CN117327602A - 一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法 - Google Patents

一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，且公开了一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，包括如下步骤：S1、从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品，并进行风干。该从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，通过从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品进行风干研磨，并制得不同梯度的土壤悬液，在通过沸水水浴杀死微生物营养体将土壤悬液涂布于营养琼脂上，最后通过分离纯化并得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)，通过实验证明该贝莱斯芽孢杆菌制成的菌剂在水稻上具有明显的稻谷降镉效果，平均稻谷镉离子含量降至国家标准要求，复合微生物菌剂在增产方面效果显著，具有良好的经济效益。

Description

一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法。
背景技术
随着工业和电子产业的快速发展，镉的产量逐年增加，镉广泛应用于电镀工业、化工业、电子业和核工业等领域，镉是炼锌业的副产品，主要用在电池、染料或塑胶稳定剂，它比其它重金属更容易被农作物所吸附，相当数量的镉通过废气、废水、废渣排入环境，造成污染，污染源主要是铅锌矿,以及有色金属冶炼、电镀和用镉化合物作原料或触媒的工厂。
镉是人体非必需元素，在自然界中常以化合物状态存在，一般含量很低，正常环境状态下，不会影响人体健康，镉和锌是同族元素，在自然界中镉常与锌、铅共生，当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒，镉被人体吸收后，在体内形成镉硫蛋白，选择性地蓄积肝、肾中，其中肾脏可吸收进入体内近1/3的镉，是镉中毒的“靶器官”，其它脏器如脾、胰、甲状腺和毛发等也有一定量的蓄积，由于镉损伤肾小管，病者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿，特别具使骨骼的代谢受阻，造成骨质疏松、萎缩和变形等一系列症状。
近年来，农田镉污染对农产品安全造成严重威胁，成为亟须解决的问题，故而提出一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，并通过该芽孢杆菌类细菌降低土壤及水稻中的镉元素。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，具备从镉污染水稻根际土壤中分离出芽孢杆菌类细菌，并利用该芽孢杆菌类细菌降低土壤及水稻中的镉含量等优点，解决了农田镉污染对农产品安全造成严重威胁的问题。
(二)技术方案
为实现上述从镉污染水稻根际土壤中分离出芽孢杆菌类细菌，并利用该芽孢杆菌类细菌降低土壤及水稻中的镉含量的目的，本发明提供如下技术方案，一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，包括如下步骤：
S1、从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品，并进行风干；
S2、将S1中的若干份水稻根际土壤样品分别进行不同梯度稀释，搅拌均匀，并制得土壤悬液；
S3、将S2中的土壤悬液经沸水水浴杀死微生物营养体，并保留芽孢类细菌；
S4、将S3中每一个稀释度的土壤悬液布于3个营养琼脂平板，并挑取不同菌落形态的单菌落进行分离纯化，从而筛选出贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)。
优选的，所述步骤S1中的试验前及稻谷采收时采集每个处理试验田土壤样品，采集时各小区按S形曲线，采用5点取样法，采集深度0～20cm，并混合成混合样，采集量约200g。
优选的，所述步骤S1中水稻根际土壤样品的份数为20份，并分别对20份水稻根际土壤样品进行编号。
优选的，所述步骤S1中土壤样品在室内自然风干，研磨过筛，筛目数为10。
优选的，所述步骤S2中分别对20份水稻根际土壤样品的稀释梯度为10-1、10-2、10-3和10-4倍。
优选的，步骤S3中沸水水浴杀死微生物营养体的时长为8～12mi n。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，具备以下有益效果：
该从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，通过从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品进行风干研磨，并制得不同梯度的土壤悬液，在通过沸水水浴杀死微生物营养体将土壤悬液涂布于营养琼脂上，最后通过分离纯化并得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)，通过实验证明该贝莱斯芽孢杆菌制成的菌剂在水稻上具有明显的稻谷降镉效果，平均稻谷镉离子含量降至国家标准要求，复合微生物菌剂在增产方面效果显著，具有良好的经济效益。
附图说明
图1为本发明中菌株AGLA201911和相关类群基于16SrRNA的系统发育树图；
图2为本发明中菌株AGLA201911与其相近种的系统发育树图；
图3为本发明中菌株AGLA201911的菌落形态照片(TSA培养基30℃培养24h)；
图4为本发明中菌株AGLA201911的革兰氏染色照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，包括如下步骤：
S1、从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品，并进行风干；
S2、将S1中的若干份水稻根际土壤样品分别进行不同梯度稀释，搅拌均匀，并制得土壤悬液；
S3、将S2中的土壤悬液经沸水水浴杀死微生物营养体，并保留芽孢类细菌；
S4、将S3中每一个稀释度的土壤悬液布于3个营养琼脂平板，并挑取不同菌落形态的单菌落进行分离纯化，从而筛选出贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)。
优选的，所述步骤S1中的试验前及稻谷采收时采集每个处理试验田土壤样品，采集时各小区按S形曲线，采用5点取样法，采集深度0～20cm，并混合成混合样，具体可通过四分法制取土壤样品约200g。
优选的，所述步骤S1中水稻根际土壤样品的份数为20份，并分别对20份水稻根际土壤样品进行编号。
优选的，所述步骤S1中土壤样品在室内自然风干，研磨过筛，筛目数为10。
优选的，所述步骤S2中分别对20份水稻根际土壤样品的稀释梯度为10-1、10-2、10-3和10-4倍。
优选的，步骤S3中沸水水浴杀死微生物营养体的时长为8～12min。
(一)实验地及水稻品种的选择：
本实施例的土样采自广西土壤镉含量较高的水稻根际土壤，并分离出的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)，该贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO：27405。
供试土壤的选择：供试土壤质地为黏壤土，肥力中等均匀，排灌方便。
水稻品种的选择：根据当地种植水平与当地生产水平相当品种。
试验地点与供试水稻品种见表1：
表1试验地点与供试稻米品种
供试微生物菌剂：由上述分离的贝莱斯芽孢杆菌制成的菌剂或粉剂，有效活菌含量≥20亿CFU/克，深圳市爱格丽生物科技有限公司提供；复合微生物菌剂，粉剂，有效活菌含量≥5亿CFU/克，深圳市爱格丽生物科技有限公司提供。
(二)试验方法
1、降镉微生物菌株分离筛选：
从广西壮族自治区河池市罗城县龙岸镇太和村上地瑶屯、物化村寨胜屯和物化村物华屯田里镉含量较高的水稻田里采集20份水稻根际土壤样品并进行编号，具体的，试验前及稻谷采收时采集每个处理试验田土壤样品，采集时各小区按S形曲线，采用5点取样法，采集深度0～20cm，并混合成混合样，采集量约200g，土壤样品在室内自然风干，研磨过筛，筛目数为10，制备不同梯度土壤稀释液，具体的稀释梯度为10-1、10-2、10-3和10-4倍，土壤悬液经沸水水浴8～12mi n杀死微生物营养体，保留芽孢类细菌，每一个稀释度的土壤悬液布于3个营养琼脂平板，挑取不同菌落形态的单菌落进行分离纯化，筛选的菌种委托中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC进行菌种鉴定，并得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)，具体的，根据菌株AGLA201911的16SrRNA基因分析：用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R(27f5'-GTTTGATCMTGGCTC AG-3'；1492r5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')测定16SrRNA基因序列，获得1463bp的基因片段，通过EzbioCloud网站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/)与已知模式菌进行比较，结果如下表2：
表2.菌株AGLA201911的16S rRNA基因序列比较分析
菌株AGLA201911与已知Bacilus velezensis模式菌株KCTC 13613T和Bacilusvelezensis的模式菌株CR-502T相似度最高，均为99.93％。构建菌株AGLA201911和相关类群基于16SrRNA的基因序列参见附件1，菌株AGLA201911和相关类群基于16SrRNA的系统发育树如图1所示，菌株AGLA201911的gyrB基因序列分析见附件2，菌株AGLA201911与其相近种的系统发育树如图2所示。
2、微生物菌剂田间试验设计：
试验设置采取单因素对比设计，每个试验点分别设定试验组与对照组(CK)。对照组，常规施肥，即按当地种植习惯施用；试验组，常规施肥及基施复合微生物菌剂1kg/667m2。试验面积为667m2，试验田间均设隔离行，确保无水肥串灌。各处理其他肥水管理、插秧密度及病虫害防治等均按当地农民种植习惯实施.
3、稻谷镉含量检测：
水稻成熟期各试验田单独收割，取脱粒晒干至含水量为13％后的稻谷样品200g，作为稻谷镉含量的待测样品。稻谷样品委托谱尼测试集团股份有限公司、东莞华测检测认证有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心按照《食品安全国家标准食品中镉的测定》(GB 5009.15-2014)进行分析检测。
4、土壤镉含量变化：
试验前及稻谷采收时采集每个处理试验田土壤样品，采集时各小区按S形曲线，采用5点取样法，采集深度0～20cm，并混合成混合样，采集量约200g。土壤样品在室内自然风干，研磨过筛。土壤样品委托谱尼测试集团股份有限公司按照《土壤质量铅、镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法》(GB/T17141-1997)进行分析检测。
5、水稻增产效果：
水稻成熟期各试验田单独收割，进行测产，稻谷脱粒晒干至含水量为13％后折算亩产量，该过程由当地村委或农业机构人员监督进行。
6、结果与分析：
①微生物菌株分离筛选与鉴定，土壤样品采自广西壮族自治区河池市罗城县龙岸镇太和村上地瑶屯田间水稻根际土壤，土样镉含量为0.40mg/kg，从20份土样中分离出菌落形态不同的35株菌，经镜检筛选出9株产芽孢的杆菌，其中编号为AGLA201911的菌株，经中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC进行菌种鉴定，通过16S rRNA基因，gyrB保守基因，细胞革兰氏染色和菌落形态以及生理生化特征(全细胞脂肪酸和API 50CH)分析如下表3所示：
表3.菌株AGLA201911的API50CH数据
注：+,阳性；-,阴性；w,弱阳性。菌株AGLA201911鉴定为Bacilus velezensis(贝莱斯芽孢杆菌)。
②贝莱斯微生物菌剂对稻谷镉含量的影响：
《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)规定稻谷中镉含量标志值≤0.2mg/kg，各个试验点收获的稻谷经过谱尼测试集团股份有限公司进行镉含量检测，结果见表4：
表4各试验点稻谷中镉含量检测结果 单位：mg/kg
从表4可以看出，对照组平均稻谷镉含量0.258mg/kg，使用贝莱斯芽孢杆菌菌剂的试验组，平均稻谷镉含量0.148mg/kg，平均镉含量下降0.110mg/kg，下降率为42.64％。
③复合微生物菌剂对稻谷镉含量的影响：
《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)规定稻谷中镉含量标志值≤0.2mg/kg，各个试验点收获的稻谷经过谱尼测试集团股份有限公司、东莞华测检测认证有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心进行镉含量检测，结果见表5：
表5各试验点稻谷中镉含量检测结果 单位：mg/kg
从表5可以看出，对照组平均稻谷镉含量0.193mg/kg，使用复合微生物菌剂的试验组，平均稻谷镉含量0.107mg/kg，平均镉离子含量下降0.086mg/kg，下降率为44.57％。
④复合微生物菌剂对土壤镉含量的影响：
《GB/T 36869-2018稻谷生产的土壤镉、铅、铬、汞、砷安全阈值》规定土壤镉含量标志值≤0.8mg/kg，广西河池市罗城县4个试验点在种植前和收获后进行了土壤镉含量检测，检测结果见表6：
表6各试验点土壤中镉含量检测结果 单位：mg/kg
表6的结果表明种植前土壤平均镉含量为0.49mg/kg，在使用复合微生物菌剂后，土壤平均镉含量降低到0.413mg/kg，镉含量下降了0.077mg/kg，下降率为15.71％。
⑤复合微生物菌剂对稻谷亩产量的影响：
从2021-2022江西、广东等地5个试验点的测产结果如下表7：
表7各试验点的水稻测产结果 单位：kg/亩
对照组平均稻谷亩产530.81kg，在使用复合微生物菌剂后，稻谷亩产630.96kg，平均亩产增加100.16kg，增产率为18.87％。
以上结果表明从镉含量较高的水稻田的水稻根际土壤样品中分类的贝莱斯芽孢杆菌制成的菌剂和复合微生物菌剂在水稻上具有明显的稻谷降镉效果，平均稻谷镉离子含量降至国家标准要求，复合微生物菌剂在增产方面效果显著，具有良好的经济效益。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
附件1：
1.菌株AGLA201911的16S rRNA基因序列(1463bp)及系统发育分析
GGGGAAGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAACCAGTTTTTTCTG
附件2
2.菌株AGLA201911的gyrB基因序列(1262bp)
TGAAGTCATCATGACCGTTCTGCACGCTGGCGGCAAATTCGACGGAAGCGGATATAAAGTATCCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCTGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGCGGTGTACCTGTGGCCGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAGAAACAACCGTATACGACTATGATCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGCGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACGAATAATATCAACACATACGAAGGCGGCACGCACGAGGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACCCGTGTCATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAAGGGATTTTCAAAGAAAATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGAGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGTCAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCGAAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCTCAAACAATGAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACAGGAATCGGAGAAGATTTTAATCTTGAAAAAGCGCGTTATCATAAAGTGGTCATCATGACAGATGCCGACGTTGATGGCTCGCACATCCGTATCCTGCTA。

Claims (6)

1.一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从镉含量较高的水稻田采集若干份水稻根际土壤样品，并进行风干、研磨；
S2、将S1中的若干份水稻根际土壤样品分别进行不同梯度稀释，搅拌均匀，并制得土壤悬液；
S3、将S2中的土壤悬液经沸水水浴杀死微生物营养体，并保留芽孢类细菌；
S4、将S3中每一个稀释度的土壤悬液布于3个营养琼脂平板，并挑取不同菌落形态的单菌落进行分离纯化，从而筛选出贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)。
2.根据权利要求1所述的一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于：所述步骤S1中的试验前及稻谷采收时采集每个处理试验田土壤样品，采集时各小区按S形曲线，采用5点取样法，采集深度0～20cm，并混合成混合样，采集量约200g。
3.根据权利要求2所述的一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于：所述步骤S1中水稻根际土壤样品的份数为20份，并分别对20份水稻根际土壤样品进行编号。
4.根据权利要求3所述的一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于：所述步骤S1中土壤样品在室内自然风干，研磨过筛，筛目数为10。
5.根据权利要求4所述的一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于：所述步骤S2中分别对20份水稻根际土壤样品的稀释梯度为10-1、10-2、10-3和10-4倍。
6.根据权利要求1所述的一种从镉污染水稻根际土壤中分离芽孢杆菌类细菌的方法，其特征在于：步骤S3中沸水水浴杀死微生物营养体的时长为8～12min。
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