CN1319446C - 新型生物农药－松刚霉素生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种新型生物农药——松刚霉素生产方法，涉及农作物真菌病虫害生物药制备。本技术以大米为原料，以含NaCl、KH2PO4、NaNO3、FeSO4的液体为营养液制备培养基；以荨麻青霉为菌种，接种培养后菌丝用有机溶剂萃取得萃取液，以4-(P-叠氮水杨基氮基)丁胺为交联剂，在UV照射下与母核萃取液进行羧基反应，然后将羧基反应物真空浓缩，得晶种后将晶种与水溶液溶解得水性成品。本发明产品具有高效抗真菌性能，对人体无毒害，对环境无残留、无污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，特别涉及用于农作物真菌病虫害生物农药制备技术。
背景技术
在植物病害中，真菌病害种类最多，约有3万种，其中许多还是为害最严重的，如禾谷类的锈病是世界性重要病害。几乎每种作物上都可以发现几种甚至几十种真菌病害，如水稻上发现的真菌病害在200种以上，其中常见的真菌病害在30种以上。各种作物常见的锈病、黑粉病、白粉病和霜霉病都是真菌引起的。目前，上述病害的防治多数仍使用化学农药，不但致使诸多致病菌产生耐药性，用药量不断地加大，残留量增高；而且由于长期使用化学农药，导致造成对环境的污染以及对人体的危害。所以传统的化学农药已成为人畜的一种新杀手。另外，由于大量使用高残留的化学农药，已引起了农畜产品残留严重超标，导致出口受阻。
现有生物农药品种结构不合理，仅限于生物杀虫剂，如Bt等和抗细菌农用抗生素，如井冈霉素、春雷霉素和农用链霉素等，而抗真菌生物农药起步甚晚，尚无高效、广谱品种，且处于试用阶段，如中生菌素和武夷霉素等。从总体上看，目前生物农药在整个农药中所占的比例还较小，而抗真菌生物农药几乎是空白，加速抗真菌生物农药的研发已成为世界上发展生物农药的一种趋势和方向。
发明内容
本发明的目的在于：采用固体发酵新工艺生产松刚霉素母核—一种具有高效抗真菌性能的非多烯类医用灰黄霉素分子结构，实施基团甲基羧化使该农药对人体无毒害、对环境无残留、无污染，具有非常良好的生物相容性。
本发明目的可通过以下技术方案实现。
本发明采用以大米为主要原料的固体发酵生产具有抗真菌性能的非多烯类含氯化合物母核技术，对该母核甲基(CH3)实施羧化，使其基团发生改变，实现松刚霉素由非水溶性转为水溶性，使制剂水溶化。提高叶面的附着力，增强对真菌的抑制力。
松刚霉素(SoGamycin)是从荨麻青霉(Penicillium Patulum)培养液得到的一种非多烯类含氯产物作为母核，实施甲基(CH3)羧化，呈水溶性荨麻青霉。
该菌种的公开已记载文献：
1)吴松刚等 中国抗生素杂志
4(6)：12-14 1979
2)吴松刚等 中国医药工业
3(2)：14 1979
3)吴松刚等 微生物通报
(3)：10 1979
4)吴松刚等 微生物通报
6(3)：10-12 1970
5)吴松刚等 微生物通报
10(5)：202-206 1983
6)吴松刚等 遗传
2(4)：16-18 1990
福建师范大学学报(自然科学版)
12(2)：88-92 1996
7)吴松刚等 药物生物技术
2(4)：28-32 1995
该菌种的商业公开途径：中国科学院微生物研究所
松刚霉素母核分子结构见图1，物理性状为白色粉末，无臭，味微苦，熔点为218-224℃，具有强烈的抗真菌活性，甲基羧化后，实现水溶性特性，提高了在叶面的附着力，增强了对致病真菌的杀菌作用，其作用机理是松刚霉素大量被致病真菌吸收后，与其细胞的脂肪结合，不与DNA与RNA结合，达到抑制真菌的作用。可用于防治多种植物病害，诸如：炭疽病、叶斑病、白粉病、霜霉病和枯萎病等。
松刚霉素母核采用现代固体发酵技术——厚层好氧发酵，以大米为主要原料，以含NaCl 4～6％、KH2PO4 0.1～0.3％、NaNO3 0.4～0.7％和FeSO4 0.001-0.003％的液体为营养液，培养温度为25～30℃，发酵周期200～240hr，料层厚度为15～30cm。发酵液经丙酮萃取后进行甲基羧化，其羧化过程为：
用一端含有一个一级胺，另一端有一个光敏感性的苯基叠氮基(Picrce)的4-(P-叠氮水杨基氨基)丁胺(ASBA)作为交联剂，这种交联剂不会自发地与羧基反应，必须用另一个交联剂来促进键的形成，本发明中用来促进键的形成的可以是水溶性的碳化二亚胺(EDC)，是用以激活一逐步形成靶标分子上的羧基。形成活性酯中间体，如图3。在ASBA(图2)存在的情况下，衍生化会发生，导致酰胺键的形成，从而产生一个光反应基团进行的修饰。ASBA的交联剂提供了一个相当长的间隔基(16.3A)。它的苯基叠氮部分是由一个水扬酸的衍生物构建的，因而具有一个激活环的羧基，这个基团的存在，使得在交联之前对环进行放射性碘化作用，在光解步骤被启动之前，这个试剂应在黑暗之中操作，或是采用避光处理，以防止苯基叠氮基因的降解。
本发明的母核生产方法的主要特点在于：
其一、以大米为主要原料，无需外源酶解，蒸熟灭菌，即可使用。
其二、采用液体种，厚层通风固体发酵工艺，料厚可达20cm，需翻动通风培养。
其三、母核有效成份全部积累在细胞内，发酵效价可达60000u/g以上。经有机溶剂萃取后，即可进行甲基羧化。见附图3所示。
本发明的母核甲基羧化工艺，以ASBA为关键的交联剂，实现母核由非水溶性转为水溶性，本生产方法主要特点在于：
其一、母核甲基基团的改造，选择生物藕合技术，而ASBA作为羧基反应性的交联剂。取得了理想的结果。
其二、ASBA含有一个一级胺基团，利用碳化二亚胺EDC，可藕合含羧基的化合物，在UV的照射下，启动光活化反应，导致共价的交联取得成功。
其三、由于母核甲基羧化，实现由非溶性到水溶性的转换，从根本上解决了作为农业杀菌剂对剂型的要求，并增强了其抗菌作用。
附图说明：
图1为松刚霉素母核分子结构图；
图2为松刚霉素前体固体发酵原理流程图；
图3为母核甲基羧化原理图；
图4为母核甲基羧化流程图；
图5为松刚霉素紫外光谱图；
本发明结合附图各实施例作如下进一步的说明：
图1中，为本发明母核的分子结构，它无异于作为医用黄霉素的分子结构，是一种具有强烈的抗真菌性能的非多烯类抗生素，理化性质均按我国2000年版药典所述。
图2中，本工艺主要原料为大米，液体种的接种量为15％，28℃培养，料层厚20cm，翻动通风发酵，发酵周期200-240hr，萃取有机溶剂为丙酮。含量可达300000u/ml，可套用。
图3、4、5中，本工艺以4-(P-叠氮水杨基氮基)丁胺和碳化二亚胺为交联剂，在UV照射下，与母核萃取液进行羧基反应，ASBA的浓度为0.3％，搅拌时间30分钟，即可完成全过程。
实施例1：
本明的生产菌株为高度耐前体生产变株，发酵配方为：
大米∶营养液＝1∶0.8
培养液中含：NaCl 5.0％
KH2PO4 0.2％
NaNO3 0.6％
FeSo4 0.002％
PH 自然
液体种接种量按15％接入大米培养基，28℃，200-240hr
本发明固体菌丝培养物，经100℃烘干，用丙酮进行萃取，萃取柱单管套用，萃取液母核含量到300000u/ml即可终止。
实施例2：
本发明的母核甲基羧化工艺，主要在反应釜中进行，该反应釜特点为：避光、带搅拌、带紫外灯的5M3罐装置，温度为常温条件，交联剂浓度为0.3％，交联反应时间为30′，终止后，进行真空浓缩：760mmhg浓缩到晶体形成。晶体干燥：100℃烘干2hr，水份＜2％，作为晶种进行配制水溶性制剂。
本发明主要优点和效益：
(1)选择深层固体发酵新工艺，生产松刚霉素母核——医用灰黄霉素分子结构，较深层液体发酵工艺，电耗，能耗大幅度下降，其发酵效价高达60000u/g，从而使生产成本显著下降。
(2)本发明采用对医用灰黄霉素分子结构基团甲基羧化工艺，从根本上解决了由非水溶性的农用品质要求，使农用化得以实现。
(3)松刚霉素的问世，以其无毒害、无公害、高效、广谱、安全、低成本的独特优势，而逐步代替化学农药。
松刚霉素的应用试验1：
1引言
本试验目的在于检测新型抗真菌生物农药——松刚霉素对甜瓜镰刀菌的抑菌作用，从而为鉴定其防治枯萎病的能力提供科学依据。试验数据由福建省农科院生物技术中心提供。
2材料与方法
2.1材料
供试菌株：镰刀菌：菌株编号为132，F-T.1.7-030520，甜瓜，供试药剂：“松刚霉素”溶液。
2.2方法
a、新型抗真菌生物农药——松刚霉素的稀释：用无菌水试管将“松刚霉素”稀释100倍、300倍、600倍、900倍和1200倍，保存各稀释液。
b、含药培养基的制备：将100mlPDA固体培养基加热熔化，待其冷却至60℃左右时，分别加入稀释好的“松刚霉素”溶液10ml，充分摇匀后分别各倒5块培养皿。以加10ml无菌水作对照。C、接菌：待培养基凝固后，用直径6mm的打孔器从长势旺盛的镰刀菌平板上打取菌落，并各移1块菌饼至上述制备的含药及对照平板中央，每处理重复5次。d、观察结果：将各处理及对照放置在25℃恒温箱内培养，每天观察菌丝的生长并用“十”字形测量菌落直径，共测定6天，观察菌丝体生长的情况，计算抑菌率，计算公式为：
抑菌率＝(CK菌落直径-供试药剂菌落直径)/CK菌落直径×100％
3结果与分析
从表1和表2以及以下的比较我们可以看出，不同稀释倍数的松刚霉素对甜瓜镰刀菌的生长都具有一定的抑制作用。稀释100倍的抑制率最大，为78.69％，并且对菌落的生长有所影响，随着稀释倍数的增大，对甜瓜镰刀菌的抑制减弱，即使我们将其稀释到1200倍时，甜瓜镰刀菌的生长仍然具有一定的影响，从图1可以看出，不同稀释倍数的松刚霉素对镰刀菌生长的速率具有一定的影响，随着稀释倍数的增加，生长速率减慢。由此可见，松刚霉素对甜瓜镰刀菌菌体的生长具有很强的抑制作用。
松刚霉素对甜瓜镰刀菌菌落的形状也具有一定的影响，同对照组相比，不同处理组的菌落形状都呈现了梅花状，不似对照组那样呈现圆形。此外，不同稀释倍数的松刚霉素对甜瓜镰刀菌的分泌物也有影响。因为菌落所表现出的颜色是由于镰刀菌的分泌物所造成的在培养中，我们发现，不同处理组的菌落颜色有所不同，随着稀释倍数的增加菌落颜色与对照组很接近，而稀释倍数少的处理组菌落不是呈现橙色，而是呈现灰白色。不同稀释倍数的松刚霉素对甜瓜镰刀菌的生长具有抑制，随着稀释倍数的减少，抑制作用增大，菌落的生长速率减少，并且对于菌落的形状以及菌体的分泌物具有一定的影响。
松刚霉素的应用试验2：
一、在香蕉上的使用
1、试用地址：广东省广州市番禺区万顷沙五户香蕉专业户，试药九瓶。
2、试用日期：2003年7月5日，第一次用药：7月15日第二次用药。
3、试用目标：防治香蕉叶斑病、黑星病、黑斑病、锈斑病。
4、试用结果：叶斑病、黑星病无明显效果，与常规药同效。
5、特别效果：对黑斑病、锈斑病明显优于其它常规药。
6、重复使用对比：两次使用的田块效果相同。
二、在白瓜作物上使用：
1、试用地址：番禺区万顷沙夏白瓜作物，专业种植户。
2、试用日期：2003年7月10日，一次性用药，未作第二次试用。
3、试用目标：防治白粉、霜霉病，设有对比区。
4、试用结果：防治白粉病效果显著、霜霉病与常规药相同。
5、对比无用药区：未施用松刚霉素的白瓜，白粉病高出30％，植株提早衰，产品差，产量低。
结论：
深圳松刚霉素经试用及对比，有几个病的防治效果确实明显，而且它无毒、安全，防治病害较为广普，可用保护性和针对性使用其它病害效果有待继续试用观察。
表1不同稀释倍数的新型抗真菌生物农药——松刚霉素对甜瓜镰刀菌落生长的影响
| 观察时间(b) | 新型抗真菌生物农药——松刚霉素不同浓度(倍)下甜瓜镰刀菌落生长直径(mm) | ||||
| CK | 100 | 300 | 600 | 1200 | |
| 123456抑制率 | 11.622.438.654.870.082.6- | 8.69.410.813.215.017.678.69％ | 10.612.214.618.220.423.072.15％ | 9.812.216.621.024.428.865.13％ | 11.415.221.426.231.036.256.17％ |
表2不同稀释倍数的新型抗真菌生物农药——松刚霉素对甜瓜镰刀菌菌丝体生长的影响
| 观察时间(b)CK | 新型抗真菌生物农药——松刚霉素不同浓度(倍)下甜瓜镰刀菌落生长情况 | |||
| 100 | 300 | 600 | 1200 | |
| 1菌丝最多，白色绒状2菌丝开始想四周伸展3菌落形状规则，菌丝生长整齐，白色4菌落橙色中带有白色，生长整齐5菌丝生长旺盛6菌丝生长旺盛，呈橙色 | 菌丝稀少，生长不整齐菌丝稀少，生长不整齐菌丝少，生长缓慢而不规则菌丝生长不旺盛，菌落形状不规则菌落形状不规则菌丝生长整齐，菌落呈现灰黑色 | 菌丝稀少，生长较为整齐菌丝稀少，生长较为整齐菌落形状极不规则，菌丝少菌丝生长不整齐，菌落形状不规则菌丝生长不整齐，菌落呈现梅花状菌落形状不规则 | 菌丝较多，生长整齐菌丝稀少，伸展较小菌落形状不规则菌丝生长较为整齐，菌落橙色，菌丝生长较为整齐，菌落形状不规则菌落形状不规则 | 菌丝较多，生长整齐菌丝较多菌落形状不规则菌丝较多菌落橙色，生长较为整齐菌丝生长较为旺盛菌落形状不规则菌丝生长较为旺盛 |
Claims (2)
1、新型生物农药——松刚霉素生产方法，其特征在于本技术的生产步骤为：
①固体培养基的制备：
a.选择大米为原料；
b.以含NaCl 4～6％，KH2PO4 0.1～0.3％，NaNO3 0.4～0.7％，FeSO40.001-0.003％的液体为营养液；
c.将大米与营养液以重量比为1∶0.8的比例混匀蒸熟；
d.将混匀蒸熟料在121℃压力下灭菌30分钟，得大米固体培养基；
②接种：
a.选用荨麻青霉液体菌种；
b.在大米固体培养基中接种，接种量为15％，在25～30℃培养，料层厚15～30cm，翻动通风发酵，发酵周期200～240hr；
c.将培养物固体菌丝用有机溶剂丙酮萃取；得含量可达300000u/ml的萃取液备用；
③甲基羧化处理：
以4-(P-叠氮水杨基氨基)丁胺和水溶性的碳化二亚胺为交联剂，在UV照射下，与母核萃取液进行羧基反应，反应过程交联剂的浓度为0.3％，搅拌时间为20～40分钟得羧基化反应物；
④水溶性制剂的制备；
a.将羧基反应物在760mmhg下真空浓缩得晶体；
b.将所得晶体在90～110℃下烘干，至水份小于2％得晶种；
c.将晶种与水溶液溶解，得水溶性制剂。
2、根据权利要求1所述的新型生物农药一松刚霉素生产方法，其特征在于母核甲基羧反应采用的工艺为：
①选用避光、带搅拌、带紫外灯的反应釜，置入萃取液及交联剂和促进剂，交联剂浓度为0.3％，交联反应时间为30分钟；
②交联反应后，在760mmhg条件下真空浓缩到晶体成形；
③在100℃下烘至水份含量小于2％。
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