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一种来自唐德链霉菌的抗植物致病性真菌的抗真菌蛋白质的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌的抗来自子囊菌科的植物致病性真菌的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。

Description

一种来自唐德链霉菌的抗植物致病性真菌 的抗真菌蛋白质的用途
本发明涉及一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌(Streptomyces tendae)的抗来自子囊菌(Ascomycetes)科的植物致病性真菌的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。
抗真菌蛋白质在前些时候曾经被描述过，在植物中这类蛋白质中的一些也被称为PR蛋白质(植物发病机理相关蛋白质)(Bol,J.F.&Linthorst,H.J.M.(1990)，植物病理学年度综述(Annu.Rev.Phytopathol.),28,113)。这些蛋白质是植物在应激反应条件下形成的，例如在病毒或真菌感染的情况下，诱导出一种被称为“诱导抵抗力”的植物的活性防御机制(Lindhorst,H.J.M.,(1991)植物科学评论综述(Cri.Rev.Plant Sci.),10(2),123)。这些蛋白质中有一些具有例如壳多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。
具有一种抗真菌活性的蛋白质也已经从微生物中检测到，这些蛋白质中有些也显示了壳多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。而其它蛋白质通过与真菌细胞壁的相互作用来发挥作用。
例如，已经从唐德链霉菌中分离出一种大小约为10kDa的抗真菌蛋白质(AFP)，其具有抗真菌种类如拟青霉(Paecilomycesvarriotii)、Byssoclamis nivea、软毛青霉(Pencillium puberulum)和Eupenicillium terrum的活性。但是这种作用也只限于这些种类。其它种类，如肉色拟青霉(Paecilomyces carneus)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacenus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)或棒形青霉(Penicillium claviforme)则不被抑制。另外，AFP的使用不具有商业价值也是因为所提到的这些真菌种类不是植物致病性的。
因此本发明的目的就是要找到对植物致病性真菌有活性的一种抗真菌蛋白质。
令人惊喜的是，现在已经发现来源于唐德链霉菌的AFP具有抗来自子囊菌科的植物致病性真菌的活性。
所以本发明的主题就是一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌的抗来自子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是抗灰葡萄孢(Botrytiscinera)的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。
上述抗真菌蛋白质包含一个典型的氨基末端信号序列，即在亲水性N-末端之后跟着的是疏水性跨膜区，其引起胞外分泌。而且已知有两种类型，即一种分子量约为9 860 Da的较短的类型和一种分子量约为10 300 Da的较长的类型。
既然AFP被唐德链霉菌分泌到培养基中，它就可以依本领域技术人员周知的方法例如从唐德链霉菌培养基滤液中直接分离。作为一种可供选择的方法，AFP可以通过遗传工程生产，分离到的基因优选地被克隆到所谓的多拷贝载体上，例如pIJ702(Hopwood,D.A.等。(1985)链霉菌遗传操作实验指南，Norwich，英国)并且使用这一结构来转化适宜的菌株，例如非烟霉素产生菌的唐德链霉菌NP9。一种编码AFP的核酸的例子示于SEQ ID NO.1中。这种优选的转化子在例如200ml培养液中生长7天大约可获得6mg的AFP，相当于30mg AFP/L。因此通过优选的可控发酵用遗传工程来生产AFP是尤其优选的。
就根据这一发明的用途而言，AFP可以以例如与优选的至少一种额外辅料一起的制剂形式直接应用。为了这一目的，例如被真菌侵袭的或有被真菌侵袭危险的植物可用所述制剂喷洒。制剂的AFP浓度通常是从大约10μg/ml到大约500mg/ml。象蛋白酶抑制剂、稳定剂例如甘油、蔗糖、盐、溶剂或通常所知的来自农作物保护领域的物质可作为适宜的辅料。
能自身产生AFP的所谓的转基因植物是可提供抗真菌感染保护的另一种可能性。
因此另一个实施方案是按照发明的AFP的用途，在转基因植物中产生AFP。转基因植物优选的是遗传工程化的玉米，棉花，马铃薯，香蕉，芥属(Arabidopsis)，木薯(casava)，烟草，油籽油菜(canola)，马铃薯，甜菜，谷类如小麦、大麦、或燕麦，草莓，蔬菜如卷心菜，豆科植物如豌豆或黄豆，番茄，莴苣或甜瓜。
为了产生转基因植物，编码AFP的核酸可以以如裸露DNA、病毒DNA或RNA，或以质粒DNA的形式被引入植物细胞。一种编码AFP核酸的一个例子示于SEQ ID NO.1中。但是本发明也涵盖了由于遗传密码的简并性而与SEQ ID No1的氨基酸序列不同的但编码相同AFP氨基酸的序列。而且本发明也包括了SEQ ID NO.1中核酸的那些突变体和变异体，所述核酸的突变体和变异体编码对子囊菌科尤其是对灰葡萄孢有活性的一种AFP蛋白质。这样的蛋白质例如，包括AFP蛋白质与其它外源蛋白质形成的融合蛋白，或带有N端缺失甲硫氨酸的一种AFP蛋白质。其它变异体的例子是在严格条件下可与SEQ ID NO.1的核酸杂交的核酸。严格杂交条件的确定可参照Sambrook,J.等的分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，1989。随后转基因植物从被转化的植物细胞中再生。优选地，通过重组土壤细菌，电穿孔，微粒轰击和/或聚乙二醇这些方法将编码AFP的核酸导入植物细胞。例如，Klee,H.等((1997)植物生理学年度综述(Annu.Rev.PlantPhysiol.)38,467或EP-B2-0122791)描述了在双子叶植物细胞中用重组根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行感染。Ishida,Y.等(1996)(自然杂志生物技术分册(Nature Biotech.)14,745针对玉米(Zea mays L.)描述了在单子叶植物中用重组根癌土壤杆菌进行的感染。为此目的使用的土壤细菌具有一种T-DNA，其中已被插入了AFP表达基因和如果适当的话，一个适宜的启动子，例如一种植物菜豆蛋白启动子(例如，见，EP-B2-0122791)或一种病毒35S启动子(例如，见，Ishida,Y.等(1996)，上文)。T-DNA可以通过例如将重组土壤细菌与目的植物的未成熟胚共培养的方法转移到植物细胞中(例如，见，Ishida,Y.等(1996)，上文)。为了挑选出被转化的植物细胞，最好使用T-DNA构建体，在植物细胞中其能够从将要表达的AFP基因中表达一种抗性基因。例如编码膦丝菌素乙酰基转移酶的基因就是一种适宜的基因(例如，见，Ishida,Y.等(1996)，上文)。这样成功地转化的植物细胞可以通过相应的抗生素膦丝菌素来挑选。来自被转化的植物细胞的植物再生已为大家所知。(例如，见，Sagi等。(1995)，自然杂志生物技术分册，13,481-485,Ishida,Y.等(1996)，上文，或Schopke等。(1996)，自然杂志生物技术分册，14,731-735)。
除了使用根癌土壤杆菌作为转化手段外，其它转化方法也是众所周知的和适合的，例如，电穿孔，微粒轰击，或使用聚乙二醇(例如，见，Potrykos,(1991)植物生理学分子生物学年度综述，(Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.,42,205；Estruch,J.J.等。(1997)自然杂志生物技术分册，15,137-141或Dingermann,T.(1995)BIOforum,18,252)。例如木薯(Schopke等。(1996)上文)或香蕉(Sagi等。(1995)上文)通过用包被DNA的颗粒轰击植物细胞已被转化。也是在这一方法中，把将要被表达的AFP基因克隆到一个适宜的载体上，这一载体上最好有一抗性基因以容许随后对被转化的植物细胞进行挑选。例如，重组载体优选应用于钨粒子，由其轰击胚胎发生细胞悬液(例如，见，Sagi等。(1995)，上文)。如此处理过的细胞悬液随后用一种适宜的抗生素(如膦丝菌素)来挑选被转化的植物细胞，并且转基因植物如上文已经描述过的例子那样由此再生。
本发明的一个重要优点就在于AFP对来源于子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是对灰葡萄孢具有活性，所述灰葡萄孢对一种或多种农作物保护剂已经产生抗性。
下面的实施例和附图意在不加任何限制的情况下详细地描述本发明。序列说明
SEQ ID NO.1列出了来源于唐德链霉菌的编码一种抗真菌(233)蛋白质(AFP)的核酸序列。实施例
实施例1：
为制备检测平板，将50μl的灰葡萄孢孢子悬液加到100ml的检测琼脂中(20g/L麦芽提取物，10g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，0.5硫酸铵，15g/L琼脂，pH6.0)。取25ml倒入培养皿中。孢子的终浓度为105个孢子/ml。随后将直径0.5cm的无菌抗生素测试杯(Schleicher和Schuell,Dassel，德国)置于检测平板之上。然后在测试杯中用移液管分别加入5、10、15和20μl的AFP溶液(100mg/ml冻干的唐德链霉菌转化子培养基滤液)。测试平板在30℃培养4天。5μl AFP溶液的抑制圈的直径是0.7cm,10μl的直径是1cm,15μl溶液的为1.3cm而20μl的是1.9cm。
实施例2：
为制备测试平板，将50μl的灰葡萄孢ZF3629(抗BCM(Benlat,BenomylTM,Hoechst Schering AgrEvo GmbH,Frankfurt,carbendazem)孢子悬液加到100ml的检测琼脂中(20g/L麦芽提取物，10g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，0.5硫酸铵，15g/L琼脂，pH6.0)。取25ml倒入培养皿中。孢子的终浓度为105个孢子/ml随后将直径0.5cm的无菌抗生素测试杯(Schleicher和Schuell,Dassel，德国)置于检测平板之上。然后在测试杯中用移液管分别加入5、10、15和20μl的AFP溶液(100mg/ml冻干的唐德链霉菌转化子培养基滤液)。测试平板在30℃培养4天。5μlAFP溶液抑制圈的直径是0.9cm,10μl的直径是1.3em,15μl溶液的为1.9cm而20μl的是2.2cm。实施例3-通过发酵提高产量
在带有软管的三角瓶中，用唐德链霉菌株琼脂斜面接种于100ml预培养培养基(103g/L蔗糖，20g/L胰化黄豆液体培养基(Oxoid,Wesel),10g/L MgCl2和10g/L酵母提取物)。培养物在定轨摇床上以200rpm、28℃生长5天。
用100ml上面描述过的预培养物接种10L生产培养基(103g/L蔗糖，20g胰化黄豆液体培养基(Oxoid,Wesel),10g/L MgCl2和10g/L酵母提取物，100μl desmophen,pH7.5)。使用的发酵罐是Biostat E(Braun,Melsungen)。发酵在28℃、700rpm和0.5vvm通气量的条件下进行4天。遂即停止发酵并在4℃条件下3000rpm离心收集上清。随后以冷冻干燥法干燥。可以直接使用粉末。如果在抑制圈测试中使用15μl的冻干物(100mg/ml)对抗灰葡萄孢，能检测到1.7cm的抗灰葡萄孢的抑制圈和2.3cm的抗抗灰葡萄孢ZF 3629的抑制圈。
                  序列表<110>    Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG<120>    来自唐德链霉菌的抗植物致病性真菌
     的抗真菌蛋白质的用途<130>    98F122<140>    尚无参考文献<141>    尚无申请日<150>    DE-19848517.4<151>    1998-10-21<160>    1<170>    PatentIn Ver.2.1<210>    1<211>    387<212>    DNA<213>    唐德链霉菌<220>    CDS<223>    编码一种抗真菌蛋白质<400>    1atgaagcttt ccgtgcgccg ttcgctcggt gtcgcaacag tcgccgccgc cgcactggcc 60gccacggtgg tgcccgccgc ggcggccacc acctctccca ccacggcttc cgccatcggc 120ccgaccatca accgtacgga ctgtaacgag aacagctacc tcgaaatcca caacaacgag 180ggccgcgaca ctctgtgctt cgccaacgcc ggaacgatgc ccgtcgccat ctacggggtg 240aactgggtcg agtccggaaa caacgtcgtc accctgcagt tccagcggaa tctgagtgat 300ccgaggctgg aaaccatcac cctccagaag tggggctcgt ggaacccggg ccacatccac 360gagatccttt ccatcaggat ctactga                                     387

Claims (7)

1．一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌的抗来自子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是抗灰葡萄孢的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。
2．如权利要求1的用途，其中AFP优选与至少一种辅料一起以制剂的形式使用。
3．如权利要求1的用途，其中AFP在转基因植物中产生。
4．如权利要求3的用途，其中转基因植物选自玉米，棉花，马铃薯，香蕉，芥属，木薯，烟草，油籽油菜(canola)，马铃薯，甜菜，谷类，草莓，蔬菜，豆科植物，番茄，莴苣或甜瓜。
5．如权利要求4的用途，其中谷类选自小麦、大麦或燕麦，所用蔬菜为卷心菜，或豆科植物选自豌豆或黄豆。
6．如权利要求3-5中任一个的用途，其中转基因植物包含如SEQ IDNO.1中要求的那样的核酸，SEQ ID NO.1是权利要求的一部分。
7．如权利要求1-6中任一个的用途，其中所述的植物致病性真菌对一种或多种农作物保护剂有抗性。
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