CN1330139A - 一种耐高硒菌种及其制备方法和该菌种在防治砷中毒的药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐高硒菌种,通过菌种初选、复选和驯化培养过程制得;该菌种具有较高生物活性且其毒性大幅度降低,所述的耐高硒菌种可以在50PPM的硒培养基中正常生长。本发明还提供所述的耐高硒菌种的制备方法以及所述的耐高硒菌种在防治砷中毒的药中的应用。
Description
本发明涉及一种用于治疗地方病的微生物及其制备方法以及该微生物在防治砷中毒的药中的应用，具体的说，本发明涉及一种治疗砷中毒的耐高硒菌种及其制备方法以及该耐高硒菌种在防治砷中毒的药中的应用。
地方性砷中毒在许多国家流行，是严重威胁人类健康的常见多发性疾病之一，其危害不仅表现为近期对健康的损害，尤为严重的是引起人体全身性多生理系统损伤和远期恶性化改变——癌变、突变和畸变，因此对砷中毒的预防和治疗为世界卫生组织和我国政府所高度重视。
60年代在我国台湾即发现有地方性砷中毒病的流行，在80年代以后陆续发现新疆、内蒙古、贵州、山西等省也有地方性砷中毒病的流行，而且病区不断扩大，病情日趋严重。
目前，治疗、防治地方性砷中毒病的方法大致有两种，其一是切断高砷水源，改饮低砷水。实践证明，改饮低砷水的方法虽有一定作用，但不能有效地排除人体蓄积的过量砷和修复受损组织。同时在某些地区，需要打井取水，使得固定设备投资较大，在我国目前经济条件下，很难保证各地区在经济上都能承受这么大的负担；另外，由于打井取水时，机井水中的含砷量难以预测，使得打井取水在实际中的操作难度较大。第二种方法是服用药物；目前我国常用的用于重金属中毒的急救药物是巯基化合物，但巯基化合物的毒副作用比较大，该药物不能长期使用，对体征和受损组织没有明显修复作用。另外一个实出的问题是，巯基化合物对于地方性砷中毒可能发生的远期恶性改变均无预防效果，而只能用于急性救治。
硒是人体和动物必须的微量元素，谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，人体内硒含量的失调可以引发一些疾病，例如克山病、大骨节病、癌症、心脑血管病、硒缺乏症、糖尿病、质褐质素沉淀、微循环障碍、白内障或免疫和生殖系统机能低下等。
硒和砷可以互为解毒剂，且硒具有抑制和抗癌变、突变、畸变的药物学特性。但无机硒制剂是剧毒物，临床应用有一定的危险性。因此，寻求低毒高效硒制剂应用于医药工业和临床治疗一直是许多国家的药物学家、化学家多年探索的目标。
综上所述，目前对于地方性砷中毒没有切实有效的防治方法。因此，寻找一种高效、价廉、服用简便、易于推广应用的治疗地方性砷中毒的药物，是一个非常紧迫的问题。寻找一种能够应用于治疗地方性砷中毒的微生物也成为研究人员所迫切需要解决的问题。
本发明的目的之一在于提供一种耐高硒菌种，该菌种具有较高生物活性且其毒性大幅度降低，所述的耐高硒菌种可以在50PPM的硒培养基中正常生长。
本发明的目的之二在于提供所述的耐高硒菌种的制备方法。
本发明的目的之三在于提供所述的耐高硒菌种在防治砷中毒的药中的应用。
下面将详细说明本发明的技术方案。
本发明所述的耐高硒菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC NO.0454，保藏日期为2000年5月31日。
本发明所述的耐高硒菌种可以在50PPM的硒培养基中正常生长，并可以在50PPM的硒基质中进行批量生产，产品酵母中硒含量＞4000PPM，该产品酵母的蛋白质含量＞38.0％。
本发明所述的耐高硒菌种的其他生理生化指标与普通医用酵母相同。
本发明所述的耐高硒菌种(酿酒酵母CGMCC NO.0454)通过菌种初选、复选和驯化培养过程制得。
本发明所述的耐高硒菌种采用如下筛选和培养程序：
一、初选菌种
本发明所述的初选菌种可以选自不同种类的酿酒酵母，其中包括各种啤酒酵母或白酒酵母。一般情况下，可以选用5—6种酿酒酵母作为筛选的初选菌种。
二、培养基
将商品饴糖(大米或玉米饴糖，28℃，39—40°波美度)稀释至6—7°波美度，加入1％KH2PO4、5‰(NH4)2SO4和2—3％的琼脂，1pt×20min灭菌后，加入硒溶液，使培养基中的硒浓度达到所需的浓度，经摇匀后，制成斜面或平面培养皿；将其中的琼脂去除，即得到液体基质。所述的硒溶液可以用Na2SeO3以蒸馏水配制。
三、筛选程序
(1)复选
将选取的初选菌种分别接种于150ml的基质中，在摇床上于28℃，振幅为60—90次/分的条件下培养2天进行复苏，然后将复苏了的各菌种分别接种在含硒量为5、50、100、200、300、400和500PPM的平面培养基上，在28℃—30℃条件下培养2—3天，选取其中2—3个在硒浓度较高的培养基上尚可生长的菌种作为复选菌种。
(2)驯化培养
a.将选取的复选菌种接种在10PPM硒的平面培养基中，在28℃—30℃条件下培养3天；然后转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中，以相同的条件继续培养3天；然后再转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中培养，直到菌种长势稳定，生长状况旺盛为止。
b.将在10PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为50PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
c.将在50PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为100PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
d.将在100PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为200PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
e.将在200PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为300PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
f.将在300PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为400PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
g.将在400PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为500PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
h.选取在500PPM的硒环境下仍可正常生长的菌种，即得到本发明所述的耐高硒菌种。
在本发明所述的复选菌种从10PPM硒培养基上驯化结束至转移到含硒量为50PPM的培养基上以前，可以在含硒量为20PPM、30PPM、40PPM的培养基上分别重复驯化步骤一次或几次。，以逐步提高复选菌种对硒的耐受性。
本发明所述的耐高硒菌种在硒一饴糖琼脂或硒一麦芽汁琼脂培养基上于28℃一30℃上培养2—3天后，可以见到橙红色、圆形突起菌落，表面湿润、粘稠，并散发有醇香气味，表明该菌种具有可使低糖转化为酒精和二氧化碳的生理特征，在镜下成不规则圆形。本发明所述的耐高硒菌种除可以在含硒量50PPM以上正常生长，并呈橙红色外，其他生理、生化特性均与普通酿酒酵母相同。
本发明所述的筛选程序是根据生物学上生物对环境逐步适应的原理而设计的；在每个培养周期中经多代繁殖，使酵母菌种逐步获得耐高硒的特性；随着环境硒浓度的提高、培养时间的延长，菌种的耐硒特性也日趋稳定。本发明所述的筛选过程是经过多个硒浓度梯度、多天培养，最后形成新的耐高硒菌种，并应用于工业生产。
本发明所述的耐高硒菌种可以在防治砷中毒的药中的得到应用。
本发明所述的耐高硒菌种在不同硒基质中生产的硒酵母的含硒量数值列入在表1中。
表1
| 基质中硒含量(PPM) | 培养时间及含硒量(PPM) | |
| 24小时 | 72小时 | |
| 20 | 1474 | 1965 |
| 30 | 2473 | 3126 |
| 40 | 3681 | 4727 |
| 50 | 4472 | 6151 |
实验证明，本发明所述的耐高硒菌种具有特殊的耐硒性，对无机硒的吸收随培养基质中硒含量的增加而增加；可以看出，生产出的硒酵母的含硒量与基质中的硒浓度呈显著的正比关系。
无机硒含量的多少是影响硒酵母产品质量的关键因素之一，可以采用如下所述的方法来测定硒酵母中的无机硒含量：在离心管中加入成品硒酵母和适量的去离子水，摇动5分钟，离心，取上清液，测定其可溶性硒含量。
硒酵母中硒的形态直接关系到硒的生物学活性。有关硒酵母中硒的形态目前尚未完全清楚其确切组份和结构。目前经典的方法是透析法。
表2为用0.1N NaOH透析硒酵母的结果。
表2
| 透析前总硒 | 透析后酵母中的硒 | 透析出的硒 | 透析率(％) |
| 4063.78 | 2365.50 | 1703.28 | 41.91 |
| 4126.28 | 2365.50 | 1760.78 | 42.66 |
| 4169.60 | 2433.26 | 1736.34 | 41.64 |
| 4121.56±50.57 | 2388.08±39.12 | 1733.47±28.86 | 42.06 |
表2的结果表明，保留在硒酵母中的硒约58％。这部分硒主要是蛋氨酸形态的蛋白质或其他大分子态的有机硒，透析的硒则是非结合态的硒氨基酸、硒谷胱甘肽等小分子量的有机态硒和少量未同化的无机态硒。
表3为本发明所述的硒酵母的动物急性毒性实验结果。
表3
| 组别 | 剂量(g/kg) | 对数剂量 | 动物死亡数(只) | 死亡率(％) |
| 1 | 16.443 | 1.2160 | 20/20 | 100 |
| 2 | 13.982 | 1.1460 | 19/20 | 95 |
| 3 | 11.890 | 1.0750 | 7/20 | 35 |
| 4 | 10.110 | 1.0050 | 4/20 | 20 |
| 5 | 8.587 | 0.9340 | 2/20 | 10 |
| 6 | 7.310 | 0.8630 | 0/20 | 0 |
由表3可以得知，本发明所述的硒酵母其半数致死量LD50为11.72±0.5g/kg，经计算，折合纯硒为62.668mg/kg，硒酵母的最小致死量为8.60g/kg。目前常用的无机态亚硒酸钠的LD50为8.77—14.560mg/kg，硒酵母的毒性远远低于亚硒酸钠，仅为亚硒酸钠的1/4，因此，可以保证临床使用的安全性。
经动物实验，本发明的硒酵母对动物的自由活动、血压、心率、呼吸频率和深度均没有明显影响。硒酵母对生物体无致突变作用，不引起染色体畸变频率的升高，亦不诱发微核率升高。
人体对硒酵母的相对生物利用率列入在表4中
表4
| 组别 | 项目 | 发硒(μg/g) | 血硒(μg/ml) |
| 亚硒酸钠 | 服硒前硒浓度 | 0.060 | 0.010 |
| 服硒三个月时浓度 | 0.195 | 0.039 | |
| 服硒后增加浓度 | 0.135 | 0.029 | |
| 相对利用率(％) | 100 | 100 | |
| 硒酵母组 | 服硒前硒浓度 | 0.062 | 0.0099 |
| 服硒三个月时浓度 | 0.318 | 0.061 | |
| 服硒后增加浓度 | 0.256 | 0.052 | |
| 相对利用率(％) | 189.63 | 179.31 |
用于治疗地方性砷中毒过程中体征和临床症状综合疗效的比较情况列入在表5中。
表5
| 处理 | 例数 | 有效 | 不变 | 恶化 | 有效-恶化 | ||||
| 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | ||
| 硒治疗组 | 100 | 88 | 88.00 | 7 | 7.00 | 4 | 4.00 | 1 | 1.00 |
| 对照组 | 86 | 27 | 31.39 | 35 | 40.70 | 13 | 15.12 | 11 | 12.79 |
用于治疗地方性砷中毒过程中体征和临床症状转归的比较情况列入在表6中。
表6
用于治疗地方性砷中毒过程中肝功阳性转归的比较情况列入在表7中。
| 处理 | 体征或症状 | 例数 | 好转 | 不变 | 恶化 | 好转-恶化 | ||||
| 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | |||
| 硒治疗组 | 体征 | 100 | 75 | 75.00 | 20 | 20.00 | 4 | 4.00 | 1 | 1.00 |
| 症状 | 100 | 55 | 55.00 | 45 | 45.00 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | |
| 对照组 | 体征 | 86 | 22 | 25.58 | 52 | 60.47 | 9 | 10.47 | 3 | 3.49 |
| 症状 | 86 | 21 | 21.41 | 51 | 59.30 | 13 | 15.12 | 1 | 1.12 | |
表7
用于治疗地方性砷中毒过程中肝B超异常转归的比较情况列入在表8中。
| 处理 | 阳性例数 | 转阴 | 阳性 | ||
| 例数 | ％ | 例数 | ％ | ||
| 硒治疗组 | 25 | 20 | 80.00 | 5 | 20.00 |
| 对照组 | 13 | 6 | 46.15 | 7 | 53.85 |
表8
| 处理 | 例数 | 痊愈 | 好转 | 总有效率 | 不变 | 加重 | |||||
| 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | ||
| 硒治疗组 | 25 | 8 | 32.00 | 7 | 28.00 | 15 | 60.00 | 10 | 40.00 | 0 | 0.00 |
| 对照组 | 13 | 1 | 7.60 | 3 | 23.08 | 4 | 30.77 | 3 | 23.08 | 6 | 46.15 |
用于治疗地方性砷中毒过程中治疗前后心电图转归的比较情况列入在表9中。
表9
| 处理 | 治疗前 | 治疗后 | |||||||||
| 病情 | 总例数 | 异常 | 正常 | 异常 | 正常 | ||||||
| 好转 | ％ | 不变 | ％ | 恶化 | ％ | 正常 | 恶化 | ||||
| 硒治疗组 | 97 | 46 | 51 | 39 | 84.8 | 6 | 13.0 | 1 | 2.2 | 51 | 0 |
| 对照组 | 63 | 29 | 34 | 13 | 44.8 | 13 | 44.8 | 4 | 13.8 | 34 | 0 |
用于治疗地方性砷中毒过程中治疗前后甲皱微循环变化的比较情况列入在表10中。
表10
| 处理 | 例数 | 好转 | ％ | 无变化 | ％ | 恶化 | ％ |
| 服硒组 | 94 | 53 | 56.38 | 39 | 41.49 | 2 | 2.13 |
| 对照组 | 61 | 22 | 36.07 | 33 | 54.10 | 6 | 9.84 |
用于治疗地方性砷中毒过程中治疗前后红细胞电镜观察结果的比较情况列入在表11中。
表11
| 处理 | 例数 | 修复好转 | ％ | 无变化 | ％ | 恶化 | ％ |
| 服硒组 | 18 | 13 | 72.22 | 5 | 27.78 | 0 | 0 |
| 对照组 | 18 | 0 | 0 | 10 | 55.56 | 8 | 44.44 |
用于治疗地方性砷中毒过程中全血GSHPX的动态比较情况列入在表12中。
表12 (单位：活力单位)
用于治疗地方性砷中毒过程中治疗前后SOD酶变化的比较情况列入在表13中。表13 (单位：ng/mg.Hb)
用于治疗地方性砷中毒过程中血、尿、发中砷、硒的动态变化情况列入在表14中。
表14
| 处理与疗程 | 试验前 | 试验后3个月 | 试验后9个月 | 试验后14个月 | 1、4净升降(％) | |
| 硒治疗组 | 血砷(μg/ml) | 0.070±0.099 | 0.072±0.099 | 0.024±0.010 | 0.016±0.006 | -77.14 |
| 尿砷(μg/ml) | 0.255±0.306 | 0.195±0.163 | 0.106±0.163 | 0.030±0.030 | -88.24 | |
| 发砷(μg/g) | 2.970±1.627 | 2.960±2.627 | 1.659±1.495 | 0.798±0.603 | -73.13 | |
| 对照组 | 血砷(μg/ml) | 0.101±0.216 | 0.046±0.039 | 0.031±0.016 | 0.027±0.011 | -73.27 |
| 尿砷(μg/ml) | 0.381±0.535 | 0.210±0.262 | 0.092±0.088 | 0.053±0.045 | -86.10 | |
| 发砷(μg/g) | 2.824±2.264 | 2.910±2.520 | 1.932±1.552 | 1.480±1.447 | -47.59 | |
| 硒治疗组 | 血硒(μg/ml) | 0.128±0.029 | 0.157±0.030 | 0.158±0.018 | 0.181±0.025 | +41.41 |
| 尿硒(μg/100ml) | 1.554±0.779 | 2.293±1.167 | 2.867±1.128 | 2.955±1.792 | +90.15 | |
| 发硒(μg/g) | 0.446±0.061 | 0.499±0.074 | 0.546±0.069 | 0.560±0.075 | +25.56 | |
| 对照组 | 血硒(μg/ml) | 0.129±0.026 | 0.133±0.022 | 0.137±0.016 | 0.131±0.014 | +1.55 |
| 尿硒(μg/100ml) | 2.051±1.290 | 1.717±0.679 | 2.085±0.845 | 1.783±0.808 | -13.07 | |
| 发硒(μg/g) | 0.477±0.068 | 0.465±0.055 | 0.477±0.081 | 0.475±0.056 | -0.42 | |
使用本发明所述的制备方法得到的硒酵母中的含硒量大约为4000PPM。
与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点：
1.本发明利用现代生物技术将无机硒化合物转化为有机硒化合物使其毒性大幅降低，并使生物活性得到了较大的提高。
2.本发明所述的有机硒酵母的生产工艺简单、价格低廉。
3.有机硒酵母不仅可以用于治疗慢性砷中毒，还可以应用于预防由于慢性砷中毒引起的远期恶性化改变；也就是说该硒酵母不仅具有化学治疗作用，还具有化学预防作用。
4.目前，普通菌种只能在5PPM的条件下生产，所产酵母中的硒含量为500PPM左右；而本发明的硒酵母在50PPM的条件下生产，酵母中的有机硒含量超过95％，硒含量可以达到4000PPM以上，因此，可以大大减少成品制剂中硒酵母原料的用量，也就降低了生产的成本。
下面通过实施例进一步地描述本发明，以促进对本发明更深入地理解。但是本发明不受这些实施例的限制。本领域内的技术人员在本发明精神的指引下，可以对本发明进行修改或改进，均属显而易见。本发明的保护范围在权利要求书中提出。
实施例1
选用购自北京营养源研究所的酵母菌1419、1571、1422、1603、1328、1599作为初选菌种。
将前述的菌种分别接种于150ml的基质中，在摇床上于28℃，振幅为80次/分的条件下培养2天进行复苏，然后将复苏了的各菌种分别接种在含硒量为5、50、100、200、300、400和500PPM的平面培养基上，在30℃条件下培养3天，选取其中3个在硒浓度较高的培养基上尚可生长的菌种作为复选菌种。
a.将选取的复选菌种接种在10PPM硒的平面培养基中，在30℃条件下培养3天；然后转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中，以相同的条件继续培养3天；然后再转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中培养，直到菌种长势稳定，生长状况旺盛为止。
b.将在10PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为50PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
c.将在50PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为100PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
d.将在100PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为200PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
e.将在200PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为300PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
f.将在300PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为400PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
g.将在400PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为500PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止。
h.选取在500PPM的硒环境下仍可正常生长的菌种，即得到本发明所述的耐高硒菌种。
Claims (7)
1.一种耐高硒菌种(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏号为CGMCC N0.0454。
2.一种耐高硒菌种(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC NO.0454的制备方法，其特征在于，所述的耐高硒菌种通过菌种初选、复选和驯化培养过程制得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的菌种初选过程的菌种选用啤酒酵母或白酒酵母。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的复选过程选取2或3个在硒浓度较高的培养基上尚可生长的菌种作为复选菌种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的驯化培养过程为：
a.将选取的复选菌种接种在10PPM硒的平面培养基中，在28℃—30℃条件下培养3天；然后转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中，以相同的条件继续培养3天；然后再转移到另一新的10PPM相同的平面培养基中培养，直到菌种长势稳定，生长状况旺盛为止；
b.将在10PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为50PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
c.将在50PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为100PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
d.将在100PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为200PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
e.将在200PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为300PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
f.将在300PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为400PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
g.将在400PPM硒培养基上长势稳定的菌种转移到含硒量为500PPM的培养基上培养3天；如a步骤的方法，重复上述步骤2次，直到菌种长势稳定，生长状况稳定为止；
h.选取在500PPM的硒环境下仍可正常生长的菌种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，复选菌种从10PPM硒培养基上驯化结束至转移到含硒量为50PPM的培养基上以前，在含硒量为20PPM、30PPM、40PPM的培养基上分别重复驯化步骤一次或几次。
7.一种权利要求1所述的耐高硒菌种在防治砷中毒的药中的应用。
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2000
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