worthington，Freehold，NJ))中匀浆化25min。匀浆后，样品冻干过夜，然后不断振荡使之溶解在120μl裂解缓冲液(7M尿素(ICNBiomedicals)，2M硫脲(Fluka)，2％CHAPS，0.4％DTT(Sigma)，0.5％pharmalyte 3-10和0.5％pharmalyte 6-11(Amersham PharmaciaBiotech，Sweden))中。
蛋白质和CPM确定
样品中的蛋白质浓度通过Bradford方法确定，用上述裂解缓冲液将其调至适用。
二维电泳
一维电泳在IPG4-7梯度胶(Amersham Pharmacia Biotech)中进行。IPG4-7胶条的再水化缓冲液与用于样品制备的裂解缓冲液成分相同，并且用带胶(in-gel)再水化物上样。每块胶上样400μg。在20℃，线性增加的压力/时间条件下(0V-600V进行2：15h；600V-3500V进行1h；3500V进行13：30h)，于Multiphor II上进行等电聚焦电泳，聚焦后，将胶条置于平衡缓冲液(6M尿素，2％SDS，30％甘油，50mMTris-HCl pH8.8，1％DTT)平衡2次15分钟，在平衡步骤之间，将胶于-80℃冻存。使用Protean II Multi Cell 2-D电泳系统(Bio-Rad公司)以及实验室制备的单百分比胶(12.5％丙烯酰胺；丙烯酰胺：N，N’-乙烯-双丙烯酰胺＝200∶1)进行第二维的SDS PAGE。于20℃，恒流电泳过夜。循环缓冲液以保持pH、温度和盐浓度恒定。
蛋白质显色和计算机分析
二维电泳后，使用所述银染法进行蛋白质显色(29)。所有的凝胶图象由同一人使用Bio Image computer program(version 6.1，B.I.System Corporation)进行分析。测量每个蛋白质的表达水平并表达为其整合的光密度百分比(％IOD)(目前正在讨论的斑点范围内所有像素灰度水平值的总和占所有被检测斑点范围内该值的百分比)。为了比较，本发明人使用对照组的6块胶和糖尿病患者组的9块胶(余下的胶显示出蛋白质在样品制备过程中发生降解，因此不能使用)。每组图象都被匹配和对比。计算每组中每个蛋白质的斑点％IOD平均值和标准偏差并利用Student t-test进行比较。以95％的显著差异水平表达的蛋白质斑点被选择用于进一步分析。
蛋白质的质谱鉴定
将目标蛋白质从胶中切下，带胶消化后，用MALDI质谱仪进行分析(27，28，29)。使用胰蛋白酶自身溶解肽对质谱进行内源性校准，然后将质量值输入NCBI数据库中利用Profound程序进行搜索并使用FindPept和FindMod程序进行进一步分析( http：//www.proteome trics.com)。用对每个程序所需少量修饰的下列属性进行数据库搜索：所有种属、不设分子量和蛋白质等电点限制、胰蛋白酶消化、允许一次丢失的切割(one missed cleavage allowed)、丙烯酰胺修饰的半胱氨酸、和可能的甲硫氨酸氧化以及质量误差范围(0.1-0.5Da)。当至少5个肽与蛋白质相匹配并且无序列重叠时，认为该鉴定是阳性的。
[32P]标记的人成肌细胞
按照前述方法培养人骨骼肌细胞(Hemmer等人，30)。在12孔平板上培养成肌细胞，在标记实验前一天将细胞培养液换成含有5mM葡萄糖和补充有10％胎牛血清的DMEM培养液。标记前，将细胞置于含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的无血清DMEM培养液中孵育2.5h。人成肌细胞蛋白质中的磷酸基团的生物合成标记通过在300μl补充有2mM L-谷氨酸(Life Technologies，Paisley，Scotland)、2％BSA以及300μCi[32P]-正磷酸盐(Amersham Biosciences)的无血清、无磷酸DMEM培养基(ICN，Ohio)中孵育2.5h而完成。然后立即除去标记培养液，在400μl上述裂解缓冲液中裂解细胞。使用所述TCA(三氯乙酸)沉淀法确定成肌细胞蛋白质中[32P]-正磷酸盐的掺入量(29)。按照所述方法进行二维电泳，在胶上细胞裂解液的上样体积相应于4×105cpm。[32p]-标记的成肌细胞的蛋白由将干胶对磷成像板暴光而显像(AGFA)。
结果
本发明者收集了分别取自于年龄、性别相匹配的对照组和2型糖尿病受试者(DM2)组的股外侧肌组织切片，通过蛋白组分析比较吸收完毕(postabsorptive)状态下静止骨骼肌中体内蛋白质的表达图。
发明者通过二维凝胶电泳来分离肌肉中的蛋白质并采用银染法进行染色观察。发明者使用计算机成像分析法匹配并定量确定了每个凝胶图像中的489个斑点。在两组中共有15个统计学上表达水平不同的蛋白质斑点(图1)。将这些2型糖尿病相关的标记蛋白质从二维凝胶中切割下来，随后进行凝胶胰蛋白酶消化，再利用基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱分析并进行数据库检索鉴定。其中11个点已经被鉴定了；3种为代谢酶、两种为伴侣蛋白、以及两种结构蛋白质的同工型(表2)。
2型糖尿病受试者中磷酸葡萄糖变位酶1(PGM-1)显著上调。磷酸葡萄糖变位酶(PGM1)是一种糖分解酶，在糖原代谢中有着非常重要的地位。
发明者还发现在2型糖尿病受试者肌肉中的热休克蛋白90β(HSP90β)表达水平也显著上调(表2)。糖尿病患者肌肉中HSP90β表达上升这种类型的压力目前仍是未知的。
2型糖尿病受试者肌肉中的肌球蛋白调节轻链2(MRLC2)的一种同工型显著下调，而其另一种同工型却显著上调(表2)。目前肌球蛋白调节轻链2(MRLC2)在骨骼肌中的功能还只是部分被了解。因此，MRLC2同工型表达上的这些变化所具有的潜在含义目前还不清楚。
下调的MRLC2同工型已经被鉴定为MRLC2的心室/心肌中的同工型(数据库登录号为P10916)，而上调的MRLC2同工型已经被鉴定为另一种同工型，其数据库登录号为AAK52797。这两个同工型之间的同源性仅为72％。
肌酸激酶B(CK-B)在2型糖尿病受试者中显著下调(表2)。发明者发现糖尿患者肌肉中的血糖水平和肌酸激酶B(CK-B)的水平呈负相关(图3C)，这暗示着后者在高血糖症患者的糖酵解中发挥作用。另外，发明者还发现在2型糖尿患者肌肉中肌酸激酶B(CK-B)和下调的ATPsyn-β磷酸化同工型(图3D)之间存在着正相关的关系。
在2型糖尿患者中，被鉴定为ATP合酶β亚基(ATPsyn-β)的斑点显著下调(表2)，并且分子量相同但是等电点不同的四个斑点同时出现下调，这表明该蛋白质具有不同电荷的突变体(图2A)。为了进一步鉴定ATP合酶β亚基的修饰产物，我们对[32P]标记的人骨骼肌细胞(成肌细胞)进行了二维电泳分析。二维电泳图显示：事实上所有四种ATPsyn-β的同工型都是磷酸化同工型(图2A)，并且假定的非修饰突变体在银染检测限之下。对ATPsyn-β三种最基本磷酸化同工型经胰蛋白酶消化后所生成的磷酸化肽(包括下调的ATPsyn-β斑点第180号)进行MALDI-MS分析以及数据库搜索，结果清晰地表明：磷酸化的残基最可能位于ATPsyn-β核苷酸结合结构域上Thr213位置处(图2B-C)。酪氨酸的硫酸化可以产生与磷酸化相同的二维电泳图像并引起相同的多肽质量增加(80Da)。然而，使用酪氨酸上硫酸化位点(31，32)的一致特征，这样的位点并不包括在ATPsynβ序列中。
[32P]标记的所有4种ATPsyn-β同工型和质谱数据表明ATPsyn-β是受多位点磷酸化调控的，当前数据显示：人F1-ATP合酶的催化性β亚基在骨骼肌中受磷酸化调节，但是在2型糖尿患者中这种调节方式可能改变了。
而且，分子量为78kDA的葡萄糖调节蛋白质(GRP78)在2型糖尿患者肌肉组织中的表达水平也显著上调。我们观察到2型糖尿病受试者体内GRP78表达水平显著上升，并且在三种已鉴定的同工型中只有最基本(非磷酸化)和最具活性的同工型显著上调。
四个斑点，均被假定为IV型胶原蛋白α-1链[α1(IV)胶原蛋白]的同工型，表明这个蛋白质及其同工型在2型糖尿患者中均显著上调。
在对照受试者中本发明者观察到了在ATPsyn-β磷酸化的同工型表达水平的下调和空腹血浆FFA之间的负相关(图3B)，然而在2型糖尿患者中该磷酸化同工型的表达和FFA之间并无关联而是反过来同空腹血糖具有逆相关性(图3A)。这一点很有趣，因为肌肉中解偶联蛋白3的mRNA水平同非糖尿病受试者空腹状态下的FFA循环水平呈现出正相关(23)，但是在2型糖尿患者中并没有观察到这种相关性(24)，而是观察到了高血糖症与ATPsyn-β的磷酸化同工型表达下调之间的关系。
总之，采用蛋白组分析，本发明者惊奇地发现在2型糖尿患者受试者肌肉中有15个蛋白质被上调或下调。这些蛋白质中有11个已经通过质谱鉴定出来了。在吸收完毕状态这些蛋白质可用作2型糖尿病骨骼肌中的标记蛋白质。IV型胶原蛋白同工型还没有作为在糖尿患者骨骼肌组织中上调的蛋白质被公开，而11种蛋白质中的剩余部分以前并未同DM2直接相关。
最令人吃惊的是，本发明者证明F1-ATP合酶的催化性β-亚基被磷酸化了。另外，本发明者还发现，糖尿患者肌肉中一种β-亚基磷酸化同工型的表达显著降低了，并且其表达水平同血糖的水平呈负相关的关系。这些资料表明ATP合酶β-亚基的磷酸化在ATP合成中的作用，并表明该蛋白质调节的改变贡献于2型糖尿病的形成。
表1  临床特征
对照  DM2  P
N 6  9
年龄(岁) 46.1±1.5  44.8±1.5  ns
体重指数(kg/m2) 25.7±1.2  33.3±1.9  0.01
男性/女性 3/3  5/4  ns
空腹葡萄糖(mmol/L) 5.3±0.1  8.5±0.7  0.002
空腹FFA(mmol/L) 0.28±0.04  0.44±0.08  ns
空腹胰岛素(pmol/L) 37±11  93±12  0.005
空腹C-肽(pmol/L) 575±120  1195±93  0.001
2型糖尿病(DM2)组和对照组受试者的临床特征。数据代表平均数±S.E.M，P值由Student t实验给出。Ns代表不显著。男性/女性比率由CHI-平方测试给出。
表2  MALDI TOF MS分析鉴定的2型糖尿病标记蛋白质
斑点号码  蛋白质 数据库登录号  理论等电点/分子量  序列覆盖率  匹配的肽  对照组％IOD±SEM 糖尿病组％IOD±SEM
180  ATP合酶β-亚基 P06576  5.0/52  56％  19  0.56±0.05 0.41±0.03**
10  IV型胶原蛋白α1(VI)链 P12109  5.3/110  10％  10  0.06±0.01 0.09±0.01*
11  IV型胶原蛋白α1(VI)链 P12109  5.3/110  5％  5  0.04±0.00 0.06±0.01**
407  IV型胶原蛋白α1(VI)链 P12109  5.3/110  6％  6  0.05±0.01 0.08±0.01*
520  IV型胶原蛋白α1(VI)链 P12109  5.3/110  6％  5  0.06±0.01 0.09±0.01*
541  肌酸激酶B P12277  5.3/43  42％  12  0.32±0.04 0.20±0.02*
375  葡萄糖调节蛋白78 P11021  4.9/78  28％  12  0.06±0.01 0.08±0.01*
81  热休克蛋白90β P08238  5.0/84  15％  11  0.03±0.01 0.05±0.00*
295  肌球蛋白轻链2(A) P10916  4.9/19  58％  9  1.26±0.10 0.92±0.10*
445  肌球蛋白轻链2(B) AAK52797  4.9/19  52％  7  0.30±0.08 0.69±0.12*
456  磷酸葡萄糖变位酶1 P36871  6.2/62  25％  12  0.14±0.04 0.28±0.04*
2型糖尿病骨骼肌中的蛋白质标记物同它们的数据库登陆号、理论分子量(mW)及等电点(pI)。
这些标记蛋白质的表达水平用它们的整合光密度百分含量(％IOD)的平均数±SEM表示。
*p＜0.05相对于对照**p＜0.01相对于对照
表3  质谱没有鉴定的2型糖尿病标记蛋白质
  匹配号码 表达(％IOD)   ～pI§   -mW(kDa)§
  DM2   对照
  199   0.025±0.015   0.067±0.032**   ～5.2   ～45
  303   0.154±0.049   0.098±0.047*   ～5.6   ～55
  391   0.028±0.028   0.072±0.046*   ～5.0   ～25
  511   0.052±0.020   0.023±0.013**   ～4.9   ～65
表达水平用它们的整合光密度百分含量(％IOD)表示，平均值±SD。
§，从二维凝胶的位置预计的近似值。
*p＜0.05相对于对照    **p＜0.01相对于对照
表达水平％IOD是使用pH值4-7的IPG胶条确定的。如果使用的凝胶系统同在此所用系统不同，其实际结果也可以不同。
蛋白质上调或下调的测试
自股外侧肌上取下一小块皮下针活组织切片，将其置入低渗溶液中(裂解细胞和线粒体)。该溶液含有蛋白水解酶、激酶及磷酸化酶抑制剂。振荡15分钟，释放蛋白质，然后取100μl该溶液加到已制备好的ELISA微孔平板合适的孔中。
微孔平板已经用抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)包被好，每行用一种抗体包被(不包括标准品—肌动蛋白和核酮糖二磷酸羟化酶)，它们可以特异性识别ATP合酶、磷酸化ATP合酶以及表2中已鉴定的部分或所有其它蛋白质。其它蛋白质(如糖原合酶)的抗体也在其中。另外还设了一种阳性对照(如肌动蛋白)和一种阴性对照(即一种不能被识别的蛋白质，如植物蛋白质核酮糖二磷酸羟化酶)以确保免疫反应正常进行。含有当前讨论的几种蛋白质标准曲线的平板在下面图解中给出。这些标准曲线可通过重组蛋白质、修饰或适当裂解蛋白质绘出。
Figure A0281980800361
然后将微平板在4℃放置1小时，清洗、显色，并在ELISA平板读数器上读取数据。某些读数器能够参照标准曲线计算出未知样品中特异蛋白质的数量。如果肌动蛋白不显色或核酮糖二磷酸羟化酶显色，则该平板被排除。
众所周知，每一种蛋白质都有平均值以及最大最小容限(相当于健康个体的通常范围)。当某人体内的某个蛋白质超出这些极限，即可认为他患上了一种2型糖尿病相关疾病。两种或更多诊断标记蛋白质呈阳性比仅一种呈阳性更有意义。例如观察到最近患局部缺血的患者体内肌酸激酶高度表达，因此，这个标记物就其本身而言，对于鉴定2型糖尿病仍然不够充分。
当然，还有许多本领域技术人员熟知的其它方法也可以得出本质上相同的诊断结论。此处所得数据可同其它糖尿病的相关数据如血糖或游离脂肪酸的水平结合起来，从而提高预测或诊断的特异性的可靠性。
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Claims (24)

1.诊断或确定人对至少一种糖尿病相关疾病，优选2型糖尿病，的易感性的方法，该方法包括确定取自于该人生物学样品中至少一种标记蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平，而该标记蛋白质选自：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3所公布的特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前体、类似物或修饰物；并且
可选将所述蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平同取自至少一个正常人的生物学样品中所述蛋白质的存在、活性、浓度和/或表达水平进行比较。
2.权利要求1的方法，该方法包括：
(A)确定取自该人的生物学样品中至少一种标记蛋白质的增加的表达、修饰、活性和/或浓度，该标记蛋白质选自：
(a)磷酸葡萄糖变位酶1；
(b)热休克蛋白90β；
(c)肌球蛋白调节轻链2上调同工型；
(d)胶原蛋白α1(VI)链；
(e)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(f)由表3所公布的特性定义的标记蛋白质(匹配号：303或511)；
(g)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(h)(a)到(f)中任一多肽的衍生物、类似物或修饰物；和/或
(B)确定取自该人的生物学样品中至少一种标记蛋白质(下调的标记蛋白质)降低的表达、修饰、活性和/或浓度，该标记蛋白质选自：
(a)ATP合酶β亚基或其磷酸化的同工型；
(b)肌酸激酶β亚基；
(c)肌球蛋白调节轻链2下调同工型；
(d)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199或391)；
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；
(f)(a)到(d)中任一多肽的衍生物、类似物或修饰物；
其中增高或降低的表达、修饰、活性和/或浓度相对于取自正常人的生物学样品的所得值。
3.权利要求1-2中任何一项的方法，其中生物学样品选自：尿、血液、淋巴液、唾液和组织。
4.权利要求3的方法，其中组织是肌肉组织，如股外侧肌。
5.基本纯的多肽，其包含至少一种选自下列的氨基酸序列：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3所公布的特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一氨基酸序列或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物；
用作药物，如用于治疗至少一种糖尿病相关疾病，优选2型糖尿病。
6.基本纯的多肽，其包含至少一种选自下列的氨基酸序列：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3所公布的特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一氨基酸序列或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物；
条件是排出(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中的氨基酸序列。
7.权利要求5或6的基本纯的多肽，其中该氨基酸序列类似物与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一序列有至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列同一性。
8.用于治疗至少一种糖尿病相关疾病，优选2型糖尿病，的药物组合物，其含有至少一种权利要求5-7任一项的多肽或其模拟物、抗模拟物或适体。
9.药物组合物，其含有：
(a)至少一种物质，其能够调节如权利要求5、6或7的肽的至少部分的编码核酸片段的表达；和/或
(b)至少一种所述多肽；和/或
(c)所述多肽或其修饰产物的至少一种抗体；和/或
(d)至少一种核酸片段，其能与编码所述多肽的、包括其调节元件的核酸序列或其互补链杂交；和/或
(e)至少一种化合物，如核酸片段，其能与所述多肽结合；和/或
(f)至少一种化合物，其能修饰该疾病的相关的蛋白质的形式而使其相对的表达、活性和/或浓度向健康人的方向改变；和/或
(g)至少一种能够标记至少(如用泛醌)一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中对于更快的更新或降解其表达量相对太高；和/或
(h)至少一种能够标记至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质对于更慢的更新或降解其表达量相对太低。
10.用于治疗人的糖尿病相关疾病的方法，包括改变至少一种标记蛋白质的表达、修饰、活性和/或浓度，而该标记蛋白质选自：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前体、类似物或修饰物。
11.用于治疗人的糖尿病相关疾病、防止所述疾病和/或延迟所述疾病在人体内发作的方法，该方法包括向所述人施用至少一种选自下列的化合物：
(a)权利要求5-7任一项的多肽；
(b)编码(a)中多肽的核苷酸序列；
(c)能结合(a)中多肽的抗体；
(d)核酸片段，其能与至少部分(a)中多肽的编码核酸序列或能与所述核酸的互补链杂交，包括其调节元件；和/或
(e)能与(a)中多肽结合的化合物；
(f)能够上调或下调至少一种(a)中多肽的表达、活性和/或浓度的化合物；
(g)能修饰与该疾病相关的蛋白质的形式的化合物，使得该蛋白质的相对表达、活性和/或浓度向健康的人方向改变；
(h)能够标记(如用泛醌)至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质在该疾病中对于更快的更新或降解其表达量相对太高；和
(i)能够标记至少一种所述蛋白质的化合物，这些蛋白质对于更慢的更新或降解其表达量相对太低。
12.权利要求5-7中任一项的多肽的用途，用于生产药物，如治疗糖尿病相关疾病的药物，优选2型糖尿病。
13.确定药剂在治疗糖尿病相关疾病中是否可能具有治疗功效的方法，其包含在将测试模型暴露于所述试剂之前和之后确定一种或更多多肽的表达水平，并比较所述水平，这些多肽选自于：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前体、类似物或修饰物。
14.确定化合物在治疗糖尿病相关疾病中的效果的方法，其包含确定一种或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如权利要求13所述的多肽的表达水平。
15.确定用于治疗糖尿病相关疾病的化合物的效果水平的方法，其包括在将测试模型暴露于所述试剂之前和之后确定一种或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如权利要求13所述的多肽的表达水平。
16.确定患有或易于患糖尿病相关疾病的人的所述疾病的特点或原因的方法，其包括相对某种模型确定一种或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如权利要求13中所述的多肽的表达水平。
17.核酸片段，其包括：
(A)编码多肽或其调节元件的核苷酸序列，该多肽包含至少一种选自下列的氨基酸序列：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中氨基酸序列或其部分中优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前体、类似物或修饰物；或
(B)核苷酸序列，其与(A)中核苷酸序列、与该核苷酸序列的调节序列或与该核酸序列的互补链杂交。
18.权利要求17的核酸片段的用途，用于检测糖尿病相关的标记蛋白质的存在或水平或者编码所述标记蛋白质的核酸序列的存在或水平。
19.能与标记蛋白质结合的抗体，该标记蛋白质选自于：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前体、类似物或修饰物。
20.权利要求19的抗体，其为多克隆抗体。
21.权利要求19的抗体，其为单克隆抗体。
22.权利要求19-21任一项中抗体的用途，用于检测糖尿病相关疾病相关的标记蛋白质的存在或水平。
23.用于在哺乳动物中诊断糖尿病相关疾病或其对所述病例如遗传学上的易感性的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
(A)至少一种特异性结合至少一种选自下列的标记蛋白的结合手段：
(a)ATP合酶β亚基或磷酸化的ATP合酶β亚基的同工型；
(b)磷酸葡萄糖变位酶1；
(c)热休克蛋白90β；
(d)肌酸激酶β亚基；
(e)肌球蛋白调节轻链2；
(f)胶原蛋白α1(VI)链；
(g)78KDa葡萄糖调节蛋白；
(h)由表3公布特性定义的标记蛋白质(匹配号：199，303，391，或511)；
(i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一的多肽或其部分优选有至少70％同源性的类似物；和
(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前体、类似物或修饰物；
例如：i)所述标记蛋白质的抗体；ii)能与所述标记蛋白质结合的核酸片段；和/或iii)能与所述标记蛋白质结合的化合物(如抗模拟物)；
(B)至少一种用于检测结合手段与至少一种所述标记蛋白质的结合(若有的话)或结合水平的手段；并且，如必要，
(C)至少一种将同所述结合手段的结合(若有的话)或该结合水平是否标记个体哺乳动物有患该疾病的高度可能性或(遗传学上)易感性相关联的手段。
24.用于确定物质在治疗糖尿病相关疾病中的效果的方法，该方法包含使用经确定具有高度可能性患所述疾病或具有对该疾病的(如遗传学上)易感性的哺乳动物或该动物的一部分，例如通过使用权利要求1中的方法，所述方法包括对所述哺乳动物或其部分施用该物质并确定其效果，优选确定在对所述哺乳动物或其部分施用该物质前后，根据权利要求5-7中任一项的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6或更多)多肽的水平。
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