CN1330550A - 具有催产素活性的物质在引起细胞再生中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有催产素活性的物质在增进细胞再生中的应用。它还涉及一种药物组合物,该组合物包含至少一种具有催产素活性从而增进细胞再生的物质。

Description

具有催产素活性的物质在引起细胞再生中的应用
本发明涉及具有催产素活性的物质在引起细胞再生中的应用。它还涉及一种药物组合物，该组合物包含至少一种具有催产素活性而引起细胞再生的物质。
催产素是被分离和测序的第一肽激素之一。它是具有两个半胱氨酸残基(在位置1和6之间形成二硫键)的九肽，如下式所示：
Figure A9981267200041
很久以来，催产素仅有的效果是对排乳和子宫收缩的刺激作用，但在过去数十年中，证实催产素在中枢神经系统(CNS)中产生宽范围的效果。有人认为，催产素参与控制记忆和学习过程以及各种行为(例如喂养，运动，以及母性和性行为)。还有人认为，催产素参与控制心血管功能、体温调节、痛觉阈和液体平衡。还有证据表明催产素参与各种免疫过程的控制。最近证实了，重复施用后，催产素注射引起血压的降低和体重增重-持久的效果。作为中枢刺激物质，催产素在哺乳动物的母体和子代之间的相互作用中起重要作用。所述产品还在未成年人中被用作预防剂，例如，已在新生婴儿或儿童中被用来预防以后的生活中疾病的发作，所述疾病依赖于胎儿生活中的应激病况。这样的病况可能是心脏/血管疾病，例如中风、心肌梗死、高血压和糖尿病。
关于催产素的合成性生产描述了不同的方法，工业方法例如描述于美国专利2,938,891和3,076,797中。
在人体中，催产素是在下丘脑的室旁核(PVN)和视上核(SON)中产生的。它与也在这些核中产生的血管升压素仅有两个氨基酸不同。SON和PVN大细胞催产素能神经元将PVN突状物中产生的小细胞神经元发送入CNS内许多区中。催产素生产细胞受胆碱能神经元、儿茶酚胺能神经元和肽能神经元的神经支配。证明了在脑外不同组织(例如子宫、卵巢、睾丸、胸腺、肾上腺髓质和胰腺)中存在催产素，而且认为催产素在这些器官中产生局部效果。
响应某些刺激(例如哺乳)而发生催产素平行分泌入脑区和分泌入循环，但其它刺激物能引起催产素能神经元的单独活化，在脑或垂体中终止。
在本文中，只要适合，催产素除了指催产素外，还指显示相同特性的前体、代谢衍生物、催产素兴奋剂或类似物。
有数种催产素衍生物，即，具有与催产素类似结构的化合物。有初步指征说明，除催产素以外的其它催产素衍生物能给出催产素和部分催产素分子的细胞再生效果。还没有文献报导除催产素或部分催产素分子以外的其它催产素衍生物在增进细胞再生方面的应用。在实验中，证实了催产素通过中枢作用的方式增大大鼠的中枢α2-受体的活性。这些受体具有抑制作用并且对抗脑内去甲肾上腺素的活化方面，它们主要是通过α1-受体介导的，α1-受体活化环腺苷酸。当α2-受体刺激超过α1-受体刺激时，通过松弛交换活性，而且能量朝向生长和愈合转移，即，未用于应激或肌收缩和活性。结果副交感神经音胜过交感神经音，于是，肌肉系统松弛。可推测，催产素在人体内也产生类似的效果。在母乳喂养(一种以重复分泌催产素为特征的情况)过程中，发现了多次施用催产素后在实验动物中所观察到的全部结果。不知道催产素对α2-受体的效果是如何被介导的，但可能不是通过传统的催产素受体介导的效果。
催产素的效果可通过与下述药物组合施用而扩大或增强，即，增大催产素的释放和/或受体的数量或亲和性的药物(例如雌激素)，或者具有α2-兴奋效果的药物(例如可乐定)。
现已证明，催产素刺激胎儿生长(实施例1)；增强卵巢成熟和卵巢功能(实施例2)，即，抗不孕的效果，它有助于体外和体内受精以及增进精子和卵细胞生成；刺激外周神经病和中枢神经病的恢复(实施例3)；刺激人皮肤树突细胞(实施例4)；刺激皮肤角质形成细胞(实施例5)；刺激骨皮质厚度(实施例6)；减少编程性细胞死亡(实施例7)；保护以防佛波酯诱发的和噁唑酮诱发的炎症(实施例8)；具有对老化的皮肤和屏障形成的效果(实施例9)；以及减少细胞能量消耗(实施例10)。这些实施例表明了，催产素或具有催产素活性的物质可被用于细胞再生。
本发明涉及具有催产素活性的物质在增进细胞再生中的应用。本发明还涉及一种药物组合物，它包含有效浓度的至少一种具有催产素活性的物质，该物质与至少一种药物上可接受的载体或赋形剂混合或组合。这样的药物组合物可被用于增进细胞再生。
本发明的一个目的是具有催产素样的活性的物质在引起细胞再生中的应用。具有催产素活性的物质实例有如下化合物：催产素 鸟催产素 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Ile，X是Gln，Y是Ile，并且Z是Gly硬骨鱼催产素
Figure A9981267200063
即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Ile，X是Ser，Y是Ile，并且Z是Gly蚯蚓催产素(annetocin) 即，在权利要求2和4中，V是Phe，W是Val，X是Arg，Y是Thr，并且Z是Gly。
蚯蚓催产素是从蚯蚓中分离的，如下列文献中所述：Oumi T，UkenaK，Matsushima O，Ikeda T，Fujita T，Minakata H，Nomoto K，“蚯蚓催产素：一种从蚯蚓[赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)]中分离的催产素相关的肽”；生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys ResCommun)，1994年，1月14日；198(1)：393～399。还可应用具有催产素活性的其它物质，例如催产素的、鸟催产素的、硬骨鱼催产素的和蚯蚓催产素的天然的或人工修饰的变体、类似物和衍生物。这样的物质可通过在这些激素中添加、插入、消除或取代至少一个氨基酸而获得。具有催产素样活性的物质还被理解为本文提及的显示相同特性的物质的前体、代谢物[例如代谢衍生物(诸如代谢降解产物)]、兴奋剂或类似物。代谢衍生物或代谢降解产物可能是催产素样的肽，例如具有九个氨基酸的肽，例如催产素、鸟催产素、硬骨鱼催产素和蚯蚓催产素，已从它们的分子的一端或两端缺失了一个或多个氨基酸。优选可能从羧基末端缺失了一个、两个或三个氨基酸，即，只缺失Gly，缺失Gly和Leu，或者缺失Gly、Leu和Pro。优选可能从氨基末端缺失了一个、两个或三个氨基酸，即，只缺失Cys，缺失Cys和Tyr，或者缺失Cys、Tyr和Ile。优选可能既从羧基末端缺失了一个、两个或三个氨基酸，即，只缺失Gly，缺失Gly和Leu，或者缺失Gly、Leu和Pro；又从氨基末端缺失了一个、两个或三个氨基酸，即，只缺失Cys，缺失Cys和Tyr，或者缺失Cys、Tyr和Ile。可通过免疫方法确定这些变体是催产素、鸟催产素、硬骨鱼催产素或蚯蚓催产素的类似物，所述免疫方法例如是：RIA(放射免疫测定法)、IRMA(辐射计法)、RIST(放射免疫吸附测定法)、RAST(放射变应原吸附测定法)。
如上所述，有迹象表明，催产素分子的亚片断能引起细胞再生。优选地，催产素分子的这些亚片断是通过二硫键以外的氨基酸的缺失制备的。催产素分子的亚片断的实例有下列化合物：序列1
Figure A9981267200081
即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Ile，X是Gln，Y没有，并且Z也没有序列2 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Ile，X是Gln，Y是Leu，并且Z没有。
还可能通过计算机模拟创造具有催产素活性的新化合物。计算机模拟的方法是本领域技术人员已知的，例如描述于EP 0660 210 A2中。已通过计算机模拟创造七种新化合物，即下列肽：序列3 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Val，X是Thr，Y是Leu，并且Z是Gly序列4 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Hoph，X是Thr，Y是Val，并且Z是Gly序列5
Figure A9981267200091
即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Phe，X是Cit，Y是Leu，并且Z是Gly序列6 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Cha，X是Arg，Y是Hos，并且Z是Ala序列7 即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Val，X是Daba，Y是Daba，并且Z是Ala序列8
Figure A9981267200094
即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Hoph，X是Daba，Y是Cit，并且Z是Ala序列9
Figure A9981267200095
即，在权利要求2和4中，V是Tyr，W是Phe，X是Arg，Y是Val，并且Z是Ala，其中，Cha表示环己基丙氨酸，
Figure A9981267200101
Hoph表示高苯丙氨酸，
Figure A9981267200102
Cit表示瓜氨酸
Figure A9981267200103
Daba表示二氨基丁酸，并且Hos表示高丝氨酸。
本发明还涉及D-型和L-型的上述肽。特别是本发明涉及L-型。通过其肽序列的转换，D-型可被转化为L-型。D-型和L-型的效果相同。这些和上述肽可通过本领域技术人员已知的方法生产，例如，按Merrifield，P.B.，“固相合成”，应用化学(Angew.Chemie)，1985，No.97，p.801的方法生产。
可通过试验确定所述化合物具有催产素的效果，例如下文Cassoni，P.的公开中描述的试验和按下文实施例中的试验。
术语“细胞再生”，我们应理解为通过现有细胞和新细胞受控的和有益的再生以及细胞成熟(以便替代损伤的细胞)使人体或动物体恢复。现有细胞的产生可能包含赋予完整细胞活力及其生长刺激的意思，例如，突起，如神经细胞上的树突和轴突。所以，可治疗神经和肌的营养障碍疾病，例如多发性硬化(MS)和肌风湿病。Cassoni，P.，Sapino，A.，Fortunati，N.，Munaron，L.，Chini，B.和Bussolati，G.。反之，催产素通过环腺苷酸和蛋白激酶A抑制MDA-MB231人乳腺癌细胞的增殖。国际癌杂志(Int.J.Cancer)，72，340～344(1997)描述了乳腺癌细胞的抑制，但没有描述体内损伤的细胞是如何被替代的。
新细胞的增殖和细胞成熟可能还在如下疾病之后的痊愈过程中是重要的：心脏病发作或中风，萎缩，变性疾病(例如帕金森病和早老性痴呆)，牛皮癣，骨质疏松症，移植术后，平衡失调，子宫、肝、肾的破裂，为了改善妇女不育症和例如在癌治疗后恢复血细胞(例如红细胞、白细胞和淋巴细胞)的增殖，为了增大牲畜的重量，为了增强人的感觉(例如改善因衰老引起的视力、听力、嗅觉和味觉的损伤)，为了减轻失禁问题，在化妆品应用中为了使皮肤回春和对抗因衰老引起的皱纹，手术前增强愈合能力，以及帮助毛发和指甲生长。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，它包含有效浓度的至少一种具有催产素活性的物质，该物质与至少一种药物上可接受的载体或赋形剂混合或组合。具有催产素活性的物质实例有：鸟催产素、硬骨鱼催产素、蚯蚓催产素、序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9。
本发明的药物组合物可能包含扩大或增强催产素的效果的物质。这类物质能增大催产素的释放和/或受体的数量或亲和性(例如雌激素)，或者具有α2-兴奋效果的药物(例如可乐定)。
所述药物组合物是按制药领域技术人员已知的方式制备的。所述载体或赋形剂可以是能起活性组分的载体或介质作用的固体、半固体或液体物质。合适的载体或赋形剂是本领域已知的。所述药物组合物可适合经口、肠胃外或局部施用，而且可作为片剂、胶囊、栓剂、溶液、悬浮剂等给患者施用。
所述药物组合物可经口施用，例如与惰性稀释剂或与可食载体一起施用。它们可被包封于明胶胶囊中或被压成片。至于经口施药，本发明的化合物可与赋形剂掺和而用作片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖等。这些制剂应当包含至少4wt％本发明的化合物(活性组分)，但可根据具体形式变化，适当地为单位的4～70wt％。含于组合物中的活性组分量这样高，以致获得适合施药的单位剂型。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等还可包含至少一种下列佐剂：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；滑移剂，例如胶体二氧化硅；还可添加增甜剂(例如蔗糖或糖精)或者调味剂(例如薄荷油、水杨酸甲酯或橙香精)。当单元剂型是胶囊时，它除了含上述类别的物质外，还可包含液体载体(例如聚乙二醇或脂肪油)。其它单元剂型可包含其它修饰该单元剂型的物理形式的不同物质(例如涂层)。因此，片剂或丸剂可用糖、紫胶或其它肠溶包被剂包衣。糖浆剂除了含活性组分外，还可包含作为增甜剂的蔗糖以及某些防腐剂、染料和调味剂。用于制备这些不同组合物的原料应当是药物纯的，并且在应用的量时是无毒的。
至于肠胃外施药，可将本发明的化合物掺和在溶液或悬浮液中。肠胃外施药指不是通过消化道而是通过下列方法施药：通过某些其它途径的注射，例如皮下、肌内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、静脉内、鼻内、肺内；通过尿道；通过滴眼剂；经直肠或阴道的(例如栓剂、vagitorium、乳膏或软膏)；通过牲畜的输乳道；进入器官(例如骨髓等)。骨髓还可被体外处理。这些制剂可包含至少0.1wt％本发明的活性化合物，但可变化到它的大约0.1～50wt％。含于这类组合物中的活性组分量这样高，以致获得合适的剂量。
溶液或悬浮剂还可包含至少一种下列佐剂：无菌稀释剂，例如注射用的水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢纳；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张度调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可被包封于玻璃或塑料制造的安瓿、一次性使用的注射器或多剂量容器中。
至于局部施药，本发明的化合物可被掺和在溶液、悬浮剂或软膏中。这些制剂可包含至少0.1wt％本发明的活性化合物，但可变化到它的大约0.1～50wt％。含于这样的组合物中的活性组分量这样高，以致获得合适的剂量。可通过接触、施加压力、按摩、加热、加温或红外光照射皮肤促进施药，这样导致增强皮肤渗透性。Hirvonen，J.，Kalia，YN和Guy，RH，“通过离子电泳经皮送递肽”，自然生物技术(NatBiotechnol)1996年12月，14(13)：1710～1713描述了如何应用施加的电场驱动力增强经皮输送药物。优选在稍微碱性的pH下进行离子电泳。
其它施药形式有：通过肺吸入、通过口经颊施药和经小肠的肠内施药，可通过本领域技术人员已知的方法进行。
本文提及的所有公开出版物都在此并入作参考。我们应将术语“包含”理解为包括但不限于。所以，可以存在其它未提及的物质、添加剂或载体。
图1。在限制食物的和随意进食的、NaCl处理的和催产素处理的母畜中，受孕头14天和20天期间母体净重(总的体重-包括胎儿和胎盘组织的子宫重量)增重。营养的作用(p＜0.001)，处理的作用(p＝0.06)，受孕天数的作用(ns)，无显著相互作用。框形表示SEM，条形则表示SD。
图2。在受孕的第14天和20天，在限制食物的和随意进食的、NaCl处理的和催产素处理的母畜中子宫旁的脂肪组织。营养的作用(p＜0.001)，处理的作用(ns)，受孕天数的作用(ns)，相互作用(受孕的天数x处理)(p＜0.05)，无其它显著相互作用。*在受孕的第20天，随意进食的催产素处理组和NaCl处理组之间存在显著(p＜0.05)差异。框形表示SEM，条形则表示SD。
图3。在受孕的第14天和20天，在限制食物的和随意进食的、NaCl处理的和催产素处理的母畜中腹膜后的脂肪组织。营养的作用(p＜0.001)，处理的作用(ns)，受孕天数的作用(ns)，相互作用(受孕的天数x处理)(p＜0.05)，无其它显著相互作用。*在受孕的第20天，随意进食的催产素处理组和NaCl处理组之间存在显著(p＜0.05)差异。框形表示SEM，条形则表示SD。
将通过如下实施例阐述本发明，但无论如何，这些实施例只是阐述而不是限制本发明。
实施例
实施例1-刺激胎儿生长原料和方法动物
Nullipara雌性Sprague-Dawley大鼠(体重±12g)得自B & KUniversal AB，Sollentuna，Sweden。在控制温度(20±1℃)和湿度(45～55％)的房间中，动物被单只地关在笼内，照明600h～1800h。定量供给丸状食物(Lactamin，Vadstena，Sweden)。动物自由饮用自来水。在头四周中每周和受孕第1、14和20天以及哺乳的第1和20天，监控母畜的体重。在哺乳的第1、5、10、15和20天记录幼畜的体重。该研究获得the Stockholm Ethical Committee forExperiments in Animals的同意。动物试验
刚到时，将动物分成两组，一组随意进食，对另一组限量进食。在试验过程中，被限量进食的动物获得随意进食的动物平均消费的食物的70％。四周后，使大鼠交配并且认为怀孕了(受孕第1天)，初期精子见于它们的阴道涂片中。再将随意进食的和限量进食的受孕大鼠各分成两个小组：催产素处理组和对比组。在受孕的1～5天，每天一次用催产素(1mg/kg体重)对催产素处理组的动物进行皮下注射，而对比组的动物则被注射盐水(NaCl 0.9％)。在受孕的第14和20天杀死随意进食的和限量进食的动物，在哺乳的第20天，杀死随意进食的母畜和幼畜。在受孕的第23天傍晚，怀孕的大鼠产下它们的幼畜。次日被当作哺乳的第1天。在这一天，采集到8只幼畜/母畜的同窝仔。在相应于交配的大鼠受孕的第1天的时候杀死未怀孕的、随意进食的和限量进食的大鼠。于是，试验中包括如下12组：NaCl处理的、未怀孕的、随意进食的(n＝8)，NaCl处理的、未怀孕的、限量进食的(n＝8)，NaCl处理的、受孕的第14天、随意进食的(n＝4)，NaCl处理的、受孕的第14天、限量进食的(n＝8)，NaCl处理的、受孕的第20天、随意进食的(n＝10)，NaCl处理的、受孕的第20天、限量进食的(n＝l0)，NaCl处理的、哺乳的第20天、随意进食的(n＝4)，催产素处理的、受孕的第14天、随意进食的(n＝4)，催产素处理的、受孕的第14天、限量进食的(n＝9)，催产素处理的、受孕的第20天、随意进食的(n＝12)，催产素处理的、受孕的第20天、限量进食的(n＝13)，催产素处理的、哺乳的第20天、随意进食的(n＝3)。
通过断头术采集母体躯部血液。从子宫旁和腹膜后部位、肝脏、各胎儿和胎盘(只在受孕的第20天)剥离母体脂肪组织并称量。在断头术后立即将躯部血液采集入盛有10IU/mL肝素(Lvens Lkemedel，Malm，Sweden)和500IU/mL抑酶肽(Bayer AB，Stockholm，Sweden)的冷藏的塑料管。立即将样品离心，收获血浆并冷冻(-20℃)。血样的分析
在按Marchini G，Lagercrantz H，Uvns-Moberg K在“Plasmagastrin i newborn infants and their relationship tpcatecholamines”，J Dev Physiol 1990，14：147～155中描述的那样在Sep-Pak C18柱体(Water Corporation，Milford，MA，USA)上纯化血浆(500μl)，再溶于500μl分析缓冲液(0.05M含0.1％BSA的磷酸盐缓冲剂，pH 7.5)后，用放射免疫测定法(RIA)测定催产素。测定在+4℃下与50μl抗体A19(Euro-Diagnostica AB，Malm，Sweden)保温24h后纯化的血浆(100μl)中的催产素浓度。添加50μl比活度为2200Ci/mmol的示踪物(125I)-Tyr2-催产素(DuPont NEN ReseachProducts，Boston，MA，USA)，继续在+4℃下保温48h。用0.05M含0.1％BSA的磷酸盐缓冲剂稀释抗体和(125I)-Tyr2-催产素。与精氨酸-(8-精)加压催产素的交叉反应性是0.01％，与赖氨酸-(8-精)加压催产素的交叉反应性＜0.01％，而与精氨酸-(8-精)加压催产素的交叉反应性是0.1％。通过样品与第二种兔抗体Decanting Suspension3(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB，Uppsala，Sweden)保温而分离结合级分与未结合级分。将样品离心(1700xg)10min，滗去上清液，测定沉淀物中的放射性。检测极限是3.2pmol/l。变量的外分析和内分析系数分别是18％和26％。统计分析
以平均值±SD表示结果。通过双向ANOVA估测随意进食的动物和限量进食的对比动物的怀孕效果，以营养(随意进食的比限量进食的)和受孕的天数(未怀孕的、第14天和第20天)作为变量成分。通过三向ANOVA估测催产素处理的效果，以营养(随意进食的和限量进食的)、处理(催产素比盐水)和受孕的天数(第14天比第20天)作为变量成分。如果发现显著相互作用，就应用计划的比较法估测催产素处理组和相应的NaCl处理组之间的差异。应用关于独立平均值的学生t检验估测了催产素处理组和NaCl处理组之间蛋白水解活性差异和出生后的幼畜重量差异。当p＜0.05时，就认为结果是显著性的。结果
催产素处理的大鼠在怀孕过程中倾向于(p＝0.06)比它们的NaCl处理的对应组更小的净重增重(图1)。在受孕的第20天，随意进食的催产素处理的大鼠相对地(净体重的％)比盐水处理的大鼠具有更少的子宫旁脂肪组织(图2)和腹膜后脂肪组织(图3)，而在怀孕早期，在催产素和盐水处理的大鼠之间，子宫旁脂肪组织和腹膜后脂肪组织的量没有差异。
与NaCl处理的大鼠的孕体和子代相比，随意进食的、催产素处理的母畜的胎儿和胎盘在受孕的第20天都更大，而且出生重量更高(表1)。在来自随意进食的、催产素处理的和NaCl处理的母畜的幼畜之间出生后的体重没有其它变化。与随意进食组相反，催产素对限量进食组的胎儿重量没有作用(表1)。
表1.随意进食的和限量进食的动物的生殖结果。表中的值都是平均值±SD
             随意进食的            限量进食的
NaCl 催产素 NaCl 催产素
胎儿/幼畜重量(g)
受孕第14天a 0.067±0.011  0.069±0.009  0.058±0.010  0.060±0.014
受孕第20天a 2.137±0.168  2.275±0.213b  1.914±0.274  1.879±0.255
哺乳第1天 7.291±0.232  7.619±0.473b
哺乳第5天 14.425±0.512  14.783±0.958
哺乳第10天 26.391±1.285  26.648±1.565
哺乳第15天 39.350±2.315  40.417±2.489
哺乳第20天 52.321±3.106  54.021±3.253
胎盘重量(g)
受孕第20天a 0.476±0.086  0.530±0.089b  0.429±0.058  0.412±0.067
a随意进食组和限量进食组之间的显著差异bNaCl处理组和催产素处理组之间的显著差异讨论
催产素对于随意进食的动物中胎儿生长具有小但显著有益的效果，但对于出生后的幼畜在哺乳期间的生长没有进一步的效果。可以想象到催产素的其它剂量、施药方式或方法可进一步促进胎儿生长。催产素的效果可能因受孕期间施药的时间而改变。按本发明，在受孕的头五天中(这段时间还没有移入受精卵)注射催产素。因此，催产素对胎儿生长的刺激作用可能通过改变母体对怀孕的适应性来解释，对于例如胎盘营养物质转移能力或者母体在怀孕晚期活动其体内贮藏物的能力具有正效应。实施例2-卵巢成熟和功能的增强
神经营养蛋白(NT)对于中枢神经系统和外周神经系统中的神经群体分化和存活具有重要作用。在卵巢中发现至少四种不同的神经营养蛋白。原料和方法动物
该动物模型如Petersson M，Alster P，Lundeberg T和Uvns-Moberg K在“催产素引起雌性和雄性大鼠中血压的长期降低”，生理学&行为(Physiology & Behavior)，Vol.60，No.5，pp.1311～1315，1996中所述，但只应用雌性大鼠。试验分两个系列进行。对雌性Sprague-Dawley大鼠(230～250g)进行皮下注射。至少在试验前3周运来动物并且每笼关5只，让它们自由进食和饮水。光照方案是12/12h亮/暗循环。室温是20±2℃。通过阴道涂片的显微镜检查确定动情周期的阶段。试验设计
对雌性大鼠在连续5天期间经皮下注射NaCl，催产素0.01、0.1和1mg/kg(Ferring，Malm，Sweden)再注射NaCl。选择五天处理期是为了覆盖大鼠的动情周期。将药物溶于生理盐水，以1mL/kg的量注射。在整个处理期间，对比动物接受皮下注射NaCl(1mL/kg)。结果
结果表明，与对比组相比，催产素处理的大鼠的表达(通过NGF基因刺激)和合成增强了，通过PCR、RNA印迹以及卵巢中的NGF trkA受体(22％≥对比组)和NGF(26％≥对比组)的放射自显影术证实了这一点。这导致卵泡产生和随后的卵泡发育的增强[Ojeda和Dissen，“卵巢发育”(Ovarian development)，p.32(1994)]。实施例3-外周神经病和中枢神经病的痊愈原料和方法动物
该动物模型如Petersson M，Alster P，Lundeberg T和Uvns-Moberg K在“催产素引起雌性和雄性大鼠中血压的长期降低”，生理学&行为，Vol.60，No.5，pp.1311～1315，1996中所述。试验分两个系列进行。对雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠(230～250g)进行皮下注射，并且对雄性Sprague-Dawley大鼠(335～375g)进行大脑室内(icv)注射(B & K Universal AB，Sollentuna，Sweden)。至少在试验前3周运来动物并且每笼关5只，但进行icv插管的动物都是单独关在笼中，让它们自由进食和饮水。光照方案是12/12h亮/暗循环。室温是20±2℃。对雌性大鼠来说，通过阴道涂片的显微镜检查确定动情周期的阶段。对于icv注射的手术
腹膜内(ip)注射50mg/kg戊巴比妥钠(Apoteksbolaget，Sweden)引起麻醉后，打开脑壳，用丙烯酸牙粘固粉将导引插管(21g)立体定位地固定到脑壳上。坐标处于前囟1.00mm后和1.30mm侧。导引达到硬膜，但不透过硬膜，针尖处于侧室中。手术后使动物恢复1周。试验结束时，通过注射2μl甲苯胺蓝检查导引插管的位置。试验设计
对雄性和雌性大鼠在连续5天期间经皮下注射NaCl，催产素0.01、0.1和1mg/kg(Ferring，Malm，Sweden)再注射NaCl。选择五天处理期是为了覆盖雌性大鼠的动情周期。将药物溶于生理盐水，以1mL/kg的量注射。在整个处理期间，对比动物接受皮下注射NaCl(1mL/kg)。
在第二个系列的试验中，在5天中对提供长期icv插管的雄性大鼠以5μl的量经icv施给(1μg/kg)催产素。对比动物接受5μl盐水icv。NGF的作用
近年来，神经生长因子(NGF)(一种对于中枢神经系统和外周神经系统的损伤细胞的生长、分化和再生有效的作用剂)已经被指出是能逆转人体中神经变性事件中的细胞损伤过程的潜在治疗剂。因为NGF不穿过血脑屏障，而NGF中枢给药法需要侵入性的手术操作，所以在脑中发现体内调节NGF合成的物质将对于NGF的可能临床应用特别有用。而且，NGF是靶-衍生的(target-derived)生长因子，它对于外周感觉神经元和交感神经元的生长和分化起关键作用。已证明NGF不但促进手术损伤的和化学损伤的外周神经细胞损伤的存活，而且促进糖尿病性神经病、麻风病、局部缺血后冠状神经分布的存活而且促进能勃起功能。通过这些观察结果，认为NGF可能在外周神经病的治疗中起作用。因为很多细胞能产生局部的和循环的NGF，所以，一种可行的方法是鉴定诱导体内NGF的上调的化合物。中枢效果
该研究的目的是分析是否可通过外周(皮下，sc)施用催产素来影响成熟大鼠脑中NGF的含量。通过应用关于NGF的灵敏免疫酶促分析法分析了下丘脑和海马趾中的NGF浓度。
表2示出了结果，这些结果是在用催产素皮下注射的大鼠海马趾和下丘脑中关于脑NGF含量(pg/g组织)获得的(与盐水处理的对比动物比较)。表2.用催产素皮下注射的大鼠脑NGF含量(pg/g组织)
脑的部分 用盐水处理的 用催产素处理的
海马趾 4312±213  5674±389
下丘脑 447±66  1543±455
表2中的结果启示，皮下注射催产素能调节脑中NGF含量。外周效果
为了阐明皮下注射催产素的外周效果，应用了大鼠中的两个外周神经病模型：一个涉及外周感觉神经系统(通过应用辣椒辣素)，另一个则涉及外周交感神经系统(通过应用6-羟多巴胺，6-OHDA)。在该研究中，我们应用了这些动物模型来研究外源性施用催产素能否影响6-OHDA对虹膜/后爪的改变和辣椒辣素对后爪的改变。下表示出了结果，这些结果是在用催产素皮下注射的大鼠的虹膜(表3)和后爪(表4关于6-OHDA，表5关于辣椒辣素)中关于外周含量(pg/g组织)获得的(与盐水处理的对比动物比较)。
表3.用催产素皮下注射的大鼠虹膜中外周NGF含量(pg/g组织)(与盐水处理的对比动物比较)，通过应用6-OHDA。
NGF pg/g
 6-OHDA+盐水 834±115
 6-OHDA+催产素 9844±1206
表4.用催产素皮下注射的大鼠后爪中外周NGF含量(pg/g组织)(与盐水处理的对比动物比较)，通过应用6-OHDA。
NGF pg/g
6-OHDA+盐水 756±223
6-OHDA+催产素 6711±987
表5.用催产素皮下注射的大鼠后爪中外周NGF含量(pg/g组织)(与盐水处理的对比动物比较)，通过应用辣椒辣素。
NGF pg/g
辣椒辣素+盐水 1039±438
辣椒辣素+催产素 1432±519
为了阐明处理作用是否具有生理显著性，应用了电热板响应。表6示出了分别用辣椒辣素+盐水和辣椒辣素+催产素处理的动物舐的(惊吓反应)潜伏期。
表6.用催产素处理的大鼠舐的(惊吓反应)潜伏期(以秒表示)，后爪中(与盐水处理的对比动物比较)，通过应用辣椒辣素。
舐的潜伏期(sec)
辣椒辣素+盐水 43±15
辣椒辣素+催产素 32±9
表3～6中的结果表明，重复施用催产素增大了损伤组织中的NGF含量，这可能具有功能含义。实施例4-刺激人皮肤树突细胞原料和方法
应用了破伤风毒素(TT)模型，如Demotz等在免疫学杂志(JImmunol)143：3881～3886中描述的那样。在该研究中，我们打算研究催产素对破伤风毒素激发的T细胞增殖模型(增殖分析)的影响。我们应用TT作为模型抗原，因为大多数瑞典患者具有接种TT的个案史并且拥有循环TT特异性记忆T细胞。为了测试催产素的效果，将一组树突细胞与催产素预保温，而将另一组与盐水预保温。静息的CD4阳性T细胞被用作应答物。使树突细胞与TT在37℃下脉冲2小时，再与5×100,000个应答细胞保温，导致刺激物：应答物的比率为1∶1,000、1∶100和1∶10。3天后测定这些培养物中的增殖反应。树突细胞
树突细胞属于抗原呈递细胞的一个家族，它们位于淋巴组织的T细胞附属区。树突细胞还见于屏障区，此处可能发生抗原进入人体(例如皮肤、肺和肠)。最近的资料表明，皮肤树突细胞在接触性超敏反应[Tse和Cooper，1990，皮肤病学研究杂志(J Invest Derm)94：267]、牛皮癣[Nestle等，1994，临床研究杂志(J Clin Invest)94：202～209]、淋巴组织增生障碍[Nestle等，1995，皮肤病学(Dermatol)190：265～280]中的作用。还研究了树突细胞向T细胞提供来自细菌的超级抗原和可溶性蛋白质抗原的潜能。[Nestle和Nickoloff，1995，实验医学与生物学进展(Adv Exp Med Biol)378：111～116]。结果
表7示出了3H-胸腺嘧啶核苷掺合数[以每分钟的数目(cpm)表示]，它作为与催产素预保温的树突细胞的刺激细胞数的函数(比较与盐水预保温的树突细胞)。表7.以cpm表示的3H-胸腺嘧啶核苷掺合数，它作为与催产素预保温的树突细胞的刺激细胞数的函数(比较与盐水预保温的树突细胞)。
刺激细胞数 3H-胸腺嘧啶核苷掺合数(cpm)
盐水 催产素
50  3,200  4,300
500  4,800  7,400
 5,000  12,000  15,100
表7中的结果表明，催产素增大了树突细胞TT特异性T细胞增殖的诱导。实施例5-刺激皮肤角质形成细胞原料和方法
应用了Rheinwald JG和Green H“人表皮角质形成细胞品系的系列培养：角质化集落从单细胞的形成”，细胞(Cell)6：331～334(1975)的方法来培养人角质形成细胞。该方法应用了补加有牛垂体提取物和表皮生长因子、不合血清的角质形成细胞培养基；应用了主要在传代3～5代培养的角质形成细胞。然后用催产素或盐水激发角质形成细胞。再应用酶联免疫吸附测定法(夹心式ELISA)对细胞培养基分析TGF-b1。角质形成细胞疗法
人们熟知，TGF-b1是刺激在分化、形态发生和伤口愈合中重要的各种基质蛋白的合成和沉积最有效的生长因子之一[Goldstein RH，Foliks CF，Pilch PF，Smith BD 和Fine A，“通过胰岛素和胰岛素样生长因子I刺激人肺成纤维细胞培养物中的胶原形成”，内分泌学(Endocrinol)124：964～970(1989)；Roberts AB和Sporn MB，见Sporn MD和Roberts AB编辑的“实验药理学手册，肽生长因子和它们的受体”(The Handbook of Experimental Pharmacology，PeptideGrowth Factors and their Receptors)，Springer Verlag，Heidelberg，1989，p.419～472中；Hill DJ，Logan A，McGarry M，De Sousa D：“通过碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I和II、胰岛素和转化生长因子-β1的相互作用控制分离的胎牛生长面软骨细胞中蛋白质和基质分子的合成”，内分泌学杂志(JEndocrinol)133：363～373(1992)]。还建立了体内培养角质形成细胞至合生供移植到患有严重皮肤损伤(通常是热致损伤)的患者的方法[Green H，Kehinde O和Thomas J，“培养的人表皮细胞在适合移植的复层上皮中的生长”，美国国家科学院院报(Proc Nat AcadSci(USA))76：5665～5668(1979)]。因此，角质形成细胞疗法不但为热损伤后而且为其它先天的和后天的皮肤病提供巨大的新治疗方法潜力。结果
表8示出了细胞培养基中的TGF-b1浓度(以pg/mL表示)。表8.用催产素激发的角质形成细胞的细胞培养基中的TGF-b1浓度(pg/mL)(与用盐水激发的角质形成细胞相比)。
TGF-b1浓度(pg/mL)
角质形成细胞+盐水 12±4
角质形成细胞+催产素 34±8
表8中的结果表明，催产素增大了角质形成细胞生产TGF-b1的产量。实施例6-刺激骨皮质厚度原料和方法
应用了Ostenson等的方法[糖尿病并发症杂志(J DiabetesComplications)1997年11月，11(6)：319～322]。它们研究了骨质减少的发生，通过长期遗传的非胰岛素依赖性糖尿病的非过度肥胖动物模型(NIDDM)[即，8个月大小的Goto-Kakizaki(GK)大鼠]中骨皮质厚度的减小反映了这个现象。此外，在GK大鼠中测定了运动神经传导速度。以大小相配和重量相配的Wistar大鼠作为对比物。在腹膜内葡糖耐量试验中，GK大鼠比对比大鼠表现出显著的葡糖不耐性。对GK大鼠的跖骨(p＜＜0.001)和肱骨(p＜＜0.05)的X射线分析表明，骨皮质厚度减小约15％。与大小相配的对比大鼠(p＜＜0.05)相比，在GK大鼠坐骨神经中测定的运动神经传导速度也减小了(减小10％)，这是外周神经病的迹象。所以，GK大鼠似乎是适合研究不存在肥胖症的糖尿病性骨病的NIDDM模型。
为了研究催产素在自发糖尿病大鼠中的效果，调查了皮下施用催产素和盐水的效果：在被杀死之前六个月，每月有5天中每天一次地这样处理大鼠：3只大鼠(对比物)接受盐水，3只大鼠用催产素(1mg/kg体重)处理。然后解剖右肱骨，进行放射线照片分析[Selby，糖尿病的医疗(Diabetic Med)5：423～428，1988；Bouillon Calcif Tissue int49：155～160，1991]。拍摄大鼠肱骨的不加色X射线照片，通过测定宽度和通过精密的测径器测定每条骨的骨干内层非皮质宽度进行分析。通过将外层骨干宽度除以内层(网状骨质)骨干宽度计算皮质厚度指数。结果
在接受盐水的自发糖尿病大鼠(对比大鼠)中，骨皮质厚度指数是1.9±0.3，而催产素处理的大鼠为2.1±0.2。这些结果表明，催产素刺激骨皮质厚度。实施例7-硫芥子气引起的角质形成细胞中细胞死亡(编程性细胞死亡)数的减少原料和方法
获取正常人表皮角质形成细胞作为原代培养物并保存在无血清的角质形成细胞生长培养基中。硫芥子气的效果
硫芥子气通过钙-钙调蛋白和caspase依赖性途径使皮肤起疱。由于硫芥子气是一种强烷基化剂，所以，它通过无嘌呤位点和内溶核活化作用引起DNA损伤的能力已发展成一条导致起疱的可能途径。
与引起DNA链断裂的其它作用剂相似，硫芥子气刺激核内蛋白多腺苷二磷酸核糖聚合酶，这样显著减小细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷三磷酸的浓度，即，一种被认为引起细胞死亡(编程性细胞死亡)的机制。
既然已证实硫芥子气可能引起角质形成细胞中的编程性细胞死亡，就对角质形成细胞施用催产素，同时用硫芥子气激发。试验设计
在组织培养瓶中生长正常人表皮角质形成细胞至70～80％铺满，然后暴露于用角质形成细胞生长培养基稀释的硫芥子气中，其中添加了或未添加催产素1mM，至100μM或300μM的最终浓度。在试验过程中未改变培养基。通过细胞排斥锥虫蓝的能力测定细胞生存能力。结果
编程性细胞死亡的特征在于核小体大小的梯级的出现。从用100μM硫芥子气处理的正常人表皮角质形成细胞分离的DNA是完整的，用300μM硫芥子气和1mM催产素处理的正常人表皮角质形成细胞情况也一样。另一方面，根据目视检测、接着用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析，用300μM硫芥子气处理的正常人表皮角质形成细胞显示核小体大小的梯级。在对比细胞中，24h时的锥虫蓝排斥是97％，用300mU硫芥子气和催产素处理后为88％，只用300mU硫芥子气处理的细胞中为57％。
与催产素一起施用减小了硫芥子气的毒性，表明抗编程性细胞死亡效果。实施例8-保护以防佛波酯和噁唑酮诱发的炎症原料和方法动物
应用了来自Charles River的雌性BALB/C小鼠和Crl：NMRI BR小鼠。在14d的适应期后应用它们而采集腹膜巨噬细胞(BALB/C)，或者诱发过敏性接触性皮炎和刺激性接触性皮炎(Crl：NMRI BR)。试验设计
就体外试验来说，将催产素溶于补加了5％或10％热灭活的胎牛血清的RPMI 1640(Gibco Life Technoogies，UK)。青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、脂多糖(LPS)都来自Escheria coli，噁唑酮和地塞米松都来自Sigma，重组小鼠干扰素-γ、白细胞介素(IL)-1-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒都来自Genzyme。在RPMI 1640中补加了青霉素、链霉素、谷氨酰胺和2-巯基乙醇。巯基乙酸激发的巨噬细胞是按Lam等在加拿大传染病杂志(Can J Infect Dis)3：94～100，1992中报导的方法获得的。应用10mL含5％胎牛血清的冷RPMI进行了腹膜灌洗。用相同的培养基洗涤巨噬细胞，在37℃和5％CO2中，在空气加湿的(air humified)气氛下的24孔板(Nunc)内培养2×10,000,000个细胞/2mL达6h和24h，培养板孔中添加了或未添加LPS、10ng/mL细胞因子蛋白质和亚硝酸盐、以及催产素100μg/mL。应用商品化试剂盒分析细胞因子，而应用标准Griess分析法[Green等，分析生物化学(AnalBiochem)126：131～138，1982]分析亚硝酸盐。十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(Sigma)诱发的刺激性接触性皮炎是通过对八只一组的小鼠左耳内表面局部施用10μl 0.01％TPA而引起的。就局部处理来说，在刺激前30min，用10μl所述化合物或载体DAE 244(二甲基乙酰胺∶丙酮∶乙醇，2∶4∶4，vol/vol/vol)处理试验区域。保持右耳未受刺激和处理。用地塞米松作为阳性对比物进行相同的处理。施用刺激物后6h，在标准条件下杀死动物并割下耳朵。以耳朵重量的增大估测炎症[Staite等，血液(Blood)88：2973～2979，1996]。以炎症的百分抑制(相对于载体对比物)计算催产素的效果。病理生理学机制
高浓度的促炎细胞因子和氧化一氮被提议为与各种变应性疾病和炎症相关的和谐地结合的病理生理机制。已完全证实了：在抗原刺激或炎症发作之后，肥大细胞产生的介体(例如组胺和5-羟色胺)引起血管舒张和血管渗透性的增大，导致形成水肿和肿胀。在二硝基氟苯引起的超敏反应中，在表皮内检测到表达白细胞介素的mRNA。在这些条件中，认为角质形成细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和淋巴细胞通过它们在表皮内局部产生增大量的细胞因子而部分地促进诱发的病理。在遗传过敏性皮炎中，细胞因子干扰素-γ的表达被提及维持慢性湿疹性皮肤损伤[Therpen等，变态反应和临床免疫学杂志(J Allergy ClinImmunol)97：828～837，1996]。还有证据表明NO是见于数种皮肤病中的免疫反应和炎症反应的潜在介体[Morita等，皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol)107：549～552，1996]。对于炎性皮肤病来说需要安全而有效的疗法。对于炎性皮肤病来说需要数种既定的疗法。对于皮炎来说可获得数个既定的、有效的局部疗法和系统性疗法，然而，所有这些疗法都多少具有严重的副作用，一些还有另外不方便的方面而限制它们的应用[Brethnach，皮肤病学教科书(Textbook ofDermatology)，Blackwell，2961～3036，1992；Hay等，皮肤病学教科书，Blackwell，Oxford，1391～1458，1992；Robertson和Maibach，局部皮质类固醇(Topical Corticosterioids)，Karger，Basel，163～169，1992]。
目的是应用通过活化的巨噬细胞产生促炎介体的体外模型以及刺激性皮炎的和过敏性接触性皮炎的动物模型评估催产素的潜在抗炎效果。原因是，如果炎性过程受抑制，将促进细胞再生。结果通过LPS活化的巨噬细胞抑制培养物上清液中细胞因子的释放
将巨噬细胞与催产素保温或者单独在培养基中保温24h不会将可检测量的细胞因子释放入培养物上清液。通过LPS活化上清液导致培养物上清液中IL-1-β(32±11pg/mL)、TNF-α(2122±186pg/mL)、IL-10(98±22pg/mL)和IFN-γ(2118±387pg/mL)的显著释放。细胞与LPS和催产素的共培养抑制IL-1-β(抑制62％)、TNF-α(抑制28％)、IL-10(抑制68％)和IFN-γ(抑制12％)的释放。LPS-活化的巨噬细胞的培养物上清液中亚硝酸盐(NO代谢物)的抑制
将巨噬细胞与催产素保温或者单独在培养基中保温24h不会将可检测量的亚硝酸盐释放入培养物上清液。用LPS活化(保温)上清液引起高亚硝酸盐含量(8.2±3.6亚硝酸盐μM)。将巨噬细胞与LPS和催产素共培养导致显著抑制亚硝酸盐的生成(4.3±1.2亚硝酸盐μM)。由佛波酯噁唑酮引起的耳炎症的抑制
为了评估催产素的潜在体内效果，通过用佛波酯溶液涂正常小鼠的耳朵引起耳水肿。在引起接触性刺激之前30min将催产素(每只耳1mg)和载体涂到耳朵上。载体处理组的耳廓重量是34.3±6.1mg，而催产素处理组的耳廓重量是17.9±9.7mg，显著减轻了。还试验了催产素在噁唑酮引起的耳炎症中的抗炎效果。在该模型中，用噁唑酮敏化小鼠的剃光的腹部。七天后，通过将半抗原涂到耳朵上而引起接触性超敏反应。在涂半抗原后30min检查局部涂催产素的抗炎效果。24h后估测处理功效。用载体处理后的耳廓重量是32.6±7.5mg，而局部涂催产素(每只耳1mg)后的耳廓重量是19.6±8.7mg。
归纳我们的研究结果说明了：催产素通过抑制促炎介体的释放对佛波酯和噁唑酮引起的耳炎症产生保护作用，从应用活化巨噬细胞进行的体外研究启示了这一点。实施例9-催产素处理对老化的皮肤和屏障形成的作用原料和方法
应用了如下文献中描述的方案：Hanley等，皮肤病学研究杂志，106：404～411(1996)；Hanley等，临床研究杂志，97：2576～2584(1996)。以前的研究
由于防护屏障对生命至关重要，所以必须在出生前完全形成表皮和角质层[Komuves等，皮肤病学研究杂志，1998年9月，111(3)：429～433]。表皮渗透性屏障由嵌入富含脂质的基质的角膜细胞构成。近期的研究(应用与子宫发育中极其相似的大鼠胎鼠皮肤发育的外植体模型)表明了激素和其它核受体族成员激活剂通过刺激脂质代谢和胞外脂质层的形成而调节透性障个体发生。Komuves等的结果阐明了，一些激素和核激素受体激活剂在胎儿发育过程中调节表皮分化，影响透明角质颗粒和角质化包膜的关键成分。所以，各种配体/核受体激活剂不但促进透性障个体发生，而且促进对角质层的形成来说至关重要的结构蛋白的表达。
以前的研究说明了：在大鼠胎鼠中，表皮透性障的个体发生和肺的出现同时进行。性别也影响肺的成熟，即，雄性表现为发育的延迟。性类固醇激素对肺的成熟产生相反的作用，雌激素促进而雄激素抑制。在近期的研究中，Hanley等(1996)阐述了：在雄性大鼠胎鼠中，皮肤屏障的形成(以经皮水损耗测定的)被延迟了。对怀孕的母体施用雌激素既在形态上又在功能上促进胎鼠屏障的形成。在体外，在添加了雌激素的培养基中培养的皮肤外植体中，还更快地形成活性屏障(competent barriers)。反之，施用二氢睾酮延迟体内和体外屏障的形成。最后，用雄激素拮抗剂氟他胺处理怀孕的大鼠消除了屏障形成的性别差异。
老化的表皮表现药物渗透性的改变，对刺激性接触性皮炎(通常是严重的干燥病)敏感性的增大，启示危及老化的表皮屏障。为了描述表皮老化的功能的、结构的和脂质生化的基础，Ghadially等，临床研究杂志，1995年5月；95(5)：2281～2290比较了年轻的受实验人(20～30岁)与年老的受实验人(＞80岁)的屏障功能以及鼠模型的屏障功能。老年人和衰老的小鼠中基本的经皮水损耗都低于正常。但是，用丙酮或胶带剥离(tape stripping)更容易干扰衰老的屏障(年老的受实验人与年轻的受实验人中分别是18±2条和31±5条)。此外，丙酮处理或胶带剥离后，年老的受实验人屏障恢复比年轻的受实验人更慢(年轻的受实验人中24h和72h分别恢复50％和80％，年老的受实验人中24h恢复15％)，在随后的6天中进一步延迟。衰老的小鼠与未成熟小鼠中见到了类似的屏障恢复差异。虽然衰老的小鼠角质层中总的脂质含量降低了(大约30％)，但神经酰胺(包括神经酰胺1)、胆固醇和游离脂肪酸的分布未变。此外，存在酯化的、很长链脂肪酸的正常补体。最后，角质层层状双层显示正常的亚结构和尺寸，但病灶数随着片层体含量的分泌的减少而减少了。所以，在基本条件下对老化的表皮屏障功能的估测会引入歧途，因为屏障完整性和屏障修复都显著反常。这些功能变化可能是全部关键的角质层脂质总体缺乏的缘故，导致角质层小间隙中层状双层的减少。这种研究结果的构象可以解释内源性老化的皮肤对外源性损害和环境损害的敏感性增大。结果
在研究施用催产素(在研究方案中用雌激素交换)的效果时，我们的结果表明，催产素通过对皮肤的直接作用促进皮肤屏障的形成。在另一个研究系列中，我们打算研究局部施用催产素是否能影响衰老的皮肤中总的脂质含量。每天重复施用催产素达21天增加了衰老的皮肤中总的脂质含量1.1～1.6％，说明局部施用催产素可能对外源性损害和环境损害具有保护作用。实施例10-细胞能量消耗的减少
本研究的目的是调查催产素对胞内Ca2+的作用。我们应用了人结肠肿瘤细胞系(HT-29)和膜片箝术。最近，Sand等[美国生理学杂志(AmJ Physiol)，1997年10月；273(4 Pt1)：C1186～C1193]应用了膜片箝术来研究卡巴胆碱(CCh)对HT-29细胞的作用。在与CCh接触过程中，细胞(n＝23)在接近关于Cl-的平衡电位[E(Cl-)；-48mV]和膜电位时去极化，然后开始振荡(16/23个细胞)。在电压箝试验中，可以阐明在完整细胞电流(whole cell currents)中的类似振荡。完整细胞电导从对比溶液中的225±25pS增大到6.728±1.165pS(平均值±SE，n＝17)。在替代试验[浴液中22mM Cl-，E(Cl-)＝0mV]中，逆转电位从-41.6±2.2mV(平均值±SE，n＝9)变到-3.2±2.0mV(平均值±SE，n＝7)。当在细胞中掺入钙敏荧光染料(fluo 3)并且同时夹上膜片时，CCh引起荧光和膜电位的同步振荡模式。在附着了细胞的膜片中，在下列电位时，CCh-活化的电流反向了：吸管中的对比溶液相对膜电位为1.9±3.7mV(平均值±SE，n＝11)时和吸管中15mM Cl-溶液为46.2±5.3mV(平均值±SE，n＝10)时。高K(144mM)不显著改变逆转电位(p＜＜或＝0.05，n＝8)。在里层向外翻的膜片中，19pS(n＝7)的电导可以阐明依赖于钙的Cl-通道。他们总结出，CCh引起包括依赖于钙的Cl-通道和K-渗透性的膜电位的振荡。结果
应用相同的规定，我们研究了1mM催产素的效果。在催产素暴露过程中，细胞(n＝2)在接近关于Cl-的平衡电位[E(Cl-)；-48mV]和膜电位时去极化，然后开始振荡。在电压箝试验中，可以阐明在完整细胞电流中的类似振荡。完整细胞电导从对比溶液中的234±26pS增大到6.262±1.434pS(平均值+/-SE，n＝2)。当在细胞中掺入钙敏荧光染料(fluo 3)并且同时夹上膜片时，催产素引起荧光和膜电位的同步振荡模式。在附着了细胞的膜片中，催产素活化的电流在相对膜电位为2.62时反向了。在里层向外翻的膜片中，14pS(n＝2)的电导可以阐明依赖于钙的Cl-通道。总之，催产素减小了能量消耗。
发现了用催产素刺激增强了胞内Ca2+振荡。胞内Ca2+振荡是不同类别的细胞中的常见模式。在胞内Ca2+振荡中，细胞在频率和振幅方面具有调节对外部刺激的响应的能力。在Words等[自然(Nature)319：600～602，1986]的研究中，在大鼠肝细胞中观察到了钙振荡。他们认为，钙瞬时物(calcium transients)的频率将决定细胞对引发钙信号的激素的响应。从能量观点来看，钙瞬时物减小了胞内钙负荷，所以减小了对贮钙细胞器的膜中ATP消耗性钙泵的需要。还熟知，[Ca2+]的持续增加会伤害细胞[Shuttleworthe，T.J.实验生物学杂志(J.Exp.Biol.)200：303～314，1997]。
序列表<110>ENTRETECH MEDICAL AB<120>一种用于细胞再生的药物<130>53387<140><141><160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(7)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>人工序列的描述：肽<400>1Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro1               5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_ES<222>(8)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>人工序列的描述：肽<400>2Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu1               5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>人工序列的描述：肽<400>3Cys Tyr Val Thr Asn Cys Pro Leu Gly1               5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>Xaa(3)＝Hoph<220><223>人工序列的描述：肽<400>4Cys Tyr Xaa Thr Asn Cys Pro Val Gly1               5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>Xaa(4)＝Cit<220><223>人工序列的描述：肽<400>5Cys Tyr Phe Xaa Asn Cys Pro Leu Gly1               5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>Xaa(3)＝Cha<220><223>Xaa(8)＝Hos<220><223>人工序列的描述：肽<400>6Cys Tyr Xaa Arg Asn Cys Pro Xaa Ala1               5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>Xaa(4)＝Daba<220><223>Xaa(8)＝Daba<220><223>人工序列的描述：肽<400>7Cys Tyr Val Xaa Asn Cys Pro Xaa Ala1               5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>Xaa(3)＝Hoph<220><223>Xaa(4)＝Daba<220><223>Xaa(8)＝Cit<220><223>人工序列的描述：肽<400>8Cys Tyr Xaa Xaa Asn Cys Pro Xaa Ala1               5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>酰胺化<220><221>二硫化物<222>(1)..(6)<220><223>人工序列的描述：肽<400>9Cys Tyr Phe Arg Asn Cys Pro Val Ala1               5

Claims (9)

1.具有催产素活性的物质在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于增进细胞再生，例如在体外和体内治疗不育症以及治疗外周神经病和中枢神经病。
2.权利要求1的应用，其特征在于，所述物质选自下组化合物：其中，V选自Tyr和Phe，W选自Ile、Val、Hoph、Phe和Cha，X选自Gln、Ser、Thr、Cit、Arg和Daba，Y选自Ile、Leu、无、Val、Hos、Daba和Cit，Z选自Gly、无和Ala。
3.权利要求1～2的应用，其特征在于，所述物质选自下组化合物：催产素、鸟催产素、硬骨鱼催产素、蚯蚓催产素、序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9。
4.增进细胞再生的药物组合物，其特征在于，它包含有效浓度的至少一种具有催产素活性的物质，该物质与至少一种药物上可接受的载体或赋形剂混合或组合，其中，所述物质选自下组化合物：其中，V选自Tyr和Phe，W选自Ile、Val、Hoph、Phe和Cha，X选自Gln、Ser、Thr、Cit、Arg和Daba，Y选自Ile、Leu、无、Val、Hos、Daba和Cit，Z选自Gly、无和Ala；催产素例外。
5.权利要求4的药物组合物，其特征在于，所述物质选自下组化合物：鸟催产素、硬骨鱼催产素、蚯蚓催产素、序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9。
6.权利要求4～5的药物组合物，其特征在于，它包含增大催产素的释放和/或受体的数量或亲和性的物质，例如雌激素，或者具有α2兴奋效果的药物，例如可乐定。
7.权利要求4～6的药物组合物，其特征在于，有效浓度是4～70wt％，优选0.1～50wt％。
8.权利要求4～7的药物组合物，其特征在于，它用于如下疾病之后的痊愈过程：心脏病发作或中风，萎缩，变性疾病例如帕金森病和早老性痴呆，牛皮癣，骨质疏松症，移植术后，平衡失调，子宫、肝、肾的破裂，为了例如在癌治疗后恢复血细胞(例如红细胞、白细胞和淋巴细胞)的增殖，为了增大牲畜的重量，为了增强人的感觉(例如改善因衰老引起的视力、听力、嗅觉和味觉的损伤)，为了减轻失禁问题，在化妆品应用中为了使皮肤回春和对抗因衰老引起的皱纹，手术前增强愈合能力，以及帮助毛发和指甲生长。
9.为了促进胎儿生长的组合物，其特征在于，它包含有效浓度的至少一种具有催产素活性的物质。
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