CN109182128A - 一种高效转化土壤硒的菌株培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到无菌PBS中，振荡、静置，收集土壤悬液，接着离心，得悬浮液保存备用；S2：取制备好的样品加入到液体培养基中进行筛选培养，然后制备系列稀释液，涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基中，菌株进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力。本发明可筛选高效、稳定的富硒微生物，为开发利用土壤硒资源提供了有效途径。

Description

一种高效转化土壤硒的菌株培养方法
【技术领域】
本发明属于富硒技术领域，具体涉及一种高效转化土壤硒的菌株培养方法。
【背景技术】
硒是人体必需的一种微量营养元素，对人体有预防疾病、增强体质及延缓衰老等功效。广西富硒土壤面积达212万hm2，土壤硒含量最高可达2.29mg/kg，为发展富硒农产品提供了有利的基础条件。然而，广西富硒土壤多呈酸性，土壤中的硒易与铁形成难溶的复合亚硒酸铁，从而导致其有效性较低，直接影响了广西富硒土壤资源的有效利用。研究表明，土壤硒的生物有效性受环境中微生物的高度影响，微生物通过自身代谢作用可以实现硒形态、价态的转化，从而提高土壤硒的有效性。因此，筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物，是开发利用土壤硒资源的有效途径。
对土壤微生物硒耐受性进行研究，发现硒的耐受性：细菌>真菌>放线菌，土壤细菌能在高硒环境下将无机硒转化且生长良好，说明土壤细菌对硒具有较好的代谢能力。因此，本研究主要侧重于富硒土壤中细菌的分离，采用含硒培养基筛选耐硒细菌，进一步通过富硒试验获得硒转化能力强的菌株，并对其进行鉴定，以期获得硒高效转化微生物载体，为土壤硒资源利用、富硒农产品生产提供参考。
【发明内容】
本发明提供一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，以解决现有筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物存在的问题。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：
S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到预先装有玻璃珠的无菌PBS中，接着振荡，静置，收集土壤悬液，再接着离心，沉淀用PBS悬浮，保存备用；
S2：取制备好的样品加入到含硒的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备系列稀释液，取稀释液分别涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；
S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。
进一步地，所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：
S1：从富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，在30℃、200r/min下振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min下离心15min，沉淀用10mL PBS悬浮，在4℃下保存备用；
S2：取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，在30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；
S3：菌株活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液在4000r/min下离心30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。
进一步地，步骤S2中所述液体培养基包括以下原料：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。
进一步地，所述液体培养基的pH＝7.3±0.2。
进一步地，所述液体培养基在121℃下灭菌20min后使用。
进一步地，步骤S2中所述固体培养基为营养琼脂。
进一步地，所述固体培养基在121℃下灭菌20min后使用。
进一步地，步骤S3中所述一定量硒浓度为4～8μg/mL。
进一步地，步骤S3中所述加硒时间为2.5～4h。
进一步地，步骤S3中所述培养时间为7～10h。
本发明具有下述效果：
(1)本发明可筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物，为开发利用土壤硒资源提供了有效途径；
(2)本发明侧重于富硒土壤中细菌的分离，采用含硒培养基筛选耐硒细菌，进一步通过富硒试验获得硒转化能力强的菌株，并对其进行鉴定，获得了硒高效转化微生物载体，为土壤硒资源利用、富硒农产品生产提供了技术支持。
【附图说明】
图1为耐硒细菌生长曲线图；
图2为富硒细菌硒转化率图；
图3为基于16S rDNA序列的系统发育树图。
【具体实施方式】
为便于更好地理解本发明，通过以下实施例加以说明，这些实施例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
1材料与方法
1.1培养基及试剂
液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.2；固体培养基：为营养琼脂，购自广东环凯微生物科技有限公司。所有培养基均在121℃灭菌20min后使用。
亚硒酸钠(Na2SeO3，AR 98％)购自山东西亚化学工业有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他化学药品均为国内生产的分析纯产品。
硒液制备：称取22.35g Na2SeO3，溶于去离子水中并定容至100mL，此溶液硒浓度为100mg/mL，使用无菌滤头(0.22μm)过滤后备用，存于避光处。使用时取上述硒液用灭菌去离子水稀释至20mg/mL。
1.2菌株的分离和纯化
从广西多个富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，30℃、200r/min振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min离心15min，沉淀用10mL PBS悬浮，4℃保存备用。取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物。
1.3菌株生长曲线测定
从固体培养基上挑取菌株接种于含10mL液体培养基的培养瓶中，活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养，每隔1h取样液，用分光光度计在530nm波长下测定吸光度值，绘制菌株的生长曲线。
1.4适宜硒浓度的测定
按1μg/mL硒浓度梯度递增依次制备含硒量为1～20μg/mL的液体培养基，待菌株活化后，按5％接种量依次接种于上述含硒液体培养基中，37℃摇床培养，根据菌液颜色变化确定适宜硒质量浓度。
1.5富硒能力测定
菌株活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，在菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行摇床培养。将培养好的菌悬液4000r/min离心30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力。
硒转化率(％)＝(总硒含量-残留无机硒含量)/总硒含量×100。
1.6菌株的鉴定
挑选具有较强富硒能力的菌株，用液体培养基活化，提取细菌基因组总DNA并以其为模板，采用细菌通用引物(27F/1492R)扩增其16S rRNA基因片段，PCR扩增产物用胶回收试剂盒进行回收纯化后在ABI3730测序仪上进行测序。将所得序列与GenBank数据库中序列进行比对，用MEGA5.0软件构建系统进化树，明确菌株的种属关系。
1.7数据处理
采用DPS 7.05软件进行统计分析，并采用Microsoft Office Excel 2003软件进行图表制作。
2结果与讨论
2.1耐硒细菌的筛选
本试验从广西永福、玉林、桂平、藤县等多个富硒区采集土壤样品，采用含硒液体培养基进行耐硒细菌筛选，并利用梯度稀释涂板法分离获得细菌32株。采用平板划线法将这些菌株进行纯化，菌株纯化后于试管斜面上4℃保藏。所获耐硒细菌中，6株来源于永福，9株来源于玉林，12株来源于藤县，5株来源于桂平，表明广西不同富硒区土壤均有耐硒细菌存在。
2.2菌株的生长曲线
由菌株生长曲线可知菌株的对数生长期及所需培养时间。对各耐硒菌株进行生长曲线测定后发现，不同耐硒细菌进入对数生长期的时间及其持续时间、到达生长稳定期所需时间均存在差异。从生产周期考虑，本研究筛选出4株培养时间较短的菌株进行下一步研究。4株耐硒细菌分别命名为YLB1-6、TXB1-10、TXB2-5和GPB1-5，其生长曲线如图1所示，YLB1-6在1h～4h时处于对数生长期，对数期出现较早且较短，4h～7h处在稳定期；其它3株细菌在2h～6h处于对数生长期，6h～10h处于稳定期。菌株对数生长期细胞生长速率最快，代谢也最为旺盛，这个时期加硒有利于硒的转化，但加硒过早会对菌体代谢活动有抑制作用，过晚菌体发生自溶也会导致转化率低，因此在对数生长期的中期加硒转化效果最好。由此确定，YLB1-6最适加硒时间为第2.5h，培养时间为7h；其他3株细菌最适加硒时间为第4h，培养时间为10h。
2.3菌株适宜硒浓度的确定
不同硒浓度下，各菌株菌液颜色变化如表1所示。随着液体培养基中硒浓度的增加，菌液呈不红→红色不明显→红色变化趋势。当菌液出现红色时，说明菌株将Na2SeO3转化为红色单质硒[9]，为了避免过多单质硒的产生，提高硒转化率，选择菌液呈红色不明显时的硒浓度作为适宜硒浓度，即YLB1-6和TXB2-5为6μg/mL，TXB1-10为4μg/mL，GPB1-5为8μg/mL。
表1不同硒浓度菌液颜色变化
注：“-”表示菌液没变红，“○”表示菌液红色不明显，“+”表示菌液呈红色。
2.4菌株的富硒能力
在各菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行菌株富硒试验，由硒转化率公式可知各菌株的富硒能力。经富硒试验后，YLB1-6、TXB1-10、TXB2-5和GPB1-5残留无机硒含量分别为：1.547μg/mL，1.358μg/mL，2.681μg/mL和2.936μg/mL，菌株硒转化率依次为74.22％，66.05％，55.31％和63.30％(图2)，5个耐硒菌富硒能力由大到小排序为：YLB1-6＞TXB1-10＞GPB1-5＞TXB2-5。目前国内外文献报道的富硒细菌，其硒转化率为50％-80％。本研究所筛4株富硒细菌硒转化率均达50％以上，具有较强富硒能力。
2.5富硒细菌的鉴定
通过PCR扩增，各富硒细菌的16S rDNA序列长度均在1450bp左右。BLAST分析结果(表3)表明，这4株富硒细菌与其同源菌株相似性均在99％以上；进一步采用Neighbor-Joining方法构建了富硒细菌的系统发育树(图3)，经鉴定，YLB1-6为Bacillus cereus，TXB1-10为Sinomonas sp.，TXB2-5为Bacillus thuringiensis，GPB1-5为Achromobacterdenitrificans.目前文献报道的富硒细菌有Bacillus，Stenotrophomonas，Enterobacter和Pseudomonas]，而本研究中Sinomonas和Achromobacter具有富硒能力为首次报道，丰富了富硒菌株的种类。
表2菌株16S rDNA序列同源性分析结果
2.6菌株对土壤硒的活化能力
水溶态硒和可交换态硒是土壤有效硒的主要形态。从表3可以看出，各处理中可交换态硒为主要的有效硒形态，而水溶性硒所占有效硒的比例较小；土壤经各菌株制成的菌剂处理后，各处理水溶态硒与CK相比无明显差异，而可交换态硒均有不同程度的提高。CK可交换态硒含量为0.053mg/kg，各菌剂处理的可交换态硒含量提高至0.085-0.112mg/kg，其中YLB1-6和TXB1-10菌剂处理均极显著提高了土壤可交换态硒含量(P＜0.01)，TXB2-5和GPB1-5菌剂处理也显著提高了土壤可交换态硒含量(P＜0.05)。本研究中，土壤经菌剂处理后，土壤可交换态硒含量显著提高，可能是吸附于氧化物和黏土矿物表面的亚硒酸盐更易与菌株分泌的肽、氨基酸结合从而获得释放，也可能是菌株分泌胞外磷酸酶溶解土壤中的难溶性磷，磷元素释放的同时与之伴生的硒元素也被活化释放，其活化机制有待进一步研究。相关研究表明，通过土壤微生物代谢转化获得的硒是一种重要的生物有效硒，它在提高土壤硒生物有效性方面具有巨大的潜力。因此，土壤富硒细菌作为作物硒生物强化的潜在工具，在富硒作物生产上具有实际应用价值。
表3土壤处理后水溶态硒和可交换态硒含量
3结论
1)从广西永福、玉林、桂平、藤县等多个富硒区分离筛选到4株富硒能力较强的菌株，其硒转化率为55.31％～74.22％，土壤富硒细菌作为作物硒生物强化的潜在工具，在富硒作物生产上具有实际应用价值。
2)通过对4株细菌16S rDNA序列分析及系统发育树分析，明确了各细菌的种属关系，YLB1-6为Bacillus cereus，TXB1-10为Sinomonas sp.，TXB2-5为Bacillusthuringiensis，GPB1-5为Achromobacter denitrificans。
以上内容是对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到预先装有玻璃珠的无菌PBS中，接着振荡，静置，收集土壤悬液，再接着离心，沉淀用PBS悬浮，保存备用；
S2：取制备好的样品加入到含硒的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备系列稀释液，取稀释液分别涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；
S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。
2.根据权利要求1所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：从富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，在30℃、200r/min下振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min下离心15min，沉淀用10mL PBS悬浮，在4℃下保存备用；
S2：取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，在30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；
S3：菌株活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液在4000r/min下离心30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。
3.根据权利要求1或2所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，步骤S2中所述液体培养基包括以下原料：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求3所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，所述液体培养基的pH＝7.3±0.2。
5.根据权利要求4所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，所述液体培养基在121℃下灭菌20min后使用。
6.根据权利要求1或2所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，步骤S2中所述固体培养基为营养琼脂。
7.根据权利要求6所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，所述固体培养基在121℃下灭菌20min后使用。
8.根据权利要求1或2所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，步骤S3中所述一定量硒浓度为4～8μg/mL。
9.根据权利要求1或2所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，步骤S3中所述加硒时间为2.5～4h。
10.根据权利要求1或2所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，步骤S3中所述培养时间为7～10h。
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